CN109153705A - 经修饰的链球菌溶血素o - Google Patents
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Abstract
[问题]提供具有优异特性如抗原活性和热稳定性的链球菌溶血素O;其制备方法;及其用途。[解决方案]包含以下氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列具有从SEQ ID NO:1的位置2的赖氨酸残基延伸至位置31的丙氨酸残基,位置32的谷氨酸残基,位置33的丝氨酸残基,和位置34的天冬酰胺残基中任一的多肽的缺失,并且还具有SEQ ID NO:1的位置465的异亮氨酸残基至位置472的丙氨酸残基中任一和所有随后氨基酸残基的缺失。
Description
技术领域
本发明涉及链球菌溶血素O(以下在本说明书中也称为“SLO”)及其用途。更具体地,本发明涉及链球菌溶血素O,产生所述蛋白质的微生物,所述蛋白质的制备方法,使用所述蛋白质测量抗链球菌溶血素O(以下在本说明书中也称为“ASO”)的方法,等等。
背景技术
SLO是由酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)胞外产生的具有溶血活性的蛋白质,广泛用于ASO测量试剂的原料以用于诊断酿脓链球菌感染。
酿脓链球菌通常被培养用于产生SLO。然而,酿脓链球菌的SLO生产率非常低,并且酿脓链球菌产生的SLO纯度低;因此,存在一个问题,即SLO的质量不稳定。因此,为了提高生产率和稳定性,已经研究了使用重组大肠杆菌(Escherichia coli)的SLO(PTL 1,PTL 2,NPL 1和NPL 2)。
然而,NPL 1报道当使用重组大肠杆菌生产SLO时,不仅产生全长型SLO,而且还产生低分子量型SLO(其在距C端侧至少50个氨基酸残基的区域中被切割)(NPL 1将全长型SLO称为高分子量型SLO)。在NPL 1中,使用重组大肠杆菌提高了生产率;然而,难以通过工业规模控制全长型SLO(以下在本说明书中也称为“全长型”)和低分子量型SLO的比例。因此,尚未实现质量稳定性。
此外,因为SLO是具有溶血活性的蛋白质,所以就制造商的安全性而言需要降低溶血活性。NPL 2报道了通过删除C端的若干个氨基酸残基来降低溶血活性。
引用列表
专利文献
PTL1:JPH05-184372A
PTL2:JPH06-237775A
非专利文献
NPL 1:Michael A.Kehoe等,Infection and Immunity,Vol.63,No.7,2776-2779,1995
NPL 2:Akira Taketo等,Biosci.Biotechnol.Biochem.,65(12),2682-2689,2001,45(14),4455-62
发明概述
技术问题
本发明是鉴于现有技术的现状而作出的。本发明的目的是提供SLO,其确保高生产率并具有与天然SLO相当的表位,而没有全长型SLO和低分子量型SLO的共存的情况。此外,就生产而言,需要不具有溶血活性且具有高热稳定性的SLO。本发明的另一个目的是提供还具有这种特性的SLO。
问题的解决方案
为了实现上述目的,发明人对SLO的表达区域进行了广泛的研究,并因此发现了克服所有问题的SLO。具体地,为了防止全长型SLO和低分子量型SLO的共存,表达了具有C端区域缺失的经修饰的SLO(以下在本说明书中也称为“片段型”)。
经修饰的SLO引起对表位丧失问题的担心;然而,发明人出人意料地证实,即使全长型SLO的C端侧的约100个氨基酸残基的区域缺失,抗原活性也不会丧失,并且每蛋白的抗原活性比全长型SLO更大地提高。这意味着在从全长型SLO缺失的约100个氨基酸残基的区域中没有重要的表位。
发明人还证实,经修饰的SLO失去了溶血活性。此外,发明人发现经修饰的SLO具有优于全长型SLO的热稳定性。由此完成了本发明。
本发明基于上述发现和结果,并提供如下所示的SLO。
[第1项]
包含以下多肽(a)至(d)之一的SLO:
(a)包含以下氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列具有从SEQ ID NO:1的位置2的丝氨酸残基延伸至位置31的丙氨酸残基,位置32的谷氨酸残基,位置33的丝氨酸残基,和位置34的天冬酰胺残基中任一的多肽的缺失,并且还具有SEQ ID NO:1的位置465的异亮氨酸残基至位置472的丙氨酸残基中任一和所有随后氨基酸残基的缺失;
(b)在(a)中所示的氨基酸序列的N端或C端区域具有一个或多个标签的多肽;
(c)多肽,所述多肽包含在(a)所示的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸残基的置换,缺失,***和/或添加的氨基酸序列,并且具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性;和
(d)多肽,其包含与(a)中所示的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列,并且具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性。
[第2项]
作为以下DNA(e)至(i)之一的DNA:
(e)编码第1项中所示的氨基酸序列的DNA;
(f)DNA,其包含碱基序列,所述碱基序列具有在SEQ ID NO:2中在5′端侧的0,3,6或9个碱基的缺失(N端的atg序列除外),并且还具有在3′端侧的3n(n是0至7的整数)个碱基的缺失;
(g)DNA,其包含与SEQ ID NO:2所示的碱基序列具有80%以上同一性的碱基序列,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽;
(h)DNA,其在严格条件下与跟SEQ ID NO:2所示的碱基序列互补的碱基序列杂交,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽;和
(i)DNA,其包含在SEQ ID NO:2所示的碱基序列中具有一个或多个碱基的置换,缺失,***和/或添加的碱基序列,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽。
[第3项]
作为以下DNA(k)至(n)之一的DNA:
(k)DNA,其包含碱基序列,所述碱基序列具有在SEQ ID NO:3中在5′端侧的0,3,6或9个碱基的缺失(N端的atg序列除外),并且还具有在3′端侧的3n(n是0至7的整数)个碱基的缺失;
(1)DNA,其包含与SEQ ID NO:3所示碱基序列具有80%以上同一性的碱基序列,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽;
(m)DNA,其在严格条件下与跟SEQ ID NO:3所示的碱基序列互补的碱基序列杂交,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽;和
(n)DNA,其包含在SEQ ID NO:3所示的碱基序列中具有一个或多个碱基的置换,缺失,***和/或添加的碱基序列,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽。
[第4项]
包含第2项或第3项的DNA的载体。
[第5项]
含有第4项的载体的转化体。
[第6项]
用于制备第1项的SLO的方法,所述方法包括培养第5项的转化体。
[第7项]
通过交联第1项的SLO获得的交联的SLO。
[第8项]
涂覆有第1项的SLO或第7项的交联的SLO的胶乳(latex)颗粒。
[第9项]
测量抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的方法,所述方法使用第8项的胶乳颗粒。
[第10项]
抗链球菌溶血素O抗体(ASO)测量试剂,其包含第8项的胶乳颗粒。
发明的有益效果
本发明的经修饰的SLO可用作用于具有优异抗原活性和热稳定性的ASO试剂的诊断原料。
附图简述
图1显示全长型链球菌溶血素O和各种类型的经修饰的链球菌溶血素O的SDS-PAGE。
图2显示具有在位置560的C端的链球菌溶血素O的SDS-PAGE。
图3显示Biokit产生的链球菌溶血素O的SDS-PAGE。
图4显示各种类型的链球菌溶血素O之间的抗原活性的比较。
图5显示各种类型的链球菌溶血素O之间的热稳定性的比较。
图6显示使用各种类型的链球菌溶血素O产生的ASO试剂之间的灵敏度的比较。
实施方案的描述
经修饰的链球菌溶血素O
本发明的一个实施方案是包含以下多肽(a)至(d)之一的SLO:
(a)包含以下氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列具有从SEQ ID NO:1的位置2的丝氨酸残基延伸至位置31的丙氨酸残基,位置32的谷氨酸残基,位置33的丝氨酸残基,和位置34的天冬酰胺残基中任一的多肽的缺失,并且还具有SEQ ID NO:1的位置465的异亮氨酸残基至位置472丙氨酸残基中任意的缺失和所有随后氨基酸残基的缺失;
(b)在(a)中所示的氨基酸序列的N端或C端区域具有标签的多肽;
(c)多肽,所述多肽包含在(a)所示的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸残基的置换,缺失,***和/或添加的氨基酸序列,并且具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性;和
(d)多肽,其包含与(a)中所示的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列,并且具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性。
在多肽(a)中,SEQ ID NO:1是SLO的全长(全长型SLO)并且包含571个氨基酸。SEQID NO:1的位置1的氨基酸残基是N端甲硫氨酸。本发明的SLO在N端侧具有在选自由以下组成的组的位置处的氨基酸残基缺失:位置2至31,位置2至32,位置2至33和位置2至34。自N端起的31个残基是分泌信号,并且当本发明的SLO由革兰氏阴性细菌如大肠杆菌胞内表达时优选缺失。在胞外表达的情况下,可以添加适合宿主的分泌信号。
此外,本发明的SLO在C端侧具有在选自由以下组成的组的位置处的氨基酸残基缺失:位置465至571,位置466至571,位置467至571,位置468至571,位置469至571,位置470至571,位置471至571,以及位置472至571。
在本发明的SLO中,N端缺失和C端缺失的组合没有特别限制。优选的实例包括含有从N端侧的位置32到C端侧的位置464的氨基酸残基的多肽(在本说明书中,通过用连字符连接指示两端氨基酸的位置的数字,这种多肽也由“N32-C464”表示)。其他优选的实例包括N32-C464,N32-C466,N32-C471,N35-C464,N35-C466,N35-C471等。
本发明的SLO不限于上述(a),并且还包括:
(b)在(a)中所示的氨基酸序列的N端或C端区域具有一个或多个标签的多肽;
(c)多肽,所述多肽包含在(a)所示的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸残基的置换,缺失,***和/或添加(在本说明书中这些也被统称为“修饰”)的氨基酸序列,并且具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性;和
(d)多肽,其包含与(a)中所示的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列,并且具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性。
这是因为如果蛋白质的氨基酸序列的一部分突变,则突变蛋白质通常在功能上等同于原始蛋白质。
在多肽(b)中,标签没有特别限制。实例包括亲和标签,如His标签,HQ标签,HN标签,HAT标签,GST标签,MBP标签和Strep(II)标签。优选从这些标签中选择一个或多个标签。其中,His标签,HQ标签,HN标签,HAT标签,Strep(II)标签等是优选的,因为它们几乎不影响表位功能。虽然将标签***N端的方法没有特别限制,但优选紧接着N端的甲硫氨酸残基之后***标签。备选地,可以在若干个氨基酸残基后***标签。这些氨基酸残基的数量没有特别限制;但是,其上限优选为20或更少,更优选为10或更少,甚至更优选为5或更少,并且其下限可以为1或更多。虽然将标签***C端的方法没有特别限制,但优选在紧接着终止密码子之前***标签。备选地,可以在若干个氨基酸残基之前***标签。这些氨基酸残基的数量没有特别限制;但是,其上限优选为20或更少,更优选为10或更少,甚至更优选为5或更少,并且其下限可以为1或更多。当表达载体骨架含有标签时,可以适当地删除基因序列。
在多肽(c)中,“更多氨基酸”的数量的下限是2。上限不受限制,只要保持针对ASO的抗原活性,但优选在不显著损害氨基酸残基的蛋白质空间构型和对ASO的抗原活性的范围内。例如,上限是对应于小于所有氨基酸的20%的数目,优选小于15%,更优选小于10%,甚至更优选小于5%,还更优选小于1%。换句话说,氨基酸的数目是,例如,114或更少,优选86或更少,更优选57或更少,甚至更优选29或更少,再更优选20或更少,再更优选15或更少,再更优选为10或更少,再更优选5或更少,再更优选4或更少,进一步再更优选3或更少。
在多肽(c)中,当通过后面描述的“测量SLO的抗原活性的方法”测量时,针对ASO的抗原活性为修饰前蛋白质的50%以上,优选80%以上,更优选90%以上,并且甚至更优选95%以上。
在多肽(d)中,与(a)中所示的氨基酸序列的同一性优选为80%以上。同一性优选为85%以上,更优选为90%以上,甚至更优选为95%以上,再更优选为98%以上,进一步更优选为99%以上。
氨基酸序列同一性可使用市售分析工具或通过电子通信线路(因特网)获得的那些来计算。在本说明书中,通过在BLAST网站中选择blastp并使用默认参数来确定同一性,BLAST网站是由National Center for Biotechnology Information (NCBI)发布的同源性检索程序。
根据后面描述的“测量SLO的抗原活性的方法”确定某种多肽是否具有针对ASO的抗原活性。
通过使用PCR方法和市售试剂盒(如Transformer Mutagenesis Kit(Clonetech生产),EXOIII/Mung Bean Deletion Kit(Stratagene生产),QuickChange Site DirectedMutagenesis Kit(Stratagene生产),或KOD-Plus-Mutagenesis Kit(Toyobo Co.,Ltd.生产)改变SEQ ID NO:2所示的碱基序列,可以获得具有针对ASO的抗原活性的经修饰的蛋白质及其基因。
通过例如以下来确定由所获得的基因编码的蛋白质的抗原活性:将获得的基因导入大肠杆菌中以产生转化体,培养转化体以产生酶蛋白,并通过稍后描述的“测量SLO抗原活性的方法”测量转化体,转化体的细菌细胞破坏液或纯化的酶蛋白。
编码经修饰的链球菌溶血素O的DNA
本发明的另一个实施方案是DNA,其是以下DNA(e)至(i)之一:
(e)编码上述本发明的SLO的氨基酸序列的DNA;
(f)包含以下碱基序列的DNA,所述碱基序列具有在SEQ ID NO:2中在5′端侧的0,3,6或9个碱基的缺失(N端的atg序列除外),并且还具有在3′端侧的3n(n是0至7的整数)个碱基的缺失;
(g)DNA,其包含与SEQ ID NO:2所示碱基序列具有80%以上同一性的碱基序列,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽;
(h)DNA,其在严格条件下与跟SEQ ID NO:2所示的碱基序列互补的碱基序列杂交,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽;和
(i)DNA,其包含在SEQ ID NO:2所示的碱基序列中具有一个或多个碱基的置换,缺失,***和/或添加的碱基序列,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽。
在DNA(e)中,本发明的SLO的氨基酸序列是上述(a)~(d)中任一项所示的SLO的氨基酸序列。在本发明的DNA中,当存在多个对应于上述氨基酸序列中的各个氨基酸的密码子时,其选择不受特别限制。
在DNA(f)中,SEQ ID NO:2编码由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的全长型SLO的甲硫氨酸和对应于位置32至471的部分。推定在SEQ ID NO:2的5′端侧,除了起始密码子之外,具有3个碱基的缺失的序列编码SEQ ID NO:1中的N33-C471。类似地,推定具有在5′端侧的6个碱基的缺失的序列编码N34-C471,并且推定具有在5′端侧的9个碱基的缺失的序列编码N35-C471。
此外,推定在3′端侧具有3n(n为1)个碱基的缺失的序列编码SEQ ID NO:1中的N32-C470。此外,推定在3′端侧具有3n(n为2)个碱基的缺失的序列编码N32-C469,推定在3′端侧具有3n(n为3)个碱基的缺失的序列编码N32-C468,推定在3′端侧具有3n(n为4)个碱基的缺失的序列编码N32-C467,推定在3′端侧具有3n(n为5)个碱基的缺失的序列编码N32-C466,推定在3′端侧具有3n(n为6)个碱基的缺失的序列编码N32-C465,推定在3′端侧具有3n(n为7)个碱基的缺失的序列编码N32-C464。
在本发明的DNA中,5′端缺失和3′端缺失的组合没有特别限制。优选的实例包括编码以上作为本发明的SLO中N端缺失和C端缺失的组合的实例提及的那些的DNA。
本发明的DNA不限于上述(e)和(f),并且还包括以下:
(g)DNA,其包含与SEQ ID NO:2所示碱基序列具有80%以上同一性的碱基序列,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽;
(h)DNA,其在严格条件下与跟SEQ ID NO:2所示的碱基序列互补的碱基序列杂交,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽;和
(i)DNA,其包含在SEQ ID NO:2所示的碱基序列中具有一个或多个碱基的置换,缺失,***和/或添加的碱基序列,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽。
这是因为如果编码蛋白质的DNA的碱基序列的部分突变,并且如果蛋白质的氨基酸序列的部分因此突变,突变蛋白质通常在功能上等同于原始蛋白质。
此外,这是因为当通过将编码本发明的SLO的DNA结合到除了所述DNA所来源的生物体以外的宿主生物(例如,大肠杆菌)中来表达本发明的SLO时,碱基序列可以是根据宿主生物的密码子使用而改变,以提高表达效率。参考例如Kazusa DNA Research Institute发布的数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/)来对密码子进行优化。
例如,当选择大肠杆菌作为宿主生物时,可以使用人工序列,如SEQ ID NO:3。
在DNA(g)中,与SEQ ID NO:2所示的碱基序列的同一性优选为80%以上。同一性优选为85%以上,更优选为90%以上,甚至更优选为95%以上,再更优选为98%以上,进一步更优选为99%以上。
碱基序列同一性可使用市售分析工具或通过电子通信线路(因特网)获得的那些来计算。在本说明书中,通过在BLAST网站中选择blastn并使用默认参数来确定同一性,BLAST网站是由National Center for Biotechnology Information (NCBI)发布的同源性检索程序。
在DNA(h)中,“严格条件”通常是指形成所谓的特异性杂交体并且不形成非特异性杂交体的条件。这种严格条件是本领域技术人员已知的,并且可以参考例如MolecularCloning(Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)来设定。
在本说明书中,“严格条件”是指,例如,以下条件:使用杂交液(50%甲酰胺,10xSSC(0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH 7.0),5xDenhardt溶液,1%SDS,10%硫酸葡聚糖,10μg/ml改良鲑鱼***DNA和50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5))在约42℃至约50℃进行温育;然后,使用0.1x SSC和0.1%SDS在约65℃至约70℃进行洗涤。
更优选的严格条件如下:使用50%甲酰胺和5xSSC(0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH7.0),1x Denhardt溶液,1%SDS,10%硫酸葡聚糖,10μg/ml改良鲑鱼***DNA和50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)作为杂交液在约42℃至约50℃进行温育;然后,使用0.1x SSC和0.1%SDS在约65℃至约70℃进行洗涤。
在这种条件下杂交的DNA可以包括在中间形成终止密码子的DNA,以及由于活性中心的突变而丧失活性的DNA。然而,通过将DNA结合到市售的活性表达载体中,允许所述DNA在合适的宿主中表达,并通过已知方法测量酶活性,可以容易地除去它们。
在DNA(i)中,“更多氨基酸”的数量的下限是2。其上限不受限制,只要保持由DNA编码的多肽的针对ASO的抗原活性,但优选在不显著损害氨基酸残基的蛋白质空间构型和对ASO的抗原活性的范围内。例如,上限是对应于小于修饰前的多肽的所有氨基酸的20%的数目,优选小于15%,更优选小于10%,甚至更优选小于5%,还更优选小于1%。换句话说,氨基酸的数目是,例如,264或更少(对应于所有氨基酸的20%的碱基数目),优选198或更少(15%),更优选132或更少(10%),甚至更优选66或更少(5%),再更优选40或更少,再更优选20或更少,再更优选15或更少,再更优选为10或更少,再更优选5或更少,再更优选4或更少,进一步再更优选3或更少。
通过以下来确定某种DNA是否编码针对ASO具有抗原活性的多肽:将DNA结合到市售的活性表达载体中,使DNA在合适的宿主中表达,并通过后面描述的“测量SLO的抗原活性的方法”测量所得多肽的针对ASO的抗原活性。
本发明的另一个实施方案是DNA,其是以下DNA(k)至(n)之一:
(k)DNA,其包含以下碱基序列,所述碱基序列具有在SEQ ID NO:3中在5′端侧的0,3,6或9个碱基的缺失,并且还具有在3′端侧的3n(n是0至7的整数)个碱基的缺失;
(1)DNA,其包含与SEQ ID NO:3所示碱基序列具有80%以上同一性的碱基序列,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽;
(m)DNA,其在严格条件下与跟SEQ ID NO:3所示的碱基序列互补的碱基序列杂交,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽;和
(n)DNA,其包含在SEQ ID NO:3所示的碱基序列中具有一个或多个碱基的置换,缺失,***和/或添加的碱基序列,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽。
在DNA(k)至(n)中,当编码本发明的SLO的DNA被结合到除了所述DNA所来源的生物体以外的宿主生物中并为了提高表达效率根据宿主生物的密码子使用改变碱基序列而在其中表达时,获得SEQ ID NO:3。SEQID NO:3被例示为当选择大肠杆菌作为宿主生物时优选应用的。
上述关于DNA(f)至(i)的内容经必要的变更应用于DNA(k)至(n)中碱基缺失的解释,计算碱基序列同一性的方法的解释,对严格条件的解释,确定DNA是否编码针对ASO具有抗原活性的多肽的方法的解释,对突变数目的上限/下限的解释等。
产生链球菌溶血素O等的方法
本发明的另一个实施方案是结合本发明DNA的载体,含有所述载体的转化体,或产生SLO的方法,所述方法包括培养所述转化体。
通过将SLO的基因***合适的载体中以制备重组载体,用所述重组载体转化合适的宿主细胞以制备转化体,并培养所述转化体,可以容易地制备本发明的SLO。
载体没有特别限制,只要其能够在各种宿主细胞如原核细胞和/或真核细胞中复制和保持或自主复制即可。实例包括质粒载体,噬菌体载体,病毒载体等。重组载体的制备可以通过常规方法进行,但不特别限于此。例如,通过使用合适的限制酶和连接酶,以及任选地另外的接头或适体DNA将本发明的SLO的基因与上述载体连接,可以容易地制备重组载体。此外,通过使用其中一个碱基加入到扩增末端的DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的扩增产生的基因片段可以通过TA克隆与载体连接。
此外,宿主细胞可以是常规已知的宿主细胞,并且不受特别限制,只要建立重组表达***即可。优选的实例包括微生物,如大肠杆菌(Escherichia coli),枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),放线菌属(Actmomyces),曲霉属(Aspergillus)和酵母,以及昆虫细胞,动物细胞,高等植物等;更优选微生物;并且特别优选大肠杆菌(例如,K12菌株和B菌株)。转化体的制备可以通过常规方法进行,但不特别限于此。当宿主是大肠杆菌时,其可用的实例包括大肠杆菌C600,大肠杆菌HB101,大肠杆菌DH5α,大肠杆菌JM109和大肠杆菌BL21;并且载体的实例包括pBR322,pUC19,pBluescript,pQE和pET。当宿主是酵母时,其实例包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevlsiae),粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe),产蛋白假丝酵母(Candida utilis)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris);载体的实例包括pAUR101,pAUR224和pYE32。当宿主是丝状真菌细胞时,其实例包括米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niniger)。
当在取决于宿主细胞的合适的培养条件下培养所获得的转化体一段时间时,本发明的SLO由结合的基因表达,并在转化体中积累。
积累在转化体中的本发明的SLO可以不经纯化而使用,但可以在纯化后使用。纯化方法没有特别限制,可以使用常规已知的方法。例如,可以通过以下进行纯化:将培养后的转化体或其培养产物在合适的缓冲液中匀浆处理,进行超声处理、表面活性剂处理等以获得细胞提取物,并通过适当组合通常用于分离和纯化蛋白质的分离技术处理细胞提取物。这种分离技术的实例包括但不限于使用溶解度差异的方法,如盐析和溶剂沉淀方法;使用分子量差异的方法,如透析,超滤,凝胶过滤,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE);使用电化的方法,如离子交换色谱和羟基磷灰石色谱;使用特异性亲和力的方法,如亲和色谱;使用疏水差异的方法,如反相高压液相色谱;使用等电点差异的方法,如等电聚焦;等等。纯化的酶制剂可以例如通过以下获得:使用Sephadex凝胶(GE Healthcare Bioscience生产)等,在DEAE Sepharose CL-6B(由GEHealthcare Bioscience生产),Octyl Sepharose CL-6B(由GE Healthcare Bioscience生产)等上的柱色谱进行分离和纯化。
链球菌溶血素O的交联
本发明的另一个实施方案是通过交联本发明的SLO获得的交联的SLO。
SLO可以共价键合到双官能物质上以稳定化。因此,本发明的经修饰的SLO也可以共价键合到双官能物质上。这种双官能物质的实例包括戊二醛和碳二亚胺。因为戊二醛的醛基和氨基反应形成的Schiff碱在水溶液中不稳定,所以可以使用氰基硼氢化钠钠或硼氢化钠进行还原胺化反应。共价键合在物理上是不可逆的;具体而言,共价键不受pH或温度变化的影响。在交联处理中,需要设定缓冲液的种类,pH,处理温度,处理时间,SLO浓度和双官能物质浓度。但是,可以使用对SLO和交联的SLO没有不利影响的条件,并且没有特别限制。实例如下所示。缓冲液的实例包括乙酸盐缓冲液,Good′s缓冲液如MES缓冲液和PIPES缓冲液,磷酸盐缓冲液,Tris-HCl缓冲液,硼酸盐缓冲液,甘氨酸缓冲液等。pH优选为5至11,更优选为6至10。温度优选为4℃至40℃,更优选10℃至30℃。蛋白质浓度优选为0.1mg/ml至100mg/ml,并且更优选为1mg/ml至10mg/ml。反应时间优选为1分钟至24小时,并且更优选为10分钟至5小时。交联反应中的双官能物质的浓度优选为0.0001%-1%,并且更优选为0.001%-0.1%。在交联反应后,可以加入终浓度为0.1%至10%的甘氨酸,以防止未交联的戊二醛的进一步反应。
胶乳颗粒
本发明的另一个实施方案是用本发明的SLO或交联的SLO涂覆的胶乳颗粒。
用于本发明的胶乳颗粒没有特别限制。实例包括聚苯乙烯,苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物,甲基丙烯酸聚合物,丙烯酸聚合物,丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物,氯乙烯-丙烯酸酯共聚物,聚乙酸乙烯酯丙烯酸酯等。胶乳颗粒的平均粒径没有特别限制;然而,考虑到测试样品中测试物质的浓度或测量设备的检测灵敏度,适当地选择平均粒径为0.05μm至1.0μm的胶乳颗粒。
其中固定抗原的胶乳颗粒
将经修饰的SLO固定在本发明的胶乳颗粒中的方法没有特别限制,并且可以适当选择物理吸附(疏水结合)方法,化学结合方法等。在物理吸附(疏水结合)方法中,可以形成聚半抗原用于吸附。在化学结合方法中,可以将结合官能团如马来酰亚胺基团引入抗原中。当抗原吸附到胶乳上时,需要设定缓冲液种类,pH,处理温度,处理时间和SLO浓度;但是,这些没有特别限制。实例如下所示。缓冲液的实例包括乙酸盐缓冲液,Good′s缓冲液如MES缓冲液和PIPES缓冲液,磷酸盐缓冲液,Tris-HC1缓冲液,硼酸盐缓冲液,甘氨酸缓冲液等。pH优选为5至11,更优选为6至10。温度优选为4℃至40℃,更优选10℃至30℃。SLO浓度优选为0.01mg/ml至30mg/ml,并且更优选为0.1mg/ml至3mg/ml。反应时间优选为1分钟至24小时,并且更优选为10分钟至5小时。为了防止非特异性反应并提高免疫测定试剂本身的稳定性,可以在含有一种或多种添加剂的状态下将SLO吸附到胶乳上,但是并不特别限于此。
测量试剂
本发明的另一个实施方案是使用本发明的胶乳颗粒或包含本发明的胶乳颗粒的ASO测量试剂测量ASO的方法。
本发明还包括使用本发明的免疫测定试剂的免疫测定。本发明的免疫测定可以通过一般方法进行,并且没有特别限制,只要其使用本发明的免疫测定试剂即可。例如,将本发明的免疫测定试剂加入到含有待测物质的介质中,并在光学上或视觉上观察到由于抗原-抗体反应待测物质和固定在本发明免疫测定试剂中所含的胶乳颗粒上的抗原之间的键合产生的聚集。反应过程中的pH下限优选为5,更优选为6;反应过程中的pH上限优选为10,更优选为9。反应过程中的温度下限优选为4℃,更优选为20℃;反应过程中的温度上限优选为50℃,更优选为40℃。可以适当地确定反应时间。
作为上述介质,根据待测物质的类型使用各种合适的缓冲液。这些缓冲液可以是那些不使待测物质失活,并且具有不抑制抗原-抗体反应的离子浓度和pH的缓冲液。这种缓冲液的实例包括已知的缓冲液,如磷酸盐缓冲液,甘氨酸缓冲液,硼酸盐缓冲液,Tris-HCl缓冲液和各种Good′s缓冲液。这些缓冲剂可以单独使用,也可以两种以上组合使用。
为了提高反应的灵敏度,上述介质可含有已知的水溶性添加剂,如聚乙二醇,羧甲基纤维素,甲基纤维素,葡聚糖,聚乙烯吡咯烷酮,聚糖基乙基甲基丙烯酸酯,支链淀粉,葡聚糖,elsinan等水溶性聚合物。此外,为了提高特异性,试剂稳定性等,介质还可以含有蛋白质,如白蛋白,酪蛋白和明胶,或其分解产物或其经修饰的产物;季铵盐,如氯化胆碱;EDTA,聚阴离子,离液离子(Cl-,I-,SCN-等),氨基酸,表面活性剂等。此外,介质还可含有防腐剂,如叠氮化钠或苯基甲磺酰氟。
检测由上述抗原-抗体反应产生的聚集程度的方法没有特别限制。例如,可以通过光学观察或视觉观察来检测聚集程度。具体地,作为光学检测不溶性载体的聚集度的方法,例如,测量散射光强度,吸光度或透射光强度的增加或减少。作为通过视觉观察的测定方法,例如,将样品和本发明的免疫测定试剂在测定板上混合,将板摇动1至5分钟,然后确定聚集的存在。备选地,可以拍摄图像并进行图像处理。
测量SLO抗原活性的方法
在本发明中,测量SLO的抗原活性的方法在以下条件下进行。在这种测定抗原活性的方法中,允许固定有SLO的胶乳颗粒和测试样品中的SLO(测试物质)竞争抑制胶乳颗粒和抗体的免疫复合物的形成,并且通过与免疫复合物形成的抑制相关联的胶乳颗粒的聚集的抑制程度来测量测试物质(抗原)。除非另外特别说明,否则本说明书中使用的术语“抗原活性”具体是指通过以下方法测量的值。
-试剂
ASO Latex Xl“Seiken”R1试剂(缓冲液),由Denka Seiken Co.,Ltd生产。
ASO Latex Xl“Seiken”R2试剂(胶乳(SLO吸附胶乳)悬浮液),由Denka SeikenCo.,Ltd生产。
ASO标准溶液(500IU/ml),由Denka Seiken Co.,Ltd生产。
-测量样品
通过将ASO标准溶液(500IU/ml,由Denka Seiken Co.,Ltd.生产),生理盐水和SLO溶液以5∶4∶1的比例混合来制备测量样品。此外,根据需要,在用20mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.5)稀释后使用SLO溶液。在盲测试中,使用用于稀释SLO的20mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.5)代替SLO溶液。
-测量方法
使用测量样品,R1试剂和R2试剂,使用Hitachi 7170Autoanalyzer在以下条件下测量样品中SLO针对ASO的抗原活性(SAU/mg:链球菌溶血素O抗原单位/mg)。
样品:3μL(含ASO标准溶液(250IU/ml))
R1试剂:70μL
R2试剂:120μL
测量方法:两点终点法(19-34)
主波长:570nm
互补波长:800nm
抗原活性(SAU/mg)
={(测量值(空白)-测量值(测试)}x10xSLO溶液/蛋白质浓度(mg/ml)的稀释比
下面参考实施例更详细地描述本发明。
实施例1
实施例1:SLO基因的克隆
使用SEQ ID NO:2中所示的人工合成基因(登录号:NC003485)作为模板,使用表1中所示的引物(表1中,Fw表示正向引物,Rv表示反向引物)扩增各种SLO基因。具体地,使用SEQ ID NO:4和6的引物扩增编码SLO的基因(其中起始密码子和组氨酸标签后面是位置32的谷氨酸残基和作为末端的位置464的赖氨酸残基)(也称为“N32-C464”)。类似地,分别使用SEQ ID NO:4和7,SEQ ID NO:4和8,SEQ ID NO:5和6,SEQ ID NO:5和7,SEQ ID NO:5和8,SEQ ID NO:4和9以及SEQ ID NO:4和10的引物扩增编码各种SLO(即,N32-C466,N32-C471,N35-C464,N35-C466,N35-C471,N32-C560和N32-C571)的基因。将限制酶位点NdeI添加到这些引物的N端侧,并将限制酶位点BamHI添加到C端侧。用限制酶NdeI和BamHI切割该DNA片段,并与用相同酶切割的载体质粒pBSK混合。加入与混合溶液相同量的连接试剂(Ligationhigh,由Toyobo Co.,Ltd.生产),并进行温育,从而进行连接。被设计成能够表达大量SLO基因的重组质粒pBSKSLO(N32-C464,N32-C466,N32-C471,N35-C464,N35-C466,N35-C471,N32-C560,和N32-C571)以这种方式获得。
表1
实施例2
实施例2:各种SLO基因在大肠杆菌中的表达和纯化
使用实施例1中构建的各种质粒,转化大肠杆菌JM 109菌株感受态细胞(Competent High JM109,由Toyobo Co.,Ltd.生产)(根据该产品所附的方案),从而获得转化体。将获得的每个转化体的菌落接种到已在试管中灭菌的5mL LB液体培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素)中,并在30℃振荡培养16小时进行需氧培养。将得到的用作种子培养液的培养液接种于置于500ml Sakaguchi烧瓶中的100mL TB培养基(含有1mM IPTG和50μg/mL氨苄青霉素)中,在30℃以180rpm的振荡速度培养20小时。通过离心分离收集如此获得的细菌细胞,悬浮在含有20mM咪唑的25mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.5)中,并用玻璃珠粉碎。将获得的粗酶施用于用含有20mM咪唑的25mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.5)平衡的1-mL HisTrap HP柱(由GE Healthcare Bioscience生产),并用含有500mM咪唑的25mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.5)洗脱以除去N32-C560的表达构建体,从而得到高纯度的链球菌溶血素溶液。此外,为了提高纯度,使用5-mL CM-FF柱(GE healthcare Bioscience)进行分离和纯化,从而成功提高纯度,从而在SDS-PAGE水平不会检测到不纯的蛋白质。图1显示了使用上面制备的每种样品的SDS-PAGE结果。在由于缺失11个C端残基而产生的N32-C560的表达构建体中,在1-mLHisTrap HP柱(由GE Healthcare Bioscience生产)的洗脱级分中,除了全长型的条带外,还证实了低分子量型SLO,其似乎是降解产物(图2)。
实施例3
实施例3:溶血活性的评估
测量实施例2中制备的每种SLO溶液的溶血活性。作为测量方法,首先,将用含有20mM半胱氨酸的PBS溶液稀释的50μl SLO加入1ml用PBS溶液稀释至2%的兔去纤维蛋白血液(由Nippon Bio-Test Laboratories Inc.生产)中,并且将混合物在37℃反应1小时。测量过程中每种SLO溶液的蛋白质浓度为1.0mg/ml。如表2所示,对于全长型SLO(N32-C571),检测到显示溶血度的541nm处的吸光度(A541)。经修饰的SLO和空白之间没有显著差异,并且证实经修饰的SLO丧失了溶血活性。
表2
样品 | A<sub>541</sub> | 溶血活性 |
空白 | 0.085 | - |
N32-C464(1.0mg/ml) | 0.081 | - |
N32-C466(1.0mg/ml) | 0.083 | - |
N32-C471(1.0mg/ml) | 0.086 | - |
N35-C464(1.0mg/ml) | 0.087 | - |
N35-C466(1.0mg/ml) | 0.089 | - |
N35-C471(1.0mg/ml) | 0.079 | - |
N32-C571(1.0mg/ml) | 1.920 | + |
实施例4
实施例4:抗原活性的测量
使用实施例2中制备的每种SLO溶液和Biokit生产的SLO(代码:T3000-5258)测量抗原活性。图3显示了Biokit SLO的SDS-PAGE结果。已证实Biokit SLO的分子量比全长型SLO的分子量高约40kDa。由于该结果表明融合蛋白的可能性,Biokit SLO在本说明书中也称为“融合型”。图4显示了抗原活性的测量结果。测量过程中SLO溶液的蛋白质浓度对于经修饰的SLO为0.08mg/ml,对于全长型SLO为0.11mg/ml,对于BiokitSLO为0.16mg/ml。经修饰的SLO显示出比全长型SLO更高的抗原活性。这些结果表明在约100个氨基酸残基的缺失区域中没有重要的表位。还证实Biokit SLO的抗原活性低于全长型SLO的抗原活性。
实施例5
实施例5:热稳定性的评价
使用实施例2中制备的每种SLO溶液和Biokit生产的SLO(代码:T3000-5258),通过测量热处理后的抗原活性来评价热稳定性。图5显示了结果。测量过程中每种SLO溶液的蛋白质浓度为2.0mg/ml,并且在每个温度下进行处理6小时。然后,测量抗原活性以评估热稳定性。结果,证实经修饰的SLO具有比全长型SLO更高的热稳定性,并且实际上获得了有益的特性。还证实,经修饰的SLO的热稳定性优于Biokit SLO(代码:T3000-5258)。
实施例6
实施例6:大肠杆菌表达中的密码子使用优化
优化密码子使用以改善大肠杆菌中的表达水平。人工合成的序列由SEQ ID NO:3表示。以与实施例1和2相同的方式构建表达质粒。表3显示了用于构建质粒的引物。使用构建的质粒,转化大肠杆菌JM 109菌株感受态细胞(Competent high JM109,由Toyobo Co.,Ltd.生产)(根据该产品所附的方案),从而获得转化体。将获得的转化体的菌落接种到已在试管中灭菌的5mL LB液体培养基(含有50μg/mL氨苄青霉素)中,并在30℃振荡培养16小时进行需氧培养。将得到的用作种子培养液的培养液接种于置于500ml Sakaguchi烧瓶中的100mL TB培养基(含有1mM IPTG和50μg/mL氨苄青霉素)中,在30℃以180rpm的振荡速度培养20小时。结果,证实了约300mg/L的经修饰的SLO的表达。该值对应于密码子使用优化之前的值的约两倍。已经证实通过密码子序列优化提高了生产率。
表3
实施例7:评价胶乳比浊试剂中的灵敏度
将实施例2中制备的每种SLO溶液和Biokit生产的SLO(代码:T3000-5258)制备成2.2mg/mL的浓度,并加入最终浓度为0.1%的25%戊二醛溶液(由Sigma生产,代码:G5882)。接下来,将溶液在室温下机械搅拌1小时。此后,加入甘氨酸至终浓度为0.1%。接下来,将溶液在室温机械搅拌30分钟,然后在4℃储存过夜。此后,通过Bradford方法测定蛋白质浓度,并将溶液涂覆在胶乳颗粒上。涂覆条件如下。将包含50mM硼酸盐缓冲液(pH 8.2)的缓冲液混合,使得交联的SLO的最终浓度为0.3至0.7mg/ml,如图6所示,并且涂覆处理在37℃进行1小时。此后,使用含有150mM NaC1和0.5%BSA的50mM甘氨酸缓冲液(pH 8.2)重复包括离心,去除上清液以及悬浮在内的洗涤步骤两次,从而获得胶乳比浊试剂中的第二试剂。作为第一试剂,制备包含20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.2),150mM NaCl和0.5%BSA的缓冲液,并评价胶乳试剂的灵敏度。作为测量方法,组合第一和第二试剂,并使用Hitachi7170Autoanalyzer测定依赖于ASO浓度的颗粒聚集体的形成。具体地,将240μL第一试剂加入3μL浓度为0(IU/mL),250(IU/mL)或500(IU/mL)的ASO溶液中,并将每种混合物在37℃加热5分钟;然后,加入60μL的第二试剂,搅拌各混合物。然后,在546nm的主波长和800nm的互补波长下测量与聚集体形成相关的吸光度变化(ΔmAb)持续5分钟。结果,当在胶乳上涂覆期间的SLO浓度为0.7mg/ml且ASO浓度为500(IU/ml)时,Biokit SLO的ΔmAb为78.1,并且全长型SLO的ΔmAb为66.9,而本发明的经修饰的SLO的ΔmAb为183.1,比其他SLO的ΔmAb高约2至3倍。此外,当SLO浓度为0.5mg/ml且ASO浓度为500(IU/ml)时,Biokit SLO的AmAb为60.2,全长型SLO的ΔmAb为38.9,而本发明的经修饰的SLO的ΔmAb为114.2,比其他SLO的ΔmAb高约2至3倍。这些结果表明,本发明的经修饰的SLO具有高的每蛋白的抗原活性,并且可以减少用于生产ASO试剂的SLO的量。
工业实用性
本发明的经修饰的SLO可用作用于具有优异抗原活性和热稳定性的ASO试剂的诊断原料。
Claims (10)
1.包含以下多肽(a)至(d)之一的链球菌溶血素O:
(a)包含以下氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列具有从SEQ ID NO:1的位置2的丝氨酸残基延伸至位置31的丙氨酸残基,位置32的谷氨酸残基,位置33的丝氨酸残基,和位置34的天冬酰胺残基中任一的多肽的缺失,并且还具有SEQ ID NO:1的位置465的异亮氨酸残基至位置472的丙氨酸残基中任一和所有随后氨基酸残基的缺失;
(b)在(a)中所示的氨基酸序列的N端或C端区域具有一个或多个标签的多肽;
(c)多肽,所述多肽包含在(a)中所示的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸残基的置换,缺失,***和/或添加的氨基酸序列,并且具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性;和
(d)多肽,所述多肽包含与(a)中所示的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列,并且具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性。
2.DNA,其是以下DNA(e)至(i)之一:
(e)DNA,其编码权利要求1中所示的氨基酸序列;
(f)DNA,其包含碱基序列,所述碱基序列具有SEQ ID NO:2中在5′端侧的0,3,6或9个碱基的缺失,N端的atg序列除外,并且还具有在3′端侧的3n(n是0至7的整数)个碱基的缺失;
(g)DNA,其包含与SEQ ID NO:2所示的碱基序列具有80%以上同一性的碱基序列,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽;
(h)DNA,其在严格条件下与跟SEQ ID NO:2所示的碱基序列互补的碱基序列杂交,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽;和
(i)DNA,其包含在SEQ ID NO:2所示的碱基序列中具有一个或多个碱基的置换,缺失,***和/或添加的碱基序列,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽。
3.DNA,其是以下DNA(k)至(n)之一:
(k)DNA,其包含碱基序列,所述碱基序列具有SEQ ID NO:3中在5′端侧的0,3,6或9个碱基的缺失,N端的atg序列除外,并且还具有在3′端侧的3n(n是0至7的整数)个碱基的缺失;
(l)DNA,其包含与SEQ ID NO:3所示碱基序列具有80%以上同一性的碱基序列,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽;
(m)DNA,其在严格条件下与跟SEQ ID NO:3所示的碱基序列互补的碱基序列杂交,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽;和
(n)DNA,其包含在SEQ ID NO:3所示的碱基序列中具有一个或多个碱基的置换,缺失,***和/或添加的碱基序列,并且编码具有针对抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的抗原活性的多肽。
4.包含权利要求2或3的DNA的载体。
5.含有权利要求4的载体的转化体。
6.用于制备权利要求1的链球菌溶血素O的方法,所述方法包括培养权利要求5的转化体。
7.通过交联权利要求1的链球菌溶血素O获得的交联的链球菌溶血素O。
8.涂覆有权利要求1的链球菌溶血素O或权利要求7的交联的链球菌溶血素O的胶乳颗粒。
9.用于测量抗链球菌溶血素O抗体(ASO)的方法,所述方法使用权利要求8的胶乳颗粒。
10.抗链球菌溶血素O抗体(ASO)测量试剂,其包含权利要求8的胶乳颗粒。
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