CN103421905A - 从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA的方法。其包括：向由多种荧光编码微球组成的混合物中加入待测样品和多种核酸探针，进行杂交反应；向发生杂交反应后的混合物中加入多种单链降解酶，进行降解反应；向发生降解反应后的混合物中加入荧光标记的链霉亲和素进行结合反应；清洗发生结合反应后的微球；识别清洗后的微球的荧光编码，同时检测微球上的链霉亲和素的荧光强度；根据微球的荧光编码确定其检测的microRNA的种类；根据荧光强度，确定该微球上是否结合有相应类型的microRNA，从而确定待测样品中是否存在相应类型的microRNA。本发明省去了合成引物的步骤，使得检测省时又省力。

Description

从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA的方法
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，具体而言，涉及从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA的方法。
背景技术
目前，检测血液中microRNA的常规方法是实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）方法，该方法检测一种microRNA分子，需要合成一对引物，如果检测几种或几十种microRNA分子，需要合成相应多的引物和qRT-PCR反应次数，费时费力。
发明内容
本发明的目的在于提供从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA的方法，以解决上述的问题。
在本发明的实施例中提供了一种从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA的方法，包括下列步骤：
向由多种荧光编码微球组成的混合物中加入待测样品和多种核酸探针，进行杂交反应；
其中，所述荧光编码微球固定有第一核酸片段，并且所述荧光编码微球的荧光编码与该荧光编码微球上的所述第一核酸片段的序列为一一对应的关系；
所述核酸探针为生物素与第二核酸片段的偶联物，并且所述第二核酸片段包括：与所述荧光编码微球上的所述第一核酸片段互补的第一子片段，以及与一种microRNA互补的第二子片段；所述第二子片段与所述第一核酸片段的序列不同；
所述第二子片段分别与以下中的一种microRNA互补：
hsa-let-7a-5p，hsa-let-7c，hsa-let-7d-5p，hsa-let-7f-5p，hsa-let-7g-5p，hsa-let-7i-5p，hsa-miR-1182，hsa-miR-1225-3p，hsa-miR-1225-5p，hsa-miR-1228-3p，hsa-miR-1234，hsa-miR-1238，hsa-miR-126-3p，hsa-miR-126-5p，hsa-miR-1260b，hsa-miR-1275，hsa-miR-128，hsa-miR-1280，hsa-miR-1304-3p，hsa-miR-142-3p，hsa-miR-146a-5p，hsa-miR-148a-3p，hsa-miR-148b-3p，hsa-miR-151a-3p，hsa-miR-151a-5p，hsa-miR-151b，hsa-miR-152，hsa-miR-15a-5p，hsa-miR-181a-5p，hsa-miR-1825，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-191-3p，hsa-miR-197-3p，hsa-miR-197-5p，hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-199a-5p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-211-3p，hsa-miR-221-3p，hsa-miR-223-3p，hsa-miR-2392，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-26b-5p，hsa-miR-27b-3p，hsa-miR-30b-5p，hsa-miR-3162-3p，hsa-miR-3180-5p，hsa-miR-3196，hsa-miR-326，hsa-miR-328，hsa-miR-331-3p，hsa-miR-335-5p，hsa-miR-340-5p，hsa-miR-3676-3p，hsa-miR-376a-3p，hsa-miR-376c，hsa-miR-377-3p，hsa-miR-382-5p，hsa-miR-425-3p，hsa-miR-4270，hsa-miR-4271，hsa-miR-4298，hsa-miR-4313，hsa-miR-4433-5p，hsa-miR-4442，hsa-miR-4463，hsa-miR-4484，hsa-miR-4499，hsa-miR-4532，hsa-miR-4655-3p，hsa-miR-4665-3p，hsa-miR-4669，hsa-miR-4695-5p，hsa-miR-4725-5p，hsa-miR-4734，hsa-miR-4749-3p，hsa-miR-4763-3p，hsa-miR-4767，hsa-miR-4778-5p，hsa-miR-4800-5p，hsa-miR-483-5p，hsa-miR-486-3p，hsa-miR-494，hsa-miR-5195-3p，hsa-miR-574-3p，hsa-miR-590-5p，hsa-miR-642b-3p，hsa-miR-652-3p，hsa-miR-652-5p，hsa-miR-671-5p，hsa-miR-936；
向发生所述杂交反应后的混合物中加入多种单链降解酶，进行降解反应，使一种所述单链降解酶降解一种microRNA；
向发生所述降解反应后的混合物中加入荧光标记的链霉亲和素进行结合反应；其中，所述链霉亲和素发出的荧光波长与所述荧光编码微球发出的荧光波长不同；
清洗发生所述结合反应后的所述荧光编码微球；
识别清洗后的所述荧光编码微球的荧光编码，同时检测所述荧光编码微球上的链霉亲和素的荧光强度；
根据所述荧光编码微球的荧光编码确定其检测的microRNA的种类；
根据所述荧光编码微球上的链霉亲和素的荧光强度，确定该荧光编码微球上是否结合有相应类型的microRNA，从而确定所述待测样品中是否存在相应类型的microRNA。
本发明上述实施例的从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA的方法，可通过一次反应完成多种microRNA的检测，并且无需合成引物，因此省去了合成引物的步骤，使得检测多种microRNA省时又省力。
具体实施方式
下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。
本发明提供了microRNA的检测所用的荧光编码微球和核酸探针，如实施例一和实施例二。
实施例一
该实施例提供了一种荧光编码微球，该荧光编码微球固定有第一核酸片段，并且荧光编码微球的荧光编码与该荧光编码微球上的第一核酸片段的序列为一一对应的关系。
由于该实施例的荧光编码微球固定有第一核酸片段，因而通过核酸杂交该荧光编码微球可用来直接或间接结合microRNA，进而用于从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA。并且荧光编码微球的荧光编码与第一核酸片段的序列为一一对应的关系，因此，一种荧光编码微球可对应检测一种microRNA，即用荧光编码区分microRNA的种类。因此，该实施例的荧光编码微球既可以实现microRNA的高通量检测，又可以保证microRNA的特异性检测。
上述荧光编码微球可进行改进：优选地，荧光编码微球上固定有多个第一核酸片段，并且每一种荧光编码微球上的第一核酸片段的序列相同。这样可以使每个荧光编码微球上连接多个microRNA，充分利用荧光编码微球的空间，即利用较少的荧光编码微球检测更高浓度的样品，节省了荧光编码微球的消耗，降低检测成本。
实施例二
该实施例提供了一种核酸探针，该核酸探针为生物素与第二核酸片段的偶联物，并且第二核酸片段包括：与一种实施例一提供的荧光编码微球上的第一核酸片段互补的第一子片段，以及与一种microRNA互补的第二子片段；第二子片段与第一核酸片段的序列不同。
并且上述核酸探针上的第二子片段分别与以下中的一种microRNA互补：
hsa-let-7a-5p，hsa-let-7c，hsa-let-7d-5p，hsa-let-7f-5p，hsa-let-7g-5p，hsa-let-7i-5p，hsa-miR-1182，hsa-miR-1225-3p，hsa-miR-1225-5p，hsa-miR-1228-3p，hsa-miR-1234，hsa-miR-1238，hsa-miR-126-3p，hsa-miR-126-5p，hsa-miR-1260b，hsa-miR-1275，hsa-miR-128，hsa-miR-1280，hsa-miR-1304-3p，hsa-miR-142-3p，hsa-miR-146a-5p，hsa-miR-148a-3p，hsa-miR-148b-3p，hsa-miR-151a-3p，hsa-miR-151a-5p，hsa-miR-151b，hsa-miR-152，hsa-miR-15a-5p，hsa-miR-181a-5p，hsa-miR-1825，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-191-3p，hsa-miR-197-3p，hsa-miR-197-5p，hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-199a-5p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-211-3p，hsa-miR-221-3p，hsa-miR-223-3p，hsa-miR-2392，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-26b-5p，hsa-miR-27b-3p，hsa-miR-30b-5p，hsa-miR-3162-3p，hsa-miR-3180-5p，hsa-miR-3196，hsa-miR-326，hsa-miR-328，hsa-miR-331-3p，hsa-miR-335-5p，hsa-miR-340-5p，hsa-miR-3676-3p，hsa-miR-376a-3p，hsa-miR-376c，hsa-miR-377-3p，hsa-miR-382-5p，hsa-miR-425-3p，hsa-miR-4270，hsa-miR-4271，hsa-miR-4298，hsa-miR-4313，hsa-miR-4433-5p，hsa-miR-4442，hsa-miR-4463，hsa-miR-4484，hsa-miR-4499，hsa-miR-4532，hsa-miR-4655-3p，hsa-miR-4665-3p，hsa-miR-4669，hsa-miR-4695-5p，hsa-miR-4725-5p，hsa-miR-4734，hsa-miR-4749-3p，hsa-miR-4763-3p，hsa-miR-4767，hsa-miR-4778-5p，hsa-miR-4800-5p，hsa-miR-483-5p，hsa-miR-486-3p，hsa-miR-494，hsa-miR-5195-3p，hsa-miR-574-3p，hsa-miR-590-5p，hsa-miR-642b-3p，hsa-miR-652-3p，hsa-miR-652-5p，hsa-miR-671-5p，hsa-miR-936。
即每一种核酸探针与一种上述microRNA互补。
该实施例的核酸探针可用于从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA，其可以特异性结合实施例一的荧光编码微球，也可以特异性结合样品中的microRNA，从而在荧光编码微球与microRNA之间建立一一对应地关系，即通过该核酸探针使荧光编码微球与microRNA间接结合在一起，以便于高通量检测。同时该核酸探针上还标记了生物素，便于结合荧光标记的链霉亲和素，从而完成最终检测。
上述核酸探针可进行改进：优选地，生物素、第二子片段、第一子片段依次连接。这样的设计可以使荧光编码微球捕获核酸探针和microRNA后，核酸探针上的生物素远离荧光编码微球，从而避免后续的链霉亲和素与生物的结合反应受到荧光编码微球的位阻，降低反应效率。
实施例三
该实施例提供了一种从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA的方法，该方法利用了上述的荧光编码微球和核酸探针，其包括下列步骤：
第一步：向由多种实施例一提供的荧光编码微球组成的混合物中加入待测样品和多种实施例二提供的核酸探针，进行杂交反应。
第二步：向发生杂交反应后的混合物中加入多种单链降解酶，进行降解反应，使一种单链降解酶降解一种microRNA。
第三步：向发生降解反应后的混合物中加入荧光标记的链霉亲和素，进行结合反应；其中，链霉亲和素发出的荧光波长与荧光编码微球发出的荧光波长不同。
第四步：清洗发生结合反应后的荧光编码微球。
第五步：识别清洗后的荧光编码微球的荧光编码，同时检测荧光编码微球上的链霉亲和素的荧光强度。
第六步：根据荧光编码微球的荧光编码确定其检测的microRNA的种类。
第七步：根据荧光编码微球上的链霉亲和素的荧光强度，确定该荧光编码微球上是否存在其检测的类型的结合有相应类型的microRNA，从而确定待测样品中是否存在相应类型的microRNA。
上述microRNA的检测方法可通过一次反应完成多种microRNA的检测，并且无需合成引物，因此省去了合成引物的步骤，使得检测多种microRNA省时又省力，其具体检测过程如下：
以荧光编码微球为反应载体。
除样品外，检测过程中所需的反应物包括：荧光编码微球上的第一核酸片段、核酸探针、单链降解酶、荧光标记的链霉亲和素。
反应过程为：第一步中，核酸探针上的第二核酸片段的第一子片段与荧光编码微球上的第一核酸片段互补发生杂交反应，同时第二子片段与样品中的microRNA互补发生杂交反应，从而样品中的microRNA被结合固定在荧光编码微球上。第二步中，由于样品中有一部分microRNA与核酸探针的第二子片段仅有部分序列互补而被不完全匹配地固定在荧光编码微球上；同时还有过量的核酸探针只与第一核酸片段杂交而不与样品反应。因此，在这一步中加入单链降解酶，用来降解不完全匹配杂交在一起的核酸以及只与第一核酸片段杂交而不与样品反应的核酸探针上的第二子片段，是这些物质称为游离状态，从而使荧光编码微球上固定的核酸探针与microRNA以及该荧光编码微球上的第一核酸片段都是完全匹配的。第三步中，再加入荧光标记的链霉亲和素，通过链霉亲和素与核酸探针上的生物素之间的结合反应，使链霉亲和素标记的荧光物质被固定在荧光编码微球上，从而使荧光编码微球具有了报告microRNA含量的荧光物质。在第四步中，通过清洗去除反应液中游离的化学物质，从而避免这些化学物质对后续检测的干扰。第五步中，判定清洗后的荧光编码微球的荧光编码，同时检测荧光编码微球上的荧光标记的链霉亲和素的荧光强度。最后进行判定：根据荧光编码微球的荧光编码确定其检测的microRNA的种类；根据荧光编码微球上的链霉亲和素的荧光强度，确定该荧光编码微球上是否存在其检测的类型的结合有相应类型的microRNA，从而确定待测样品中是否存在相应类型的microRNA。
由上文可知，荧光微球的种类、核酸探针的种类、microRNA的种类是一一对应的关系，因而在最终的结果评判中，通过识别荧光编码微球的荧光编码可以确定该荧光编码微球上固定（捕获）的microRNA的种类，同时再根据该荧光编码微球上的链霉亲和素的荧光强度确定待测样品中是否存在microRNA。最终通过一次反应实现了多种microRNA的定性检测。
其中，可以毫无异议确定地是：当荧光编码微球上存在链霉亲和素发出的荧光时，表明待测样品中存在该微球相对应的microRNA；若荧光编码微球上不存在链霉亲和素发出的荧光时，表明待测样品中不存在该微球相对应的microRNA。
此外，由于荧光标记的链霉亲和素发出的荧光波长与荧光编码微球发出的荧光波长不同，因而可通过识别荧光波长识别荧光的来源（来自荧光编码微球的编码荧光或来自链霉亲和素上标记的荧光）。
此外，由于第二子片段与第一核酸片段的序列不同，因而避免了microRNA与第一核酸片段互补杂交使得microRNA不通过核酸探针直接被固定在荧光编码微球上，进而避免了无法进一步固定荧光标记的链霉亲和素以便检测的问题。
可见，上述实施例不仅实现了高通量检测的目的，同时避免了合成引物，因而省时省力。
上述检测方法实现了从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA的目的，该检测结果可以用作其它用途，例如用来确诊脑卒中或者其它用途。其中，确诊脑卒中的具体方法为：当通过上述方法检测出血液中含有以下92种microRNA中一种或多种时，则可以确定被检测者患有脑卒中。92种microRNA如下：
hsa-let-7a-5p，hsa-let-7c，hsa-let-7d-5p，hsa-let-7f-5p，hsa-let-7g-5p，hsa-let-7i-5p，hsa-miR-1182，hsa-miR-1225-3p，hsa-miR-1225-5p，hsa-miR-1228-3p，hsa-miR-1234，hsa-miR-1238，hsa-miR-126-3p，hsa-miR-126-5p，hsa-miR-1260b，hsa-miR-1275，hsa-miR-128，hsa-miR-1280，hsa-miR-1304-3p，hsa-miR-142-3p，hsa-miR-146a-5p，hsa-miR-148a-3p，hsa-miR-148b-3p，hsa-miR-151a-3p，hsa-miR-151a-5p，hsa-miR-151b，hsa-miR-152，hsa-miR-15a-5p，hsa-miR-181a-5p，hsa-miR-1825，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-191-3p，hsa-miR-197-3p，hsa-miR-197-5p，hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-199a-5p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-211-3p，hsa-miR-221-3p，hsa-miR-223-3p，hsa-miR-2392，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-26b-5p，hsa-miR-27b-3p，hsa-miR-30b-5p，hsa-miR-3162-3p，hsa-miR-3180-5p，hsa-miR-3196，hsa-miR-326，hsa-miR-328，hsa-miR-331-3p，hsa-miR-335-5p，hsa-miR-340-5p，hsa-miR-3676-3p，hsa-miR-376a-3p，hsa-miR-376c，hsa-miR-377-3p，hsa-miR-382-5p，hsa-miR-425-3p，hsa-miR-4270，hsa-miR-4271，hsa-miR-4298，hsa-miR-4313，hsa-miR-4433-5p，hsa-miR-4442，hsa-miR-4463，hsa-miR-4484，hsa-miR-4499，hsa-miR-4532，hsa-miR-4655-3p，hsa-miR-4665-3p，hsa-miR-4669，hsa-miR-4695-5p，hsa-miR-4725-5p，hsa-miR-4734，hsa-miR-4749-3p，hsa-miR-4763-3p，hsa-miR-4767，hsa-miR-4778-5p，hsa-miR-4800-5p，hsa-miR-483-5p，hsa-miR-486-3p，hsa-miR-494，hsa-miR-5195-3p，hsa-miR-574-3p，hsa-miR-590-5p，hsa-miR-642b-3p，hsa-miR-652-3p，hsa-miR-652-5p，hsa-miR-671-5p，hsa-miR-936。
此外，上述方法还可进一步改进，达到更多的有益效果，例如：
优选地，上述实施例一中第一步的杂交反应可采用逐步降温杂交方法，以提高第一核酸片段、核酸探针和microRNA三者之间反应的特异性。
优选地，核酸探针中，生物素、第二子片段、第一子片段依次连接。与上文中描述的核酸探针的改进相同，因而可以达到同样的技术效果。
优选地，荧光编码微球上固定有多个第一核酸片段，并且每一种荧光编码微球上的第一核酸片段的序列相同。与上文中描述的荧光编码微球的改进相同，因而可以达到同样的技术效果。
优选地，加入待测样品和多种核酸探针时，加入的核酸探针的种类与待测样品中待测microRNA的种类相同。这样既保证了待测种类的microRNA都有与之匹配的核酸探针，又可以避免加入过多种类核酸探针造成的材料浪费。
在上述优选的基础上，荧光编码微球的种类与加入的核酸探针的种类相同。同样，该步骤既可以保证所有核酸探针都有与之匹配的荧光编码微球，进而保证所有待测种类的microRNA都有与之匹配的荧光编码微球，又可以避免加入过多种类荧光编码微球造成的材料浪费。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA的方法，其特征在于，包括下列步骤：
向由多种荧光编码微球组成的混合物中加入待测样品和多种核酸探针，进行杂交反应；
其中，所述荧光编码微球固定有第一核酸片段，并且所述荧光编码微球的荧光编码与该荧光编码微球上的所述第一核酸片段的序列为一一对应的关系；
所述核酸探针为生物素与第二核酸片段的偶联物，并且所述第二核酸片段包括：与所述荧光编码微球上的所述第一核酸片段互补的第一子片段，以及与一种microRNA互补的第二子片段；所述第二子片段与所述第一核酸片段的序列不同；
所述第二子片段分别与以下中的一种microRNA互补：
hsa-let-7a-5p，hsa-let-7c，hsa-let-7d-5p，hsa-let-7f-5p，hsa-let-7g-5p，hsa-let-7i-5p，hsa-miR-1182，hsa-miR-1225-3p，hsa-miR-1225-5p，hsa-miR-1228-3p，hsa-miR-1234，hsa-miR-1238，hsa-miR-126-3p，hsa-miR-126-5p，hsa-miR-1260b，hsa-miR-1275，hsa-miR-128，hsa-miR-1280，hsa-miR-1304-3p，hsa-miR-142-3p，hsa-miR-146a-5p，hsa-miR-148a-3p，hsa-miR-148b-3p，hsa-miR-151a-3p，hsa-miR-151a-5p，hsa-miR-151b，hsa-miR-152，hsa-miR-15a-5p，hsa-miR-181a-5p，hsa-miR-1825，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-191-3p，hsa-miR-197-3p，hsa-miR-197-5p，hsa-miR-199a-3p，hsa-miR-199a-5p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-211-3p，hsa-miR-221-3p，hsa-miR-223-3p，hsa-miR-2392，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-26b-5p，hsa-miR-27b-3p，hsa-miR-30b-5p，hsa-miR-3162-3p，hsa-miR-3180-5p，hsa-miR-3196，hsa-miR-326，hsa-miR-328，hsa-miR-331-3p，hsa-miR-335-5p，hsa-miR-340-5p，hsa-miR-3676-3p，hsa-miR-376a-3p，hsa-miR-376c，hsa-miR-377-3p，hsa-miR-382-5p，hsa-miR-425-3p，hsa-miR-4270，hsa-miR-4271，hsa-miR-4298，hsa-miR-4313，hsa-miR-4433-5p，hsa-miR-4442，hsa-miR-4463，hsa-miR-4484，hsa-miR-4499，hsa-miR-4532，hsa-miR-4655-3p，hsa-miR-4665-3p，hsa-miR-4669，hsa-miR-4695-5p，hsa-miR-4725-5p，hsa-miR-4734，hsa-miR-4749-3p，hsa-miR-4763-3p，hsa-miR-4767，hsa-miR-4778-5p，hsa-miR-4800-5p，hsa-miR-483-5p，hsa-miR-486-3p，hsa-miR-494，hsa-miR-5195-3p，hsa-miR-574-3p，hsa-miR-590-5p，hsa-miR-642b-3p，hsa-miR-652-3p，hsa-miR-652-5p，hsa-miR-671-5p，hsa-miR-936；
向发生所述杂交反应后的混合物中加入多种单链降解酶，进行降解反应，使一种所述单链降解酶降解一种microRNA；
向发生所述降解反应后的混合物中加入荧光标记的链霉亲和素进行结合反应；其中，所述链霉亲和素发出的荧光波长与所述荧光编码微球发出的荧光波长不同；
清洗发生所述结合反应后的所述荧光编码微球；
识别清洗后的所述荧光编码微球的荧光编码，同时检测所述荧光编码微球上的链霉亲和素的荧光强度；
根据所述荧光编码微球的荧光编码确定其检测的microRNA的种类；
根据所述荧光编码微球上的链霉亲和素的荧光强度，确定该荧光编码微球上是否结合有相应类型的microRNA，从而确定所述待测样品中是否存在相应类型的microRNA。
2.根据权利要求1所述的从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA的方法，其特征在于，所述杂交反应的方法为：
逐步降温杂交。
3.根据权利要求1所述的从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA的方法，其特征在于，所述核酸探针中，所述生物素、所述第二子片段、所述第一子片段依次连接。
4.根据权利要求1所述的从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA的方法，其特征在于，所述荧光编码微球上固定有多个所述第一核酸片段，并且每一种所述荧光编码微球上的多个所述第一核酸片段的序列相同。
5.根据权利要求1所述的从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA的方法，其特征在于，加入待测样品和多种核酸探针时，加入的所述核酸探针的种类与所述待测样品中待测microRNA的种类相同。
6.根据权利要求5所述的从血液中检测用于诊断脑卒中的microRNA的方法，其特征在于，所述荧光编码微球的种类与加入的所述核酸探针的种类相同。
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