CN109206336A - 一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法。所述方法包括以下步骤：米糠经除杂、粉碎、过筛后，向米糠粉中加入灵芝菌发酵；将发酵液分离，取清液得到神经酰胺溶液，将所得神经酰胺溶液经浓缩结晶可得神经酰胺固体。本发明利用灵芝菌发酵米糠，不仅能显著提高米糠中神经酰胺的溶出，而且灵芝菌也会产生一定量的神经酰胺，本发明不需要任何衍生化过程，操作简单，提取方便、周期短、绿色环保，且不受地区气候限制，能显著降低经济成本。

Description

一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法。

背景技术

神经酰胺(Ceramide)即N-脂酰神经鞘胺醇，又名分子钉、赛洛美，是一种广泛存在于真核生物细胞中的信号传导物质，主要以细胞膜的结构组成成分或胞内自由分子形式存在。神经酰胺是近年来被重点关注的一种药品、食品和化妆品活性成分，据报道，神经酰胺的生物功能主要有以下几个方面：①细胞黏合；②调节细胞增殖和分化；③诱导细胞凋亡；③调节蛋白分泌；④炎症中的作用。在化妆品中应用可起到屏障作用而防止水分的丢失，且具有防护和修复皮肤、提高人体免疫力、防癌抗癌等功效。

米糠是稻谷脱壳后依附在糙米上的表面层，由碾白加工过程中产生的外果皮、中果皮、交朕层、种皮及糊粉层组成，米糠中集中了64％的稻米营养素以及90％以上的人体必需元素，其化学成分以糖类、脂肪和蛋白质为主，在国外被誉为“天赐营养源”。米糠中的神经酰胺含量较高，如在专利“含有从谷皮中提取的神经酰胺作为活性成分而具有抗特应性活性的组合物[(公开(公告)号：CN105311041A]”和“一种从米糠中提取高纯度神经酰胺的方法[(公开(公告)号：CN106008253B]”中，都提供了利用乙醇、石油醚等有机溶剂，经长时间加热、浸提的方式从米糠中制备神经酰胺的方法，但是由于植物细胞的细胞壁结构，使得壁内物质不易被分离提取出来，致使在提取过程中能量消耗大、有机溶剂用量大，且提取得率较低。而在“一种发酵法制备神经酰胺的工艺[(公开(公告)号：CN106119310A]”中，开始利用产紫青霉菌通过发酵来制备神经酰胺，虽然该发明简化了神经酰胺的制备工艺，但在制备过程中使用甲醇作为溶剂，残留的甲醇会对人体产生伤害，且该发明的生产周期较长。

为了更高效的获得神经酰胺，急需一种效率高、成本低、分离步骤简单、绿色环保的制备方法。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的提供一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法，以米糠为原料，利用灵芝菌发酵米糠，不仅能显著提高米糠中神经酰胺的溶出，而且灵芝菌也会产生一定量的神经酰胺，故不需要任何衍生化过程，操作简单，提取方便、周期短、绿色环保。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法，所述方法以米糠为原料，采用灵芝菌对米糠进行发酵以降解米糠的细胞壁；发酵后进行匀浆破壁获得破壁匀浆物，去除杂质后获得神经酰胺溶液。

进一步地，采用灵芝菌对米糠进行发酵时，需要控制发酵条件，以使灵芝菌进行深层发酵。

进一步地，为了使灵芝菌对米糠进行深层发酵，具体发酵条件为：将灵芝种子液与米糠原料粉按质量比(1～5):1的比例混合，放入发酵罐内，28±2℃条件下发酵2至5天，控制发酵罐内空间氧浓度为0.010～0.025mol/L，该发酵条件能够使灵芝菌在发酵罐内能良好的生长，产生丰富的菌丝，灵芝菌丝体的大量增殖，能够富集神经酰胺类化合物。

进一步地，所述灵芝种子液的制备方法包括：

菌种活化：用接种钩从斜面上切带培养基的灵芝菌丝接入固体培养基中部，28±2℃培养3至5天；

种子液制备：待灵芝菌丝长满固体培养基表面，用接种钩将带有灵芝菌的固体培养基捣碎，然后加入适量无菌水，获得灵芝种子液，其中，无菌水的用量为固体培养基体积的2-5倍。

进一步地，发酵后进行匀浆破壁的方法具体为：发酵结束后，将发酵物加入等重量的蒸馏水，混合均匀后，通过高压均质机，在常温、70-120Mpa的条件下，高压均质1-5次，至无明显灵芝菌丝，获得破壁匀浆物。

进一步地，所述去除杂质的方法为：用过滤或离心的方式去除破壁匀浆物中的杂质，收集过滤液或离心后上清液，得到神经酰胺溶液。

进一步地，采用灵芝菌对米糠进行发酵之前，需要对米糠进行处理，处理方法为：将米糠除杂，然后粉碎并过筛。

进一步地，所述灵芝菌为赤芝(G.lucidum)、紫芝(G.sinense)、松杉灵芝(G.tsugae Murr.)、中国灵芝(G.lingzhi)、白肉灵芝(G.leucocontextum)、中的一种。

进一步地，将制备获得的所述神经酰胺溶液和质量分数为95％的乙醇溶液按重量比1:5在常温下混合，搅拌均匀放置过夜，滤除沉淀后于0.001～0.01MPa，30-40℃条件下减压浓缩至溶液浑浊，常压下冷却结晶，得到神经酰胺固体，所述神经酰胺固体中，神经酰胺质量分数为0.1-1.0％。

进一步地，所述方法具体包括以下步骤：

原料处理：将米糠除杂，然后粉碎并过筛；

菌种活化：用接种钩从斜面上切0.5-1cm²带培养基的斜面灵芝菌菌丝接入固体培养基中部，28±2℃培养3至5天。

种子液制备：用接种钩将带有灵芝菌的固体培养基捣碎，然后加入适量无菌水，得到灵芝种子液。

发酵培养：将灵芝种子液与米糠原料粉按质量比(1～5):1的比例混合，放入发酵罐内，在灵芝菌最适生长(即28±2℃，发酵罐内空间氧浓度为0.010～0.025mol/L)条件下发酵2至5天；

匀浆破壁：发酵结束后，将发酵物加入等重量的蒸馏水，混合均匀后，通过高压均质机，常温，90Mpa，高压均质2次，获得破壁匀浆物；

去除杂质：用过滤或离心的方式去除破壁匀浆物的杂质，收集过滤液或离心后上清液，得到神经酰胺溶液。

其中，灵芝(Ganoderma)是担子菌纲、多孔菌科、灵芝属的一种重要的药、食两用真菌，是我国传统的名贵药材之一。灵芝在深层发酵过程中，菌丝体会大量的增殖，不仅会产生多糖、三萜等活性物，还会产生丰富的胞外酶系，如纤维素酶类、半纤维素酶、木质素酶、蛋白酶、淀粉酶类等，这些酶类在胞外可进行多种胞外生化反应，可有效降解细胞壁，促进壁内物质的溶出，同时灵芝菌丝体的大量增殖，也会富集神经酰胺类化合物。因此，应用灵芝发酵的法从米糠中制备神经酰胺，可以获得更高的神经酰胺得率。

本发明的有益技术效果：

本发明所述方法采用灵芝菌对米糠进行发酵，由于灵芝菌所产生的胞外酶系(包括纤维素酶、半纤维素、木质素酶、蛋白酶等)可有效降解米糠的细胞壁，从而显著提高了神经酰胺的溶出，同时灵芝菌会大量增殖，也能产生一定量的神经酰胺。

本发明所述方法操作简单、提取方便，全程不使用乙醇、石油醚、甲醇等有机溶剂，产品安全无污染，利用本发明生产神经酰胺，可大大降低生产成本和环境污染，推动神经酰胺的大规模工业化生产。并且本发明所述方法采用灵芝菌对米糠进行深层发酵，发酵时间为2至5天，发酵周期短。

将本发明所述方法制备获得的神经酰胺溶液进行减压浓缩，获得的神经酰胺固体中，神经酰胺质量分数为0.1-1.0％。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的灵芝为如下种类的菌株：赤芝(Ganoderma lucidum)、紫芝(G.sinense)、树舌灵芝(G.aplanatum)、白肉灵芝(G.leucocontextum)。各菌株均购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

针对现有技术中，采用甲醇、乙醇、石油醚等有机溶剂从米糠中制备神经酰胺，存在壁内物质不易被分离提取出来，提取过程能量消耗大、有机溶剂用量大，且提取得率较低的问题。本发明实施例提供过一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法。

实施例1

一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法，所述方法具体包括：

(1)原料处理：将米糠在80℃的烘箱内烘干后，去除杂质，然后粉碎并过20-40目筛；

(2)菌种活化：将赤芝(G.lucidum)用接种钩从斜面上切1cm²带培养基的斜面菌丝接入固体培养基中部，30℃培养5天；

(3)种子液制备：用接种钩将带有灵芝菌的固体培养基捣碎，然后加入适量无菌水，得到灵芝种子液；

(4)发酵培养：将灵芝种子液与米糠原料粉按质量比5:1的比例混合，放入发酵罐内，30℃条件下培养5天，控制发酵罐内空间氧浓度为0.025mol/L；

(5)匀浆破壁：发酵结束后，将发酵物加入等重量的蒸馏水，混合均匀后，通过高压均质机，常温，100Mpa，高压均质2次，获得破壁匀浆物；

(6)去除杂质：用过滤或离心的方式去除破壁匀浆物的杂质，收集过滤液或离心后上清液，得到神经酰胺溶液。

在本实施例中，将所得神经酰胺溶液经浓缩结晶可得神经酰胺固体，具体方法为：将制备获得的所述神经酰胺溶液和质量分数为95％的乙醇溶液按重量比1:5在常温下混合，搅拌均匀放置过夜，滤除沉淀后于0.001～0.01MPa，30-40℃条件下减压浓缩至溶液浑浊，常压下冷却结晶，得到神经酰胺固体，获得的神经酰胺固体中，神经酰胺质量分数为10％。

实施例2

一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法，所述方法具体包括：

(1)原料处理：将米糠在80℃的烘箱内烘干后，去除杂质，然后粉碎并过20-40目筛；

(2)菌种活化：将白肉灵芝(G.leucocontextum)用接种钩从斜面上切1cm²带培养基的斜面菌丝接入固体培养基中部，28℃培养5天；

(3)种子液制备：用接种钩将带有灵芝菌的固体培养基捣碎，然后加入适量无菌水，得到灵芝种子液；

(4)发酵培养：将灵芝种子液与米糠原料粉按质量比3:1的比例混合，放入发酵罐内，28℃条件下培养5天，控制发酵罐内空间氧浓度为0.02mol/L；

(5)匀浆破壁：发酵结束后，将发酵物加入等重量的蒸馏水，混合均匀后，通过高压均质机，常温，70Mpa，高压均质5次，获得破壁匀浆物；

(6)去除杂质：用过滤或离心的方式去除破壁匀浆物的杂质，收集过滤液或离心后上清液，得到神经酰胺溶液。

(7)神经酰胺溶液经减压浓缩后可获得总神经酰胺含量为0.5％的神经酰胺原液。

本发明所述方法利用灵芝菌发酵米糠，不仅能显著提高米糠中神经酰胺的溶出，而且灵芝菌也会产生一定量的神经酰胺，故不需要任何衍生化过程，操作简单，提取方便；发酵周期短、见效快，且不受地区气候限制；利用本发明工艺生产神经酰胺，能大幅减少有机溶剂的用量，减少环境影响，降低经济成本。

Claims (10)

1.一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法，其特征在于，所述方法以米糠为原料，采用灵芝菌对米糠进行发酵以降解米糠的细胞壁；发酵后进行匀浆破壁获得破壁匀浆物，去除杂质后获得神经酰胺溶液。

2.根据权利要求1所述一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法，其特征在于，采用灵芝菌对米糠进行发酵时，控制发酵条件以使灵芝菌进行深层发酵。

3.根据权利要求2所述一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法，其特征在于，为了使灵芝菌对米糠进行深层发酵，具体发酵条件为：将灵芝种子液与米糠原料粉按质量比(1～5):1的比例混合，放入发酵罐内，28±2℃条件下发酵2至5天，控制发酵罐内空间氧浓度为0.010～0.025mol/L。

4.根据权利要求3所述一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法，其特征在于，所述灵芝种子液的制备方法包括：

菌种活化：用接种钩从斜面上切带培养基的斜面灵芝菌丝接入固体培养基中部，28±2℃培养3至5天；

种子液制备：用接种钩将带有灵芝菌的固体培养基捣碎，然后加入适量无菌水，获得灵芝种子液，其中，无菌水的用量为固体培养基体积的2-5倍。

5.根据权利要求1所述一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法，其特征在于，发酵后进行匀浆破壁的方法具体为：发酵结束后，将发酵物加入等重量的蒸馏水，混合均匀后，通过高压均质机，在常温、70-120Mpa的条件下，高压均质1-5次，获得破壁匀浆物。

6.根据权利要求1所述一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法，其特征在于，所述去除杂质的方法为：用过滤或离心的方式去除破壁匀浆物中的杂质，收集过滤液或离心后上清液，得到神经酰胺溶液。

7.根据权利要求1所述一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法，其特征在于，采用灵芝菌对米糠进行发酵之前，需要对米糠进行处理，处理方法为：将米糠除杂，然后粉碎并过筛。

8.根据权利要求1-7任一项所述一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法，其特征在于，所述灵芝菌采用赤芝、紫芝、中国灵芝、白肉灵芝、松杉灵芝中的一种。

9.根据权利要求1任一项所述一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法，其特征在于，将制备获得的所述神经酰胺溶液和质量分数为95％的乙醇溶液按重量比1:5在常温下混合，搅拌均匀放置过夜，滤除沉淀后于0.001～0.01MPa，30-40℃条件下减压浓缩至溶液浑浊，常压下冷却结晶，得到神经酰胺固体，所述神经酰胺固体中，神经酰胺质量分数为0.1-1.0％。

10.根据权利要求1任一项所述一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

原料处理：将米糠除杂，然后粉碎并过筛；

菌种活化：用接种钩从斜面上切0.5-1cm²带培养基的斜面灵芝菌菌丝接入固体培养基中部，28±2℃培养3至5天。

种子液制备：用接种钩将带有灵芝菌的固体培养基捣碎，然后加入适量无菌水，得到灵芝种子液。

发酵培养：将灵芝种子液与米糠原料粉按质量比(1～5):1的比例混合，放入发酵罐内，28±2℃条件下2至5天，控制发酵罐内空间氧浓度为0.010～0.025mol/L；

匀浆破壁：发酵结束后，将发酵物加入等重量的蒸馏水，混合均匀后，通过高压均质机，常温，70-120Mpa，高压均质1-5次，获得破壁匀浆物；

去除杂质：用过滤或离心的方式去除破壁匀浆物的杂质，收集过滤液或离心后上清液，得到神经酰胺溶液。