CN104450614B - 一种无动物蛋白源的免疫细胞无血清培养基及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及体外培养免疫细胞领域，具体涉及一种无动物蛋白源的免疫细胞无血清培养基及其培养方法，所述培养基为液体培养基，每升培养基中包括如下组分，氨基酸为1400‑1500mg，维生素为70‑75mg，盐类为9800‑10000mg，有机质为9500‑9700mg，蛋白质为76‑80mg。本发明配制的培养基很好地满足了免疫细胞生长所需的特定条件，更加适合免疫细胞的生长，明显提高了细胞增殖效率及生物学效力。所述培养基克服了现有技术中的培养基中添加的人或动物血清及组分受限供体的相异性导致质量每批间存在差异的缺陷，质量易于控制，且不会因血清质量问题遭到污染，杀瘤率效果好，成本低。

Description

一种无动物蛋白源的免疫细胞无血清培养基及其使用方法

技术领域

本发明涉及体外培养免疫细胞领域，具体涉及一种无动物蛋白源的免疫细胞无血清培养基及其使用方法。

背景技术

肿瘤的过继性细胞免疫治疗(Adoptive cellular immunotherapy，ACI或AIT)是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞(特异性的和相对特异性的)直接杀伤肿瘤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，达到***的目的。该细胞免疫治疗是肿瘤康复医学一种新兴的、具有显著疗效的全新的抗肿瘤治疗方法，被称为二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有发展前途的一种治疗手段。

有效地细胞免疫治疗就离不开在体外大量培养、扩增和活化免疫细胞。适宜免疫细胞生长的培养基为细胞提供了适宜的基础环境如营养物质、渗透压、PH值等，并且细胞将代谢的产物排放至培养基中。市面现有培养基并非针对免疫细胞培养所需条件进行配制，导致细胞增殖效率及生物学效力不佳，而且很多培养基添加了人或动物血清及组分来补充完全。但人血清昂贵，不适宜大规模扩增，且由于供体的相异性，导致血清质量每批间存在差异，尤其是被肝炎病毒或HIV污染的危险。添加有人血白蛋白、人转铁蛋白、人胰岛素等人源性组分的无血清培养基，虽经过病源检测及消毒，但仍避免不了由于供体的不同每批间存在差异，不利于质量的控制。动物血清如胎牛血清、新生牛血清等来自牛材料的血清组分，虽然有足够的量供应，价格便宜，但存在传播传染病的风险，如支原体、病毒(如BSE病源因子)污染的危险。

发明内容

本发明的目的是提供一种无动物蛋白源的免疫细胞无血清培养基，该培养基特别针对免疫细胞的培养，满足免疫细胞生长所需的特定条件，更加适合免疫细胞的生长，提高细胞增殖效率及生物学效力，且不会因血清质量问题遭到污染，质量可控性强，成本低。

本发明的另一个目的是提供上述无动物蛋白源的免疫细胞无血清培养基的培养方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种无动物蛋白源的免疫细胞无血清培养基，其特征在于：该培养基为液体培养基，每升培养基中包括如下组分，

氨基酸为1400-1500mg，维生素为70-75mg，盐类为9800-10000mg，有机质为9500-9700mg，蛋白质为76-80mg。优选的，所述氨基酸为1453mg，维生素为72.31mg，盐类为9841.1524mg，有机质为9610.64mg，蛋白质为78.5mg。

所述氨基酸为甘氨酸、L-精氨酸、L-门冬酰胺、L-天冬氨酸、L-盐酸胱氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-羟脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐二水合物、L-缬氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸二肽的组合物。

所述氨基酸中的各组分的浓度为甘氨酸17-19mg/L、L-精氨酸185-195mg/L、L-门冬酰胺40-45mg/L、L-天冬氨酸15-20mg/L、L-盐酸胱氨酸55-60mg/L、L-谷氨酸10-15mg/L、L-组氨酸20-30mg/L、L-羟脯氨酸10-15mg/L、L-异亮氨酸120-130mg/L、L-亮氨酸75-85mg/L、L-盐酸赖氨酸95-105mg/L、L-蛋氨酸20-25mg/L、L-苯丙氨酸30-35mg/L、L-脯氨酸20-30mg/L、L-丝氨酸40-50mg/L、L-苏氨酸25-35mg/L、L-色氨酸10-20mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物40-45mg/L、L-缬氨酸40-45mg/L、谷氨酰胺和丙氨酸二肽480-520mg/L。优选的，所述氨基酸中的各组分的浓度为甘氨酸18mg/L、L-精氨酸190mg/L、L-门冬酰胺45mg/L、L-天冬氨酸20mg/L、L-盐酸胱氨酸60mg/L、L-谷氨酸15mg/L、L-组氨酸25mg/L、L-羟脯氨酸15mg/L、L-异亮氨酸130mg/L、L-亮氨酸80mg/L、L-盐酸赖氨酸100mg/L、L-蛋氨酸25mg/L、L-苯丙氨酸35mg/L、L-脯氨酸25mg/L、L-丝氨酸45mg/L、L-苏氨酸30mg/L、L-色氨酸15mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物40mg/L、L-缬氨酸40mg/L、谷氨酰胺和丙氨酸二肽500mg/L。

所述维生素为维生素H、氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、维生素B12和肌醇的组合物；所述维生素中的各组分的浓度分别为维生素H0.2-0.4mg/L、氯化胆碱0.8-1.2mg/L、泛酸钙2.5-3.5mg/L、叶酸4-6mg/L、烟酰胺8-12mg/L、对氨基苯甲酸0.4-0.6mg/L、盐酸吡哆醇1.1-1.3mg/L、盐酸硫胺素1.1-1.3mg/L、维生素B120.01mg/L、肌醇48-52mg/L。优选的，所述维生素中的各组分的浓度分别为维生素H0.4mg/L、氯化胆碱1mg/L、泛酸钙3mg/L、叶酸5mg/L、烟酰胺10mg/L、对氨基苯甲酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇1.2mg/L、盐酸硫胺素1.2mg/L、维生素B120.01mg/L、肌醇50mg/L。

所述有机质为葡萄糖、谷胱甘肽、羟乙基哌嗪乙硫磺酸、酚红、丙酮酸钠、次黄嘌呤、亚油酸、盐酸丁二胺、硫辛酸、胸苷和吐温80的组合物；所述有机质中的各组分的浓度为葡萄糖3500mg/L、谷胱甘肽1-4mg/L、羟乙基哌嗪乙硫磺酸6000mg/L、酚红5-7mg/L、丙酮酸钠100mg/L、次黄嘌呤1-3mg/L、亚油酸0.04mg/L、盐酸丁二胺0.1-0.2mg/L、硫辛酸0.1-0.2mg/L、胸苷0.4-0.6mg/L、吐温80为0-2mg/L。优选的，所述有机质中的各组分的浓度为葡萄糖3500mg/L、谷胱甘肽2mg/L、羟乙基哌嗪乙硫磺酸6000mg/L、酚红6mg/L、丙酮酸钠100mg/L、次黄嘌呤2mg/L、亚油酸0.04mg/L、盐酸丁二胺0.1mg/L、硫辛酸0.1mg/L、胸苷0.4mg/L、吐温80为0-2mg/L。为增加有机质的溶解度，可加入助溶剂吐温80。

所述蛋白质为重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白、重组人胰岛素、重组人生长激素的组合物。所述蛋白质中的组合物浓度为重组人血白蛋白2-4mg/L、重组人转铁蛋白50-70mg/L、重组人胰岛素12-16mg/L重组人生长激素0.3-0.6mg/L。优选的，所述蛋白质中的组合物浓度为重组人血白蛋白3mg/L、重组人转铁蛋白60mg/L、重组人胰岛素15mg/L重组人生长激素0.5mg/L。

所述盐类为硝酸钙四水合物、硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、***钠五水合物、硫酸铜五水合物、硫酸亚铁七水合物、氯化镍、氯化亚锡二水合物、硫酸锌七水合物的组合物。所述硫酸镁和磷酸氢二钠均为无结晶水。

所述盐类中的各组分的浓度为硝酸钙四水合物70-85mg/L、硫酸镁58-62mg/L、氯化钾450-500mg/L、碳酸氢钠2450-2550mg/L、氯化钠6000mg/L、磷酸氢二钠700mg/L、***钠五水合物0.13-0.16mg/L、硫酸铜五水合物0.002-0.003mg/L、硫酸亚铁七水合物0.3-0.6mg/L、氯化镍0.0001-0.0002mg/L、氯化亚锡二水合物0.0001-0.0002mg/L、硫酸锌七水合物0.3-0.5mg/L。优选的，盐类中的各组分的浓度为硝酸钙四水合物80mg/L、硫酸镁60mg/L、氯化钾500mg/L、碳酸氢钠2500mg/L、氯化钠6000mg/L、磷酸氢二钠700mg/L、***钠五水合物0.15mg/L、硫酸铜五水合物0.002mg/L、硫酸亚铁七水合物0.5mg/L、氯化镍0.0002mg/L、氯化亚锡二水合物0.0002mg/L、硫酸锌七水合物0.5mg/L。

所述培养基的PH值为6.8-7.2，优选的培养基的PH值为7.0。可以用0.1mol/L盐酸和0.1mol/L氢氧化钠调节PH值。所述培养基通过0.22um滤膜过滤两次除菌。

所述培养基的保藏温度为3-5℃，优选的为4℃。所述培养基需要避光保藏。

上述无动物蛋白源的免疫细胞无血清培养基的使用方法，其步骤包括：将需要培养的免疫细胞用生理盐水离心，去除上清液；计数细胞，用无动物蛋白源的免疫细胞无血清培养基，将细胞配制成浓度为1×10⁶个/mL的细胞悬液；按每孔2mL培养基细胞悬液加入6孔板中,加入1000IU/mL的INF-r干扰素，37℃培养24小时；加入50ng/mL CD3单抗和500IU/mL的IL-2；每隔48小时补加无动物蛋白源的免疫细胞无血清培养基和500IU/mL的IL-2，计数至1×10⁶个/mL细胞浓度，共培养14天，观察细胞形态。

本发明制备的免疫细胞无血清培养基尤为适合淋巴细胞和NK细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明配制的培养基是特别针对免疫细胞培养的，满足免疫细胞生长所需的特定条件，更加适合免疫细胞的生长，明显提高了细胞增殖效率及生物学效力。

(2)本发明配制的培养基克服了现有技术中的培养基中添加的人或动物血清及组分受限供体的相异性导致质量每批间存在差异的缺陷，而且不会因血清质量问题遭到污染。

(3)本发明配制的培养基的质量可控，杀瘤率效果好，成本低。

附图说明

图1为四组样品的细胞增值率对比图。

图2为四组样品的细胞存活率对比图。

图3为四组样品的细胞的表型比较图。

图4为四组样品的细胞的杀瘤率比较图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

实施例1

将三蒸水作为溶剂，并溶解有氨基酸、维生素、盐类、有机质和蛋白质，配制成培养基，为增加有机质的溶解度可加入助溶剂吐温80，用0.1mol/L盐酸和0.1mol/L氢氧化钠调节PH值，使培养基的PH值为6.8-7.2。培养基经0.22um滤膜过滤两次除菌，4摄氏度冰箱避光保存即可。

以1L配制好的培养基为准，其组分中含有以下浓度的组分：

氨基酸成分：甘氨酸浓度为18mg/L、L-精氨酸浓度为190mg/L、L-门冬酰胺45mg/L、L-天冬氨酸20mg/L、L-盐酸胱氨酸60mg/L、L-谷氨酸15mg/L、L-组氨酸25mg/L、L-羟脯氨酸15mg/L、L-异亮氨酸130mg/L、L-亮氨酸80mg/L、L-盐酸赖氨酸100mg/L、L-蛋氨酸25mg/L、L-苯丙氨酸35mg/L、L-脯氨酸25mg/L、L-丝氨酸45mg/L、L-苏氨酸30mg/L、L-色氨酸15mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物40mg/L、L-缬氨酸40mg/L、谷氨酰胺&丙氨酸二肽500mg/L，共计1453mg/L。

维生素成分：维生素H 0.4mg/L、氯化胆碱1mg/L、泛酸钙3mg/L、叶酸5mg/L、烟酰胺10mg/L、对氨基苯甲酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇1.2mg/L、盐酸硫胺素1.2mg/L、维生素B120.01mg/L、肌醇50mg/L，共计72.31mg/L

盐类成分：硝酸钙四水合物80mg/L、硫酸镁无水60mg/L、氯化钾500mg/L、碳酸氢钠2500mg/L、氯化钠6000mg/L、磷酸氢二钠无水700mg/L、***钠五水合物0.15mg/L、硫酸铜五水合物0.002mg/L、硫酸亚铁七水合物0.5mg/L、氯化镍0.0002mg/L、氯化亚锡二水合物0.0002mg/L、硫酸锌七水合物0.5mg/L，共计9841.1524mg/L。

有机质成分：葡萄糖3500mg/L、谷胱甘肽2mg/L、羟乙基哌嗪乙硫磺酸6000mg/L、酚红6mg/L、丙酮酸钠100mg/L、次黄嘌呤2mg/L、亚油酸0.04mg/L、盐酸丁二胺0.1mg/L、硫辛酸0.1mg/L、胸苷0.4mg/L，共计9610.64mg/L。

蛋白质成分：重组人血白蛋白3mg/L、重组人转铁蛋白60mg/L、重组人胰岛素15mg/L重组人生长激素0.5mg/L，共计78.5mg/L。

助溶剂吐温80为2mg/L。

实施例2

将实施例1中配制的培养基进行质量测试

1)无菌检测

使用平板法检测，取羊血琼脂平板1块和沙保弱琼脂平板1块，平衡至室温。取实施例1中配制的培养基为样品经4000rpm离心15min后从样品管底部吸取样品，每块平板100μl，用接种针划线。将平板放入37℃培养箱中，培养48h后观察结果为阴性，样品合格。

2)内毒素检测

使用凝胶法检测，取实施例1中配制的培养基为样品经稀释后，同阴性对照、阳性对照、供试品阳性对照分别加入经无菌检查用水复融后的鲎试剂中，每种平行两管。结果为阴性对照管为阴性，阳性对照管为阳性，供试品阳性对照管为阳性且样品管为阴性，样品合格。

3)支原体检测为PCR法检测

将实施例1中配制的培养基为样品进行沸水浴10min后经12000rpm离心3min后使用，采用25μL体系对待测样品、阳性对照、阴性对照进行PCR扩增；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪上观察检测结果。检测结果为阴性，样品合格。

实施例3

使用淋巴细胞分离液密度梯度离心分离外周血单个核细胞，或者复苏冻存的单个核细胞。生理盐水500g离心5分钟，去除上清液。计数细胞，用实施例1中配制的培养基配成浓度为1×10⁶个/mL细胞悬液。按每孔2mL培养基细胞悬液加入6孔板中，每组3个平行孔。第一天加入1000IU/mL的INF-r，放于二氧化碳培养箱中培养，24小时后加入50ng/mL CD3单抗和500IU/mL IL-2。以后每隔48小时，补加所述培养基和500IU/mL IL-2，计数至1×10⁶个/mL细胞浓度。共培养18天观察细胞形态。培养结果为：细胞形状为多边形，形态饱满，生长良好。

实施例4

采用实施例3中的细胞培养方法，将免疫细胞的培养基更换成PRMI1640+10％FBS，标记为A，PRMI 1640+人源性白蛋白、转铁蛋白、胰岛素和生长激素，标记为B，采用本专利的培养基，标记为C，将本专利培养基的组分中的蛋白质更换成人源性白蛋白、转铁蛋白、胰岛素和生长激素，标记为D。第15天时，台盼蓝染色计算细胞增值倍数和活率，结果分别如图1和图2所示。从图中可看出，采用本发明配制的培养基培养出的免疫细胞增值率和存活率都高于采用其他几组。

实施例5

取培养第15天时免疫细胞悬液为样品，2000rpm，离心10min。弃上清，加入适量生理盐水，混匀。取适量EP管，做好标记，将离心后混匀的细胞悬液分装至1.5mL EP管中，每管0.5mL。每管中加入待测表型对应的同型和抗体5ul，旋涡混合器振荡30S，避光孵育30min。取出孵育好的试管，2000rpm离心10min。弃上清，再次加入500ul生理盐水，混合均匀后，上机检测，结果见图3所示，从图中可看出，采用本发明的培养基培养出的免疫细胞的表型检测结果明显高于其他几组，本发明的培养基对免疫细胞的培养具有特异性。

实施例6

实施例4中分离培养至15天的免疫细胞为效应细胞，用实施例1中配制的的培养基洗涤1次，配制成1×10⁶个/mL细胞悬液。以K562细胞为靶细胞，用实施例1中配制的培养基洗涤1次，配制成密度为1×10⁵个/mL悬液。按效、靶细胞比10:1接种到96孔板中，37摄氏度、5％二氧化碳培养24小时。使用CCK-8试剂盒测吸光度值，计算杀瘤率。

杀瘤率％＝1-(试验孔-效应细胞孔)/(靶细胞孔-空白孔)，结果见图4所示，从图中看出，采用本发明的培养基培养出的免疫细胞的杀瘤率明显高于其他几组。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (2)

1.一种无动物蛋白源的免疫细胞无血清培养基，其特征在于：该培养基为液体培养基，每升培养基中含有氨基酸、维生素、盐类、有机质和蛋白质；

所述氨基酸中的各组分的浓度为甘氨酸18mg/L、L-精氨酸190mg/L、L-门冬酰胺45mg/L、L-天冬氨酸20mg/L、L-盐酸胱氨酸60mg/L、L-谷氨酸15mg/L、L-组氨酸25mg/L、L-羟脯氨酸15mg/L、L-异亮氨酸130mg/L、L-亮氨酸80mg/L、L-盐酸赖氨酸100mg/L、L-蛋氨酸25mg/L、L-苯丙氨酸35mg/L、L-脯氨酸25mg/L、L-丝氨酸45mg/L、L-苏氨酸30mg/L、L-色氨酸15mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物40mg/L、L-缬氨酸40mg/L、谷氨酰胺-丙氨酸二肽500mg/L；

所述维生素中的各组分的浓度分别为维生素H 0.4mg/L、氯化胆碱1mg/L、泛酸钙3mg/L、叶酸5mg/L、烟酰胺10mg/L、对氨基苯甲酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇1.2mg/L、盐酸硫胺素1.2mg/L、维生素B12 0.01mg/L、肌醇50mg/L；

所述有机质中的各组分的浓度为葡萄糖3500mg/L、谷胱甘肽2mg/L、羟乙基哌嗪乙硫磺酸6000mg/L、酚红6mg/L、丙酮酸钠100mg/L、次黄嘌呤2mg/L、亚油酸0.04mg/L、盐酸丁二胺0.1mg/L、硫辛酸0.1mg/L、胸苷0.4mg/L；

所述盐类中的各组分的浓度为硝酸钙四水合物80mg/L、硫酸镁60mg/L、氯化钾500mg/L、碳酸氢钠2500mg/L、氯化钠6000mg/L、磷酸氢二钠700mg/L、***钠五水合物0.15mg/L、硫酸铜五水合物0.002mg/L、硫酸亚铁七水合物0.5mg/L、氯化镍0.0002mg/L、氯化亚锡二水合物0.0002mg/L、硫酸锌七水合物0.5mg/L；

助溶剂吐温80为2mg/L；

所述蛋白质中的各组分的浓度为重组人血白蛋白3mg/L、重组人转铁蛋白60mg/L、重组人胰岛素15mg/L、重组人生长激素0.5mg/L。

2.根据权利要求1所述的无动物蛋白源的免疫细胞无血清培养基，其特征在于：所述培养基的PH值为6.8-7.2，保藏温度为3-5℃。