CN109169638A - 一种细胞保存液及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞保存液及其用途。该保存液是在含有电解质和氨基酸的溶液中，添加羟乙基哌嗪乙磺酸、碳酸氢钠、葡萄糖、海藻糖、L抗坏血酸钠，并添加一种或多种抗氧化剂(MnTBAP、MnTMPyP、L‑还原型谷胱甘肽、N‑乙酰基‑L‑半胱氨酸)。该保存液的特点是不仅能够为细胞提供营养和代谢的能量，而且含有多种pH缓冲剂和自由基清除剂，可以在2‑8℃或常温下保持细胞活性和功能，不仅方便细胞保存和运输，而且克服了传统低温运输后细胞需要较长时间恢复功能的缺点。

Description

一种细胞保存液及其用途
技术领域
本发明涉及细胞保存和运输技术，具体涉及一种细胞保存液及其用途，属于生物学技术领域。
背景技术
随着近年来细胞治疗技术的快速发展，越来越多证据显示细胞治疗在多种疾病的治疗上具有重要应用前景。细胞治疗是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。
由于各种细胞治疗技术需要在体外对目的细胞进行适当处理，这些操作要求在GMP环境下完成，并且通常具有一定技术难度和需要一定时间，因此治疗用细胞的准备难以在医院内完成，通常由细胞制备实验室准备好后运送至医院使用。影响细胞治疗效果的除了细胞制备技术本身外，运输环节可能对细胞的活力和功能造成较大影响。特别是一些细胞治疗产品可能由一个细胞中心制备后供给多家研究机构或医院使用时，运输的距离和时间相对较长，运输环节对细胞质量的影响非常重要。
由于临床应用的细胞产品不能含有异种动物蛋白和人血清，因此理想的保存液中不应含有血清或牛血清白蛋白等。虽然有报道将细胞混悬在琼脂糖凝胶或基质胶中可以常温运输(Yang L，Li C，Ling C and Li Z.An Agarose-Gel Based Method forTransporting Cell Lines.Current Chemical Genomics，2009；3：50-53 pmid：20161836；Wang J，Chen P，Xu J，Zou JX，Wang H，Chen HW Transporting cells in semi-solid gelcondition and at ambient temperature.PLOS ONE 2015 June 22，10(6)：e0128229.pmid：26098554。)，但这些方法比较复杂，所用的成分是否适合临床应用尚不明确。目前临床上间充质干细胞的运输仍以低温(0-4℃)运输为主，保存液多采用生理盐水，但生理盐水成分单一，除提供生理条件的晶体渗透压外，根本无法保证胶体渗透压的维持、细胞能量代谢、局部环境酸碱平衡的维持等。开发和研制更好的运输保存液是非常必要的。
为保证在运输过程中尽量减少细胞损伤，通常将活细胞在0-4℃条件下进行运输，以减少细胞代谢活动，避免代谢产物堆积导致环境酸化和大量自由基对细胞造成损伤。但细胞从0-4℃恢复到37℃后，仍有一部分细胞受到损伤，并且细胞从低温环境恢复到正常功能状态需要数小时时间。这些对临床应用都是不利的。有研究显示，将细胞保存在生长培养基中24小时，放置于常温组(16℃和22℃)细胞活力和克隆形成能力明显高于低温组(1℃和5℃)(Wang J，Wei Y，Zhao S，Zhou Y，He W，Zhang Y，Deng W.The analysis of viabilityfor mammalian cells treated at different temperatures and its application incell shipment.PLoS One，2017，12(4)：e0176120)(28460350)，说明合适的常温条件保存对细胞功能影响较小，如果放置于合适的保存液中常温运输细胞可能优于0-4℃运输。该研究中保存液中细胞密度为1*105细胞/mL时效果最佳，但在许多情况下，为方便保存和运输大量细胞时，细胞密度较高，因此，需要开发效果更好的适合常温运输的保存液。
细胞的增殖和代谢活动明显受温度影响，在不超过37℃条件下，温度越高增殖和代谢越活跃，因此需要能量越多，产生代谢物也越多。同时代谢过程中产生自由基多对细胞本身会造成一定损伤。因此，常温保存液需要解决封闭环境中细胞代谢所需能量、代谢导致的pH值变化、自由基损伤等问题。
发明内容
为实现活细胞在非冷冻条件下，特别是常温下运输的目的，本发明的第一个目的是提供一种细胞保存液。该保存液是在含有电解质和氨基酸的溶液中，添加羟乙基哌嗪乙磺酸、碳酸氢钠、葡萄糖、海藻糖、L抗坏血酸钠，并添加一种或多种抗氧化剂(MnTBAP、MnTMPyP、L-还原型谷胱甘肽、N-乙酰基-L-半胱氨酸)。该保存液的特点是不仅能够为细胞提供营养和代谢的能量，而且含有多种pH缓冲剂和自由基清除剂，可以在2-8℃或常温下保持细胞活性和功能。
本方面提供的细胞保存液的特征在于含有电解质、氨基酸、5-20mM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、5.5-24.5mM葡萄糖、0.01-0.5M海藻糖、50-500mg/L L抗坏血酸钠、以及任选的细胞通透的抗氧化剂；
其中抗氧化剂可以是下列物质中的一种或多种：1-200μM MnTBAP、1-100μMMnTMPyP、0.5-50mM L-还原型谷胱甘肽、0.5-50mM N-乙酰基-L-半胱氨酸。
优选地，本发明所述的细胞保存液含有：10-15mM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、5.5-17.5mM葡萄糖、0.05-0.3M海藻糖、100-300mg/L L抗坏血酸钠、任选的一种或多种细胞通透的抗氧化剂：10-100μM MnTBAP、5-50μM MnTMPyP、2-10mM L-还原型谷胱甘肽、1-20mM N-乙酰基-L-半胱氨酸。
更优选地，本发明所述的细胞保存液含有：15mM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、17.5mM葡萄糖、0.1M海藻糖、200mg/L L抗坏血酸钠、任选的一种或多种细胞通透的抗氧化剂：50μM MnTBAP、10μM MnTMPyP、5mM L-还原型谷胱甘肽、10mM N-乙酰基-L-半胱氨酸。
本方面提供的细胞保存液中电解质成分包括：NaCl 6-8g/L、KCl 0.2-0.4g/L、Na2HPO40.06-0.08g/L、NaH2PO40.04-0.06g/L、MgCl2·6H2O 0.1-0.3g/L、MgSO40.04-0.06g/L、CaCl20.1-0.13g/L、CuSO4·5H2O 0.001-0.002mg/L、ZnSO4·7H2O 0.33-0.53mg/L、NaHCO31.2-2.8g/L。
优选地，所述细胞保存液中电解质成分包括：NaCl 7g/L、KCl 0.3g/L、Na2HPO40.07g/L、NaH2PO40.05g/L、MgCl2·6H2O 0.2g/L、MgSO40.05g/L、CaCl20.12g/L、CuSO4·5H2O 0.0013mg/L、ZnSO4·7H2O 0.43mg/L、NaHCO32g/L。
本方面提供的细胞保存液中氨基酸成分包括：L-丙氨酸0.1-0.3g/L、L-精氨酸0.4-0.6g/L、L-天冬酰胺0.2-0.3g/L、L-半胱氨酸0.1-0.14g/L、L-谷氨酰胺0.2-0.8g/L、甘氨酸0.1-0.3g/L、L-组氨酸0.2-0.3g/L、L-异亮氨酸0.1-0.15g/L、L-亮氨酸0.1-0.15g/L、L-蛋氨酸0.05-0.1g/L、L-苯丙氨酸0.1-0.15g/L、L-丝氨酸0.1-0.3g/L、L-苏氨酸0.2-0.4g/L、L-色氨酸0.01-0.03g/L、L-酪氨酸0.2-0.4g/L、L-缬氨酸0.05-0.15g/L。
优选地，所述细胞保存液中氨基酸成分包括：L-丙氨酸0.2g/L、L-精氨酸0.5g/L、L-天冬酰胺0.25g/L、L-半胱氨酸0.12g/L、L-谷氨酰胺0.3g/L、甘氨酸0.2g/L、L-组氨酸0.25g/L、L-异亮氨酸0.125g/L、L-亮氨酸0.125g/L、L-蛋氨酸0.075g/L、L-苯丙氨酸0.125g/L、L-丝氨酸0.2g/L、L-苏氨酸0.3g/L、L-色氨酸0.02g/L、L-酪氨酸0.3g/L、L-缬氨酸0.1g/L。
本发明的第二个目的是提供所述的细胞保存液的制备方法，其包括将上述电解质用去离子水溶解后加入上述各种氨基酸，混匀后添加HEPES、葡萄糖、海藻糖、L抗坏血酸钠和抗氧化剂，充分溶解后过0.22μm滤膜除菌。
本发明的第三个目的是提供一种保存细胞的方法，其包括：将制备好的细胞样品置于无菌容器中，将本发明的细胞保存液与所述细胞样本混合，其中所述细胞保存液中细胞密度不高于1×108个细胞/mL，然后将获得的混合物密闭保存，保存温度为常温或2-8℃。
采用本发明提供的细胞保存方法，可以保存细胞悬液、培养瓶中生长的贴壁细胞或微载体等其他培养载体上生长的细胞。
本发明的优点在于：
本发明提供的细胞保存液为细胞生存提供了基本的电解质、氨基酸和能量；
本发明提供的细胞保存液具有强大的酸碱缓冲能力，可以保证细胞保存期间相对稳定的pH值；
本发明提供的细胞保存液中含有抗氧化剂，可以及时清除和捕获细胞产生的自由基，避免保存期间细胞损伤；
本发明提供的细胞保存方法不仅可以在2-8℃保存细胞，而且可以常温保存细胞，使细胞运输方式更简单；
本发明提供的细胞保存方法可以在常温下保存细胞，保存期间细胞所处温度与其发挥功能的温度相似，运输后马上可以使用，不需要特别的细胞功能恢复时间和技术，因此，本发明的细胞保存液在细胞运输，特别是临床细胞治疗领域具有广泛应用前景。
下面结合具体实施方式进一步说明本发明，但是应当指出，实施例仅作为说明本发明的例子，不限制本发明的范围。
具体实施方式
本发明公开了一种细胞保存液及其制备方法和用途，本领域技术人员可以借鉴本发明内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所以类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明范围内。本发明的方法和应用通过实施例进行描述，相关人员可以在不脱离本发明内容情况下对本发明所述的细胞保存液及其制备方法和应用进行改动或变更组合，来实现和应用本发明的技术。
本发明所提供的细胞保存液及其制备方法和用途，其中所用试剂和仪器均可商业获得。实施例中所有试剂购自Sigma公司。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细描述。
实施例1细胞保存液的配制方法
在下述实施例中所使用的细胞保存液使用相同的配制方法，具体如下：
在900ml去离子水中分别加入电解质，磁力搅拌器上搅拌溶解，然后加入各种氨基酸，搅拌溶解后，加入HEPES、葡萄糖、海藻糖、L抗坏血酸钠和抗氧化剂，充分溶解后加水定容至1L，调节pH值至7.2-7.5。使用0.22μm滤膜的一次性杯状滤器(Thermo Scientific公司货号5954520)过滤除菌。
实施例2细胞保存液1
细胞保存液1，含有电解质、氨基酸、5mM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、5.5mM葡萄糖、0.01M海藻糖、50mg/L L抗坏血酸钠、以及50μM MnTBAP；
其中电解质成分为：NaCl 6g/L、KCl 0.2g/L、Na2HPO40.06g/L、NaH2PO40.04g/L、MgCl2·6H2O 0.1g/L、MgSO40.04g/L、CaCl20.1g/L、CuSO4·5H2O 0.001mg/L、ZnSO4·7H2O0.33mg/L、NaHCO31.2g/L。
其中氨基酸成分为：：L-丙氨酸0.1g/L、L-精氨酸0.4g/L、L-天冬酰胺0.2g/L、L-半胱氨酸0.1g/L、L-谷氨酰胺0.2g/L、甘氨酸0.1g/L、L-组氨酸0.2g/L、L-异亮氨酸0.1g/L、L-亮氨酸0.1g/L、L-蛋氨酸0.05g/L、L-苯丙氨酸0.1g/L、L-丝氨酸0.1g/L、L-苏氨酸0.2g/L、L-色氨酸0.01g/L、L-酪氨酸0.2g/L、L-缬氨酸0.05g/L。
实施例3细胞保存液2
细胞保存液2，含有电解质、氨基酸、20mM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、24.5mM葡萄糖、0.05M海藻糖、100mg/L L抗坏血酸钠、以及10μM MnTMPyP；
其中电解质成分为：NaCl 8g/L、KCl 0.4g/L、Na2HPO40.08g/L、NaH2PO40.06g/L、MgCl2·6H2O 0.3g/L、MgSO40.06g/L、CaCl20.13g/L、CuSO4·5H2O 0.002mg/L、ZnSO4·7H2O0.53mg/L、NaHCO32.8g/L。
其中氨基酸成分为：：L-丙氨酸0.3g/L、L-精氨酸0.6g/L、L-天冬酰胺0.3g/L、L-半胱氨酸0.14g/L、L-谷氨酰胺0.8g/L、甘氨酸0.3g/L、L-组氨酸0.3g/L、L-异亮氨酸0.15g/L、L-亮氨酸0.15g/L、L-蛋氨酸0.1g/L、L-苯丙氨酸0.15g/L、L-丝氨酸0.3g/L、L-苏氨酸0.4g/L、L-色氨酸0.03g/L、L-酪氨酸0.4g/L、L-缬氨酸0.15g/L。
实施例4细胞保存液3
细胞保存液3，含有电解质、氨基酸、10mM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、11.1mM葡萄糖、0.02M海藻糖、100mg/L L抗坏血酸钠、以及5mM L-还原型谷胱甘肽；
其中电解质成分为：NaCl 6.5g/L、KCl 0.25g/L、Na2HPO40.065g/L、NaH2PO40.045g/L、MgCl2·6H2O 0.15g/L、MgSO40.045g/L、CaCl20.11g/L、CuSO4·5H2O0.0015mg/L、ZnSO4·7H2O 0.4mg/L、NaHCO31.5g/L。
其中氨基酸成分为：：L-丙氨酸0.15g/L、L-精氨酸0.45g/L、L-天冬酰胺0.25g/L、L-半胱氨酸0.11g/L、L-谷氨酰胺0.4g/L、甘氨酸0.15g/L、L-组氨酸0.25g/L、L-异亮氨酸0.11g/L、L-亮氨酸0.11g/L、L-蛋氨酸0.075g/L、L-苯丙氨酸0.11g/L、L-丝氨酸0.15g/L、L-苏氨酸0.25g/L、L-色氨酸0.015g/L、L-酪氨酸0.25g/L、L-缬氨酸0.11g/L。
实施例5细胞保存液4
细胞保存液4，含有电解质、氨基酸、15mM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、17.5mM葡萄糖、0.03M海藻糖、300mg/L L抗坏血酸钠、以及20mM N-乙酰基-L-半胱氨酸；
其中电解质成分为：NaCl 7.5g/L、KCl 0.35g/L、Na2HPO40.07g/L、NaH2PO40.05g/L、MgCl2·6H2O 0.25g/L、MgSO40.055g/L、CaCl20.12g/L、CuSO4·5H2O 0.0015mg/L、ZnSO4·7H2O 0.5mg/L、NaHCO32.2g/L。
其中氨基酸成分为：：L-丙氨酸0.25g/L、L-精氨酸0.55g/L、L-天冬酰胺0.28g/L、L-半胱氨酸0.13g/L、L-谷氨酰胺0.75g/L、甘氨酸0.25g/L、L-组氨酸0.25g/L、L-异亮氨酸0.14g/L、L-亮氨酸0.14g/L、L-蛋氨酸0.085g/L、L-苯丙氨酸0.14g/L、L-丝氨酸0.25g/L、L-苏氨酸0.35g/L、L-色氨酸0.025g/L、L-酪氨酸0.35g/L、L-缬氨酸0.14g/L。
实施例6细胞保存液5
细胞保存液5，含有电解质、氨基酸、15mM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、17.5mM葡萄糖、0.01M海藻糖、200mg/L L抗坏血酸钠、以及50μM MnTBAP和5mM L-还原型谷胱甘肽；
其中电解质成分为：NaCl 7g/L、KCl 0.3g/L、Na2HPO40.07g/L、NaH2PO40.05g/L、MgCl2·6H2O 0.2g/L、MgSO40.06g/L、CaCl20.12g/L、CuSO4·5H2O 0.0013mg/L、ZnSO4·7H2O0.43mg/L、NaHCO32g/L。
其中氨基酸成分为：：L-丙氨酸0.2g/L、L-精氨酸0.5g/L、L-天冬酰胺0.25g/L、L-半胱氨酸0.12g/L、L-谷氨酰胺0.3g/L、甘氨酸0.2g/L、L-组氨酸0.2g/L、L-异亮氨酸0.125g/L、L-亮氨酸0.125g/L、L-蛋氨酸0.075g/L、L-苯丙氨酸0.125g/L、L-丝氨酸0.2g/L、L-苏氨酸0.3g/L、L-色氨酸0.02g/L、L-酪氨酸0.3g/L、L-缬氨酸0.1g/L。
实施例7细胞保存液6
细胞保存液6，含有电解质、氨基酸、15mM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、17.5mM葡萄糖、0.01M海藻糖、200mg/L L抗坏血酸钠、以及50μM MnTBAP和20mM N-乙酰基-L-半胱氨酸；
其中电解质成分为：NaCl 7g/L、KCl 0.3g/L、Na2HPO40.07g/L、NaH2PO40.05g/L、MgCl2·6H2O 0.2g/L、MgSO40.06g/L、CaCl20.12g/L、CuSO4·5H2O 0.0013mg/L、ZnSO4·7H2O0.43mg/L、NaHCO32g/L。
其中氨基酸成分为：：L-丙氨酸0.2g/L、L-精氨酸0.5g/L、L-天冬酰胺0.25g/L、L-半胱氨酸0.12g/L、L-谷氨酰胺0.3g/L、甘氨酸0.2g/L、L-组氨酸0.2g/L、L-异亮氨酸0.125g/L、L-亮氨酸0.125g/L、L-蛋氨酸0.075g/L、L-苯丙氨酸0.125g/L、L-丝氨酸0.2g/L、L-苏氨酸0.3g/L、L-色氨酸0.02g/L、L-酪氨酸0.3g/L、L-缬氨酸0.1g/L。
实施例8细胞保存液7
细胞保存液7，含有电解质、氨基酸、15mM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、17.5mM葡萄糖、0.01M海藻糖、200mg/L L抗坏血酸钠、以及10μM MnTMPyP和5mM L-还原型谷胱甘肽；
其中电解质成分为：NaCl 7g/L、KCl 0.3g/L、Na2HPO40.07g/L、NaH2PO40.05g/L、MgCl2·6H2O 0.2g/L、MgSO40.06g/L、CaCl20.12g/L、CuSO4·5H2O 0.0013mg/L、ZnSO4·7H2O0.43mg/L、NaHCO32g/L。
其中氨基酸成分为：：L-丙氨酸0.2g/L、L-精氨酸0.5g/L、L-天冬酰胺0.25g/L、L-半胱氨酸0.12g/L、L-谷氨酰胺0.3g/L、甘氨酸0.2g/L、L-组氨酸0.2g/L、L-异亮氨酸0.125g/L、L-亮氨酸0.125g/L、L-蛋氨酸0.075g/L、L-苯丙氨酸0.125g/L、L-丝氨酸0.2g/L、L-苏氨酸0.3g/L、L-色氨酸0.02g/L、L-酪氨酸0.3g/L、L-缬氨酸0.1g/L。
实施例9细胞保存液8
细胞保存液8，含有电解质、氨基酸、15mM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、17.5mM葡萄糖、0.01M海藻糖、200mg/L L抗坏血酸钠、以及10μM MnTMPyP和20mM N-乙酰基-L-半胱氨酸；
其中电解质成分为：NaCl 7g/L、KCl 0.3g/L、Na2HPO40.07g/L、NaH2PO40.05g/L、MgCl2·6H2O 0.2g/L、MgSO40.06g/L、CaCl20.12g/L、CuSO4·5H2O 0.0013mg/L、ZnSO4·7H2O0.43mg/L、NaHCO32g/L。
其中氨基酸成分为：：L-丙氨酸0.2g/L、L-精氨酸0.5g/L、L-天冬酰胺0.25g/L、L-半胱氨酸0.12g/L、L-谷氨酰胺0.3g/L、甘氨酸0.2g/L、L-组氨酸0.2g/L、L-异亮氨酸0.125g/L、L-亮氨酸0.125g/L、L-蛋氨酸0.075g/L、L-苯丙氨酸0.125g/L、L-丝氨酸0.2g/L、L-苏氨酸0.3g/L、L-色氨酸0.02g/L、L-酪氨酸0.3g/L、L-缬氨酸0.1g/L。
实施例10细胞保存液9
细胞保存液9，含有电解质、氨基酸、15mM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、17.5mM葡萄糖、0.01M海藻糖、200mg/L L抗坏血酸钠、以及50μM MnTBAP、5mM L-还原型谷胱甘肽和20mMN-乙酰基-L-半胱氨酸；
其中电解质成分为：NaCl 7g/L、KCl 0.3g/L、Na2HPO40.07g/L、NaH2PO40.05g/L、MgCl2·6H2O 0.2g/L、MgSO40.06g/L、CaCl20.12g/L、CuSO4·5H2O 0.0013mg/L、ZnSO4·7H2O0.43mg/L、NaHCO32g/L。
其中氨基酸成分为：：L-丙氨酸0.2g/L、L-精氨酸0.5g/L、L-天冬酰胺0.25g/L、L-半胱氨酸0.12g/L、L-谷氨酰胺0.3g/L、甘氨酸0.2g/L、L-组氨酸0.2g/L、L-异亮氨酸0.125g/L、L-亮氨酸0.125g/L、L-蛋氨酸0.075g/L、L-苯丙氨酸0.125g/L、L-丝氨酸0.2g/L、L-苏氨酸0.3g/L、L-色氨酸0.02g/L、L-酪氨酸0.3g/L、L-缬氨酸0.1g/L。
实施例11细胞保存液10
细胞保存液10，含有电解质、氨基酸、15mM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、17.5mM葡萄糖、0.01M海藻糖、200mg/L L抗坏血酸钠、以及10μM MnTMPyP、5mM L-还原型谷胱甘肽和20mM N-乙酰基-L-半胱氨酸；
其中电解质成分为：NaCl 7g/L、KCl 0.3g/L、Na2HPO40.07g/L、NaH2PO40.05g/L、MgCl2·6H2O 0.2g/L、MgSO40.06g/L、CaCl20.12g/L、CuSO4·5H2O 0.0013mg/L、ZnSO4·7H2O0.43mg/L、NaHCO32g/L。
其中氨基酸成分为：：L-丙氨酸0.2g/L、L-精氨酸0.5g/L、L-天冬酰胺0.25g/L、L-半胱氨酸0.12g/L、L-谷氨酰胺0.3g/L、甘氨酸0.2g/L、L-组氨酸0.2g/L、L-异亮氨酸0.125g/L、L-亮氨酸0.125g/L、L-蛋氨酸0.075g/L、L-苯丙氨酸0.125g/L、L-丝氨酸0.2g/L、L-苏氨酸0.3g/L、L-色氨酸0.02g/L、L-酪氨酸0.3g/L、L-缬氨酸0.1g/L。
实施例12细胞保存液保存细胞悬液的效果
利用上述实施例2-11的细胞保存液对消化收集的人肝细胞系IHH进行保存实验：用胰酶消化收集的IHH细胞，Hank’s也离心洗涤一次，细胞沉淀置于20个无菌冻存管中，每管1×107个细胞，将细胞磕散，加入上述实施例2-11的细胞保存液1ml/管，每种保存液2管，1管放于2-8℃，另一管放于室温，分别在24h、48h、72h在无菌环境取样50μl，台盼蓝染色测定细胞活率，结果如下表1所示，本发明提供的细胞保存液即可在2-8℃较好保存细胞活率，也可在常温条件下较好保存细胞活率，这将为便捷的细胞常温运输提供有益帮助。
表1：细胞保存液对单细胞悬液的保存效果比较
实施例13细胞保存液保存微载体细胞的效果
利用上述实施例2-11的细胞保存液对生长在微载体上的人肝细胞系IHH进行保存实验：将长满IHH的微载体200μl加入2ml的无菌冻存管中，共制备20管，尽量吸弃管中液体，每管中加入上述实施例2-11的细胞保存液1ml，每种保存液2管，1管放于2-8℃，另一管放于室温，分别在24h、48h、72h在无菌环境取样200μl，Hank’s液洗去悬浮细胞后，结晶紫计数微载体上细胞总数。结果如下表2所示，本发明提供的细胞保存液对微载体细胞在2-8℃和常温的保存效果均较好，这将为微载体细胞的运输和应用提供便利方案。
表2：细胞保存液对微载体细胞的保存效果比较 单位：万个
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种细胞保存液，其特征在于含有电解质、氨基酸、5-20mM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、5.5-24.5mM葡萄糖、0.01-0.5M海藻糖、50-500mg/L L抗坏血酸钠、以及任选的细胞通透的抗氧化剂；
其中抗氧化剂可以是下列物质中的一种或多种：1-200μM MnTBAP、1-100μM MnTMPyP、0.5-50mM L-还原型谷胱甘肽、0.5-50mM N-乙酰基-L-半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的细胞保存液，其中除电解质和氨基酸外，其他成分用量优选为：10-15mM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、5.5-17.5mM葡萄糖、0.05-0.3M海藻糖、100-300mg/L L抗坏血酸钠、任选的一种或多种细胞通透的抗氧化剂：10-100μM MnTBAP、5-50μMMnTMPyP、2-10mM L-还原型谷胱甘肽、1-20mM N-乙酰基-L-半胱氨酸。
3.根据权利要求1所述的细胞保存液，其中电解质成分包括：NaCl 6-8g/L、KCl 0.2-0.4g/L、Na2HPO40.06-0.08g/L、NaH2PO40.04-0.06g/L、MgCl2·6H2O 0.1-0.3g/L、MgSO40.04-0.06g/L、CaCl20.1-0.13g/L、CuSO4·5H2O 0.001-0.002mg/L、ZnSO4·7H2O0.33-0.53mg/L、NaHCO31.2-2.8g/L。
4.根据权利要求1所述的细胞保存液，其中氨基酸成分包括：L-丙氨酸0.1-0.3g/L、L-精氨酸0.4-0.6g/L、L-天冬酰胺0.2-0.3g/L、L-半胱氨酸0.1-0.14g/L、L-谷氨酰胺0.2-0.8g/L、甘氨酸0.1-0.3g/L、L-组氨酸0.2-0.3g/L、L-异亮氨酸0.1-0.15g/L、L-亮氨酸0.1-0.15g/L、L-蛋氨酸0.05-0.1g/L、L-苯丙氨酸0.1-0.15g/L、L-丝氨酸0.1-0.3g/L、L-苏氨酸0.2-0.4g/L、L-色氨酸0.01-0.03g/L、L-酪氨酸0.2-0.4g/L、L-缬氨酸0.05-0.15g/L。
5.权利要求1-4之一所述的细胞保存液的制备方法，其包括将电解质溶解后加入各种氨基酸，混匀后添加HEPES、葡萄糖、海藻糖、L抗坏血酸钠和抗氧化剂，充分溶解后过0.22μm滤膜除菌。
6.使用权利要求1-4所述的细胞保存液保存细胞的方法，其包括：将制备好的细胞样品置于无菌容器中，将权利要求1-4之一所述的细胞保存液与所述细胞样本混合，其中所述细胞保存液中细胞密度不高于1×108个细胞/mL，然后将获得的混合物密闭保存。
7.权利要求6所述的保存方法，其中保存温度为常温或2-8℃。
8.权利要求6所述的细胞保存方法，其特征在于所述的细胞样品为细胞悬液、细胞团或生长在培养瓶或微载体等培养载体上的细胞。
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