CN1635923A - 增强一氧化氮吸入剂的疗效 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种减少、部分防止或完全防止哺乳动物与吸入一氧化氮(NO)有关的缺氧的肺血管收缩的损伤的方法。该方法包括通过吸入给该哺乳动物使用有效治疗量的一氧化氮，并同时给予有效量的抗活泼氧类物质(抗ROS剂)，例如N－乙酰半胱氨酸，或白三烯阻滞剂。还公开了一种减少、部分防止或完全防止哺乳动物作为一氧化氮吸入的响应的肺血管舒张响应的损失的方法。该方法包括通过吸入给哺乳动物使用有效治疗量的一氧化氮，并同时给予有效量的抗ROS剂和治疗有效量的白三烯阻滞剂。

Description

增强一氧化氮吸入剂的疗效
技术领域
本发明涉及肺生理学和心脏病学。
背景技术
一氧化氮(NO)是由机体的许多细胞产生的一种高活性的自由基化合物。它可以通过与细胞质鸟苷酸环化酶的血红素部分结合，激活鸟苷酸环化酶并增加细胞内的环鸟嘌呤核苷3′，5′-单磷酸酯(cGMP)水平而松弛血管平滑肌，导致血管舒张。
当被吸入时，NO气体作为人和动物肺部脉管的选择性血管舒张药。因此，NO吸入剂被用来促进在肺的空气通透性良好的区域的血管舒张。在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中，肺部组织空气通透的减少降低了动脉血的氧合作用。一氧化氮吸入剂常常可以改善ARDS病人的氧合作用。这实际上是通过扩张肺部空气通透性良好部分的血管，向空气通透性良好的区域重新分配血流并从接受很少的NO的空气通透性差的区域带走血流来实现的。但是，对于30-40％的ARDS病人而言，NO吸入剂不能改善动脉的氧合作用(Bigatello等人，1994，Anesthesiology 80：761-770；Dellinger等人，1998，Crit.Care Med.26：1523)。很难预知患有ARDS的病人不会对NO吸入剂产生反应或仅产生短暂的反应。但是，已知高至60％的患有与败血症有关的ARDS的病人不会对吸入的NO产生反应(Krafft等人，1996，Chest 109：486-493)。
正常的肺部脉管***对肺泡缺氧的反应是收缩。在患有肺损伤如ARDS的病人中，缺氧性肺血管收缩(HPV)通过将血流带离空气通透性差(缺氧)的肺部区域或将血流带向空气通透性良好的(含氧量正常的)肺部区域的血流重新分配而升高了全身动脉氧合作用的水平。败血症和内毒素血症损害了HPV，使得动脉氧浓度极大的降低(Hutchinson等人，1985，J.Appl.Physio.，58：1463-1468)。这种全身氧合作用水平的降低可能对生命构成威胁。期望一氧化氮吸入剂在败血症期间能通过增加肺部空气通透性良好的区域的血流量而改善氧合作用或动脉血。但是，实际上，在败血症期间，NO吸入剂常常无效，并且有时甚至因为NO吸入剂与HPV的损伤有关而是有害的。参见例如Gerlach等人，1996，“在急性肺损伤中吸入低水平的一氧化氮”，第271-283页，Nitric Oxide and the Lung，(Zapol和Bloch编辑)，Marcel Dekker Inc，纽约。
内源性NO是由氧化氮合酶在存在氧的情况下通过将L-精氨酸转换成L-瓜氨酸而产生的(Knowles等人，1994，Biochemistry 298：249-258)。已经对氧化氮合酶(NOS)的不同形式的特性进行了描述。神经元的NOS(NOS1)和内皮的NOS(NOS3)都是组成酶。一种可诱导的被称为NOS2的能够产生大量NO的NOS能可被内毒素(也被称为脂多糖或LPS)和细胞素所诱导产生(Knowles等人，同上)。尽管已经证明了NO吸入剂对于各种适应症的治疗有价值，但是被损伤的肺部血管对NO吸入剂的反应延迟并且NO与HPV损伤有关的事实在急性呼吸疾病中仍然是重要的问题。
概述
本发明人发现对于在败血症期间的HPV损伤而言，增加肺部NO水平是必须的，并且这种HPV损伤可以通过活性氧类清除剂或白三烯阻滞剂来得到改善。因此，本发明开发了一种保留NO吸入剂的血管舒张作用以改善有肺部损伤的病人的动脉血氧合作用，而同时又改善了NO吸入剂的HPV损伤作用的方法。本发明已经发现HPV的损伤不仅仅是由于NO-介导的血管舒张。本发明人还发现在用内毒素激发的小鼠中，肺部NO水平的升高和其它的脂多糖诱导剂对于损伤NO吸入剂的肺血管舒张响应是必须的。
一方面，本发明的特征是一种减少、部分防止或完全防止哺乳动物的与NO吸入剂有关的HPV损伤的方法。在一个实施方案中，该方法包括给哺乳动物使用治疗有效量的NO吸入剂，并同时给予有效量的抗-活性氧类(抗-ROS)物质。该抗-ROS剂可以是例如N-乙酰半胱氨酸、别嘌呤醇、抗坏血酸(维生素C)、胆红素、咖啡酸、过氧化氢酶、PEG-过氧化氢酶、血浆铜蓝蛋白、二异丙基水杨酸铜、甲磺酸去铁胺、二甲基脲、依布硒(2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3(2H)-酮；Pz51)、EUK-8、FeTMTPyP(5，10，15，20-四(N-甲基-4′-吡啶基)卟吩合铁(III)氯化物)、FETPPS(5，10，15，20-四(4-磺化苯基)卟啉合铁(III)氯化物)、糖皮质激素、谷胱甘肽、MnTBAP(四(4-苯甲酸)卟啉合Mn(III)氯化物)、MnTMPyP(四(1-甲基-4-吡啶基)卟啉合Mn(III)五氯化物)、硒代蛋氨酸、过氧化物歧化酶(SOD)、聚乙二醇-共轭的-SOD(PEG-SOD)、黄衫素(双氢槲皮苷；3，3′，4′，5，7-五羟基黄酮)，和维生素E。N-乙酰半胱氨酸是优选的抗-ROS剂。在可供替代的一个实施方案中，该方法包括通过吸入给予治疗有效量的NO，并且同时给予有效量的白三烯阻滞剂。在其它的实施方案中，可将两种或多种抗-ROS剂、或抗-ROS剂和白三烯阻滞剂与NO吸入剂共同给药。
在另一方面，本发明的特征是用于减少、部分防止或完全防止哺乳动物对NO吸入剂有响应的肺血管舒张的损失。在一个实施方案中，该方法包括通过吸入的形式给哺乳动物使用治疗有效量的NO，并同时给予有效量的抗-ROS剂。在可供替代的一个实施方案中，该方法包括通过吸入使用使用治疗有效量的NO，并且同时给予有效量的白三烯阻滞剂。在其它的实施方案中，可以将两种或多种抗-ROS剂、或抗-ROS剂和白三烯阻滞剂与NO吸入剂共同给药。
除非另有定义，这里所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属的熟练技术人员公知的含义相同的含义。在二者产生冲突的情况中，将由本说明书所包括的定义来决定。这里所提及的所有的出版物、专利、以及其它文件都被引入作为参考。
虽然与这里所描述的方法和材料相似或同等的方法和材料都可用于本发明的实践和试验，但优选的是下面所描述的方法和材料。该材料、方法和实施例都是仅用于说明本发明，而不是要对本发明进行限制。本发明的其它特征和优点将从对本发明的详细说明和权利要求书中表现出来。
附图说明
图1是在从未进行处理的野生型小鼠获得的分离-灌注的肺中进行肺动脉压(PAP；等于灌注压)和左心房压力(LAP)测定的实验的示踪图。注入稳定的血栓素A2类似物U46619，以便于PAP增加5或6mmHg。分别将各种剂量(0.4、4.0、和40ppm)的NO气体给药5分钟。在每次给药后，使PAP恢复到给予NO前的水平。
图2A是用脂多糖进行预处理(实心圆)和未进行处理(空心圆)的野生型小鼠对于NO吸入剂的剂量-响应曲线。与未用脂多糖进行处理的野生型小鼠相比，用脂多糖进行了预处理的野生型小鼠对NO吸入剂的响应受到了损害(*P＜0.001)。数据用平均值±SE表示。ΔPAP＝肺动脉压的改变，以其U46619诱导增加的百分比表示。
图2B是用脂多糖进行预处理(实心正方形)和未进行处理(空心正方形)的NOS2缺失小鼠的NO吸入剂的剂量-响应曲线。与未进行处理的NOS2缺失小鼠(+P＜0.05)和用脂多糖进行预处理的野生型小鼠(P＜0.001)相比，用脂多糖进行了处理的NOS2缺失小鼠对NO吸入剂的响应更大。数据用平均值±SE表示。ΔPAP＝以其U46619诱导增加的百分比的方式表示的肺动脉压的改变。
图3是在从用脂多糖进行预处理(野生型/LPS)和未处理(野生型/对照)野生型小鼠上获得的分离-灌注的肺中通过短期NO吸入剂而产生的血管舒张的汇总数据图，并且在环境空气中，将用脂多糖预处理(ko/LPS)和未处理(ko/对照)的NOS2缺失小鼠获得的分离灌注肺预先在20ppm的NO中暴露16小时。在进行长期NO暴露后，用脂多糖预处理的NOS2缺失小鼠对短期NO吸入剂的响应比未接受脂多糖的NOS2缺失小鼠对短期NO吸入剂的响应低(*P＜0.05)。类似地，在进行长期NO暴露后，用脂多糖预处理的野生型小鼠对短期NO吸入剂的响应比未接受脂多糖的野生型小鼠对短期NO吸入剂的响应低(*P＜0.05)。数据用均值±SE表示。
图4是由在从NOS2缺失小鼠所获得的分离-灌注的肺内进行的，在脂多糖激发后，吸入0、0.2、2.0和20ppm的NO 16小时，对随后的对0.4ppm的NO气短期吸入剂的血管舒张响应的作用的实验所获得的汇总数据的矩形图。暴露于2和20ppm的NO气体时增加了肺血管舒张对NO的响应。数据用均值±SE表示。对0ppm的NO暴露16小时，*P＜0.05；**P＜0.001。
图5是从用脂多糖激活的小鼠(实心圆)和对照小鼠(空心圆)的血管舒张对NO吸入剂的响应的实验中所获得的汇总数据的图，在用脂多糖进行处理的同时，将用脂多糖激活的小鼠用N-乙酰半胱氨酸(150mg/kg，腹膜内给药)进行处理，并且3.5小时之后重复进行(实心三角形)。与对照小鼠相比，用脂多糖进行处理的小鼠对NO吸入剂的响应减少(*P＜0.001)。N-乙酰半胱氨酸(150mg/kg)的两次给药可以完全保护糖类诱导的对于NO吸入剂的血管反应性的减少。血管舒张％是用U46619-诱导的增加的百分比表示的肺动脉压变化。数据用均值±SE表示。
图6是从同时用腹膜内注射N-乙酰半胱氨酸或生理盐水进行处理的用脂多糖(LPS)激发的小鼠对NO吸入剂的肺血管舒张响应的实验获得的汇总数据的图，并且该小鼠吸入室内空气或室内空气加上20ppm的NO气体16小时。在长期吸入NO期间，N-乙酰基-半胱氨酸150mg/kg对于用脂多糖激发的小鼠对NO的肺血管舒张药的响应的保护作用受到了保护。(对两组中的LPS+生理盐水*P＜0.05)。
图7是从用内毒素进行激发3小时后，用生理盐水(对照，空心柱；n＝7)、内毒素(内毒素，实心柱；n＝6)、或内毒素与5mg/kg L-NIL(内毒素与L-NIL(选择性NOS2抑制剂)，有斑纹的柱；n＝5)腹膜内给药进行处理的野生型小鼠(+/+)和NOS2缺失小鼠(-/-)，在左主干支气管阻塞(LMBO)后5分钟左肺血流量的变化分数(QLPA/QPA)实验所得的汇总数据的矩形图。(内毒素对对照，*P＜0.05；野生型对NOS2缺失，P＜0.01；内毒素+L-NIL对只用内毒素，#P＜0.01)。测量是在吸入空气或含40ppm NO的空气22小时的过程停止后1小时进行的(NO对无NO，§P＜0.05)。在LMBO后，内毒素激发造成野生类型小鼠的肺血流重新分配显著减少，但是在NOS2缺失小鼠中却并不显著。在长时间吸入40ppm的NO后，在停止吸入NO后1小时对用内毒素进行处理的NOS2缺失小鼠进行测定，表明HPV的损伤与用内毒素处理的野生型小鼠相同。在停止吸入NO后1小时进行测定，吸入22小时40ppm NO的用生理盐水进行处理的NOS2缺失小鼠和野生型小鼠在LMBO后仍然保留着重新分布肺血流的能力。
图8是从测定对作为LMBO的响应的左肺血管阻力的增加的改变，ΔiLPV，的实验-缺氧性肺血管收缩(HPV)的测定实验所获得的汇总结果的矩形图。用内毒素激发的野生型小鼠的HPV受到了损伤(ETX；与生理盐水激发的小鼠比较，#P＜0.05)。用500mg/kg N-乙酰半胱氨酸(NAC；与内毒素同时腹膜内给药)进行处理的用内毒素激发的小鼠的HPV得到了保护(与用内毒素激发的小鼠比进行比较，P＜0.05)，但是用150mg/kg N-乙酰半胱氨酸(NAC；与内毒素同时腹膜内给药)处理的小鼠的HPV没有得到保护(与用生理盐水激发的小鼠进行比较，*P＜0.05)。用EUK-8，一种过氧化物、过氧化氢和过硝酸盐清除剂进行处理的用内毒素激发的小鼠的HPV被完全保护(与未用内毒素激发的小鼠进行比较，P＜0.05)。
图9A-9C表示的是在带有和不带有短暂的左肺动脉(LPA)堵塞的LMBO之前和LMBO期间进行的肺和全身血液动力学测定示踪图。描述了在LMBO之前(a)和期间(b和c)由作用于中枢血流动力学的LBMO所诱导的单侧肺泡缺氧作用。在LBMO 1分钟后出现全部肺泡萎缩。连续记录用生理盐水进行处理的野生型小鼠在基值和LMBO后的右肺动脉(QRPA)平均流量、平均肺动脉压(PPA)，、平均全身动脉压(PSA)、和平均导气管压力(PALV)。为了评价右和左肺动脉之间的血流分布，将左侧肺动脉短暂堵塞，在该点QRPA＝QPA(见a和c)。QPA-QRPA的差等于QLPA。测定是在基准和LMBO后5分钟进行的。箭头表示左侧肺动脉的阻塞(90秒)和释放。
图10A是表示通过用静脉注射荧光微球(直径15μm)和通过用超声流量探针同时测定QRPA而评估的左或右肺血流量百分比的相关性图。其中的数值被表示为在LMBO之前或之后右侧或左侧肺的流量分数(用生理盐水进行处理的野生型小鼠；n＝4)。注意两种方法之间非常一致(r2＝0.967)。
图10B是表示用生理盐水处理的野生型小鼠(n＝6)在LMBO前(基准)和LMBO 5分钟后左肺流量-压力关系实验结果的图。左肺动脉流量(QLPA)是用超声流量探针进行测定的，斜率是由于下静脉腔短暂堵塞造成QPA减少而产生的(斜率与基准不同，P＜0.05)。
图10C是说明用生理盐水进行处理的野生型小鼠(n＝3)在萎缩的左肺重新膨胀期间总的左肺肺脉管阻力(TLPVR)变化的图。该值表现为具有95％置信区间的所有数据点都线性相关。
图11是表示用在内毒素进行处理的野生型小鼠(粗线)和用内毒素进行处理的NOS2缺失小鼠(细线)中由LMBO诱导的局部缺氧对氧气的全身动脉部分氧压力(PaO2)的影响的图。在研究开始前22小时，通过腹膜内注射10mg/kg的大肠杆菌内毒素来进行内毒素的给药。用位于主动脉弓上的Clark型氧电极连续记录PaO2。数据是分别用野生型小鼠(n＝5)和NOS2缺失小鼠(n＝3)所进行的各实验的均值。
图12是由血液动力学测定所获得的数据表。在血液动力学实验前22小时，用生理盐水(对照组)或内毒素(内毒素组)对野生型小鼠(NOS2+/+)和NOS2缺失小鼠(NOS2-/-)进行激活，并且进行或不进行22小时含40ppm的NO的空气的吸入(同样在NO吸入停止后1小时进行测定)，在LMBO前(基准)和左肺缺氧(LMBO)后5分钟进行血液动力学测定。HR＝心率(min-1)，PSA＝全身动脉压(mmHg)，PPA＝平均肺动脉压(mmHg)，QPA＝在左肺动脉阻塞期间通过右肺动脉流量(μl×min-1×g-1bw)，QRPA＝通过右肺动脉流量(μl×min-1×g-1bw)，QLPA＝通过左肺动脉流量(μl×min-1×g-1bw)，QLPA/QPA＝左肺动脉流量与在短暂的左肺动脉阻塞期间右肺动脉流量的比率。通过ANOVA将各组间在LMBO前的所有基准值进行比较。对各组结合其后的特定比较用ANOVA分析LMBO对各参数的影响(与基准比，AP＜0.05，BP＜0.01，CP＜0.001)。
图13是从用生理盐水进行激发的野生型小鼠(n＝7)、用生理盐水进行激发的5-LO-缺失小鼠(n＝7)、用内毒素进行激发的野生型小鼠(n＝8)、用内毒素进行激发的5LO-缺失小鼠(n＝9)、用5-LO-活化蛋白抑制剂MK886进行处理的内毒素激发的野生型小鼠(n＝8)，和用cysLT1-受体拮抗剂-MK571进行处理的内毒素激发的野生型小鼠(n＝7)所进行的LMBO诱导左肺肺脉管阻力(左PVR)增加实验所获得的汇总数据的矩形图。与用生理盐水进行激发野生型小鼠比，*P＜0.01；与用内毒素激活的野生型小鼠比，#P＜0.01。
详细说明
NO吸入剂
通过吸入的方法安全有效的给予NO的方法在现有技术中是已知的。参见例如Zapol，美国专利5,570,683；Zapol等人，美国专利4,938；Frostell等人，1991，Circulation，83：2038-2047。用于吸入的NO在商业上是可以获得的(INOmaxTM，INO Therapeutics，Inc.，Clinton，NJ)。在本发明中，NO吸入优选地与已有的医学实践相吻合。
通过吸入给药的NO的适宜起始剂量是20ppm。参见例如，INOmaxTM包装说明书( www.inotherapeutics.com)。但是，该剂量可以根据病人的年龄和状况、所治疗的疾病或病症、以及其它一些主治医生认为相关的因素而进行调整，例如可从0.1ppm至100ppm。优选地吸入最低有效剂量。为了获得经验上的最低有效剂量，可以从20ppm的剂量开始给药，然后逐渐降低给药剂量，直至血管舒张作用消失。在认为20ppm的剂量不能用作有效吸入剂量的情况中，可逐渐增加NO的剂量直至出现血管舒张作用。这种剂量调整是本领域技术人员所惯用的。本发明的一个优点是在许多情况中能用比NO单独给药时所需剂量更低的剂量来获得所希望获得的结果。此外，本发明的方法还可使在不会对吸入的NO发生响应的情况中，例如败血症的肺损伤中对吸入的NO产生响应，或即使在急性肺损伤的过程中也可以保留响应。
抗-ROS剂
活泼氧类(ROS)包括过氧化物自由基(O2·)、过氧化氢(H2O2)、以及羟基自由基(OH·)。这里所说的“抗-ROS剂”指的是如下的化合物：(1)抑制活泼氧类产生的化合物；或(2)清除活泼氧类的化合物，即一旦产生活泼氧类就与其迅速反应的化合物。在本发明中所用的各种抗-ROS剂都是已知的。抗-ROS剂的实例包括：N-乙酰半胱氨酸(MucosilTM)、别嘌呤醇、抗坏血酸(维生素C)、胆红素、咖啡酸、过氧化氢酶、PEG-过氧化氢酶、儿茶素、血浆铜蓝蛋白、二异丙基水杨酸铜、甲磺酸去铁胺、二甲基脲、依布硒、EUK-8、FeTMTPyP、FETPPS、糖皮质激素、谷胱甘肽、MnTBAP、MnTMPyP、硒代蛋氨酸、过氧化物歧化酶、PEG-过氧化物歧化酶、黄衫素和维生素E。在本发明的一些实施方案中，可以联合使用两种或多种抗-ROS剂。优选的抗-ROS剂是N-乙酰半胱氨酸(MUCOSILTM，Dey，Napa，CA)，它是一种在商业上可获得的，用于气雾剂，例如用常用的喷雾器的适用于吸入的无菌溶液(10％或20％)。
一些抗-ROS剂还可清除由NO与过氧化物反应而产生的有毒的活泼氮类-过硝酸盐。清除活泼氮类可以减少、部分防止或完全防止与NO吸入剂有关的HPV损伤，和由于NO吸入剂而产生的肺血管舒张的减少。
抗-ROS剂的给药剂量和途径取决于所使用的特定制剂。各种抗-ROS剂安全有效的给药剂量和给药途径在现有技术中是已知的，参见例如Physician′s Desk Reference(PDR)，临床药理学2000，Gold StandardMultimedia(http：//cp.gsm.com/fromcpo.asp)，或销售商的包装说明书。
一种优选的抗-ROS剂是N-乙酰半胱氨酸，可以买到如MUCOMYSTTM、MUCOSIL-10TM、和MUCOSIL-20TM的商品。对于N-乙酰半胱氨酸而言，适宜的给药途径包括口服、直肠给药、雾化气雾剂、和静脉给药。超声或常规的雾化器可用于N-乙酰半胱氨酸给药。(由于N-乙酰基-半胱氨酸会与某些金属例如铁、铜和橡胶发生反应，所用与N-乙酰半胱氨酸接触的雾化装置的任何部件都应当由塑料或玻璃制成)。示范性的N-乙酰半胱氨酸(MUCOSILTM)给药方案非限制性的包括如下的方案：
20-小时IV方案：15分钟内用150mg/kg IV(用200ml的D5W稀释)，随后4小时内用50mg/kg IV(用500ml的D5W稀释)，然后在16小时内用100mg/kg IV(用1000ml的D5W稀释)。
48-小时IV方案：1小时内用140mg/kg IV(按1∶5的比例用D5W稀释)，接着在给予初始负荷剂量后4小时给予12次给药中的第一个剂量70mg/kg IV(按1∶5用D5W稀释)，每4小时给药一次，总剂量980mg/kg。48小时剂量方案中的各剂量是在1小时内给药IV的。
用面罩、接口管或气管造口术雾化：成人和青少年：每6-8小时使用20％的溶液5-10ml，或10％的溶液10-20ml。儿童：每6-8小时使用20％的溶液3-5ml，或10％的溶液6-10ml。婴儿：每6-8小时使用20％的溶液1-2ml，或10％的溶液2-4ml。
用tent或croupette雾化：成人和儿童：能提供浓雾的足够容积的10％或20％的溶液，可使用多至300ml的溶液。
儿童口服或直肠给药：5-30ml 10％的溶液，每天给药3-6次，例如每天4次，每次10ml。
优选地，抗-ROS剂的给药与开始吸入NO同时进行。抗-ROS剂给药的持续时间取决于所使用的药剂以及吸入NO的持续时间。
白三烯阻滞剂
白三烯是一类天然存在于白细胞中的具有生物学活性的化合物。白三烯能产生与组胺所产生的过敏和炎症反应相类似的过敏和炎症反应。花生四烯酸通过5-脂肪氧合酶(5LO)和5LO-活化蛋白(FLAP)的作用而被转化成白三烯A4。白三烯A4被迅速转化成白三烯B4(LTB4)和白三烯C4(LTC4)。LTC4又被转化成白三烯D4(LTD4)和E4(LTE4)。LTC4、LTD4和LTE4也被称为半胱氨酰白三烯，与Cys LT1和Cys LT2受体相互作用。这里所说的“白三烯阻滞剂”指的是如下的化合物：(1)抑制白三烯生物合成途径中的步骤的化合物；或(2)抑制白三烯受体活化作用的化合物。白三烯阻滞剂的实例包括：孟鲁司特(montelukast)(SINGULAIR；Merck；选择性和口服的白三烯受体拮抗剂)、扎鲁司特(zafirlukast)(ACCOLATE；AstraZeneca；选择性肽白三烯受体拮抗剂)、齐留通(zileuton)(ZYFLO；Abbott；口服活性5LO抑制剂)、潘库司特(prankulast)、MK-571、MK-591、MK-886、BAYx1005、西那司特(cinalukast)、乙二胺泊比司特(pobilukast edamine)、MK-679和ZD2138。在本发明的一些实施方案中，可联合使用两种或多种白三烯阻滞剂。优选的白三烯阻滞剂是孟鲁司特(SINGULAIR)，一种选择性和口服的白三烯受体拮抗剂；扎鲁司特(ACCOLATE)，一种白三烯D4(LTD4)和白三烯E4(LTD4)的选择性和竞争受体拮抗剂；和齐留通(ZYFLO)，一种口服活性5LO抑制剂。
一种或多种白三烯阻滞剂的给药剂量和给药途径取决于所用的特定药剂。各种白三烯阻滞剂安全有效的给药剂量和给药途径在现有技术中是已知的，参见例如Physician′s Desk Reference(PDR)或销售者的包装说明书。例如，优选的扎鲁司特(ACCOLATE)成人给药剂量为20mg，一天两次，以片剂的形式口服给药。在另一个实施例中，孟鲁司特(SINGULAIR)的成人给药剂量为10mg，一天一次，以片剂的形式口服给药。
优选地，在开始吸入NO时同时进行白三烯阻滞剂的给药。白三烯阻滞剂给药的持续时间取决于所用的药剂和吸入NO的持续时间。肺损伤
虽然在一般的NO吸入治疗期间可以有利的利用本发明，但本发明尤其用于改善患有肺损伤，包括急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的病人的氧合作用。急性肺损伤的实例包括：弥散性肺感染(例如病毒性、细菌性、真菌性肺感染)；吸引术(aspiration)(例如胃内容物、在接近淹溺情况中的水、新生儿胎便)；吸入毒物和刺激物(例如氯气、NO2烟尘、臭氧、高浓度的氧气)；麻醉剂过量的肺水肿(例如***、***(methodone)、***、右旋丙氧吩)；非***物的影响(例如硝基呋喃妥因)；对于宿主抗原的免疫反应(例如古德帕斯切综合症、全身性红斑狼疮)；与肺的外部作用引发的全身反应(例如革兰氏阴性的败血症、出血性胰腺炎、羊水栓塞症、脂肪栓)有关的伴有低血压的非胸部创伤的影响(“肺休克”)；和包括肺挫伤、肺移植、心肺分流术肺损伤、以及肺切除术后肺水肿在内的外伤后肺损伤。
HPV损伤
本发明的方法可用于减少、部分防止或完全防止与NO吸入剂有关的HPV损伤。存在HPV损伤的迹象包括可通过病人的蓝色来显现出来的低血氧合作用(低血氧)、氧饱和度减少、精神状况的改变、神经机能障碍、呼吸困难、心动过速和低血压。存在HPV损伤的症状包括呼吸短促和胸痛。HPV损伤或减少的诊断是现有技术中的常用技能。
可能会出现HPV损伤或减少的病人包括患败血症的病人和患有潜在的肺部炎症的病人。肺部炎症可由例如肺炎或急性呼吸窘迫综合征的情况而导致。
NO吸入响应的损伤
本发明的方法可用于减少、部分防止或完全防止作为NO吸入响应的血管舒张的减少。作为NO响应的肺血管舒张减少意味着NO不能增加氧合作用或不能降低肺动脉压(PAP)。不能降低PAP的迹象包括心输出量减少和右心衰竭，表现为如休克、浮肿和全身水肿。
可能会出现作为NO响应的肺血管舒张减少的病人包括患败血症的病人和患有潜在的肺部炎症的病人。肺部炎症可由例如肺炎或急性呼吸窘迫综合征的情况而导致。
实验资料
实施例1：抗-ROS剂和和作为对NO的响应的肺脉管的损伤
从用内毒素进行激发的小鼠所获得的实验证据表明对活泼氧和活泼氮类的清除可以防止作为NO响应的肺脉管的损伤。这些实验是用NOS2缺失小鼠进行的，其中将长期NO吸入剂与除NO之外的内毒素诱导因素一起给药会损伤肺部脉管***对随后的NO吸入剂的血管舒张的反应能力。可以用U46618进行预收缩的分离-灌注肺来对吸入NO后的响应进行评估。在进行肺分离前用内毒素处理16小时的野生型小鼠对NO吸入剂的响应受到了损害(图2A)。用内毒素进行处理的NOS2缺失的小鼠对NO吸入剂的响应没有受到损害(图2B)。在进行肺分离前暴露于20ppm的NO达16小时的野生型小鼠对NO吸入剂的响应没有受到损害。用内毒素进行处理和暴露于NO吸入剂16小时的NOS2缺失小鼠对NO吸入剂的响应受到了损害(图3)。用生理盐水替代内毒素对NOS2缺失对照小鼠进行处理并将其暴露于20ppm的NO吸入剂下16小时，该小鼠对于NO吸入剂的响应能力没有受到损害。在用内毒素进行处理的野生型小鼠中，活泼氧和活泼氮类的清除剂，包括N-乙酰半胱氨酸(图5)、二甲基脲、EUK8、和过氧化氢酶，也可防止对NO吸入剂响应的损伤。尽管长时间的吸入NO，但N-乙酰基-半胱氨酸可以防止内毒素激发的野生型小鼠的肺脉管对NO吸入剂的响应受到损害(图6)。
图5所示的实验结果证明用N-乙酰半胱氨酸进行处理可以保护内毒素激发的野生型小鼠对NO吸入剂的响应。图6所示的实验结果证明了N-乙酰半胱氨酸的保护机理不仅仅是对内毒素诱导的肺NOS2表达的抑制。
方法和材料
这些研究是经过麻萨诸塞州中心医院的实验动物管理委员会批准的。用列于表1中的和在这里所述的78只重20-35g的成年雄性小鼠来进行研究。NOS2缺失小鼠(MacMicking等人，1995，Cell，81：641-650)是由Dr.Carl Nathan所提供的。用具有相同背景的小鼠(双亲品系为SV129和C57 Black/6的F1代)作为野生型小鼠(Hickey等人，1997，FASEB J.，11：955-964)。
分离的、灌注的并进行通气的小鼠肺模型  通过腹膜内注射戊巴比妥钠(200mg/kg体重)处死的小鼠，并将其放置在37℃的水冷却室中(Isolated Perfused Lung Size 1 Type 839；Hugo-Sachs Elektronik，March-Hugstetten，Germany)。将气管分离出来并进行插管，并用限制容量的通风机(687型；Harvard Apparatus，South Natick，MA)以85次/分的通气速率和2cm H2O的末端呼气压力向肺中通入21％的O2、6％的CO2和73％的N2。在各研究中将潮流般的气量调节至能提供10cm H2O的吸气峰压。通过胸骨中线切开术而将肺暴露出来，在肺的主动脉流出通道上进行结扎。在向右心室中注射10 IU的肝素后，通过右心室用不锈钢套管(1mm的内径)对肺动脉进行插管。经由一根通过左心室顶端穿过二尖瓣瓣膜并穿入到左心房中的不锈钢套管(内径为1mm)将肺静脉流出物排出。将左心房压力维持在2mmHg。在37℃将一种非循环体系恒速灌注到肺中(50ml·kg体重-1·min-1；IsmatecReglo-Analogue滚轴泵；Laboratoriumstechnik GmbH，Wertheim-Mondfeld，Germany)。所用的灌注液是包含1.26mM CaCl2、5.33mMKCl、0.44mM KH2PO4、0.50mM MgCl2、0.41mM MgSO4、138.0mMNaCI、4.0mM NaHCO3、0.3mM Na2HPO4、以及5.6mM葡萄糖的Hanks平恒盐溶液(GibcoBRL，Grand Island，NY)。将5％的牛血清蛋白和5％的葡聚糖(二者均得自Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)加入到该灌注液中以防止肺水肿，该肺水肿与Holzmann等人，1996，Am.J.Physiol.271：L98 1-L986在被分离、灌注和通气的大鼠肺中所描述的基本相同。将30mM的消炎痛(Sigma Chemical Co.)和1mM L-NAME(Sigma Chemical Co.)加入到该灌注液中以分别抑制内源性***素和NO的合成。向其中加入碳酸氢钠以便将该灌注液的pH值调节到7.34-7.43。
如果肺具有同质的白色外观，没有止血或膨胀不全的迹象，并且在开始的10分钟基准灌注期间的第二个5分钟期间表现出低于10mmHg的稳定灌注压，则该肺可用于本研究。根据这两个标准，在研究之前各组中有大约15％的肺制品被丢弃。
分别经由与流入和流出套管侧口相连的填充生理盐水的膜压力转换器(Argon，Athens，TX)来测定肺动脉压力(PAP)和左心房压力。导气管压力(Paw)是用与恰好位于Y段前的吸气枝相连的微分压力转换器(MP-45-32-871型；Validyne Engineering Corp.，Northridge，CA)来进行测定的。压力转换器与生物医学放大器(Hewlett Packard 7754B，Andover，MA)相连，数据是在150Hz下在个人电脑上用带有数字采集***(DI-220；Dataq Instruments，Akron，OH)的数字模拟界面来进行记录的。在每次试验前要对该***进行校准。
对于NO吸入剂而言，NO气体(氮气中800或80ppm NO，Airco，Murray Hill，NJ)与氧气、二氧化碳、以及氮气进行混合(氧气混合机；BirdCorporation，Palm Springs，CA)以得到21％O2、6％CO2，和所希望NO浓度的最终浓度。对NO和较高氧化状态的NO(NOx；CLD 700 AL；EcoPhysics，Dumten，Switzerland)、氧(Hudson Ventronics Ddivision，Temecula，CA)、以及二氧化碳(Datex C02监测器；Puritan-BennettCorpration，Los Angeles，CA)的浓度进行连续监测。
在用脂多糖进行激发后肺脉管对NO吸入剂的响应在分离的肺进行灌注前16小时，将野生型小鼠和NOS2缺失小鼠以50mg/kg体重的量腹膜内注射溶解于生理盐水中的大肠埃希氏杆菌0111：B4脂多糖(LPS；Difco Laboratories，Detroit，MI)。该时间点的选择是以前用大鼠进行的研究为基础的(Holzmann等人，1996，Am.J.Physio.271：L981-L986)。用未进行处理的野生型和NOS2缺失小鼠作为对照。
在开始的10分钟基准灌注期间，通过连续输入血栓素A2类似物U-46619(Cayman Chemicals，Ann Arbor，MI)来诱导肺血管收缩。调节灌注速率以使得PAP稳定增加5或6mmHg。然后，通过随后分别向肺各通入5分钟的0.4、4和40ppm的NO来获得吸入NO后的剂量-响应曲线。在NO通气的各周期后，使PAP回到被NO升高前的基准水平上。如果在停止吸入NO后5分钟，PAP不在吸入NO前的值±10％的范围内，则重新调整U-46619的输入。对于吸入的NO的血管舒张响应(ΔPAP)的测定同由吸入NO而产生的PAP的变化一样(在吸入NO后5分钟的PAP减去吸入NO前的PAP)是用U-46619诱导的PAP增加的百分比表示的(NO前的PAP减去最初基准的PAP)。
NO暴露对吸入NO的肺脉管响应的作用四组小鼠吸入20ppm的NO 16小时。一组野生型小鼠和一组NOS2缺失小鼠在临暴露于NO前被腹膜内注射50mg/kg的脂多糖。另外的野生型和NOS2缺失小鼠不用脂多糖进行处理就接受NO吸入剂。在暴露于NO 16小时后，如前面所描述的那样将肺分离出来并进行灌注。通过输入U46619来诱导肺血管收缩，并测定对0.4、4和40ppm NO的血管舒张反应。
在进行环境压力的NO暴露期间，动物被关在401丙烯酸小室内。在如前所述的新鲜NO(在氮气中含10,000ppm NO；Airco，Murry Hill，NJ)、空气、以及氧气的高流速下用碱石灰下小心控制NO和NOX的浓度(Steudel等人，1998，101：2468-2477)。
将另外两组NOS2缺失小鼠用脂多糖进行处理(50mg/kg，腹膜内给药)，然后将其分别暴露于0.2和2ppm的NO吸入剂。16小时以后，进行分离肺灌注研究，测定吸入0.4、4和40ppm的NO所产生的肺血管舒张度。
肺湿重-干重比例  在各实验结束时，将不包括肺门结构的两叶的肺切除下来并进行称重(湿重)。其后，用以前所描述的方法(Holzmann等人，同上)，将该肺用微波炉干燥60分钟，然后重新称重(干重)。通过用湿重除以干重来计算肺的湿-干重比例。
统计学分析所有数据都被表示为均值±标准偏差(SE)。为了对各组进行比较，采用方差的双侧分析。当通过方差分析发现有显著差异时，用一种在后的最小显著差异试验来进行有计划的比较(Statistica for Windows；StatSoft，Inc.，Tulsa，OK)。统计学显著被定为P值＜0.05。
结果
以恒定的灌注液流速输入U46619能引起PAP的稳定增加，在实验结束时，这种增加在停止输入U46619后可以被逆转。U46619的剂量必须能使PAP增加5或6mmHg，在用脂多糖进行预处理和未进行处理的野生型和NOS2缺失小鼠中没有差别。
腹膜内注射脂多糖的小鼠出现与野生型和NOS2缺失小鼠程度相似的竖毛、腹泻、和嗜眠。在注射脂多糖后16小时的死亡率约为15％，在两种小鼠种属间没有差别。
肺脉管对于NO吸入剂的响应在所有的组中，吸入NO能以剂量依赖的方式降低PAP。图1是表示用未进行处理的野生型小鼠的分离灌注的肺测定肺动脉压(PAP；等于灌注压)和左心房压力(LAP)实验的示踪图。将稳定的血栓素A2类似物U46619进行输入以将PAP增加5或6mmHg。将肺用各种浓度的NO气体(0.4、4.0和40ppm)进行通气，各通入5分钟。在停止输入NO后，使PAP恢复到吸入NO前的水平。这些结果表明，在小鼠的分离灌注肺中，易于测定肺动脉压力、易于诱导稳定的肺血管收缩、易于通过通入低浓度的NO气体来减少肺血管收缩。
在用脂多糖进行激发的野生型小鼠的分离灌注肺中，吸入0.4和4ppm的NO时，PAP分别下降79％和45％，低于未进行处理的动物相(P＜0.001；图2A)。这些组之间对于40ppm NO的肺血管舒张响应没有差别。未进行处理的NOS2缺失小鼠与未进行处理的野生型小鼠对于NO的响应没有差别。相反，从用脂多糖进行激发的NOS2缺失小鼠所获得的肺对吸入的NO表现出比脂多糖处理的野生型小鼠的肺更强的血管舒张(在各NO剂量下P＜0.001；图2B)。此外，与未进行处理的NOS2缺失小鼠相比，用脂多糖进行处理的NOS2缺失小鼠的NO诱导的血管舒张增强(在各剂量下，P分别＜0.05；图2B)。
图2A中的数据表明，在通入0.4和40ppm的NO时，内毒素激发损害了野生型小鼠扩张其肺部脉管***的能力(*P＜0.001)。图2B中的数据表明内毒素激发不损害对吸入NO的肺血管舒张响应。内毒素增加了NOS2缺失小鼠肺部脉管***对所通入的0.4、4和40ppm的NO的扩张反应(+P＜0.05)。内毒素激发的NOS2缺失小鼠对于吸入的NO的肺血管舒张反应高于内毒素激发的野生型小鼠(P＜0.001)。
在暴露NO吸入剂后肺脉管对NO的响应  为了研究NO分子在NO吸入剂响应低下的形成中所扮演的角色，我们研究了吸入带有20ppm NO的空气16小时的用脂多糖进行了处理和未进行处理的NOS2缺失和野生型小鼠。预先暴露于NO吸入剂并不能改变随后由未进行处理的野生型或NOS2缺失小鼠或用脂多糖进行了预处理的野生型小鼠所获得的灌注肺对吸入的NO的响应。相反，与未进行NO暴露的用脂多糖进行了预处理的小鼠相比，暴露于环境NO下16小时的用脂多糖进行了预处理的NOS2缺失小鼠对NO吸入剂的肺血管舒张响应降低。在将由在20ppm的环境NO中暴露16小时的NOS2缺失小鼠所获得的分离灌注肺中，在用脂多糖进行预处理(对未处理的对照组比)后，在0.4(ΔPAP-24±4％与-42±4％比；P＜0.05)和4ppm(ΔPAP-39±5％与-58±4％比；P＜0.01)的NO时，随后对NO吸入剂的血管舒张响应受到了损害，但是在NO为40ppm时却并没有受到损害(ΔPAP-55±3％与-62±5％比；P＝不显著；图3)。类似于预先未进行NO吸入剂暴露的动物，与未进行处理的在肺灌注实验前吸入16小时20ppm NO的野生型小鼠相比，用脂多糖进行了预处理的野生型小鼠的NO诱导的血管舒张减少(图3)。
在进行长时间的NO暴露后，内毒素激发的NOS2缺失小鼠对短期NO吸入剂的响应比未接受脂多糖的NOS2小鼠低(*P＜0.05)。类似地，在进行长时间NO暴露后，用脂多糖进行了预处理的野生型小鼠对于短期NO吸入剂的响应比未用脂多糖进行预处理的野生型小鼠低(*P＜0.05)。这些观察到的结果证明了20ppm NO的长期吸入不损害未进行处理的野生型或NOS2缺失小鼠对随后通入的NO的肺血管舒张响应。相反，20ppm NO的长期吸入显著损害用内毒素进行了激发的NOS2缺失小鼠对随后吸入的NO的肺血管舒张响应(与图2B中的数据进行比较)。
为了测定吸入16小时低水平的NO是否会损害对肺灌注期间短期NO吸入剂的血管反应性，将用脂多糖进行了处理的NOS2缺失小鼠暴露于0.2和2ppm的NO吸入剂。在NOS2缺失小鼠中，在脂多糖给药后吸入16小时0.2ppm的NO不会引起随后的对短期吸入NO的响应性低下。但是，与对照组小鼠的响应相比，吸入16小时2ppm的NO降低了对0.4ppm NO吸入剂的血管舒张响应(P＜0.05；图4)。
肺湿-干重比例在灌注后通过没有变化的肺湿-干重比例可以证明没有出现肺水肿。在用脂多糖进行预处理的野生型(湿重-干重：4.3±0.2)和NOS2缺失(4.8±0.1)小鼠间、或在未进行处理的野生型(4.6±0.1)和未进行处理的NOS2缺失(4.6±0.1)小鼠间没有差异。与未进行暴露的小鼠相比，暴露于NO吸入剂16小时不影响用脂多糖进行预处理的野生型(4.9±0.1)和NOS2缺失(5.1±0.2)小鼠或未进行处理的野生型(4.5±0.3)和未进行处理的NOS2缺失(4.8±0.1)小鼠的肺湿-干重比例。肺湿-干重比例与对吸入NO所产生的血管舒张响应并不相关。
N-乙酰半胱氨酸的作用我们对用N-乙酰半胱氨酸(NAC)来清除活泼氧类是否能预防用内毒素激发的小鼠对NO吸入剂的肺血管舒张响应进行了研究。野生型小鼠用内毒素进行处理(大肠杆菌011：B4-LPS，50mg/kg，腹膜内给药)，然后立即和在3.5小时之后给予生理盐水或NAC(150mg/kg，腹膜内给药)(n＝5)。另外的用内毒素激发的用NAC处理的小鼠吸入16小时的20ppm的NO。
在内毒素激发后，将小鼠的肺分离出来，进行16小时的灌注和通气。将仅用生理盐水处理并吸入室内空气的小鼠的肺作为对照(n＝10)。用U46618诱导肺血管收缩，并测定吸入0.4、4.0和40ppm的NO的血管舒张响应。与对照小鼠相比，用内毒素激发的小鼠对于0.4、4.0和40ppm的NO的血管舒张反应分别为32±13％、43±10％、和53±8％(与对照比，p＜0.001)(图6)。相反，用NAC进行了处理的用内毒素进行激发的小鼠对NO吸入剂的血管舒张响应分别为75±14％、103±15％、和91±7％，(与LPS比，p＜0.001)(图6)。还可以保护用内毒素进行激发的用NAC进行了处理的并暴露于20ppm的NO的小鼠对NO吸入剂的响应。这表明NAC不能通过防止内毒素诱导的肺NO水平的增加而防止对急性NO吸入剂的响应。这些结果证明了NAC(一种活泼氧类清除剂)在防止内毒素诱导的NO吸入剂响应损伤中的效能。
实施例2：HPV和活泼氧类清除剂
所得的实验证据表明活泼氧类清除剂可以防止用内毒素激发的小鼠的HPV损伤。为了研究NOS2在内毒素诱导的HPV损伤中所扮演的角色，我们比较了野生型小鼠和先天NOS2缺失的小鼠在主流支气管阻塞(LMBO)后重新分配肺血流量重的能力。对于这些实验而言，我们研制出一种鼠LMBO模型。这使得我们可以用无伤小鼠来评估内毒素对HPV的影响。
图7所示的结果证明LMBO使得肺血流量重新分布，离开缺氧的左肺，反映为左肺血流量与总肺血流量比例(QLPA/QPA比例)的负变化。在LMBO后，野生型小鼠的内毒素激发可引起肺血流量重新分配显著减少(内毒素与对照比，*P＜0.05)，但是NOS2缺失小鼠不这样(与野生型小鼠比，P＜0.01)。早给予L-NIL可以防止LMBO诱导的肺血流量重新分布的减少(与用内毒素激发但不用-NIL进行处理的小鼠比，#P＜0.01)。在长期吸入40ppm的NO后，用内毒素进行了处理的NOS2缺失小鼠表现出与用内毒素进行了激发的野生型小鼠一样的HPV损失(与不吸入NO的比，§P＜0.05)。在停止吸入NO后，进行了40ppm NO 16小时吸入的用生理盐水进行激发的NOS2缺失小鼠和野生型小鼠保留了在LMBO后重新分配肺血流量的能力。这些结果表明，由于内毒素诱导的NOS2表达或由于NO吸入而导致的肺NO水平增加是用内毒素进行激发后HPV的减少所必须的。但是，只是长期暴露于增加的肺NO水平对于减少HPV而言并不够(正如在NO吸入停止后1小时所测定的那样)。
我们对作为LBMO响应的增长的左肺脉管阻力的变化，ΔiLPV进行了实验-HPV的测定。用内毒素进行激发的野生型小鼠的HPV受到了损害(图8)。用500mg/kg的N-乙酰半胱氨酸进行了处理(与内毒素一起被腹膜内给药)的内毒素激发小鼠的HPV受到了保护，但是用150mg/kg的N-乙酰半胱氨酸进行处理的小鼠的HPV受到了损害。在用EUK-8，一种过氧化物、过氧化氢和过硝酸盐清除剂进行了处理的用内毒素进行激发小鼠的HPV受到了完全保护。
从上述实验我们发现，NOS2缺失可以保护小鼠不受内毒素诱导的HPV损伤。我们进一步发现活泼氧类清除剂可以防止内毒素激发的野生型小鼠的HPV损伤(图8)。
支持这些结论的六个证据是：(1)在野生型小鼠中，LMBO能增加左肺的肺脉管阻力(PVR)，但是在内毒素激发22小时后，LMBO诱导的左肺血管收缩受到了损害；(2)在未暴露于NO的内毒素激发的NOS2缺失小鼠中，LMBO诱导的左肺血管收缩没有受到损害(图7)；(3)在暴露于40ppm的NO 22小时的用内毒素进行激发的NOS2缺失小鼠中，LMBO诱导的左肺血管收缩受到了损害(图7)；(4)仅仅长期吸入NO不损害小鼠的HPV，(图)；(5)N-乙酰半胱氨酸或EUK-8防止了内毒素激发的野生型小鼠的HPV损害(图8)；和(6)用N-乙酰半胱氨酸进行处理并暴露于20ppm的NO 22小时的用内毒素进行激发的野生型小鼠的HPV没有受到损害。
方法和材料
在获得麻萨诸塞州中心医院实验动物委员会组织机构的批准后，我们用SV129/B6F1野生型小鼠(SV129和C57 BL/6小鼠的F1代)和SV129野生型小鼠(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine，USA)，和带有SV129和C57BL/6杂交背景的NOS2缺失小鼠(MacMicking等人，1995，Cell，81：641-650)(由C.Nathan，Cornell University，New York，NY提供)进行了研究。在追加的研究中，用在C57BL/6背景上逆代杂交10代(C57BL/6 Nos2tmlLau，N10-逆代杂交代；The Jackson Laboratory)的NOS2缺失小鼠(18)，以及野生型C57BL/6小鼠进行研究。
使用动物年龄、体重、以及性别相匹配的实验组。用年龄在2-5个月、体重18-30g范围的雄性和雌性小鼠进行研究。
组1：对照组。将SV129/B6F1野生型小鼠(n＝5)、SV129野生型小鼠(n＝7)和NOS2缺失小鼠(n＝7)腹膜内注射0.2mL的生理盐水，22小时后进行研究。
组2：用内毒素进行处理的组。在通过腹膜内注射10mg/kg溶解于0.2mL生理盐水中的大肠埃希氏杆菌011B4内毒素进行激发后22小时，对SV129/B6F1野生型小鼠(n＝5)、SV129野生型小鼠(n＝6)、以及NOS2缺失小鼠(n＝6)进行研究。此外，在通过腹膜内注射10mg/kg溶解于0.2mL生理盐水中的内毒素进行激发后，对C57BL/6野生型小鼠(n＝7)和C57BL/6Nos2tmlLau小鼠(n＝5)进行研究。
组3：用内毒素+L-NIL进行处理的组。将SV129/B6F1野生型小鼠(n＝5)腹膜内注射10mg/kg的溶解于0.2mL生理盐水中的大肠杆菌011B4内毒素。在内毒素激发后3小时，通过腹膜内给予L-NIL 5mg/kg来对小鼠进行处理。在用内毒素进行激发后22小时进行研究。另外，在LMBO期间，对预先进行了(n＝5)或未进行(n＝4)内毒素激发(22小时前)的SV129/B6F1小鼠静脉注射给予5mg/kg L-NIL后的急性反应进行了研究。我们选择5mg/kg的L-NIL腹膜内给药剂量是因为已经表明类似的剂量可以有效的抑制啮齿类动物炎症模型体内的NOS2活性(Schwartz等人，1997，J.Clin.Invest.100：439-448)。
组4：长期暴露于4或40ppm的NO。用生理盐水进行处理的SV129野生型小鼠(n＝5)和NOS2缺失小鼠(n＝5)，吸入含有40ppm的NO的空气22小时，在停止吸入NO后1小时进行研究。在用10mg/kg内毒素腹膜内给药进行激发后，使SV129野生型小鼠(n＝5)和NOS2缺失小鼠(n＝5)吸入含有40ppm NO的空气22小时，在停止吸入NO后1小时进行研究。在用10mg/kg内毒素腹膜内给药进行激发后，使另外的NOS2缺失小鼠(n＝4)吸入含有4ppm NO的空气22小时，在停止吸入NO后1小时进行研究。
组5：连续的PaO2和PvO2测定。在用10mg/kg内毒素腹膜内给药进行激发后22小时，在LMBO前和LMBO期间，对SV129/B6F1野生型小鼠(n＝3)和NOS2缺失小鼠(n＝3)的PaO2连续进行评价。在用100mg/kg内毒素腹膜内给药进行激发后22小时，在LBMO之前和期间，对SCV129/B6F1野生型小鼠(n＝4)和NOS2-缺失小鼠(n＝4)的PvO2连续进行评价。在用生理盐水进行处理的SV129野生型小鼠中，没有预先进行内毒素激发，在控制条件下对LMBO前和LMBO期间的PaO2(n＝4)和PvO2(n＝4)进行研究。
组6：对于增加剂量的静脉血管紧张素II的肺脉管响应。在激发后22小时，对用内毒素(n＝5)或生理盐水(n＝3)进行处理的SV129/B6F1野生型小鼠进行研究。
实验准备通过腹膜内注射***(0.1mg/g体重[bw])对小鼠进行麻醉。用以前所描述的方法来进行气管造口术和动脉导管***术(Steudel等人，1997，Circ.Res.，81：34-41)。将一种与2 French Fogarty动脉栓塞导管(Baxter Healthcare Corp.，Irvine，California，USA)相连的专门定制的气管内插管(22G Angiocath；Becton Dickinson HealthcareSystems，Sandy，Utah，USA)***到气管中，使得头上剩余的Fogarty导管的囊状末端留在气管内。以每分钟110-120的呼吸速率、1.0的FiO2、13cm H2O的吸气峰压力和23cm H20的正末端呼气压力开始进行控制容积的通气。实施右胸骨旁的胸廓切开术，并将小管的超声流量探针(1RB；Transonic Instruments，Ithaca，NY)放置在右肺动脉周围并用微型操纵器(X-tra Hand；TechniTool，Plymouth，PA)将其固定于一定的位置上。用4-0丝质缝合线将其固定在左主肺动脉上以造成短暂的脉管阻塞。将一根肺动脉导管(PE 10)通过直接穿刺而***到主肺动脉中。在其它的实验中，按以前所报道的方法(Steudel等人，同上)放置低级胸主动脉流量探针。
在一些研究中，用与PE10管相连的30G针刺穿从右中叶流出的肺静脉，并用微型夹进行固定，以评估左心房压力(PLA)。为了测定主动脉中的氧分压(PaO2)，经由颈动脉将一种柔软的极谱的Clark型PO2电极(LICOX A3-Revoxode，1.5Fr.；GMS Gesellschaft fuermedizinische Sondentechnik，Kiel，Germany)引入到主动脉弓上。为了测定肺动脉中的氧分压(PvO2)，将右心室流出通道刺穿，并将氧电极放入肺动脉中。在每次实验前和实验后，在空气中，环境压力下，用试验探针套管对电极进行校准。用腹膜内注射***(0.1mg/g bw)和甲苯噻嗪(0.01mg/g bw)来维持麻醉，并同时腹膜内注射巴夫龙(0.002mg/g bw)以产生肌肉松弛效果。
血流量和压力测定  用生物医学放大器(Hewlett Packard 8805C，Palo Alto，CA；Siemens Sirecust 960，Danvers，MA)对平均全身动脉压(PSA)、平局肺动脉压(PPA)、和一些研究中的PLA进行连续监测。用与流量计(T106；Transonic Instruments)相连的小管流量探针来测定平均降低的胸廓主动脉流量(QLTAF)和右肺动脉流量(QRPA)。在一些实验中，用1.4Fr.Millar导管来测定左心室末端舒张压。该导管通过右颈动脉被导入到左心室中。所有的测定信号都被传递到一个数字模拟转换器中，被显示于计算机屏幕上，并用个人电脑上的数据采集***(DI220；Dataq Instruments，Akron，OH)在640Hz下进行记录。在各实验前对所有的监测装置进行校准。
左和右肺动脉流量的鉴别测定为了评价QRPA和左肺动脉流量(QLPA)对总肺动脉流量(QPA)的贡献，进行左肺动脉(QLPA)的短暂阻塞(90秒)。在急性左肺动脉阻塞期间的QRPA被认为是QPA(即心输出量)并与QLTAF紧密相关(r2＝0.88；y＝0.95x+0.38；n＝9)。QLPA是通过左肺动脉阻塞期间的QRPA(QPA)和左肺动脉的放开期间的QRPA间的差异计算出来的(QLPA＝QPA-QRPA)。各自流量的绝对值被记录了下来，可以计算出右和左肺流量的分布分数(QRPA/QPA和QLPA/QPA)。
当在较低的胸廓主动脉处进行测定时，由于血流流失到上端和顶端，所以在左肺动脉(QLPA)的短暂阻塞期间，可以通过QRPA的测定来对QPA进行评估。此外，增加第二流基探针可能会增加误差，由于小鼠的体积小，所以会增加手术创伤和对动物的压力。
单侧肺泡缺氧  为了诱导局部(即左肺)肺泡缺氧，通过视觉的控制向左主干支气管中导入一根具有扁平的囊状末端的Fogarty导管来可逆性的阻塞该左主干支气管(LMBO)。在大约1分钟内可以用眼观察到左肺完全萎缩，并且可以通过右肺短暂的过度膨大来得到证实。在LMBO期间，连续测定PPA、PSA、和QRPA。在一些实验中，用含有5％CO2的N2使萎缩的左肺重新膨胀以得到30cm H2O的导气管峰压力。在LMBO之前和LMBO后5分钟对QLPA进行测定。
血管紧张素II的输入用一种输入泵(Pump 11；Harvard ApparatusCo.，South Natick，MA)，经由中枢静脉导管输入溶解于无菌的普通生理盐水中的剂量递增的血管紧张素II(每分钟0.05、0.5、和5.0ng/gbw)。连续测定PLA、PPA、PSA和QLTAF。
呼吸补充的NO将小鼠放在具有特别结构的小室中(Steudel等人，同上)，在其中它们自然呼吸22小时具有0.21氧分数(FiO2)的气体，该呼吸气体混合物中被加入了40ppm的NO。在进行暴露后，将小鼠从小室中转移出来，并呼吸诱导麻醉期间的气体。在从小室中拿出来后60分钟测定其血液动力学。在测量期间，用FiO21.0，不加入NO的气体对动物进行机械通气。
肺血流量测定的检验在用生理盐水进行处理的野生型小鼠中(n＝5)，我们用静脉注射荧光标记微球(Glenny等人，1993，J.Appl.Physiol.，74：2585-2597)进行测定而得到的各部分肺血流量与本文中如前所述的用超声流量探针同时进行测定所获得的结果进行了比较。在LMBO前，将混悬于0.2mL生理盐水中的50,000个染色的微球(15um NuFlowSpheres；Interactive Medical Technologies Ltd.，West Los Angeles，CA)进行涡旋，在所说的0.2mL生理盐水中包含0.05％吐温-80表面活性剂以防止聚集，然后将其立即(在30秒内)通过颈静脉的插管进行输入。在完全注入后，将该导管用0.1mL的生理盐水进行冲洗。在LMBO5分钟后，用不同颜色的微球重复进行注入。将动物处死，取出肺，分别进行称重。用流动细胞计数分析来对总微球计数进行分析。用右肺总微球数和左肺总微球数与总的微球数来计算右肺与左肺血流量的分数。
另外，在用生理盐水进行处理的野生型小鼠中(n＝6)，为了证实LMBO能诱导通过左肺脉管阻力增加而反映出来的肺血流量的重新分布，我们在下静脉的短暂阻塞期间直接测定QLPA，并且计算左肺动脉压力-流量关系的斜率和截距。
肺湿/干重比例在用戊巴比妥(0.1mg/g，腹膜内给药)进行安乐死后，将不包括肺门结构的两侧的肺切除下来，吸去残血，立即称重。其中，如前所述(20)的那样，将该组织用微波炉干燥60分钟，重新称重。计算肺湿/干重比例。
统计学分析  肺血流量的变化被表示为基准血流量的下降百分比。各组间的差异用双侧ANOVA来决定。当用ANOVA发现有显著差异时，使用一种在后的Fisher检验(Statistica for Windows；StatSoft Inc.，Tulsa，OK)。P值小于0.05表明有显著差异。所有的数据都被表示为均值±SEM。
结果
单侧肺泡缺氧对肺血流量的作用。为了在体评价HPV，我们提出了一种鼠动物模型，在该模型中，在左肺单侧肺泡缺氧前和期间可以获得有差别的肺血流量测定(图9A-9C)。由于右主干支气管的阻塞造成了严重的低血氧和血液动力学的不稳定性，所以我们选择闭合左主干支气管(LMBO)，这样就产生了一个稳定的单侧肺萎缩模型。在胸廓切开术中用放在右肺动脉周围的超声流量探针来测定肺血流量差量，并且通过左肺动脉的短暂闭合来评价右肺和左肺间的流量分布(图9A-9C)。
图9A-9C表示的是在有和没有短暂的左肺动脉(LPA)阻塞的情况中，在LMBO前(图9A)、开始时(图9B)和LMBO后5分钟(图9C)时肺和全身血流动力学的扫描图。左动脉流量的短暂阻塞并不会对全身血液动力学产生任何作用(图9A)。在LMBO后约1分钟，发生整个的肺萎缩。联机记录用生理盐水进行处理的小鼠在基准和出现LMBO后通过左肺动脉的平均流量(QRPA)、平均肺动脉压(PPA)、平均全身动脉压(PSA)、以及平均导气管压力(PALV)。为了评价右肺和左肺动脉间血流量的重新分布，将左肺动脉短暂堵塞，在该点QRPA＝QPA(见图9A和图9C)。QPA和QRPA之差等于QLPA。在基准和LMBO后5分钟进行测定。箭头表示阻塞(90秒)和左肺动脉的松弛。这些代表性的扫描图突出了用小鼠在体测定肺血流量分布的能力。
图10A-10C表示用于对测定小鼠肺血流量分布方法的进行验证的实验方法。图10A表示通过静脉注射荧光微球(直径15μ)和通过用超声流量探针同时测定的QRPA而评价的左肺或右肺肺血流量百分比的相关性。在后者的方法中，通过左肺动脉的短暂阻塞来评价右肺和左肺间血流量分布的差异。数值用LMBO前和LMBO后右肺或左肺流量分数表示(用生理盐水进行处理的野生型小鼠；n＝4)。注意两种方法之间的接近一致性(r＝0.967)。图10B表示了用生理盐水进行处理的野生型小鼠(n＝6)在LMBO前(基准)和LMBO后5分钟左肺肺流量-压力关系实验的结果。注意到斜率显著增加，这代表了由LMBO诱导的增加的左肺肺脉管阻力的增加。在这些研究中，用超声流量探针对左肺动脉流量(QLPA)进行直接测定，斜率是通过由于下腔静脉短暂阻塞而导致的QPA的减少而产生的(斜率差别与基准比，P＜0.05)。图10C说明了用生理盐水进行处理的野生型小鼠(n＝3)在萎缩左肺的重新膨胀期间整个左肺肺脉管阻力(TLPVR)的变化。通过连续输入包含5％CO2的N2而使左肺重新膨胀并升至30cm H2O的吸气峰压。用95％的置信区间内的所有数据点的线性回归来表示数值。这些结果证明在LMBO后肺血流量的重新分配可归因于缺氧而不是左肺萎缩。
在LMBO前，野生型小鼠和NOS2缺失小鼠间的血流动力学参数没有差别。在LMBO后5分钟，用生理盐水进行处理的野生型小鼠的QLPA/QPA下降46±5％，用生理盐水处理的NOS2缺失小鼠的QLPA/QPA下降50±7％(图7)。在补充的研究中，用位于左肺动脉周围的流量探针来直接测定QLPA，我们观察到LMBO诱导的肺血流量重新分配是通过增加的左肺脉管阻力从102±18mmHg·min·g·mL-1增加到210±38mmHg·min·g·mL-1而反映出来的(图10B)。LMBO诱导的肺血流量重新分布不能归因于与左肺萎缩有关的机械因素，因为当用包含5％CO2的N2使萎缩的肺在直接目测下重新膨胀到正常的肺容积时，左肺脉管阻力(LPVR)并没有发生变化(n＝3；图10C)。
在单侧肺泡缺氧期间内毒素性血症对肺和全身血流动力学的作用在通过用腹膜内注射10mg/kg的大肠杆菌内毒素进行激发后，小鼠出现伴有竖毛和腹泻的嗜眠。在用内毒素进行激发后1周内，约有50％的小鼠死亡，并且在野生型和NOS2缺失小鼠的死亡率之间没有差异(数据没有表示出)。在LMBO前，用生理盐水进行处理的小鼠和用内毒素进行处理的小鼠间的血液动力学参数间没有差异(图12)，但是用内毒素处理的野生型小鼠的QPA趋向于高于NOS2缺失的小鼠(230±35比120±32μL·min-1·g-1·bw)，虽然这种差异并没有达到统计学显著的程度。对所有被研究的用内毒素进行激发的野生型和NOS2缺失小鼠的QPA进行的比较证实了在两种遗传型间没有显著差异(野生型小鼠每克180±20μL/min；NOS2缺失小鼠每克140±15μL/min；n分别等于21和15)。因为QPA间的差异可能会影响肺血流的重新分布，所以我们对QLPA/QPA的改变是否依赖于QPA的改变进行了研究。线性回归分析显示在LMBO期间，QPA和QLPA/QPA之间没有相关性(r2＝0.03，对于所有的小鼠和对于所有用内毒素进行了处理的小鼠，P＜0.001；图7)。在LMBO后，用生理盐水进行处理的小鼠的QLPA/QPA减少46±5％，用内毒素进行处理的小鼠的QLPA/QPA减少18±5％。相反，在生理盐水处理的NOS2缺失小鼠中，LMBO将QLPA/QPA减少50±7％，在用内毒素处理的NOS2缺失小鼠中，LMBO将QLPA/QPA减少51±6％(图7)。在SV129、SV129B6F1或C57BL/6野生品系之间或在有SV129B6F1杂交背景的NOS2缺失小鼠和C57BL/6背景逆代杂交第10代NOS2缺失小鼠间对于内毒素的响应没有差别(数据没有表示出)。
在单侧肺泡缺氧期间内毒素性血症对PaO2和PvO2的影响为了测定野生型和NOS2缺失小鼠在用内毒素进行激发后，LMBO诱导的肺血流量重新分布的差异是否可以反映出LMBO诱导的动脉氧合作用的改变，在LMBO前和LMBO后对PaO2进行连续测定。在分别用内毒素进行处理的野生型和NOS2缺失小鼠中，评价了LMBO对PvO2的作用。用生理盐水进行处理的野生型小鼠(n＝4)，在FiO2 1.0进行呼吸，LMBO 5分钟可以将PaO2从432±7mmHg降到225±13mmHg。用内毒素进行处理的野生型小鼠的PaO2为342±23mmHg，用内毒素进行处理的NOS2缺失小鼠的PaO2为347±33mmHg。在LMBO进行5分钟后，用内毒素进行处理的野生型小鼠的PaO2下降(145±9mmHg)，比用内毒素进行处理的NOS2缺失小鼠中的PaO2下降更大(230±18mmHg；P＜0.05；图11)。
用内毒素进行处理的野生型小鼠和用内毒素进行处理的NOS2缺失小鼠的PvO2没有差别(在LMBO前：分别为39±5和44±8mmHg；在LMBO后：分别为34±4和43±7mmHg；两组的n都等于3)。
NOS2活性的长期药理学抑制作用为了测定NOS2的长期药理学抑制是否能保持HPV，将野生型小鼠(n＝5)腹膜内注射10mg/kg的内毒素，3小时后，用一种NOS2活性选择性抑制剂-L-NIL对其进行处理(5mg/kg，腹膜内注射)。L-NIL的这种剂量足以防止在内毒素激发后7小时野生型小鼠肺cGMP水平的增加(数据没有表示出来)。在内毒素激发后22小时进行肺血流量研究。在用L-NIL处理进行内毒素暴露的小鼠中，与用生理盐水进行处理或用内毒素进行处理的野生型小鼠相比，在LMBO前我们测得的全身和肺血流动力学没有差异。用L-NIL进行了处理的用内毒素激发的野生型小鼠中的QLPA/QPA下降高于只用内毒素进行处理的野生型小鼠中的下降(分别为53±10％对18±5％，P＜0.01；图7)。
L-NIL对NOS2的急性药理学抑制为了测定在LMBO期间的急性抑制是否能增加HPV，在LMBO后，对用生理盐水进行处理和用内毒素进行处理的野生型小鼠进行L-NIL给药(5mg/kg，腹膜内给药)，然后进行肺血流量研究。在用生理盐水进行处理的野生型小鼠中(n＝5)，急性L-NIL给药在LMBO期间并不能进一步减少QLPA/QPA(在给予L-NIL前为49±3％；在给予L-NIL后为56±3％)。在注射L-NIL后所有的其它血液动力学参数都没有发生变化。在22小时前用内毒素进行处理的野生型小鼠中(n＝4)，急性L-NIL给药在LMBO期间并不能进一步减少QLPA/QPA(在给予L-NIL前为降低22±11％；在给予L-NIL后为降低24±18％)。
长期吸入4或40ppm NO  为了了解NO的肺浓度是否增加，或者更恰当的说是另外一种NOS2产物是否有助于内毒素诱导的HPV损伤，使生理盐水处理的和用内毒素进行激发的野生型和NOS2缺失小鼠呼吸22小时的包含40ppm NO的空气。在1小时后，在使得有足够的时间使吸入的NO的任何血管舒张作用都消失后，进行血液动力学研究。吸入40ppm的NO 22小时并不损害用生理盐水进行处理的野生型小鼠和NOS2缺失小鼠的HPV：在吸入40ppm NO 22小时后，在LMBO后，用生理盐水进行处理的野生型小鼠QLPA/QPA的减少是51±10％，用生理盐水进行处理的NOS2缺失小鼠的减少是50±11％(图7)。除了心率有适中的差异外，长期吸入40ppm的NO达22小时的用内毒素进行处理和用生理盐水进行处理的小鼠间的LMBO前的血流动力学间没有发现其它差异(图12)。与没有吸入追加的NO的用内毒素进行处理的NOS2缺失小鼠相比，在长时间的吸入40ppm的NO后，用内毒素处理的NOS2缺失小鼠表现出显著的HPV减弱(QLPA/QPA的减少分别为：20±7％与50±11％；P＜0.05；图7)。相反，长时间的吸入NO并不影响野生型小鼠中内毒素诱导的HPV的损伤(用内毒素进行处理的野生型小鼠呼吸40ppm的NO 22小时后，QLPA/QPA的减少为：19±10％，而未暴露于NO的用内毒素进行处理的野生型小鼠的减少为18±5％；图7)。相反，呼吸22小时4ppm的NO并不损害用内毒素进行处理的NOS2缺失小鼠的HPV(QLPA/QPA的减少为：62±2％；n＝4)。
对血管紧张素II的肺血管反应性为了测定内毒素对HPV的影响是否有助于内毒素对肺脉管收缩功能的非特异性作用，我们测定了在用生理盐水进行处理野生型小鼠和用内毒素进行激发后22小时的野生型小鼠对于血管紧张素剂量增加的肺血管收缩反应。没有使用内毒素的用生理盐水进行了处理的野生型小鼠在每分钟5.0μg/kg血管紧张素II时，PVR从基准值的74±24增加到184±25mmHg·min·g·mL-1(P＜0.01)，在用内毒素进行了激发的野生型小鼠中，从55±11增加到174±40mmHg·min·g·mL-1(P＜0.001)。在血管紧张素II的任何输入剂量水平上，用内毒素进行处理和用生理盐水进行处理的小鼠间的PVR都没有差异。用生理盐水进行处理的野生型小鼠(6±1mmHg)和用内毒素进行处理的野生型小鼠(5±1mmHg)间的PLA基准值间没有差异，在各组中进行血管紧张素II输入时PLA也不会产生变化。
肺湿/干重比例  用内毒素进行激发的野生型小鼠(湿重/干重：5.0±0.5)和NOS2缺失小鼠(4.6±0.2)间、或用生理盐水进行处理的野生型小鼠(4.6±0.1)和用生理盐水进行处理的NOS2缺失小鼠(4.5±0.1)间的湿/干肺重比例没有差异。呼吸4或40ppm的NO 22小时并不会改变湿/干肺重比例。
实验的概述和解释  为了研究NO和NOS2在败血症的HPV损伤中所扮演的角色，我们建立了一种体内小鼠模型以用来评价作为由LMBO诱导的单侧肺泡缺氧响应的肺血流量的重新分布。在没有接触内毒素的小鼠中，LMBO使左肺PVR加倍，因此，50％的左肺血流量都转移到了右肺，从而引起PaO2适度下降。用胸廓切开术中所放置的超声流量探针测定的鼠科动物肺血流量的改变与用荧光微球静脉注射所获得的测定结果紧密相关(见图10A)，并且与研究了大量动物模型的研究者所提供的报告相似(Domino等人，1984，Anesthesiology，60：562-566；Sprague等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：8711-8715)。
在用内毒素激发后22小时的野生型小鼠中，我们观测到了作为局部肺缺氧响应的肺血流量的重新分布能力受到了严重损伤，导致了全身动脉氧合作用的显著降低。这种内毒素诱导的小鼠肺血流量重新分布的损伤与用清醒的绵羊所进行的在静脉注射活的细菌(Fischer，等人，1997，Am.J.Respir.Crit.Care Med.，156：833-839)或内毒素(Hutchison等人，1985，J.Appl.Physio.，58：1463-1468)后所观察到的结果相似。
并不能表明内毒素诱导的HPV损伤是由于血管舒张收缩装置的非特异性功能紊乱而导致的，因为我们发现在用内毒素进行激发和用生理盐水进行处理的小鼠间，血管紧张素II收缩肺部脉管***的能力并没有差别。此外，内毒素对鼠科动物肺部脉管***的有害作用是可逆的，在进行内毒素给药后14天时，HPV重新恢复(数据没有表示出来)。
在之前22小时用内毒素进行激发的NOS2缺失小鼠中，HPV没有受到损伤，在LMBO期间全身动脉氧合所用得到了保护。类似地，在内毒素激发后3小时用一种特异性的NOS2酶活性抑制剂-L-NIL进行处理的野生型小鼠的HPV能力也得到了保护。这些结果证明，NOS2酶活性是产生内毒素诱导的HPV损伤的关键。
和LMBO后立即进行L-NIL的急性给药并不能重建HPV一样，在用内毒素激发后22小时野生型小鼠的HPV损伤不能归因于肺NO水平的额外增加。这些结果证明内毒素诱导的肺NOS2表达是损害HPV所必须的，但持续的NOS2活性并不是内毒素激发后22小时所测得的HPV损伤所需要的。
在一些情况中，NOS2可产生过氧化物和NO(28)。我们通过使内毒素激发的NOS2缺失小鼠进行吸入，重新补充肺部的NO水平而验证了由NOS2产生的NO是否有助于内毒素诱导的HPV损伤。NOS2缺失小鼠被用内毒素进行激发，并被放置于包含各种浓度的NO的小室中进行22小时的暴露。在从该小室中取出后1小时测定作为LMBO响应的肺血流量重新分布，并不期望在该时间内肺NO水平会增加。呼吸了40ppm的NO的用内毒素激发的NOS2缺失小鼠的HPV受到了损伤(见图7)。相反，呼吸22小时4ppm的NO并不损害用内毒素进行了处理的NOS2缺失小鼠的HPV。这些数据表明，肺NO水平显著增加(通过NOS2内源性的产生或通过吸入)是损伤HPV所需要的。如果将我们用小鼠所观测到的结果外推到人类，我们的研究的一个重要的临床暗示就是使患有肺部炎症的病人吸入高浓度的NO可以减少HPV，这将会反常的降低动脉氧合作用。此外，这些结果支持了目前当治疗患有急性呼吸衰竭的病人时，吸入较低的有效浓度的NO的临床实践(Zapol，1993，Intensive Care Med.，19：433-434)。
在用生理盐水进行了处理的野生型和NOS2缺失小鼠中，当对从暴露小室中取出1小时后的动物进行研究时，吸入40ppm的NO 22小时并不损伤HPV(见图7)。这些结果表明仅仅由于肺NO水平的持续增加并不足以引起持续的HOV损伤。此外，吸入22小时40ppm的NO并不能进一步损害内毒素激发的野生型小鼠的HPV。因此，显然吸入NO和内毒素诱导的肺NO产生并不能增加损伤的HOV。我们的研究表明在内毒素激发后的HPV持续损伤需要肺NO水平的增加，并且需要附加的内毒素诱导的炎性产物。
实施例3：白三烯阻滞剂和HPV的损伤
所获得的实验证据证明了白三烯合成抑制剂和白三烯受体活化作用抑制剂能防止内毒素激发的小鼠的HPV损伤。我们发现当存在5LO-活化蛋白(FLPA)时，用内毒素进行激发的催化花生四烯酸转化成白三烯A4的5-脂肪氧合酶(5LO)缺失的小鼠的HPV可以受到保护。我们发现在野生型小鼠中，用FLAP抑制剂MK886，或CysT1受体阻滞剂MK571进行处理的内毒素激发的小鼠的HPV受到了保护。在这些实验中，我们使用单侧肺缺氧的体内小鼠模型。
将野生型(SV129B6/F1)小鼠和5LO-缺失小鼠进行麻醉并在胸廓切开的条件下进行研究。连续测定左肺动脉流量(QLPA)和肺(PPA)以及全身(PSA)动脉压。通过下静脉腔的短暂阻塞而获得左肺循环的压力-流量关系。
在左主支气管阻塞(LMBO)后，用左肺脉管阻力增加百分比(P/Q-关系的斜率，LPVR)来对HPV进行评估。LMBO可将5LO缺失小鼠的LPVR增加99±13％，将野生型小鼠增加100±11％。数据被概括于图13中。这些结果证明对半胱氨酰-白三烯合成或受体活化作用的抑制可以防止内毒素诱导的HPV损伤。
其它实施方案
已经对本发明的实施方案进行了描述。然而，应当清楚所作的各种修改并没有脱离本发明的主旨和范围。例如本发明可以用除这里所列出的物质之外的其它抗ROS剂和白三烯阻滞剂来进行实施。因此，其它的实施方案是在下面的权利要求书的范围内的。

Claims (14)

1.一种减少、部分防止或完全防止哺乳动物与吸入一氧化氮有关的缺氧性肺血管收缩的损伤的方法，该方法包括：通过吸入给该哺乳动物使用有效治疗量的一氧化氮，并同时给予有效量的抗ROS剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所说的抗ROS剂选自：N-乙酰半胱氨酸、别嘌呤醇、抗坏血酸(维生素C)、胆红素、咖啡酸、过氧化氢酶、PEG-过氧化氢酶、儿茶素、血浆铜蓝蛋白、二异丙基水杨酸铜、甲磺酸去铁胺、二甲基脲、依布硒、EUK-8、FeTMTPyP、FETPPS、糖皮质激素、谷胱甘肽、MnTBAP、MnTMPyP、硒代蛋氨酸、过氧化物歧化酶、PEG-过氧化物歧化酶、黄衫素以及维生素E。
3.如权利要求2所述的方法，其中所说的抗ROS剂是N-乙酰半胱氨酸。
4.如权利要求1所述的方法，其中还包括同时给予有效量的白三烯阻滞剂。
5.一种减少、部分防止或完全防止哺乳动物与吸入一氧化氮有关的缺氧的肺血管收缩的损伤的方法，该方法包括：通过吸入给该哺乳动物使用有效治疗量的一氧化氮，并同时给予有效量的白三烯阻滞剂。
6.如权利要求5所述的方法，其中所说的白三烯阻滞剂选自：孟鲁司特、扎鲁司特、齐留通、潘库司特、MK-571、MK-591、MK-886、BAYx1005、西那司特、乙二胺泊比司特、MK-679和ZD2138。
7.如权利要求6所述的方法，其中所说的白三烯阻滞剂选自：孟鲁司特、扎鲁司特以及齐留通。
8.一种减少、部分防止或完全防止哺乳动物作为一氧化氮吸入的响应的肺血管舒张响应损失的方法，该方法包括：通过吸入给哺乳动物使用有效治疗量的一氧化氮，并同时给予有效量的抗ROS剂。
9.如权利要求8所述的方法，其中所说的抗ROS剂选自：N-乙酰半胱氨酸、别嘌呤醇、抗坏血酸(维生素C)、胆红素、咖啡酸、过氧化氢酶、PEG-过氧化氢酶、儿茶素、血浆铜蓝蛋白、二异丙基水杨酸铜、甲磺酸去铁胺、二甲基脲、依布硒、EUK-8、FeTMTPyP、FETPPS、糖皮质激素、谷胱甘肽、MnTBAP、MnTMPyP、硒代蛋氨酸、过氧化物歧化酶、PEG-过氧化物歧化酶、黄衫素以及维生素E。
10.如权利要求9所述的方法，其中所说的抗ROS剂是N-乙酰半胱氨酸。
11.如权利要求8所述的方法，其中还包括同时给予有效量的白三烯阻滞剂。
12.一种减少、部分防止或完全防止哺乳动物作为一氧化氮吸入的响应的肺血管舒张响应损失的方法，该方法包括：通过吸入给哺乳动物使用有效治疗量的一氧化氮，并同时给予有效量的白三烯阻滞剂。
13.如权利要求12所述的方法，其中所说的白三烯阻滞剂选自：孟鲁司特、扎鲁司特、齐留通、潘库司特、MK-571、MK-591、MK-886、BAYx1005、西那司特、乙二胺泊比司特、MK-679和ZD2138。
14.如权利要求13所述的方法，其中所说的白三烯阻滞剂选自：孟鲁司特、扎鲁司特、以及齐留通。
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