CN101491237A - 四氢嘧啶在冷冻保存细胞、组织、器官中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了四氢嘧啶的一种新用途，即四氢嘧啶在冷冻保存细胞、组织、器官中的应用，其有效浓度为0.1g/L－100g/L，优选浓度为0.5g/L－20g/L。使用时可单独使用，也可与一些常规的用于细胞、组织、器官冷冻保存的化学试剂联合使用。本申请的发明人通过试验证明：四氢嘧啶可以帮助细胞抵抗冷冻条件，提高细胞、组织、器官冻存的保护效果。与二甲基亚砜联合使用可以减少其用量降低其对细胞的毒性，提高冻存效果。

Description

四氢嘧啶在冷冻保存细胞、组织、器官中的应用

技术领域

本发明涉及四氢嘧啶在冷冻保存细胞、组织、器官中的应用。

背景技术

在生物实验及疾病治疗中经常需要对微生物及动物细胞、组织、器官进行冷冻保存，尤其是器官移植过程中，对器官的冻存有利于保证供体器官的质量。但低温冻存时细胞内和外环境中的水会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。目前常用的冻存保护剂为二甲基亚砜，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性，但二甲基亚砜在常温下对细胞有较强的毒性作用。与蛋白质疏水基团发生作用B导致蛋白质变性。因此，冻存过程中应尽可能地减少二甲基亚砜的用量来降低其对细胞的毒性。

器官移植是20世纪人类医学科学的重大进展，目前，全世界在肾脏、肝脏、心脏、胰腺和骨髓移植的领域的移植总数已超过70万例(次)，存活最长的器官移植受者已近半个世纪。器官移植是治疗终末期器官衰竭唯一有效的根治手段。任何临床器官移植首先要有高质量的供体，这是器官移植成功的先决条件和根本保障。

目前常用的器官保存液有UW液、IGL保存液、Celsior液、HTK液、SMO保存液、Collins液、HC-A液、WMO-1溶液、HCA-II保存液、LYPS液、STH-1、STH-2液、、Euro-Collins液。其主要原理是：减少由于低温保存导致的细胞水肿；防止细胞的酸化作用；防止灌洗液保存过程中细胞间隙的膨胀；防止再灌注过程中氧自由基的损伤；提供再生高能磷酸化合物的底物。因此多含有一定的非渗透性物质、自由基清除剂、细胞膜稳定剂及其他线粒体保护剂、提高器官供养的物质。

1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，俗称四氢嘧啶(Ectoine)，是1985年发现的一种新型氨基酸，是许多耐盐微生物为维持渗透压平衡而在细胞内产生的一种相容性溶质，具有高度水溶性。四氢嘧啶能够稳定天然蛋白质的水合层，保护酶、DNA等生物大分子和细胞膜结构，帮助细胞抵抗冷冻、干旱、高温、高盐、辐射等各种逆境，去目前开发的商业用途集中于化妆品，专利文献WO0219978公开了其在口腔护理中的应用，专利文献DE102004016129公开了其在皮肤护理及疾病预防中的应用。目前尚未发现四氢嘧啶用于细胞、组织、器官冻存保护的相关研究和报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了四氢嘧啶的一种新用途。

本发明实质上是四氢嘧啶在冷冻保存细胞、组织、器官中的应用。

四氢嘧啶的有效浓度为0.1g/L-100g/L，优选浓度为0.5g/L-20g/L。

四氢嘧啶在冷冻保存细胞、组织、器官时可以单独使用，也可以与一些常规的用于细胞、组织、器官冷冻保存的化学试剂联合使用。这些化学试剂包括以下几类：

1、二甲基亚砜、甘油、血清白蛋白：四氢嘧啶与其中的任一种或任几种的组合联合使用，可以提高细胞和组织的冻存的保护效果。

2、聚乙二醇、乳糖酸、木棉糖、羟乙基淀粉、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、还原型谷胱甘肽、培氟卡波、曲美他嗪、色氨酸、α-酮戊二酸及川芎嗪、硫酸镁、磷酸二氢钾：四氢嘧啶与其中的任一种或任几种的组合联合使用，可以提高器官冻存的保护效果。

所述细胞、组织、器官包括动物(包括人)细胞、组织、器官，也可以是微生物细胞。

本申请的发明人通过试验证明：四氢嘧啶可以帮助细胞抵抗冷冻条件，提高细胞、组织、器官冻存的保护效果。与二甲基亚砜联合使用可以减少其用量降低其对细胞的毒性，提高冻存效果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明：

实施例1：四氢嘧啶对猪肝细胞低温冻存的影响

健康1-7日龄中国实验型小型猪，采用改良Seglen体外二步胶原酶灌注法分离肝细胞，双层消毒纱布过滤，然后50g，3min离心3次，获取肝细胞，于Olympus倒置相差显微镜下用血细胞计数板计算肝细胞数量，4g/L台盼蓝拒染法计存活率，超过85％的用于实验。

细胞培养液为L-15培养液，加有10ml/L FBS、氢化可的松0.1μg/L、胰岛素100μg/L、青霉素100kU/L及链霉素100mg/L，对照组加入50mL/L DMSO，实验组加入50mL/L DMSO及100mL/L四氢嘧啶。

然后分装入冻存管，在室温下放置15min，置于4℃ 20min，以-1℃/min降至-20℃，保存30min，再以-1℃/min降至-80℃长期保存.30d与60d后取出冻存后的肝细胞，快速置于37℃水浴1-2min，然后缓慢稀释，共加入培养液约30mL，4℃，30g，离心3min，弃上清液，重新混悬于培养液中，计算细胞存活率(见表1)，并计算贴壁率。于Olympus倒置相差显微镜下观察肝细胞形态。

表1：冻存复苏后肝细胞存活率和贴壁率(％)

*与对照组相比P＜0.01

在倒置显微镜下观察对照组和复苏后接种培养的肝细胞生长情况发现，对照肝细胞形态较差，未见双核细胞，实验组组肝细胞生长旺盛，贴壁率高，细胞膜完整，胞质内颗粒丰富，可见较多双核细胞，核仁清楚。

实施例2：四氢嘧啶对人肝细胞低温冻存的影响

人肝细胞的分离按照文献方法进行(王宇明，陈国致，董家鸿，等.分离肝细胞的体外灌流法及其应用。中华实验外科杂志，1994，11(增刊)：45-46))。分离的细胞经台盼蓝染色、计数。将肝细胞调至浓度为1×10⁷-2×10⁷/ml分装入冻存管各0.7ml备用，对照组加入50mL/L DMSO，实验组加入50mL/L DMSO及150mL/L四氢嘧啶。先将冻存管在0℃下冻存30min，然后-30℃下冻存1h，再在-80℃下冻存4h最后移入液氮罐中，保存1个月后复苏。计算存活率和24h贴壁率(结果见表2)，后在倒置相差显微镜下观察培养肝细胞的生长情况及形态变化。收集的上清液用全自动生化分析仪检测其白蛋白含量(结果见表4)，复苏后的人肝细胞培养3d后去上清液用PBS缓冲液冲洗，然后加入含4mmol/ml氯化铵、无血清的DMEM培养液，于加氯化铵后2、6、12、24h分别留取标本，在生化分析仪上检测上清液中尿素含量(结果见表3)。

表2：复苏后肝细胞的存活率和24h贴壁率(％)

表3：复苏后肝细胞尿素的合成(mmol/l)

表4：复苏后肝细胞培养上清液白蛋白含量(g/l)

*与对照组相比P＜0.01

复苏后倒置相差显微镜下形态学变化，实验组肝细胞完整性恢复快，肝细胞生长旺盛，细胞膜完整，胞浆内有丰富颗粒，核仁清楚。

实施例3：四氢嘧啶对大鼠卵巢自体移植的影响

选用未交配过的雌性SD大鼠，经***涂片查脱落细胞证实有规律的动情周期。随机分为2组，每组各10只，对照组为DMSO冻存后卵巢自体移植组，切除双侧卵巢后冰冻保存1周，然后再行自体皮下移植；实验组为四氢嘧啶冻存后卵巢自体移植组，切除双侧卵巢后冰冻保存1周，然后再行自体皮下移植。

于术后第2天起每天行***涂片，观察***脱落细胞的变化。出现动情周期变化者，根据脱落细胞的类型进行分期；未出现动情周期者，光镜下计数角化细胞所占的比例，＞50％者视为有***作用；4个月后处死动物，观察移植物的大小、血运及周围血管网形成情况。

对照组无一只出现有规律的动情周期变化，但8只角化细胞比例超过50％，2只是持续无角化状态。实验组6只有规律的动情周期变化，3只光镜下每视野的角化细胞比例超过50％，上述9只大鼠认为有***作用。另外对照组有1只大鼠出现卵巢萎缩，表面灰白色，血管网较少，实验组移植物明显增大，周围血管网丰富，表面呈粉红色。

Claims (10)

1.四氢嘧啶在冷冻保存细胞、组织、器官中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：四氢嘧啶的有效浓度为0.1g/L-100g/L。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：四氢嘧啶在冷冻保存细胞、组织、器官时单独使用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：四氢嘧啶在冷冻保存细胞、组织、器官时与二甲基亚砜、甘油、血清白蛋白中的一种或任几种联合使用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：四氢嘧啶在冷冻保存细胞、组织、器官时与聚乙二醇、乳糖酸、木棉糖、羟乙基淀粉中的一种或任几种联合使用。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：四氢嘧啶在冷冻保存细胞、组织、器官时与磷酸盐缓冲液或/和组氨酸缓冲液联合使用。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：四氢嘧啶在冷冻保存细胞、组织、器官时与还原性谷胱甘肽联合使用。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：四氢嘧啶在冷冻保存细胞、组织、器官时与培氟卡波联合使用。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：四氢嘧啶在冷冻保存细胞、组织、器官时与曲美他嗪、色氨酸和α-酮戊二酸及川芎嗪中的一种或任几种联合使用。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：四氢嘧啶在冷冻保存细胞、组织、器官时与硫酸镁或/和磷酸二氢钾联合使用。