WO2017204325A1 - 改変型ストレプトリジンo - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to streptolysin O (hereinafter also referred to as SLO in the present specification) and uses thereof. Specifically, the present invention relates to streptolysin O, a bacterium that produces the protein, a method for producing the protein, and anti-streptolysin O (anti streptolysin O) using the protein (hereinafter also referred to as ASO in this specification). It relates to the measurement method.
- SLO is a protein having hemolytic activity produced by Streptococcus pyogenes outside the cells, and is widely used as a raw material for ASO measurement reagents for diagnosing the presence or absence of hemolytic streptococci.
- Non-Patent Document 1 In Non-Patent Document 1, full-length SLO is described as high-molecular-weight SLO. In Non-Patent Document 1, productivity is improved by using recombinant Escherichia coli, but the ratio of full-length SLO (hereinafter also referred to as Full length type in this specification) and low molecular weight SLO is an industrial scale. It is difficult to control with this, and the problem of quality stability has not been overcome.
- Non-Patent Document 2 Since SLO is a protein having hemolytic activity, it is desired to reduce the hemolytic activity from the viewpoint of the manufacturer's safety. If several amino acid residues at the C-terminus are deleted, the hemolytic activity is reduced. Has been reported (Non-Patent Document 2).
- the present invention was devised in view of the current state of the prior art.
- the purpose of the present invention is to produce an epitope equivalent to natural SLO because of the high productivity of SLO and the absence of a mixture of full-length SLO and low molecular weight SLO. It is to provide an SLO having. Further, from the viewpoint of production, an SLO having no hemolytic activity and high thermal stability is desired, and an object is to provide an SLO having such characteristics.
- the present inventor has intensively studied the SLO expression region, and as a result, has found an SLO that overcomes both problems. Specifically, in order to prevent mixing of full-length SLO and low molecular weight SLO, a modified SLO lacking the C-terminal region (hereinafter also referred to as Fragment type in this specification) was expressed. Although this modified SLO was concerned about the problem of epitope loss, surprisingly, the present inventor lost antigen activity even when the region of about 100 amino acid residues on the C-terminal side of full-length SLO was deleted. Rather, it was confirmed that the antigenic activity per protein was improved relative to full-length SLO.
- Fragment type in this specification
- SLO comprising the polypeptide of any of the following (a) to (d); (A) a polypeptide from the serine residue at position 2 to any one of the alanine residue at position 31, the glutamic acid residue at position 32, the serine residue at position 33, or the asparagine residue at position 34 in SEQ ID NO: 1 And a polypeptide comprising an amino acid sequence from which any of the amino acid residues subsequent to the alanine residue at position 472 to the alanine residue at position 472 is deleted.
- (B) A polypeptide having one or more tags in the N-terminal region or C-terminal region of the amino acid sequence shown in (a) above.
- (C) the amino acid sequence shown in (a) above, consisting of an amino acid sequence obtained by substitution, deletion, insertion and / or addition of one or several amino acid residues, and against anti-streptridine O antibody (ASO) A polypeptide having antigenic activity.
- (D) A polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in (a) above and having an antigenic activity against an anti-streptridine O antibody (ASO).
- [Section 2] DNA of any of the following (e) to (i): (E) DNA encoding the amino acid sequence shown in item 1.
- (H) a polypeptide that hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and has an antigenic activity against an anti-streptridine O antibody (ASO) DNA encoding (I) a base sequence in which one or several bases are substituted, deleted, inserted and / or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and an antigen against anti-streptridine O antibody (ASO) DNA encoding a polypeptide having activity.
- ASO anti-streptridine O antibody
- ASO anti-streptridine O antibody
- (M) a polypeptide that hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and has an antigenic activity against an anti-streptridine O antibody (ASO) DNA encoding
- ASO anti-streptridine O antibody
- N A nucleotide sequence in which one or several bases are substituted, deleted, inserted and / or added in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, and an antigen against anti-streptridine O antibody (ASO) DNA encoding a polypeptide having activity.
- [Claim 7] A crosslinked SLO obtained by crosslinking the SLO of Item 1.
- [Section 8] Item 10. Latex particles coated with the SLO of Item 1 or the crosslinked SLO of Item 7.
- [Claim 9] Item 9.
- a reagent for measuring anti-streptridine O antibody (ASO) comprising the latex particles according to Item 8.
- the modified SLO of the present invention is useful as a diagnostic agent raw material used for an ASO reagent having excellent antigen activity and thermal stability.
- One embodiment of the present invention is an SLO comprising a polypeptide of any one of the following (a) to (d).
- A a polypeptide from the serine residue at position 2 to any one of the alanine residue at position 31, the glutamic acid residue at position 32, the serine residue at position 33, or the asparagine residue at position 34 in SEQ ID NO: 1 And a polypeptide comprising an amino acid sequence from which any of the amino acid residues subsequent to the alanine residue at position 472 to the alanine residue at position 472 is deleted.
- B A polypeptide having a tag in the N-terminal region or C-terminal region of the amino acid sequence shown in (a) above.
- (C) the amino acid sequence shown in (a) above, consisting of an amino acid sequence obtained by substitution, deletion, insertion and / or addition of one or several amino acid residues, and against anti-streptridine O antibody (ASO) A polypeptide having antigenic activity.
- (D) A polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in (a) above and having an antigenic activity against an anti-streptridine O antibody (ASO).
- SEQ ID NO: 1 is the full length of SLO (full length SLO) and consists of 571 amino acids.
- the 1st position of SEQ ID NO: 1 is an N-terminal methionine, and the SLO of the present invention has 2 to 31 positions, 2 to 32 positions, 2 to 33 positions, and 2 to 34 positions on the N terminal side.
- One of the group consisting of is missing.
- From the N-terminal to 31 residues is a secretion signal, and when the SLO of the present invention is expressed in microbial cells by Gram-negative bacteria such as Escherichia coli, it is preferably deleted. When expressed outside the cells, an appropriate secretion signal suitable for the host may be given.
- the SLO of the present invention has 465 to 571, 466 to 571, 467 to 571, 468 to 571, 469 to 571, 469 to 571, 470 to 571, 471 on the C-terminal side.
- One of the groups consisting of 571 from position and 472 to 571 is missing.
- a polypeptide comprising the N-terminal 32nd position to the C-terminal 464th position is a polypeptide.
- such a polypeptide is also represented as N32-C464 by connecting the numbers indicating the amino acid positions at both ends with hyphens).
- N32-C464, N32-C466, N32-C471, N35-C464, N35-C466, N35-C471 and the like are also preferable.
- the SLO of the present invention is not limited to the above (a), (B) A polypeptide having one or more tags in the N-terminal region or C-terminal region of the amino acid sequence shown in (a) above. (C) Substitution, deletion, insertion and / or addition of one or several amino acid residues in the amino acid sequence shown in (a) above (in the present specification, these are also collectively referred to as “modification”).
- the tag is not particularly limited, and examples include affinity tags such as His tag, HQ tag, HN tag, HAT tag, GST tag, MBP tag, and Strep (II) tag. It is preferable to select one or more of these. Among these, from the viewpoint that the function as an epitope is not affected as much as possible, a His tag, an HQ tag, an HN tag, a HAT tag, a Strep (II) tag, and the like are preferable.
- the method for inserting the tag at the N-terminus is not particularly limited, but it is preferable that the tag be inserted immediately below the N-terminal methionine residue. A tag may be inserted after several amino acid residues.
- the number of amino acid residues is not particularly limited, but a preferable upper limit is 20 residues or less, more preferably 10 residues or less, more preferably 5 residues or less, and a lower limit may be 1 residue or more.
- the method for inserting the tag into the C-terminus is not particularly limited, but it is preferable that the tag is inserted immediately before the stop codon. A tag may be inserted before several amino acid residues.
- the number of amino acid residues is not particularly limited, but a preferable upper limit is 20 residues or less, more preferably 10 residues or less, more preferably 5 residues or less, and a lower limit may be 1 residue or more. Further, when a tag is included in the expression vector backbone, the gene sequence may be appropriately deleted.
- the lower limit of “several” is two.
- the upper limit is not limited as long as the antigenic activity against ASO is maintained, but it is preferably within a range that does not significantly impair the three-dimensional structure of the amino acid residue protein and the antigenic activity against ASO.
- a number corresponding to less than 20% of all amino acids preferably a number corresponding to less than 15%, more preferably a number corresponding to less than 10%, more preferably a number corresponding to less than 5%, more preferably It is a number corresponding to less than 1%.
- the number is, for example, 114 or less, preferably 86 or less, more preferably 57 or less, more preferably 29 or less, further preferably 20 or less, more preferably 15 or less, and still more preferably. Is 10 or less, more preferably 5 or less, more preferably 4 or less, and even more preferably 3 or less.
- the identity with the amino acid sequence shown in (a) is preferably 80% or more. This identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and more preferably 99% or more.
- Identities of amino acid sequences can be calculated using analysis tools that are commercially available or available through telecommunication lines (Internet). In this specification, identity is calculated by selecting blastp on the BLAST website, a homology search program published by the National Center for Biotechnology Information (NCBI), and using default (initial setting) parameters. To do.
- NCBI National Center for Biotechnology Information
- Whether or not a certain polypeptide has antigenic activity against ASO is determined according to the “method for measuring antigenic activity of SLO” described later.
- a variant of a protein having antigenic activity against ASO and its gene are, for example, Transformer Mutagenesis Kit; manufactured by Clonetech; EXOIII / Mung Bean Selection Kit; manufactured by Stratagene; It can be obtained by modifying the base sequence described in SEQ ID NO: 2 using a commercially available kit such as
- the antigenic activity of the protein encoded by the obtained gene can be determined, for example, by introducing the obtained gene into E. coli to produce a transformant, and culturing the transformant to produce an enzyme protein. This can be confirmed by measuring the cell disruption solution or purified enzyme protein of this transformant by the “method for measuring the antigenic activity of SLO” described later.
- DNA encoding modified streptolysin O Another embodiment of the present invention is any one of the following DNAs (e) to (i):
- (E) DNA encoding the amino acid sequence of the SLO of the present invention.
- (F) In SEQ ID NO: 2, 0, 3, 6 or 9 bases on the 5 ′ end side excluding the N-terminal atg sequence are deleted, and 3n on the 3 ′ end side (n is 0 to 7) DNA consisting of a base sequence from which one of the integers) is deleted.
- G A DNA encoding a polypeptide having a base sequence that is 80% or more identical to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having an antigenic activity against an anti-streptridine O antibody (ASO).
- (H) a polypeptide that hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and has an antigenic activity against an anti-streptridine O antibody (ASO) DNA encoding (I) a base sequence in which one or several bases are substituted, deleted, inserted and / or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and an antigen against anti-streptridine O antibody (ASO) DNA encoding a polypeptide having activity.
- ASO anti-streptridine O antibody
- the amino acid sequence of the SLO of the present invention is the amino acid sequence of SLO shown in any of the above (a) to (d).
- the selection is not particularly limited.
- SEQ ID NO: 2 encodes the methionine of the full-length SLO represented by the amino acid of SEQ ID NO: 1 and a portion corresponding to positions 32 to 471.
- the one lacking 3 bases on the 5 ′ end side excluding the start codon encodes N33-C471 in SEQ ID NO: 1.
- those lacking 3n (n 1) bases on the 3 ′ end side encode N32-C470 in SEQ ID NO: 1.
- those lacking 3n (n is 2) bases on the 3 ′ end side are N32-C469
- those lacking 3n (n is 3) bases on the 3 ′ end side are N32-C468
- the combination of the 5 ′ terminal deletion and the 3 ′ terminal deletion is not particularly limited, but preferred examples include the N-terminal deletion and C terminal of the SLO of the present invention described above. Examples include DNA encoding what is exemplified as a combination with a side defect.
- the DNA of the present invention is not limited to the above (e) and (f), (G) DNA encoding a polypeptide consisting of a base sequence having 80% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having an antigenic activity against anti-streptridine O antibody (ASO); (H) a polypeptide that hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and has an antigenic activity against an anti-streptridine O antibody (ASO) DNA encoding and (I) a base sequence in which one or several bases are substituted, deleted, inserted and / or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and an antigen against anti-streptridine O antibody (ASO) DNA encoding a polypeptide having activity, Is also included.
- ASO antigen against anti-streptridine O antibody
- the SLO of the present invention is expressed by incorporating the DNA encoding the SLO of the present invention into a host organism (such as E. coli) other than the source organism, in order to improve the expression efficiency, it is matched with the codon usage of the host organism. This is because the base sequence may be changed.
- codon optimization codons were optimized with reference to a list of codon usage (http://www.kazusa.or.jp/codon/) published by Kazusa DNA Research Institute. The For example, when E. coli is selected as the host organism, an artificial sequence such as SEQ ID NO: 3 can be mentioned.
- the identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is preferably 80% or more. This identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and more preferably 99% or more.
- the identity of the base sequence can be calculated using an analysis tool that is commercially available or available through a telecommunication line (Internet). In this specification, identity is calculated by selecting blastn on the BLAST website, a homology search program published by the National Center for Biotechnology Information (NCBI), and using default (initial setting) parameters. To do.
- NBI National Center for Biotechnology Information
- stringent conditions generally refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Such stringent conditions are known to those skilled in the art, and can be set with reference to, for example, Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
- stringent conditions refers to the following conditions.
- Hybridization solution 50% formamide, 10 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 5 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, 10 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA, Conditions of incubation at about 42 ° C. to about 50 ° C. using 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), followed by washing at about 65 ° C. to about 70 ° C. using 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS Can be mentioned.
- More preferable stringent conditions include 50% formamide, 5 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 1 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate as a hybridization solution. Incubate at about 42 ° C. to about 50 ° C. with 10 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), then about 65 with 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS. The conditions for washing at from about 70 ° C. to about 70 ° C. can be mentioned.
- DNA that hybridizes under such conditions may include those in which a stop codon has occurred in the middle or those that have lost activity due to mutations in the active center, but these are incorporated into commercially available active expression vectors. It can be easily removed by expressing it in a suitable host and measuring the enzyme activity by a known method.
- the lower limit of “several” is two.
- the upper limit is not limited as long as the antigen activity against ASO of the polypeptide encoded by the DNA is maintained, but it is preferably within a range that does not significantly impair the protein's three-dimensional structure of amino acid residues or antigen activity against ASO. .
- it is a number corresponding to less than 20% of all amino acids of the polypeptide before modification, preferably a number corresponding to less than 15%, more preferably a number corresponding to less than 10%, more preferably less than 5% And more preferably a number corresponding to less than 1%.
- the number is, for example, 264 or less (the number of bases corresponding to 20% of all amino acids), preferably 198 or less (15%), more preferably 132 or less (10%), more preferably 66 or less (5%), more preferably 40 or less, more preferably 20 or less, more preferably 15 or less, further preferably 10 or less, more preferably 5 or less, more preferably 4 or less, More preferably, it is 3 or less.
- Whether or not a certain DNA encodes a polypeptide having an antigenic activity against ASO is determined by incorporating the DNA into a commercially available active expression vector and expressing it in a suitable host. The resulting polypeptide has an antigenic activity against ASO. Is measured by the “method for measuring antigenic activity of SLO” described later.
- Another embodiment of the present invention is any one of the following DNAs (k) to (n):
- (K) In SEQ ID NO: 3, 0, 3, 6 or 9 bases on the 5 ′ end side are deleted, and 3n (n is an integer from 0 to 7) on the 3 ′ end side DNA consisting of a base sequence lacking a base.
- (L) DNA encoding a polypeptide comprising a base sequence having 80% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and having an antigenic activity against anti-streptridine O antibody (ASO).
- ASO anti-streptridine O antibody
- M a polypeptide that hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and has an antigenic activity against an anti-streptridine O antibody (ASO) DNA encoding
- ASO anti-streptridine O antibody
- N A nucleotide sequence in which one or several bases are substituted, deleted, inserted and / or added in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, and an antigen against anti-streptridine O antibody (ASO) DNA encoding a polypeptide having activity.
- SEQ ID NO: 3 is a host organism for the purpose of improving the expression efficiency and the like when incorporating and expressing the DNA encoding the SLO of the present invention in a host organism other than the source organism.
- the base sequence is changed according to the codon usage, and is preferably applied when E. coli is selected as the host organism.
- Another embodiment of the present invention is a method for producing the above SLO comprising a vector incorporating the above-described DNA of the present invention, a transformant containing the vector, or culturing the transformant, It is.
- the SLO of the present invention is prepared by inserting a gene into an appropriate vector to prepare a recombinant vector, transforming an appropriate host cell with the recombinant vector, preparing a transformant, and culturing the transformant. This can be done easily.
- the vector is not particularly limited as long as it can be replicated and autonomously propagated in various prokaryotic and / or eukaryotic host cells, and includes plasmid vectors, phage vectors, virus vectors and the like.
- the preparation of the recombinant vector is not particularly limited, and may be performed according to a conventional method.
- the SLO gene of the present invention is added to the appropriate restriction enzyme and ligase, or, if necessary, a linker or adapter DNA. It can carry out easily by using and connecting.
- gene fragments amplified using a DNA polymerase that adds a single base to the amplification end, such as Taq polymerase can be connected to a vector by TA cloning.
- a conventionally known cell can be used and is not particularly limited as long as a recombinant expression system is established.
- microorganisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Actinomyces, Neisseria gonorrhoeae and yeast are used. Insect cells, animal cells, higher plants, etc., more preferably microorganisms, and particularly preferably Escherichia coli (for example, K12 strain, B strain, etc.).
- the preparation of the transformant is not particularly limited, and may be performed according to a conventional method.
- Escherichia coli Escherichia coli C600, Escherichia coli HB101, Escherichia coli DH5 ⁇ , Escherichia coli JM109, Escherichia coli BL21, etc. are used, and vectors such as pBR322, pUC19, pBluescript, pQE, pET, etc.
- yeast examples include Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida utilis, Pichia pastoris, and vectors include pAUR101, pAUR224, and pYE32.
- a filamentous fungal cell for example, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger and the like can be exemplified.
- the SLO of the present invention is expressed from the integrated gene and accumulated in the transformant.
- the SLO of the present invention accumulated in the transformant can be used as it is, but it may be purified.
- the purification method is not particularly limited, and conventionally known ones can be used.
- a transformant after culturing or a culture thereof is homogenized in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonic treatment or surfactant treatment.
- a cell extract can be obtained by, for example, and a separation technique conventionally used for separation and purification of proteins can be appropriately combined.
- separation techniques include methods utilizing the difference in solubility such as salting out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide.
- Method using molecular weight difference such as gel electrophoresis (SDS-PAGE), method using charge such as ion exchange chromatography and hydroxyapatite chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, and reverse Examples include, but are not limited to, a method using a difference in hydrophobicity such as phase high performance liquid chromatography and a method using a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing.
- a method using a difference in hydrophobicity such as phase high performance liquid chromatography
- a method using a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing.
- gel filtration using Sephadex gel GE Healthcare Bioscience
- DEAE Sepharose CL-6B GE Healthcare Bioscience
- octyl Sepharose CL-6B GE Healthcare Bioscience
- purified by column chromatography such as
- Another embodiment of the present invention is a cross-linked SLO obtained by cross-linking the SLO of the present invention.
- the SLO may be covalently bound to the bifunctional material for stabilization.
- the modified SLO of the present invention may also be covalently attached to a bifunctional material, examples of such bifunctional materials are glutaraldehyde and carbodiimide. Since the Schiff base formed by the reaction between an aldehyde group and an amino group of glutaraldehyde is unstable in an aqueous solution, a reductive amination reaction may be performed with sodium cyanoborohydride or sodium borohydride. A covalent bond is physically irreversible in that the covalent bond is not affected by changes in pH or temperature.
- the buffer In the crosslinking treatment, it is necessary to set the buffer type, pH, treatment temperature, treatment time, SLO concentration, and concentration of the bifunctional substance, as long as the conditions do not adversely affect the SLO and the crosslinked SLO.
- the buffer include Good buffer such as acetate buffer, MES buffer, and PIPES buffer, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, borate buffer, glycine buffer, and the like.
- the pH condition is preferably in the range of pH 5 to pH 11, more preferably pH 6 to pH 10.
- the temperature condition is preferably 4 ° C. to 40 ° C., more preferably 10 ° C. to 30 ° C.
- the protein concentration is preferably 0.1 mg / ml to 100 mg / ml, more preferably 1 mg / ml to 10 mg / ml.
- the reaction time is preferably 1 minute to 24 hours, more preferably 10 minutes to 5 hours.
- the concentration of the bifunctional substance in the cross-linking reaction is preferably 0.0001% to 1%, and more preferably 0.001% to 0.1%. After the crosslinking reaction, a final concentration of 0.1% to 10% glycine may be added to prevent further reaction of uncrosslinked glutaraldehyde.
- the latex particles used in the present invention are not particularly limited.
- examples include ester copolymers and polyvinyl acetate acrylate.
- the average particle diameter of the latex particles is not particularly limited, but is suitably selected from 0.05 ⁇ m to 1.0 ⁇ m in consideration of the concentration of the test substance in the test sample or the detection sensitivity of the measuring instrument.
- the method for immobilizing the modified SLO in the latex particles of the present invention is not particularly limited, and a physical adsorption (hydrophobic bond) method, a chemical bond method, or the like can be appropriately selected.
- a physical adsorption (hydrophobic bond) method a polyhapten can be formed and adsorbed, and in the chemical bond method, a binding functional group such as a maleimide group can be introduced into the antigen.
- adsorbing an antigen to latex it is necessary to set the type of buffer, pH, treatment temperature, treatment time, and SLO concentration, but there is no particular limitation. An example is shown below.
- the buffer examples include Good buffer such as acetate buffer, MES buffer, and PIPES buffer, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, borate buffer, glycine buffer, and the like.
- the pH condition is preferably in the range of pH 5 to pH 11, more preferably pH 6 to pH 10.
- the temperature condition is preferably 4 ° C. to 40 ° C., more preferably 10 ° C. to 30 ° C.
- the SLO concentration is preferably from 0.01 mg / ml to 30 mg / ml, more preferably from 0.1 mg / ml to 3 mg / ml.
- the reaction time is preferably 1 minute to 24 hours, more preferably 10 minutes to 5 hours.
- SLO is adsorbed on latex in the state containing one or more additives. You may let them.
- Another embodiment of the present invention is a method for measuring ASO using the latex particles of the present invention described above, or an ASO measuring reagent containing the latex particles of the present invention described above.
- An immunoassay using the immunoassay reagent of the present invention is also one aspect of the present invention.
- the immunoassay method of the present invention is not particularly limited as long as the immunoassay reagent of the present invention is used, and can be performed by a usual method.
- the immunoassay reagent of the present invention is added to the medium containing the substance to be measured, and the substance to be measured and the antigen immobilized on the latex particles contained in the immunoassay reagent of the present invention are combined by an antigen-antibody reaction. Aggregation is observed optically or visually.
- the preferable lower limit of the pH of the reaction is 5, the upper limit is 10, and the more preferable lower limit is 6, and the upper limit is 9.
- the preferable lower limit of the reaction temperature is 4 ° C. and the upper limit is 50 ° C.
- the more preferable lower limit is 20 ° C., and the upper limit is 40 ° C.
- the reaction time is appropriately determined.
- As the medium various appropriate buffer solutions are used depending on the type of the substance to be measured.
- Such a buffer solution may be any buffer solution that does not inactivate the substance to be measured and has an ion concentration or pH that does not inhibit the antigen-antibody reaction.
- a phosphate buffer solution a glycine buffer solution
- Known buffer solutions such as borate buffer solution, Tris-HCl buffer solution, and various Good buffers can be used. These buffer solutions may be used alone or in combination of two or more.
- the above medium contains known water-soluble additives such as polyethylene glycol, carboxymethylcellulose, methylcellulose, dextran, polyvinylpyrrolidone, polyglycosylethylmethacrylate, pullulan, dextran, erucinane and the like in order to increase the sensitivity of the reaction. You may contain.
- proteins such as albumin, casein, and gelatin, or degradation products and modified products thereof; quaternary ammonium salts such as choline chloride, EDTA, polyanions, chaotropic ions ( Cl-, I-, SCN-, etc.), amino acids, surfactants and the like.
- quaternary ammonium salts such as choline chloride, EDTA, polyanions, chaotropic ions ( Cl-, I-, SCN-, etc.), amino acids, surfactants and the like.
- the method for detecting the degree of aggregation caused by the antigen-antibody reaction is not particularly limited, and for example, it is detected by optical observation or visual observation.
- examples of the method for optically detecting the degree of aggregation of the insoluble carrier include a method for measuring an increase or decrease in scattered light intensity, absorbance, or transmitted light intensity.
- examples of the method for visual observation and determination include, for example, a method in which a sample and the immunoassay reagent of the present invention are mixed on a determination plate and shaken for 1 to 5 minutes, and then the presence or absence of aggregation is determined. It is done. Alternatively, an image may be taken and image processing may be performed.
- the antigen activity of SLO is measured under the following conditions.
- this antigen activity measurement method latex particles with immobilized SLO compete with SLO (test substance) in a test sample to inhibit the formation of an immune complex between the latex particles and an antibody.
- SLO test substance
- the term “antigen activity” specifically means a value measured by the following method unless otherwise specified.
- the measurement sample used is a mixture of ASO standard solution (500 IU / ml), physiological saline and SLO solution, manufactured by Denka Seken Co., at a ratio of 5: 4: 1.
- the SLO solution was used after being diluted with a 20 mM phosphate buffer solution (pH 7.5) as necessary. In the blind test, 20 mM phosphate buffer solution (pH 7.5) for diluting SLO is used instead of SLO solution.
- SLO gene Cloning of SLO gene
- Various SLO genes were amplified using the artificially synthesized gene (Accession number NC003485) described in SEQ ID NO: 2 as a template and the primers shown in Table 1 (in Table 1, Fw is Forward primer, Rv represents reverse primer).
- the gene encoding SLO (which is also referred to as N32-C464) followed by a glutamic acid residue at position 32 followed by a lysine residue at position 464 is followed by a start codon and a histidine tag.
- Amplification was performed using primers number 4 and 6.
- each SLO of N32-C466, N32-C471, N35-C464, N35-C466, N35-C471, N32-C560 and N32-C571, SEQ ID NO: 4 and 7, 4 and 8, SEQ ID NOs: 5 and 6, SEQ ID NOs: 5 and 7, SEQ ID NOs: 5 and 8, SEQ ID NOs: 4 and 9, and primers of SEQ ID NOs: 4 and 10 were used, respectively.
- the restriction enzyme site NdeI is added to the N-terminal side of this primer, and the restriction enzyme site BamHI is added to the C-terminal side.
- the DNA fragment is cleaved with the restriction enzymes NdeI and BamHI and cleaved with the same enzyme.
- Ligation was carried out by mixing with the vector plasmid pBSK and adding the same amount of ligation reagent (Toyobo Ligation High) as the mixture and incubating.
- Recombinant plasmids pBSKSLO N32-C464, N32-C466, N32-C471, N35-C464, N35-C466, N35-C471, N35-C560, and N32 designed to express the SLO gene in a large amount in this way. -C571) was obtained.
- Example 2 E. coli of various SLO genes Expression and purification in E. coli Using the various plasmids constructed in Example 1, Escherichia coli JM109 strain competent cells (Toyobo Competent High JM109) were transformed according to the protocol attached to this product, and transformants were transformed. I got it. The obtained colonies of each transformant were inoculated into 5 mL of LB liquid medium (containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin) sterilized in a test tube, and then aerobically cultured by shaking at 30 ° C. for 16 hours. .
- LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin
- the obtained culture solution was used as a seed culture solution, inoculated into 100 mL of TB medium (containing IPTG 1 mM and ampicillin 50 ⁇ g / mL) in a 500 ml Sakaguchi flask, and cultured at 30 ° C. for 20 hours at a shaking number of 180 rpm.
- TB medium containing IPTG 1 mM and ampicillin 50 ⁇ g / mL
- the bacterial cells thus obtained were collected by centrifugation, suspended in a 25 mM phosphate buffer solution (pH 7.5) containing 20 mM imidazole, crushed using glass beads, and the resulting crude enzyme was Apply to 1 mL of HisTrap HP (GE Healthcare Bioscience) equilibrated with 25 mM phosphate buffer solution (pH 7.5) containing 20 mM imidazole and elute with 25 mM phosphate buffer solution (pH 7.5) containing 500 mM imidazole.
- HisTrap HP GE Healthcare Bioscience
- Example 3 Evaluation of hemolytic activity The hemolytic activity of each SLO solution prepared in Example 2 was measured. As a measuring method, first, 50 ⁇ l of SLO diluted with a PBS solution containing 20 mM cysteine was added to 1 ml of rabbit defibrinated blood (manufactured by Nippon Biotest Laboratories) diluted to 2% with PBS solution, and at 37 ° C. The reaction was carried out for 1 hour. The protein concentration of the SLO solution at the time of measurement was measured at a concentration of 1.0 mg / ml.
- the full-length SLO (N32-C571) detected an absorption at 541 nm (A 541 ) representing the degree of hemolysis, and there was no significant difference from Blank for the modified SLO. It was confirmed that the hemolytic activity was lost.
- Example 4 Measurement of antigen activity
- Antigen activity was measured using each SLO solution prepared in Example 2 and SLO (Code: T3000-5258) manufactured by Biokit.
- SLO Code: T3000-5258
- the SDS-PAGE result of BIKIT SLO is shown in FIG. 3. It was confirmed that the molecular weight was about 40 kDa larger than that of full-length SLO. Since this result suggests that the protein is a fusion protein, in the present specification, SLO manufactured by BIOKIT is also referred to as Fusion type.
- the measurement result of the antigen activity is shown in FIG.
- the protein concentration of the SLO solution at the time of measurement was 0.08 mg / ml for the modified SLO, 0.11 mg / ml for the full-length SLO, and 0.16 mg / ml for the BIKIT SLO. Measured at a concentration of ml.
- the modified SLO showed higher antigen activity than the full-length SLO. This result indicates that there is no important epitope in the deleted region of about 100 amino acid residues. Further, it was confirmed that the antigen activity of BIKIT SLO was lower than that of full-length SLO.
- Example 5 Evaluation of thermal stability Thermal stability was evaluated by measuring antigen activity after heat treatment using each SLO solution prepared in Example 2 and SLO (Code: T3000-5258) manufactured by Biokit. The results are shown in FIG. In addition, the protein concentration of the SLO solution at the time of measurement was treated at each temperature for 6 hours at a concentration of 2.0 mg / ml, and then the antigenic activity was measured to evaluate the thermal stability. As a result, it was confirmed that the modified SLO has higher thermal stability than the full-length SLO and has acquired practically useful characteristics. It was also confirmed that the thermal stability was superior to SLO (Code: T3000-5258) manufactured by BIOKIT.
- Example 6 Optimization of codon usage in E. coli expression
- codon usage was optimized.
- the artificially synthesized sequence is shown in SEQ ID NO: 3.
- Expression plasmids were constructed in the same manner as described in Examples 1 and 2. The primers used for the construction of the plasmid are shown in Table 3. Using the constructed plasmid, Escherichia coli JM109 strain competent cell (Toyobo Competent High JM109) was transformed according to the protocol attached to this product to obtain a transformant.
- the obtained colonies of each transformant were inoculated into 5 mL of LB liquid medium (containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin) sterilized in a test tube, and then aerobically cultured by shaking at 30 ° C. for 16 hours. .
- the obtained culture solution was used as a seed culture solution, inoculated into 100 mL of TB medium (containing IPTG 1 mM and ampicillin 50 ⁇ g / mL) in a 500 ml Sakaguchi flask, and cultured at 30 ° C. for 20 hours at a shaking number of 180 rpm.
- the expression of about 300 mg / L modified SLO was confirmed. This value corresponds to about twice that before optimization of the codon usage, and it was confirmed that productivity was improved by optimization of the codon sequence.
- Example 7 Evaluation of sensitivity in latex turbidimetric reagent
- Respective SLO solutions prepared in Example 2 and BIKIT SLO (Code: T3000-5258) were prepared at a concentration of 2.2 mg / mL, and the final concentration was 0.
- a 25% glutaraldehyde solution (Sigma, Code: G5882) was added to a concentration of 1%.
- the solution is then mechanically stirred for 1 hour at room temperature. Thereafter, glycine is added to a final concentration of 0.1%.
- the solution was then mechanically stirred at room temperature for 30 minutes and then stored at 4 ° C. overnight. Subsequently, the protein concentration was calculated by the Bradford method and coded into latex particles.
- the coating conditions were a buffer solution composed of 50 mM borate buffer (pH 8.2), and the final concentration of crosslinked SLO was 0.3 to 0.7 mg / ml as shown in FIG. Each was mixed, and coating treatment was carried out at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, centrifugation, supernatant removal, and suspension washing steps are repeated twice with a 50 mM glycine buffer solution (pH 8.2) containing 150 mM NaCl and 0.5% BSA. A reagent was obtained. As a first reagent, a buffer solution consisting of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.2), 150 mM NaCl, 0.5% BSA was prepared, and the sensitivity of the latex reagent was evaluated.
- the first reagent and the second reagent were combined, and the formation of particle agglomerates depending on the ASO concentration was confirmed using a Hitachi 7170 automatic analyzer. Specifically, 240 ⁇ L of the first reagent is added to 3 ⁇ L of an ASO solution having a concentration of 0 (IU / mL), 250 (IU / mL), and 500 (IU / mL), and the mixture is heated at 37 ° C. for 5 minutes. Reagent 60 ⁇ L was added and stirred. Thereafter, the change in absorbance ( ⁇ mAbs) accompanying the formation of aggregates for 5 minutes was measured at a main wavelength of 546 nm and a sub wavelength of 800 nm.
- ⁇ mAbs change in absorbance
- the modified SLO of the present invention was about 2 to 3 times 183.1.
- the modified SLO of the present invention was about 2 to 3 times 114.2. This result shows that the modified SLO of the present invention has a high antigenic activity per protein and can reduce the amount of SLO used for the production of ASO reagent.
- the modified SLO of the present invention is useful as a diagnostic agent raw material used for an ASO reagent having excellent antigen activity and thermal stability.
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Abstract
【課題】抗原活性、熱安定性などの特性に優れた、ストレプトリジンO及びその製造法、並びにその用途を提供することを課題とする。 【解決手段】配列番号1に記載の2位のリジン残基から31位のアラニン残基、32位のグルタミン酸残基、33位のセリン残基、34位のアスパラギン残基のいずれかまでのポリペプチドが欠損し、かつ、配列番号1に記載の465位のイソロイシン残基から472位のアラニン残基のいずれかから、それ以降の全てのアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
Description
本発明はストレプトリジンO(以下、本明細書ではSLOとも表記する。)及びその用途に関する。詳しくは、本発明はストレプトリジンO、及び当該タンパク質の生産菌、当該タンパク質の製造法、当該タンパク質を使用した抗ストレプトリジンO(Anti Streptolysin O)(以下、本明細書ではASOとも表記する。)の測定方法などに関する。
SLOは溶血性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)が菌体外に生産する溶血活性を有するタンパク質で、溶血性連鎖球菌の感染有無を診断するためのASO測定試薬の原料に広く使用されている。
従来、SLOの製造のためには、溶血性連鎖球菌が培養されてきたが、溶血性連鎖球菌のSLO生産性は非常に低く、溶血性連鎖球菌から製造されたSLOは純度も低いため、SLOの品質が安定しないという問題があった。そこで、生産性の向上と安定性の向上を目的として、組換え大腸菌を利用したSLOの研究が行われている(特許文献1、特許文献2、非特許文献1及び非特許文献2)。
しかしながら、組換え大腸菌を用いてSLOを製造する場合、全長型SLOに加え、C末端側から少なくとも50アミノ酸残基離れた領域で切断された低分子量型のSLOも生産されることが報告されていた(非特許文献1)(非特許文献1では、全長型SLOは高分子量型SLOと記載されている)。非特許文献1では、組換え大腸菌を用いることで生産性は向上しているが、全長型SLO(以下、本明細書ではFull length typeとも表記する。)と低分子量型SLOの比率を工業スケールで制御することは難しく、品質の安定性という課題は克服できていない。
さらに、SLOは溶血活性を有するタンパク質であるため、製造者の安全性の観点から溶血活性は低減させることが望まれており、C末端の数アミノ酸残基を欠損させると溶血活性が低減することが報告されている(非特許文献2)。
MICHAEL A. KEHOE et al.,INFECTION ANDIMMUNITY,Vol.63,No.7,2776-2779,1995
AKIRA TAKETO et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.,65(12),2682-2689,2001,45(14),4455-62
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、SLOの生産性が高く、全長型SLOと低分子量型SLOが混在せず、天然のSLOと同等のエピトープを有するSLOを提供することにある。また、製造の観点からは、溶血活性が無く、熱安定性の高いSLOが望まれており、そのような特性も兼ね備えたSLOを提供することにある。
本発明者は、上記目的を達成するために、SLOの発現領域を鋭意検討した結果、いずれの課題も克服するSLOを見出した。具体的には、全長型SLOと低分子量型SLOの混在を防ぐために、C末端領域を欠損させた改変型SLO(以下、本明細書ではFragment typeとも表記する。)を発現させた。
この改変型SLOはエピトープの損失の問題が懸念されたが、驚くべきことに、本発明者は、全長型SLOのC末端側の約100アミノ酸残基の領域を欠損させても抗原活性は損失されず、むしろタンパク質あたりの抗原活性が全長型SLOに対して向上することを確認した。このことは、全長型SLOから削除した約100アミノ酸残基の領域には重要なエピトープが存在しないことを意味する。
また、本発明者は、改変型SLOが溶血活性を損失していることを確認した。さらに、熱安定性に関しても、改変型SLOが全長型SLOに対して向上していることを見い出し、本発明を完成させた。
この改変型SLOはエピトープの損失の問題が懸念されたが、驚くべきことに、本発明者は、全長型SLOのC末端側の約100アミノ酸残基の領域を欠損させても抗原活性は損失されず、むしろタンパク質あたりの抗原活性が全長型SLOに対して向上することを確認した。このことは、全長型SLOから削除した約100アミノ酸残基の領域には重要なエピトープが存在しないことを意味する。
また、本発明者は、改変型SLOが溶血活性を損失していることを確認した。さらに、熱安定性に関しても、改変型SLOが全長型SLOに対して向上していることを見い出し、本発明を完成させた。
本発明は以上の知見ないし成果に基づくものであり、以下に示すSLOを提供する。
[項1]
下記の(a)~(d)のいずれかのポリペプチドからなるSLO;
(a)配列番号1に記載の2位のセリン残基から31位のアラニン残基、32位のグルタミン酸残基、33位のセリン残基、34位のアスパラギン残基のいずれかまでのポリペプチドが欠損し、かつ、配列番号1に記載の465位のイソロイシン残基から472位のアラニン残基のいずれかから、それ以降の全てのアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)上記(a)に示されるアミノ酸配列のN末端領域もしくはC末端領域にタグを1つ以上有するポリペプチド。
(c)上記(a)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド。
(d)上記(a)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド。
[項2]
下記の(e)~(i)のいずれかのDNA:
(e)項1に示されるアミノ酸配列をコードするDNA。
(f)配列番号2において、N末端のatgの配列を除く5’末端側の0、3、6または9個の塩基が欠損し、かつ、3’末端側の3n(nは0から7のうちいずれかの整数)個の塩基が欠損した塩基配列からなるDNA。
(g)配列番号2に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(h)配列番号2に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(i)配列番号2に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
[項3]
以下の(k)~(n)のいずれかのDNA:
(k)配列番号3において、N末端のatgの配列を除く5’末端側の0、3、6または9個の塩基が欠損し、かつ、3’末端側の3n(nは0から7のうちいずれかの整数)個の塩基が欠損した塩基配列からなるDNA。
(l)配列番号3に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(m)配列番号3に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(n)配列番号3に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
[項4]
項2または3に記載のDNAを組み込んだベクター。
[項5]
項4に記載のベクターを含む形質転換体。
[項6]
項5に記載の形質転換体を培養することを含む、項1に記載のSLOを製造する方法。
[項7]
項1に記載のSLOを架橋処理して得られる架橋型SLO。
[項8]
項1に記載のSLOもしくは項7に記載の架橋型SLOがコーティングされたラテックス粒子。
[項9]
項8に記載のラテックス粒子を使用した抗ストレプトリジンO抗体(ASO)の測定方法。
[項10]
項8に記載のラテックス粒子を含む抗ストレプトリジンO抗体(ASO)測定試薬。
[項1]
下記の(a)~(d)のいずれかのポリペプチドからなるSLO;
(a)配列番号1に記載の2位のセリン残基から31位のアラニン残基、32位のグルタミン酸残基、33位のセリン残基、34位のアスパラギン残基のいずれかまでのポリペプチドが欠損し、かつ、配列番号1に記載の465位のイソロイシン残基から472位のアラニン残基のいずれかから、それ以降の全てのアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)上記(a)に示されるアミノ酸配列のN末端領域もしくはC末端領域にタグを1つ以上有するポリペプチド。
(c)上記(a)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド。
(d)上記(a)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド。
[項2]
下記の(e)~(i)のいずれかのDNA:
(e)項1に示されるアミノ酸配列をコードするDNA。
(f)配列番号2において、N末端のatgの配列を除く5’末端側の0、3、6または9個の塩基が欠損し、かつ、3’末端側の3n(nは0から7のうちいずれかの整数)個の塩基が欠損した塩基配列からなるDNA。
(g)配列番号2に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(h)配列番号2に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(i)配列番号2に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
[項3]
以下の(k)~(n)のいずれかのDNA:
(k)配列番号3において、N末端のatgの配列を除く5’末端側の0、3、6または9個の塩基が欠損し、かつ、3’末端側の3n(nは0から7のうちいずれかの整数)個の塩基が欠損した塩基配列からなるDNA。
(l)配列番号3に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(m)配列番号3に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(n)配列番号3に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
[項4]
項2または3に記載のDNAを組み込んだベクター。
[項5]
項4に記載のベクターを含む形質転換体。
[項6]
項5に記載の形質転換体を培養することを含む、項1に記載のSLOを製造する方法。
[項7]
項1に記載のSLOを架橋処理して得られる架橋型SLO。
[項8]
項1に記載のSLOもしくは項7に記載の架橋型SLOがコーティングされたラテックス粒子。
[項9]
項8に記載のラテックス粒子を使用した抗ストレプトリジンO抗体(ASO)の測定方法。
[項10]
項8に記載のラテックス粒子を含む抗ストレプトリジンO抗体(ASO)測定試薬。
本発明の改変型SLOは抗原活性、熱安定性に優れたASO試薬に用いる診断薬原料として有用である。
(改変型ストレプトリジンO)
本発明の実施形態のひとつは、下記の(a)~(d)のいずれかのポリペプチドからなるSLOである。
(a)配列番号1に記載の2位のセリン残基から31位のアラニン残基、32位のグルタミン酸残基、33位のセリン残基、34位のアスパラギン残基のいずれかまでのポリペプチドが欠損し、かつ、配列番号1に記載の465位のイソロイシン残基から472位のアラニン残基のいずれかから、それ以降の全てのアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)上記(a)に示されるアミノ酸配列のN末端領域もしくはC末端領域にタグを有するポリペプチド。
(c)上記(a)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド。
(d)上記(a)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド。
本発明の実施形態のひとつは、下記の(a)~(d)のいずれかのポリペプチドからなるSLOである。
(a)配列番号1に記載の2位のセリン残基から31位のアラニン残基、32位のグルタミン酸残基、33位のセリン残基、34位のアスパラギン残基のいずれかまでのポリペプチドが欠損し、かつ、配列番号1に記載の465位のイソロイシン残基から472位のアラニン残基のいずれかから、それ以降の全てのアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)上記(a)に示されるアミノ酸配列のN末端領域もしくはC末端領域にタグを有するポリペプチド。
(c)上記(a)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド。
(d)上記(a)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド。
上記(a)のポリペプチドにおいて、配列番号1はSLOの全長(全長型SLO)であり571アミノ酸からなる。配列番号1の1位はN末端のメチオニンであり、本発明のSLOは、N末端側において、2位から31位、2位から32位、2位から33位、および、2位から34位からなる群のうちいずれかが欠損している。N末端から31残基までは分泌シグナルであって、本発明のSLOを大腸菌等のグラム陰性菌で菌体内に発現させる場合には削除することが好ましい。菌体外に発現させる場合は、宿主に合わせた適当な分泌シグナルを付与してもよい。
また、本発明のSLOは、C末端側において、465位から571位、466位から571位、467位から571位、468位から571位、469位から571位、470位から571位、471位から571位、および、472位から571位からなる群のうちいずれかが欠損している。
また、本発明のSLOは、C末端側において、465位から571位、466位から571位、467位から571位、468位から571位、469位から571位、470位から571位、471位から571位、および、472位から571位からなる群のうちいずれかが欠損している。
上記の本発明のSLOにおいて、N末端側の欠損とC末端側の欠損との組合せは特に限定されないが、好ましい例として、N末側の32位からC末側の464位からなるポリペプチドが挙げられる(なお、本明細書では、このようなポリペプチドを、両端のアミノ酸の位置を示す数字をハイフンで結び、N32-C464のようにも表す。)。それ以外に、N32-C464、N32-C466、N32-C471、N35-C464、N35-C466、N35-C471なども好ましいものとして挙げられる。
本発明のSLOは、上記(a)のものに限定されず、
(b)上記(a)に示されるアミノ酸配列のN末端領域もしくはC末端領域にタグを1つ以上有するポリペプチド。
(c)上記(a)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および/または付加(本明細書ではこれらを一括して「改変」とも表す。)したアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド、及び、
(d)上記(a)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド、
も、含まれる。
(b)上記(a)に示されるアミノ酸配列のN末端領域もしくはC末端領域にタグを1つ以上有するポリペプチド。
(c)上記(a)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および/または付加(本明細書ではこれらを一括して「改変」とも表す。)したアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド、及び、
(d)上記(a)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド、
も、含まれる。
これは、タンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等のタンパク質であることが多いからである。
上記(b)のポリペプチドにおいて、タグは特に限定されないが、Hisタグ、HQタグ、HNタグ、HATタグ、GSTタグ、MBPタグ、Strep(II)タグ等のアフィニティータグなどが挙げられる。これらの中から1つ以上を選択することが好ましい。中でも、エピトープとしての機能を極力影響を及ぼさないという観点からすると、Hisタグ、HQタグ、HNタグ、HATタグ、Strep(II)タグ等が好ましい。N末端へのタグの挿入方法としては特に限定されないが、N末端のメチオニン残基の直下にタグが挿入されることが好ましい。また、数アミノ酸残基の後にタグを挿入してもよい。そのアミノ酸残基数としては特に限定されないが、好ましい上限は20残基以下、さらに好ましくは10残基以下、さらに好ましくは5残基以下であり、下限は1残基以上であれば良い。C末端へのタグの挿入方法としては特に限定されないが、終止コドンの直前にタグが挿入されることが好ましい。また、数アミノ酸残基前にタグを挿入してもよい。そのアミノ酸残基数としては特に限定されないが、好ましい上限は20残基以下、さらに好ましくは10残基以下、さらに好ましくは5残基以下であり、下限は1残基以上であれば良い。また、発現ベクター骨格にタグが含まれる場合は、遺伝子配列が適宜、削除されてもよい。
上記(c)のポリペプチドにおいて「数個」の下限は2個である。上限はASOに対する抗原活性が維持される限り数は制限されないが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造やASOに対する抗原活性を大きく損なわない範囲であることが好ましい。例えば、全アミノ酸の20%未満に相当する数であり、好ましくは15%未満に相当する数、さらに好ましくは10%未満に相当する数、さらに好ましくは5%未満に相当する数、さらに好ましくは1%未満に相当する数である。換言すれば、個数とは、例えば、114個以下、好ましくは86個以下、さらに好ましくは57個以下、さらに好ましくは29個以下、さらに好ましくは20個以下、さらに好ましくは15個以下、さらに好ましくは10個以下、さらに好ましくは5個以下、さらに好ましくは4個以下、さらに好ましく3個以下である。
上記(c)のポリペプチドにおいては、ASOに対する抗原活性が、後述の「SLOの抗原活性測定方法」で測定した場合、それぞれの改変前のタンパク質の50%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上保持していることが望ましい。
上記(d)のポリペプチドにおいて、上記(a)に示されるアミノ酸配列との同一性は80%以上であることが好ましい。この同一性は、好ましくは85%以上であり、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上である。
アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線(インターネット)を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本明細書においては、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)が公開している相同性検索プログラムであるBLASTのウェブサイトにおいてblastpを選択しデフォルト(初期設定)のパラメータを用いることにより、同一性を算出する。
あるポリペプチドがASOに対する抗原活性を有するかどうかは、後述の「SLOの抗原活性測定方法」にしたがって判断する。
ASOに対する抗原活性を有するタンパク質の改変体及びその遺伝子は、例えばTransformerMutagenesis Kit;Clonetech製、EXOIII/Mung Bean Deletion Kit;Stratagene製、QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit;Stratagene製、KOD-Plus-Mutagenesis Kit;東洋紡製などの市販のキットやPCR法を利用して配列番号2に記載の塩基配列を改変することによって得ることができる。
得られた遺伝子によってコードされるタンパク質の抗原活性は、例えば、得られた遺伝子を大腸菌に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を培養して酵素タンパク質を生成させ、この形質転換体、この形質転換体の菌体破砕液もしくは精製した酵素タンパク質を後述の「SLOの抗原活性測定方法」で測定することによって確認することができる。
得られた遺伝子によってコードされるタンパク質の抗原活性は、例えば、得られた遺伝子を大腸菌に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を培養して酵素タンパク質を生成させ、この形質転換体、この形質転換体の菌体破砕液もしくは精製した酵素タンパク質を後述の「SLOの抗原活性測定方法」で測定することによって確認することができる。
(改変型ストレプトリジンOをコードするDNA)
本発明の別の実施形態は、下記の(e)~(i)のいずれかのDNAである。
(e)上記の本発明のSLOのアミノ酸配列をコードするDNA。
(f)配列番号2において、N末端のatgの配列を除く5’末端側の0、3、6または9個の塩基が欠損し、かつ、3’末端側の3n(nは0から7のうちいずれかの整数)個の塩基が欠損した塩基配列からなるDNA。
(g)配列番号2に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(h)配列番号2に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(i)配列番号2に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
本発明の別の実施形態は、下記の(e)~(i)のいずれかのDNAである。
(e)上記の本発明のSLOのアミノ酸配列をコードするDNA。
(f)配列番号2において、N末端のatgの配列を除く5’末端側の0、3、6または9個の塩基が欠損し、かつ、3’末端側の3n(nは0から7のうちいずれかの整数)個の塩基が欠損した塩基配列からなるDNA。
(g)配列番号2に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(h)配列番号2に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(i)配列番号2に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
上記(e)のDNAにおいて、本発明のSLOのアミノ酸配列は、上記の(a)~(d)のいずれかに示されるSLOのアミノ酸配列である。本発明のDNAでは、前記アミノ酸配列における各アミノ酸に対応するコドンが複数ある場合は、その選択には特に制限はない。
上記(f)のDNAにおいて、配列番号2は、前記の配列番号1のアミノ酸で示される全長型SLOのメチオニン及び32位から471位に相当する部分をコードしている。配列番号2において、開始コドンを除く5’末端側の3個の塩基が欠損したものは、配列番号1におけるN33-C471をコードしていることになる。同様に、5’末端側の6個の塩基が欠損したものはN34-C471を、5’末端側の9個の塩基が欠損したものはN35-C471を、それぞれコードしていることになる。
また、3’末端側の3n(nが1)個の塩基が欠損したものは、配列番号1におけるN32-C470をコードしていることになる。同様に、3’末端側の3n(nが2)個の塩基が欠損したものはN32-C469を、3’末端側の3n(nが3)個の塩基が欠損したものはN32-C468を、3’末端側の3n(nが4)個の塩基が欠損したものはN32-C467を、3’末端側の3n(nが5)個の塩基が欠損したものはN32-C466を、3’末端側の3n(nが6)個の塩基が欠損したものはN32-C465を、3’末端側の3n(nが7)個の塩基が欠損したものはN32-C464を、それぞれコードしていることになる。
また、3’末端側の3n(nが1)個の塩基が欠損したものは、配列番号1におけるN32-C470をコードしていることになる。同様に、3’末端側の3n(nが2)個の塩基が欠損したものはN32-C469を、3’末端側の3n(nが3)個の塩基が欠損したものはN32-C468を、3’末端側の3n(nが4)個の塩基が欠損したものはN32-C467を、3’末端側の3n(nが5)個の塩基が欠損したものはN32-C466を、3’末端側の3n(nが6)個の塩基が欠損したものはN32-C465を、3’末端側の3n(nが7)個の塩基が欠損したものはN32-C464を、それぞれコードしていることになる。
上記の本発明のDNAにおいて、5’末端側の欠損と3’末端側の欠損との組合せは特に限定されないが、好ましい例としては、上述の本発明のSLOのN末端側の欠損とC末端側の欠損との組合せとして例示されているものをコードするDNAが挙げられる。
また、本発明のDNAは、上記(e)、(f)のものに限定されず、
(g)配列番号2に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
(h)配列番号2に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA、及び、
(i)配列番号2に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
も含まれる。
(g)配列番号2に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
(h)配列番号2に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA、及び、
(i)配列番号2に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
も含まれる。
これは、タンパク質をコードするDNAの塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果としてタンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等のタンパク質であることが多いからである。
また、本発明のSLOをコードするDNAを、由来生物以外の宿主生物(大腸菌など)に組込んで本発明のSLOを発現させる場合、発現効率向上のため、宿主生物のコドンユーセージに合わせて塩基配列を変更することもあるからである。コドンの至適化については、かずさDNA研究所が公開しているコドン使用頻度の一覧表(http://www.kazusa.or.jp/codon/)などを参考にして、コドンが最適化される。
例えば、宿主生物として大腸菌を選択した場合は、配列番号3のような人工配列が挙げられる。
また、本発明のSLOをコードするDNAを、由来生物以外の宿主生物(大腸菌など)に組込んで本発明のSLOを発現させる場合、発現効率向上のため、宿主生物のコドンユーセージに合わせて塩基配列を変更することもあるからである。コドンの至適化については、かずさDNA研究所が公開しているコドン使用頻度の一覧表(http://www.kazusa.or.jp/codon/)などを参考にして、コドンが最適化される。
例えば、宿主生物として大腸菌を選択した場合は、配列番号3のような人工配列が挙げられる。
上記(g)のDNAにおいて、配列番号2に示される塩基配列との同一性は80%以上であることが好ましい。この同一性は、好ましくは85%以上であり、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上である。
塩基配列の同一性は、市販の又は電気通信回線(インターネット)を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本明細書においては、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)が公開している相同性検索プログラムであるBLASTのウェブサイトにおいてblastnを選択しデフォルト(初期設定)のパラメータを用いることにより、同一性を算出する。
上記(h)のDNAにおいて、「ストリンジェントな条件」とは、一般には、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えば、Molecular Cloning(Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)を参照して設定することができる。
本明細書では、「ストリンジェントな条件」とは、以下に示す条件を言う。ハイブリダイゼーション液(50%ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1% SDS、10% デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ***DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5))を用いて約42℃~約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1% SDSを用いて約65℃~約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。
更に好ましいストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーション液として50%ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1% SDS、10% デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ***DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5))を用いて約42℃~約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1% SDSを用いて約65℃~約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。
このような条件でハイブリダイズするDNAの中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれ得るが、それらについては、市販の活性発現ベクターに組み込み、適当な宿主で発現させて、酵素活性を公知の手法で測定することによって容易に取り除くことができる。
上記(i)のDNAにおいて、「数個」の下限は2個である。上限は、そのDNAがコードするポリペプチドのASOに対する抗原活性が維持されている限り数は制限されないが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造やASOに対する抗原活性を大きく損なわない範囲であることが好ましい。例えば、改変前のポリペプチドの全アミノ酸の20%未満に相当する数であり、好ましくは15%未満に相当する数、さらに好ましくは10%未満に相当する数、さらに好ましくは5%未満に相当する数、さらに好ましくは1%未満に相当する数である。換言すれば、個数とは、例えば、264個以下(全アミノ酸の20%に相当する塩基数)、好ましくは198個以下(15%)、さらに好ましくは132個以下(10%)、さらに好ましくは66個以下(5%)、さらに好ましくは40個以下、さらに好ましくは20個以下、さらに好ましくは15個以下、さらに好ましくは10個以下、さらに好ましくは5個以下、さらに好ましくは4個以下、さらに好ましく3個以下である。
あるDNAが、ASOに対する抗原活性を有するポリペプチドをコードしているかどうかは、そのDNAを、市販の活性発現ベクターに組み込み、適当な宿主で発現させて、得られたポリペプチドのASOに対する抗原活性を後述の「SLOの抗原活性測定方法」で測定することによって判断する。
本発明の別の実施形態は、以下の(k)~(n)のいずれかのDNAである。
(k)配列番号3において、5’末端側の0、3、6または9個の塩基が欠損し、かつ、3’末端側の3n(nは0から7のうちいずれかの整数)個の塩基が欠損した塩基配列からなるDNA。
(l)配列番号3に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(m)配列番号3に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(n)配列番号3に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(k)配列番号3において、5’末端側の0、3、6または9個の塩基が欠損し、かつ、3’末端側の3n(nは0から7のうちいずれかの整数)個の塩基が欠損した塩基配列からなるDNA。
(l)配列番号3に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(m)配列番号3に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(n)配列番号3に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
上記(k)~(n)のDNAにおいて、配列番号3は、本発明のSLOをコードするDNAを由来生物以外の宿主生物に組込んで発現させるにあたり、発現効率向上等を目的として、宿主生物のコドンユーセージに合わせて塩基配列を変更したものであり、宿主生物として大腸菌を選択した場合に好ましく適用されるものとして例示される。
上記(k)~(n)のDNAにおいて、塩基の欠損についての説明、塩基配列の同一性の計算方法についての説明、ストリンジェントな条件の説明、当該DNAがASOに対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするものであるか確認する方法の説明、改変個数の上限・下限の説明などについては、上記の(f)~(i)のDNAで記載した内容を準用する。
(ストレプトリジンOの製造方法等)
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のDNAを組み込んだベクター、前記のベクターを含む形質転換体、または、前記の形質転換体を培養することを含む前記のSLOを製造する方法、である。
本発明のSLOは、その遺伝子を適当なベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養することによって容易に行うことができる。
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のDNAを組み込んだベクター、前記のベクターを含む形質転換体、または、前記の形質転換体を培養することを含む前記のSLOを製造する方法、である。
本発明のSLOは、その遺伝子を適当なベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養することによって容易に行うことができる。
ベクターとしては、原核および/または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター、ウィルスベクター等が包含される。組換えベクターの調製は、特に限定されないが常法に従って行えばよく、例えば、これらのベクターに、本発明のSLOの遺伝子を適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターDNAを用いて連結することにより容易に行うことができる。また、Taqポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を付加するようなDNAポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、TAクローニングによるベクターへの接続も可能である。
また、宿主細胞としては、従来公知のものが使用可能であり、組換え発現系が確立しているものであれば特に制限されないが、好ましくは大腸菌、枯草菌、放線菌、麹菌、酵母といった微生物ならびに昆虫細胞、動物細胞、高等植物などが挙げられ、より好ましくは微生物が挙げられ、特に好ましくは大腸菌(例えば、K12株、B株など)が挙げられる。形質転換体の調製は、特に限定されないが常法に従って行えばよい。宿主が大腸菌の場合、エシェリヒア・コリC600、エシェリヒア・コリHB101、エシェリヒア・コリDH5α、エシェリヒア・コリJM109、エシェリヒア・コリBL21などが用いられ、ベクターとしてはpBR322、pUC19、pBluescript、pQE、pETなどが例として挙げられる。宿主が酵母の場合は、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、キャンデイダ・ウチリス、ピキア・パストリスなどが例として挙げられ、ベクターとしてはpAUR101、pAUR224、pYE32などが挙げられる。宿主が糸状菌細胞である場合は、例えば、Aspergillus oryzae, Aspergillus niger等を例示することができる。
得られた形質転換体を、その宿主細胞に応じた適当な培養条件で一定期間培養すれば、組込まれた遺伝子から本発明のSLOが発現されて、形質転換体中に蓄積する。
形質転換体中に蓄積した本発明のSLOは、未精製のまま用いることができるが、精製したものを使用しても良い。この精製方法としては、特に限定されないが従来公知のものが使用可能であり、例えば、培養後の形質転換体あるいはその培養物を適当な緩衝液中でホモジナイズし、超音波処理や界面活性剤処理等により細胞抽出液を得、そこからタンパク質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。このような分離技術としては、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、セファデックス(Sephadex)ゲル(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)などによるゲルろ過、DEAEセファロースCL-6B (GEヘルスケア バイオサイエンス社製)、オクチルセファロースCL-6B(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。
(ストレプトリジンOの架橋)
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のSLOを架橋処理して得られる架橋型SLOである。
SLOは、安定化するために二官能価物質に共有結合させてもよい。従って、本発明の改変型SLOも、二官能価物質への共有結合が行われても良く、そのような二官能価物質の例は、グルタルアルデヒド及びカルボジイミドである。グルタルアルデヒドのアルデヒド基とアミノ基との反応によって形成されるシッフ塩基は水溶液中で不安定なため、シアノ水素化ホウ素ナトリウムや水素化ホウ素ナトリウムによって、還元的アミノ化反応が行われても良い。共有結合は、その共有結合がpH又は温度変化により影響されない点で、物理的に不可逆的である。架橋処理の際は、バッファーの種類、pH、処理温度、処理時間、SLO濃度、二官能化物質の濃度を設定する必要があるが、SLO及び架橋型SLOに悪影響を与えない条件であれば良く、特に限定されない。下記に一例を示す。バッファーは、酢酸緩衝液、MES緩衝液、PIPES緩衝液などのグッドバッファー、リン酸緩衝液、Tris-HCl緩衝液,ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液などが例示される。pH条件は、pH5~pH11の範囲が好ましく、さらに好ましくはpH6~pH10の条件である。温度条件は、4℃~40℃が好ましく、さらに好ましくは10℃~30℃の条件である。タンパク濃度は、0.1mg/ml~100mg/mlの条件が好ましく、さらに好ましくは1mg/ml~10mg/mlの条件が好ましい。反応時間は、1分~24時間の反応が好ましく、さらに好ましくは10分~5時間の反応が好ましい。架橋反応における二官能化物質の濃度は、0.0001%~1%の条件が好ましく、さらに好ましくは、0.001%~0.1%の条件である。架橋反応後、未架橋のグルタルアルデヒドがさらに反応するのを防ぐために終濃度0.1%~10%グリシンが添加されてもよい。
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のSLOを架橋処理して得られる架橋型SLOである。
SLOは、安定化するために二官能価物質に共有結合させてもよい。従って、本発明の改変型SLOも、二官能価物質への共有結合が行われても良く、そのような二官能価物質の例は、グルタルアルデヒド及びカルボジイミドである。グルタルアルデヒドのアルデヒド基とアミノ基との反応によって形成されるシッフ塩基は水溶液中で不安定なため、シアノ水素化ホウ素ナトリウムや水素化ホウ素ナトリウムによって、還元的アミノ化反応が行われても良い。共有結合は、その共有結合がpH又は温度変化により影響されない点で、物理的に不可逆的である。架橋処理の際は、バッファーの種類、pH、処理温度、処理時間、SLO濃度、二官能化物質の濃度を設定する必要があるが、SLO及び架橋型SLOに悪影響を与えない条件であれば良く、特に限定されない。下記に一例を示す。バッファーは、酢酸緩衝液、MES緩衝液、PIPES緩衝液などのグッドバッファー、リン酸緩衝液、Tris-HCl緩衝液,ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液などが例示される。pH条件は、pH5~pH11の範囲が好ましく、さらに好ましくはpH6~pH10の条件である。温度条件は、4℃~40℃が好ましく、さらに好ましくは10℃~30℃の条件である。タンパク濃度は、0.1mg/ml~100mg/mlの条件が好ましく、さらに好ましくは1mg/ml~10mg/mlの条件が好ましい。反応時間は、1分~24時間の反応が好ましく、さらに好ましくは10分~5時間の反応が好ましい。架橋反応における二官能化物質の濃度は、0.0001%~1%の条件が好ましく、さらに好ましくは、0.001%~0.1%の条件である。架橋反応後、未架橋のグルタルアルデヒドがさらに反応するのを防ぐために終濃度0.1%~10%グリシンが添加されてもよい。
(ラテックス粒子)
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のSLOもしくは架橋型SLOがコーティングされたラテックス粒子である。
本発明に用いるラテックス粒子としては、特に限定されず、例えば、ポリスチレン、スチレン-スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル-アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックス粒子の平均粒径は特に限定されないが、被検物質の被検試料中での濃度あるいは測定機器の検出感度などを考慮し、0.05μm~1.0μmのものが適宜選択される。
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のSLOもしくは架橋型SLOがコーティングされたラテックス粒子である。
本発明に用いるラテックス粒子としては、特に限定されず、例えば、ポリスチレン、スチレン-スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル-アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックス粒子の平均粒径は特に限定されないが、被検物質の被検試料中での濃度あるいは測定機器の検出感度などを考慮し、0.05μm~1.0μmのものが適宜選択される。
(抗原を固定化したラテックス粒子)
本発明のラテックス粒子における改変型SLOの固定化方法は、特に限定されず、物理吸着(疎水結合)法、化学結合法等を適宜選択することができる。物理吸着(疎水結合)法においては、ポリハプテンを形成させて吸着させる方法、化学結合法においてはマレイミド基などの結合性の官能基を抗原に導入したりすることができる。抗原をラテックスに吸着させる際は、バッファーの種類、pH、処理温度、処理時間、SLO濃度を設定する必要があるが、特に限定されない。下記に一例を示す。バッファーは、酢酸緩衝液、MES緩衝液、PIPES緩衝液などのグッドバッファー、リン酸緩衝液、Tris-HCl緩衝液,ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液などが例示される。pH条件は、pH5~pH11の範囲が好ましく、さらに好ましくはpH6~pH10の条件である。温度条件は、4℃~40℃が好ましく、さらに好ましくは10℃~30℃の条件である。SLO濃度は、0.01mg/ml~30mg/mlの条件が好ましく、さらに好ましくは0.1mg/ml~3mg/mlの条件が好ましい。反応時間は、1分~24時間の反応が好ましく、さらに好ましくは10分~5時間の反応が好ましい。また、非特異反応を抑制するためや免疫測定試薬自体の安定性を高めるために、特に限定されるものではないが、1種類もしくは2種類以上の添加剤を含んだ状態でSLOをラテックスに吸着させてもよい。
本発明のラテックス粒子における改変型SLOの固定化方法は、特に限定されず、物理吸着(疎水結合)法、化学結合法等を適宜選択することができる。物理吸着(疎水結合)法においては、ポリハプテンを形成させて吸着させる方法、化学結合法においてはマレイミド基などの結合性の官能基を抗原に導入したりすることができる。抗原をラテックスに吸着させる際は、バッファーの種類、pH、処理温度、処理時間、SLO濃度を設定する必要があるが、特に限定されない。下記に一例を示す。バッファーは、酢酸緩衝液、MES緩衝液、PIPES緩衝液などのグッドバッファー、リン酸緩衝液、Tris-HCl緩衝液,ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液などが例示される。pH条件は、pH5~pH11の範囲が好ましく、さらに好ましくはpH6~pH10の条件である。温度条件は、4℃~40℃が好ましく、さらに好ましくは10℃~30℃の条件である。SLO濃度は、0.01mg/ml~30mg/mlの条件が好ましく、さらに好ましくは0.1mg/ml~3mg/mlの条件が好ましい。反応時間は、1分~24時間の反応が好ましく、さらに好ましくは10分~5時間の反応が好ましい。また、非特異反応を抑制するためや免疫測定試薬自体の安定性を高めるために、特に限定されるものではないが、1種類もしくは2種類以上の添加剤を含んだ状態でSLOをラテックスに吸着させてもよい。
(測定試薬)
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のラテックス粒子を使用したASOの測定方法、または、上記の本発明のラテックス粒子を含むASO測定試薬である。
本発明の免疫測定試薬を用いる免疫測定法もまた、本発明の1つである。本発明の免疫測定法としては、本発明の免疫測定試薬を用いるのであれば特に限定されず、通常の方法により行うことができる。例えば、被測定物質を含む媒体に本発明の免疫測定試薬を加え、被測定物質と本発明の免疫測定試薬に含まれるラテックス粒子上に固定された抗原とが抗原抗体反応により結合して生じた凝集を光学的に観察または目視により観察する。反応のpHの好ましい下限は5、上限は10であり、より好ましい下限は6、上限は9である。反応の温度の好ましい下限は4℃、上限は50℃であり、より好ましい下限は20℃、上限は40℃である。反応時間は適宜決められる。
上記媒体としては、被測定物質の種類に応じて適当な各種緩衝液が用いられる。かかる緩衝液としては、被測定物質を失活させることがなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しないようなイオン濃度やpHを有するものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、Tris-HCl緩衝液、各種グッド緩衝液等の公知の緩衝液が挙げられる。これらの緩衝液は単独で用いてもよく、2種以上を併用してもよい。
上記媒体は、反応の感度を高めるために公知の水溶性添加剤、例えばポリエチレングリコール、カルボキシルメチルセルロース、メチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリグリコシルエチルメタクリレート、プルラン、デキストラン、エルシナン等の水溶性高分子等を含有してもよい。また、特異性の向上、試薬の安定性向上等の目的から、アルブミン、カゼイン、ゼラチン等のタンパク質又はその分解物、変性物;塩化コリン等の第4級アンモニウム塩、EDTA、ポリアニオン、カオトロピックイオン(Cl-,I-,SCN-等)、アミノ酸、界面活性剤等を含有してもよい。また、防腐剤として、例えば、アジ化ナトリウムやフェニルメタンスルホニルフルオリドなどを含有してもよい。
上記抗原抗体反応によって生じた凝集の度合いを検出する方法は特に限定されないが、例えば光学的な観察又は目視により観察することにより検出される。具体的には、不溶性担体の凝集の程度を光学的に検出する方法としては、例えば、散乱光強度、吸光度又は透過光強度の増加又は減少を測定する方法等が挙げられる。また、目視により観察して判定する方法としては、例えば、試料と本発明の免疫測定試薬とを判定板上で混合し、1~5分間揺り動かしたあと、凝集の有無を判定する方法等が挙げられる。また、像を撮影し画像処理を施してもよい。
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のラテックス粒子を使用したASOの測定方法、または、上記の本発明のラテックス粒子を含むASO測定試薬である。
本発明の免疫測定試薬を用いる免疫測定法もまた、本発明の1つである。本発明の免疫測定法としては、本発明の免疫測定試薬を用いるのであれば特に限定されず、通常の方法により行うことができる。例えば、被測定物質を含む媒体に本発明の免疫測定試薬を加え、被測定物質と本発明の免疫測定試薬に含まれるラテックス粒子上に固定された抗原とが抗原抗体反応により結合して生じた凝集を光学的に観察または目視により観察する。反応のpHの好ましい下限は5、上限は10であり、より好ましい下限は6、上限は9である。反応の温度の好ましい下限は4℃、上限は50℃であり、より好ましい下限は20℃、上限は40℃である。反応時間は適宜決められる。
上記媒体としては、被測定物質の種類に応じて適当な各種緩衝液が用いられる。かかる緩衝液としては、被測定物質を失活させることがなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しないようなイオン濃度やpHを有するものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、Tris-HCl緩衝液、各種グッド緩衝液等の公知の緩衝液が挙げられる。これらの緩衝液は単独で用いてもよく、2種以上を併用してもよい。
上記媒体は、反応の感度を高めるために公知の水溶性添加剤、例えばポリエチレングリコール、カルボキシルメチルセルロース、メチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリグリコシルエチルメタクリレート、プルラン、デキストラン、エルシナン等の水溶性高分子等を含有してもよい。また、特異性の向上、試薬の安定性向上等の目的から、アルブミン、カゼイン、ゼラチン等のタンパク質又はその分解物、変性物;塩化コリン等の第4級アンモニウム塩、EDTA、ポリアニオン、カオトロピックイオン(Cl-,I-,SCN-等)、アミノ酸、界面活性剤等を含有してもよい。また、防腐剤として、例えば、アジ化ナトリウムやフェニルメタンスルホニルフルオリドなどを含有してもよい。
上記抗原抗体反応によって生じた凝集の度合いを検出する方法は特に限定されないが、例えば光学的な観察又は目視により観察することにより検出される。具体的には、不溶性担体の凝集の程度を光学的に検出する方法としては、例えば、散乱光強度、吸光度又は透過光強度の増加又は減少を測定する方法等が挙げられる。また、目視により観察して判定する方法としては、例えば、試料と本発明の免疫測定試薬とを判定板上で混合し、1~5分間揺り動かしたあと、凝集の有無を判定する方法等が挙げられる。また、像を撮影し画像処理を施してもよい。
(SLOの抗原活性測定方法)
本発明において、SLOの抗原活性測定は以下の条件で行う。本抗原活性測定方法は、SLOが固定化されたラテックス粒子と被検試料中のSLO(被検物質)とを競合させて、当該ラテックス粒子と抗体との免疫複合体の形成を阻害し、免疫複合体の形成阻害に伴う当該ラテックス粒子の凝集阻害の程度から被検物質(抗原)を測定する方法である。なお、本明細書で「抗原活性」という場合は、具体的には、特に断りのない限り、以下の方法で測定した値を意味する。
<試薬>
デンカ生研社製 ASOラテックスX1「生研」 R1試薬(緩衝液)
デンカ生研社製 ASOラテックスX1「生研」 R2試薬(ラテックス(SLO吸着ラテックス)浮遊液)
デンカ生研社製 ASO標準液(500 IU/ml)
<測定試料>
測定試料は、デンカ生研社製ASO標準液(500 IU/ml)、生理食塩水及びSLO溶液が5:4:1の比率で混合されたものが使用する。また、SLO溶液は必要に応じて、20mMリン酸緩衝溶液(pH7.5)で希釈された後、使用された。盲検はSLO溶液の代わりにSLOを希釈する20mMリン酸緩衝溶液(pH7.5)が使用する。
<測定方法>
上記の測定試料、上記のR1試薬及び上記R2試薬を下記条件で日立7170形自動分析装置を用いて、試料中のSLOのASOに対する抗原活性(SAU/mg:StreptolysinO Antigenic Unit/mg)を測定する。
試料 : 3μL(ASO標準液(250 IU/ml)を含む)
R1試薬 : 70μL
R2試薬 : 120μL
測定方法 : 2ポイントエンド法(19-34)
主波長 : 570nm
副波長 : 800nm
抗原活性(SAU/mg)
={(測定値(BLANK)-測定値(TEST)}×10×SLO溶液の希釈率/タンパク質濃度(mg/ml)
本発明において、SLOの抗原活性測定は以下の条件で行う。本抗原活性測定方法は、SLOが固定化されたラテックス粒子と被検試料中のSLO(被検物質)とを競合させて、当該ラテックス粒子と抗体との免疫複合体の形成を阻害し、免疫複合体の形成阻害に伴う当該ラテックス粒子の凝集阻害の程度から被検物質(抗原)を測定する方法である。なお、本明細書で「抗原活性」という場合は、具体的には、特に断りのない限り、以下の方法で測定した値を意味する。
<試薬>
デンカ生研社製 ASOラテックスX1「生研」 R1試薬(緩衝液)
デンカ生研社製 ASOラテックスX1「生研」 R2試薬(ラテックス(SLO吸着ラテックス)浮遊液)
デンカ生研社製 ASO標準液(500 IU/ml)
<測定試料>
測定試料は、デンカ生研社製ASO標準液(500 IU/ml)、生理食塩水及びSLO溶液が5:4:1の比率で混合されたものが使用する。また、SLO溶液は必要に応じて、20mMリン酸緩衝溶液(pH7.5)で希釈された後、使用された。盲検はSLO溶液の代わりにSLOを希釈する20mMリン酸緩衝溶液(pH7.5)が使用する。
<測定方法>
上記の測定試料、上記のR1試薬及び上記R2試薬を下記条件で日立7170形自動分析装置を用いて、試料中のSLOのASOに対する抗原活性(SAU/mg:StreptolysinO Antigenic Unit/mg)を測定する。
試料 : 3μL(ASO標準液(250 IU/ml)を含む)
R1試薬 : 70μL
R2試薬 : 120μL
測定方法 : 2ポイントエンド法(19-34)
主波長 : 570nm
副波長 : 800nm
抗原活性(SAU/mg)
={(測定値(BLANK)-測定値(TEST)}×10×SLO溶液の希釈率/タンパク質濃度(mg/ml)
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
[実施例1]SLO遺伝子のクローニング
配列番号2に記載の人工合成遺伝子(Accession number NC003485)を鋳型とし、表1に記載のプライマーを用いて、各種SLO遺伝子を増幅した(表1において、Fwはフォワードプライマー、Rvはリバースプライマーを表す。)。具体的には、開始コドン、ヒスチジンタグの後に、32位のグルタミン酸残基が続き、464位のリジン残基を末端とするSLO(これをN32-C464とも表記する)をコードする遺伝子は、配列番号4及び6のプライマーを用いて増幅した。同様に、N32-C466、N32-C471、N35-C464、N35-C466、N35-C471、N32-C560及びN32-C571の各SLOをコードする遺伝子の増幅には、配列番号4及び7、配列番号4及び8、配列番号5及び6、配列番号5及び7、配列番号5及び8、配列番号4及び9、ならびに、配列番号4及び10のプライマーをそれぞれ用いた。なお、本プライマーのN末端側には制限酵素サイトNdeIが、C末端側には制限酵素サイトBamHIが、それぞれ付加されており、このDNA断片を制限酵素NdeIとBamHIで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドpBSKと混合し、混合液と等量のライゲーション試薬(東洋紡製ライゲーションハイ)を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにしてSLO遺伝子を大量に発現できるように設計された組換えプラスミドpBSKSLO(N32-C464、N32-C466、N32-C471、N35-C464、N35-C466、N35-C471、N32-C560及びN32-C571)を取得した。
配列番号2に記載の人工合成遺伝子(Accession number NC003485)を鋳型とし、表1に記載のプライマーを用いて、各種SLO遺伝子を増幅した(表1において、Fwはフォワードプライマー、Rvはリバースプライマーを表す。)。具体的には、開始コドン、ヒスチジンタグの後に、32位のグルタミン酸残基が続き、464位のリジン残基を末端とするSLO(これをN32-C464とも表記する)をコードする遺伝子は、配列番号4及び6のプライマーを用いて増幅した。同様に、N32-C466、N32-C471、N35-C464、N35-C466、N35-C471、N32-C560及びN32-C571の各SLOをコードする遺伝子の増幅には、配列番号4及び7、配列番号4及び8、配列番号5及び6、配列番号5及び7、配列番号5及び8、配列番号4及び9、ならびに、配列番号4及び10のプライマーをそれぞれ用いた。なお、本プライマーのN末端側には制限酵素サイトNdeIが、C末端側には制限酵素サイトBamHIが、それぞれ付加されており、このDNA断片を制限酵素NdeIとBamHIで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドpBSKと混合し、混合液と等量のライゲーション試薬(東洋紡製ライゲーションハイ)を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにしてSLO遺伝子を大量に発現できるように設計された組換えプラスミドpBSKSLO(N32-C464、N32-C466、N32-C471、N35-C464、N35-C466、N35-C471、N32-C560及びN32-C571)を取得した。
[実施例2]各種SLO遺伝子のE.coliにおける発現及び精製
実施例1で構築した各種のプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリJM109株コンピテントセル(東洋紡製コンピテントハイJM109)を当製品に添付のプロトコールに従って形質転換し、形質転換体を取得した。得られた各形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した5mLのLB液体培地(アンピシリン50μg/mLを含む)に植菌後、30℃で16時間振とうして好気的に培養した。得られた培養液を種培養液とし、500mlの坂口フラスコに入った100mLのTB培地(IPTG1mM、アンピシリン50μg/mLを含む)に植菌し、振とう数180rpmで30℃、20時間培養した。このようにして得られた菌体を遠心分離で集菌し、20mMイミダゾールを含む25mMリン酸緩衝溶液(pH7.5)に懸濁し、ガラスビーズを用いて破砕し、得られた粗酵素を、20mMイミダゾールを含む25mMリン酸緩衝溶液(pH7.5)で平衡化したHisTrap HP1mL(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)に供し、500mMイミダゾールを含む25mMリン酸緩衝溶液(pH7.5)で溶出することで、N32-C560の発現コンストラクトを除き、高い純度のストレプトリジン溶液を得た。さらに、純度を向上させるため、CM FFカラム5mL(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)により分離精製することで、不純タンパク質がSDS-PAGEレベルでは検出できないほど、純度を向上させることに成功した。前記で調製した各サンプルを用いてSDS-PAGEを行った結果は図1に示す。なお、C末端を11残基削除したN32-C560の発現コンストラクトにおいては、HisTrap HP1mL(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)での溶出画分にて、全長型のバンドに加えて、分解産物とみられる低分子量型のSLOが確認された(図2)。
実施例1で構築した各種のプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリJM109株コンピテントセル(東洋紡製コンピテントハイJM109)を当製品に添付のプロトコールに従って形質転換し、形質転換体を取得した。得られた各形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した5mLのLB液体培地(アンピシリン50μg/mLを含む)に植菌後、30℃で16時間振とうして好気的に培養した。得られた培養液を種培養液とし、500mlの坂口フラスコに入った100mLのTB培地(IPTG1mM、アンピシリン50μg/mLを含む)に植菌し、振とう数180rpmで30℃、20時間培養した。このようにして得られた菌体を遠心分離で集菌し、20mMイミダゾールを含む25mMリン酸緩衝溶液(pH7.5)に懸濁し、ガラスビーズを用いて破砕し、得られた粗酵素を、20mMイミダゾールを含む25mMリン酸緩衝溶液(pH7.5)で平衡化したHisTrap HP1mL(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)に供し、500mMイミダゾールを含む25mMリン酸緩衝溶液(pH7.5)で溶出することで、N32-C560の発現コンストラクトを除き、高い純度のストレプトリジン溶液を得た。さらに、純度を向上させるため、CM FFカラム5mL(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)により分離精製することで、不純タンパク質がSDS-PAGEレベルでは検出できないほど、純度を向上させることに成功した。前記で調製した各サンプルを用いてSDS-PAGEを行った結果は図1に示す。なお、C末端を11残基削除したN32-C560の発現コンストラクトにおいては、HisTrap HP1mL(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)での溶出画分にて、全長型のバンドに加えて、分解産物とみられる低分子量型のSLOが確認された(図2)。
[実施例3]溶血活性の評価
実施例2において調製した各SLO溶液の溶血活性をそれぞれ測定した。測定方法としては、まず、PBS溶液で2%に希釈されたウサギ脱繊維血液(日本バイオテスト研究所製)1mlに対し、20mMシステインを含むPBS溶液で希釈されたSLO50μlを添加し、37℃で1時間反応させた。なお、測定時のSLO溶液のタンパク質濃度は、全て1.0mg/mlの濃度で測定された。結果は表2に示した通り、全長型のSLO(N32-C571)は、溶血の程度を表す541nmの吸収(A541)が検出され、改変型SLOに関しては、Blankとの有意な差はなく、溶血活性(Hemolytic activity)を損失していることが確認された。
実施例2において調製した各SLO溶液の溶血活性をそれぞれ測定した。測定方法としては、まず、PBS溶液で2%に希釈されたウサギ脱繊維血液(日本バイオテスト研究所製)1mlに対し、20mMシステインを含むPBS溶液で希釈されたSLO50μlを添加し、37℃で1時間反応させた。なお、測定時のSLO溶液のタンパク質濃度は、全て1.0mg/mlの濃度で測定された。結果は表2に示した通り、全長型のSLO(N32-C571)は、溶血の程度を表す541nmの吸収(A541)が検出され、改変型SLOに関しては、Blankとの有意な差はなく、溶血活性(Hemolytic activity)を損失していることが確認された。
[実施例4]抗原活性の測定
実施例2において調製した各SLO溶液及びBIOKIT社製SLO(Code:T3000-5258)を用いて、抗原活性を測定した。BIOKIT社製SLOのSDS-PAGE結果を図3に示すが、全長型SLOと比較して、約40kDa、分子量が大きいことを確認した。この結果から融合タンパク質であることが示唆されたため、本明細書では、BIOKIT社製SLOをFusion typeとも表記する。抗原活性の測定結果は図4に示す。なお、測定時のSLO溶液のタンパク質濃度は、改変型SLOは、0.08mg/mlの濃度で、全長型SLOは、0.11mg/mlの濃度で、BIOKIT社製SLOは、0.16mg/mlの濃度で測定された。改変型SLOは、全長型SLOに対して、高い抗原活性を示した。本結果は、削除した約100アミノ酸残基の領域には重要なエピトープが存在しないことを示している。また、BIOKIT社製SLOの抗原活性は全長型SLOよりも低いことを確認した。
実施例2において調製した各SLO溶液及びBIOKIT社製SLO(Code:T3000-5258)を用いて、抗原活性を測定した。BIOKIT社製SLOのSDS-PAGE結果を図3に示すが、全長型SLOと比較して、約40kDa、分子量が大きいことを確認した。この結果から融合タンパク質であることが示唆されたため、本明細書では、BIOKIT社製SLOをFusion typeとも表記する。抗原活性の測定結果は図4に示す。なお、測定時のSLO溶液のタンパク質濃度は、改変型SLOは、0.08mg/mlの濃度で、全長型SLOは、0.11mg/mlの濃度で、BIOKIT社製SLOは、0.16mg/mlの濃度で測定された。改変型SLOは、全長型SLOに対して、高い抗原活性を示した。本結果は、削除した約100アミノ酸残基の領域には重要なエピトープが存在しないことを示している。また、BIOKIT社製SLOの抗原活性は全長型SLOよりも低いことを確認した。
[実施例5]熱安定性の評価
実施例2において調製した各SLO溶液及びBIOKIT社製SLO(Code:T3000-5258)を用いて、熱処理後の抗原活性測定により、熱安定性を評価した。結果を図5に示す。なお、測定時のSLO溶液のタンパク質濃度は、2.0mg/mlの濃度において、各温度で6時間処理され、その後、抗原活性を測定することにより、熱安定性を評価した。その結果、改変型SLOは、全長型SLOに対して、熱安定性が高まっており、実用上、有益な特性を獲得していることを確認した。また、BIOKIT社製のSLO(Code:T3000-5258)よりも、熱安定性が優れていることを確認した。
実施例2において調製した各SLO溶液及びBIOKIT社製SLO(Code:T3000-5258)を用いて、熱処理後の抗原活性測定により、熱安定性を評価した。結果を図5に示す。なお、測定時のSLO溶液のタンパク質濃度は、2.0mg/mlの濃度において、各温度で6時間処理され、その後、抗原活性を測定することにより、熱安定性を評価した。その結果、改変型SLOは、全長型SLOに対して、熱安定性が高まっており、実用上、有益な特性を獲得していることを確認した。また、BIOKIT社製のSLO(Code:T3000-5258)よりも、熱安定性が優れていることを確認した。
[実施例6]大腸菌発現でのコドンユーセージ至適化
大腸菌での発現量を向上させるため、コドンユーセージの至適化を行った。人工合成された配列は、配列番号3に示す。実施例1及び2に記載と同様の手法で、発現プラスミドを構築した。プラスミドの作成に用いたプライマーは、表3に示す。構築したプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリJM109株コンピテントセル(東洋紡製コンピテントハイJM109)に当製品に添付のプロトコールに従って形質転換し、形質転換体を取得した。得られた各形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した5mLのLB液体培地(アンピシリン50μg/mLを含む)に植菌後、30℃で16時間振とうして好気的に培養した。得られた培養液を種培養液とし、500mlの坂口フラスコに入った100mLのTB培地(IPTG1mM、アンピシリン50μg/mLを含む)に植菌し、振とう数180rpmで30℃、20時間培養した。その結果、約300mg/Lの改変型SLOの発現を確認した。この値は、コドンユーセージの至適化前の約2倍に相当し、コドン配列の至適化により、生産性が向上していることが確認された。
大腸菌での発現量を向上させるため、コドンユーセージの至適化を行った。人工合成された配列は、配列番号3に示す。実施例1及び2に記載と同様の手法で、発現プラスミドを構築した。プラスミドの作成に用いたプライマーは、表3に示す。構築したプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリJM109株コンピテントセル(東洋紡製コンピテントハイJM109)に当製品に添付のプロトコールに従って形質転換し、形質転換体を取得した。得られた各形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した5mLのLB液体培地(アンピシリン50μg/mLを含む)に植菌後、30℃で16時間振とうして好気的に培養した。得られた培養液を種培養液とし、500mlの坂口フラスコに入った100mLのTB培地(IPTG1mM、アンピシリン50μg/mLを含む)に植菌し、振とう数180rpmで30℃、20時間培養した。その結果、約300mg/Lの改変型SLOの発現を確認した。この値は、コドンユーセージの至適化前の約2倍に相当し、コドン配列の至適化により、生産性が向上していることが確認された。
[実施例7]ラテックス比濁測定用試薬における感度評価
実施例2において調製した各SLO溶液及びBIOKIT社製SLO(Code:T3000-5258)を2.2mg/mLの濃度に調製し、終濃度0.1%となるよう25%グルタルアルデヒド溶液(Sigma社製、Code:G5882)を添加した。次に、その溶液を室温で1時間、機械的に攪拌する。その後、グリシンを添加し、0.1%の最終濃度にする。次に、その溶液を室温で30分間、機械的に撹拌した後、4℃で一晩保存した。その後、ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を算出し、ラテックス粒子にコーディングされた。コーティング条件としては、50mMホウ酸緩衝液(pH8.2)から構成される緩衝液であって、架橋されたSLOの終濃度が図6に記載の通り、0.3~0.7mg/mlとなるようそれぞれ混合され、37℃で1時間、コーティング処理を実施した。その後、遠心、上清の除去、懸濁の洗浄工程を150mM NaCl及び0.5%BSAを含む50mMグリシン緩衝液(pH8.2)で2回繰り返すことで、ラテックス比濁測定用試薬における第2試薬を得た。また、第1試薬として、20mMTris-HCl緩衝液(pH8.2)、150mM NaCl、0.5%BSAからなる緩衝液を調製し、ラテックス試薬の感度評価を行った。測定方法としては、第1試薬と第2試薬を組合せ、日立7170形自動分析装置を用いてASO濃度依存的な粒子凝集塊の形成を確認した。具体的には、濃度0(IU/mL)、250(IU/mL)、500(IU/mL)のASO溶液3μLに、第1試薬240μLを加えて37℃で5分間加温後、第2試薬60μLを加えて攪拌した。その後5分間の凝集形成に伴う吸光度変化(ΔmAbs)を、主波長546nm、副波長800nmにて測定した。その結果、ラテックスへコーティングする際のSLO濃度が0.7mg/ml、ASO濃度500(IU/ml)の条件では、BIOKIT社製SLOのΔmAbsが78.1、全長型SLOのΔmAbsが66.9であるのに対し、本発明の改変型SLOは、約2~3倍の183.1であった。また、SLO濃度が0.5mg/ml、ASO濃度500(IU/ml)の条件においても、BIOKIT社製SLOのΔmAbsが60.2、全長型SLOのΔmAbsが38.9であるのに対し、本発明の改変型SLOは、約2~3倍の114.2であった。本結果により、本発明の改変型SLOはタンパク質あたりの抗原活性が高く、ASO試薬の製造に使用するSLOの量を低減できることが示された。
実施例2において調製した各SLO溶液及びBIOKIT社製SLO(Code:T3000-5258)を2.2mg/mLの濃度に調製し、終濃度0.1%となるよう25%グルタルアルデヒド溶液(Sigma社製、Code:G5882)を添加した。次に、その溶液を室温で1時間、機械的に攪拌する。その後、グリシンを添加し、0.1%の最終濃度にする。次に、その溶液を室温で30分間、機械的に撹拌した後、4℃で一晩保存した。その後、ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を算出し、ラテックス粒子にコーディングされた。コーティング条件としては、50mMホウ酸緩衝液(pH8.2)から構成される緩衝液であって、架橋されたSLOの終濃度が図6に記載の通り、0.3~0.7mg/mlとなるようそれぞれ混合され、37℃で1時間、コーティング処理を実施した。その後、遠心、上清の除去、懸濁の洗浄工程を150mM NaCl及び0.5%BSAを含む50mMグリシン緩衝液(pH8.2)で2回繰り返すことで、ラテックス比濁測定用試薬における第2試薬を得た。また、第1試薬として、20mMTris-HCl緩衝液(pH8.2)、150mM NaCl、0.5%BSAからなる緩衝液を調製し、ラテックス試薬の感度評価を行った。測定方法としては、第1試薬と第2試薬を組合せ、日立7170形自動分析装置を用いてASO濃度依存的な粒子凝集塊の形成を確認した。具体的には、濃度0(IU/mL)、250(IU/mL)、500(IU/mL)のASO溶液3μLに、第1試薬240μLを加えて37℃で5分間加温後、第2試薬60μLを加えて攪拌した。その後5分間の凝集形成に伴う吸光度変化(ΔmAbs)を、主波長546nm、副波長800nmにて測定した。その結果、ラテックスへコーティングする際のSLO濃度が0.7mg/ml、ASO濃度500(IU/ml)の条件では、BIOKIT社製SLOのΔmAbsが78.1、全長型SLOのΔmAbsが66.9であるのに対し、本発明の改変型SLOは、約2~3倍の183.1であった。また、SLO濃度が0.5mg/ml、ASO濃度500(IU/ml)の条件においても、BIOKIT社製SLOのΔmAbsが60.2、全長型SLOのΔmAbsが38.9であるのに対し、本発明の改変型SLOは、約2~3倍の114.2であった。本結果により、本発明の改変型SLOはタンパク質あたりの抗原活性が高く、ASO試薬の製造に使用するSLOの量を低減できることが示された。
本発明の改変型SLOは抗原活性、熱安定性に優れたASO試薬に用いる診断薬原料として有用である。
Claims (10)
- 下記の(a)~(d)のいずれかのポリペプチドからなるストレプトリジンO;
(a)配列番号1に記載の2位のセリン残基から31位のアラニン残基、32位のグルタミン酸残基、33位のセリン残基、34位のアスパラギン残基のいずれかまでのポリペプチドが欠損し、かつ、配列番号1に記載の465位のイソロイシン残基から472位のアラニン残基のいずれかから、それ以降の全てのアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)上記(a)に示されるアミノ酸配列のN末端領域もしくはC末端領域にタグを1つ以上有するポリペプチド。
(c)上記(a)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド。
(d)上記(a)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド。 - 下記の(e)~(i)のいずれかのDNA:
(e)請求項1に示されるアミノ酸配列をコードするDNA。
(f)配列番号2において、N末端のatgの配列を除く5’末端側の0、3、6または9個の塩基が欠損し、かつ、3’末端側の3n(nは0から7のうちいずれかの整数)個の塩基が欠損した塩基配列からなるDNA。
(g)配列番号2に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(h)配列番号2に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(i)配列番号2に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。 - 以下の(k)~(n)のいずれかのDNA:
(k)配列番号3において、N末端のatgの配列を除く5’末端側の0、3、6または9個の塩基が欠損し、かつ、3’末端側の3n(nは0から7のうちいずれかの整数)個の塩基が欠損した塩基配列からなるDNA。
(l)配列番号3に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(m)配列番号3に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(n)配列番号3に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。 - 請求項2または3に記載のDNAを組み込んだベクター。
- 請求項4に記載のベクターを含む形質転換体。
- 請求項5に記載の形質転換体を培養することを含む、請求項1に記載のストレプトリジンOを製造する方法。
- 請求項1に記載のストレプトリジンOを架橋処理して得られる架橋型ストレプトリジンO。
- 請求項1に記載のストレプトリジンOもしくは項7に記載の架橋型ストレプトリジンOがコーティングされたラテックス粒子。
- 請求項8に記載のラテックス粒子を使用した抗ストレプトリジンO抗体(ASO)の測定方法。
- 請求項8に記載のラテックス粒子を含む抗ストレプトリジンO抗体(ASO)測定試薬。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020076691A (ja) * | 2018-11-09 | 2020-05-21 | 東洋紡株式会社 | 抗ストレプトリジンo測定試薬 |
JP2020076692A (ja) * | 2018-11-09 | 2020-05-21 | 東洋紡株式会社 | 抗ストレプトリジンo測定用ラテックス粒子の製造方法 |
WO2022158373A1 (ja) * | 2021-01-19 | 2022-07-28 | デンカ株式会社 | タンパク質、溶血性連鎖球菌ワクチン、dna、ベクター、形質転換体、タンパク質を製造する方法、バキュロウイルス、アグロバクテリウム、ラテックス粒子、キット及び抗ストレプトリジンo抗体の測定方法 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112485443A (zh) * | 2020-11-12 | 2021-03-12 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种灵敏度高的抗Ro52抗体检测试剂盒 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02242683A (ja) * | 1988-11-18 | 1990-09-27 | Michael Kehoe | ストレプトリシン0抗原誘導体、その製造方法およびその用途 |
WO1993005156A1 (en) | 1991-08-30 | 1993-03-18 | Beckman Instruments, Inc. | Streptolysin o derivatives |
JPH05184372A (ja) * | 1991-10-04 | 1993-07-27 | Nippon Suisan Kaisha Ltd | 枯草菌によるストレプトリジンoの製法及びそのための遺伝子組換え体 |
JPH06502769A (ja) * | 1991-08-30 | 1994-03-31 | ベックマン インスツルメンツ インコーポレーテッド | ストレプトリシンo変異体 |
WO2001092885A1 (fr) * | 2000-05-30 | 2001-12-06 | Iatron Laboratories, Inc. | Methode immunologique de turbidimetrie provoquee par du latex et reactif pour la mise en oeuvre de ladite methode |
JP2003344410A (ja) * | 2002-05-23 | 2003-12-03 | Sekisui Chem Co Ltd | 免疫測定試薬及び免疫測定法 |
CN102964435A (zh) | 2011-08-31 | 2013-03-13 | 北京利德曼生化股份有限公司研发中心 | 截短型溶血链球菌溶菌素o及利用其的检测试剂盒 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4240056A1 (de) * | 1992-11-28 | 1994-06-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Streptolysin O Peptidantigene und Verfahren zur Bestimmung von Streptolysin-Antikörper |
JPH06237775A (ja) | 1993-02-17 | 1994-08-30 | Nippon Suisan Kaisha Ltd | Slo発現ベクター、そのベクターで形質転換された菌株、そのベクターの製造方法、及びsloの製造方法 |
KR20070044868A (ko) * | 2005-10-26 | 2007-05-02 | 주식회사 바이오인프라 | 스트렙토라이신 o 단백질을 암호화하는 유전자를 발현하는재조합 아데노바이러스 및 이를 유효성분으로 하는 항암용조성물 |
AU2007348285A1 (en) * | 2006-10-30 | 2008-09-12 | Novartis Ag | Immunogenic and therapeutic compositions for streptococcus pyogenes |
CN101977926B (zh) * | 2007-12-21 | 2014-10-08 | 诺华股份有限公司 | 链球菌溶血素o的突变形式 |
-
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Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02242683A (ja) * | 1988-11-18 | 1990-09-27 | Michael Kehoe | ストレプトリシン0抗原誘導体、その製造方法およびその用途 |
WO1993005156A1 (en) | 1991-08-30 | 1993-03-18 | Beckman Instruments, Inc. | Streptolysin o derivatives |
JPH06502769A (ja) * | 1991-08-30 | 1994-03-31 | ベックマン インスツルメンツ インコーポレーテッド | ストレプトリシンo変異体 |
JPH05184372A (ja) * | 1991-10-04 | 1993-07-27 | Nippon Suisan Kaisha Ltd | 枯草菌によるストレプトリジンoの製法及びそのための遺伝子組換え体 |
WO2001092885A1 (fr) * | 2000-05-30 | 2001-12-06 | Iatron Laboratories, Inc. | Methode immunologique de turbidimetrie provoquee par du latex et reactif pour la mise en oeuvre de ladite methode |
JP4704662B2 (ja) * | 2000-05-30 | 2011-06-15 | 三菱化学メディエンス株式会社 | 免疫学的ラテックス比濁分析方法及びその試薬 |
JP2003344410A (ja) * | 2002-05-23 | 2003-12-03 | Sekisui Chem Co Ltd | 免疫測定試薬及び免疫測定法 |
CN102964435A (zh) | 2011-08-31 | 2013-03-13 | 北京利德曼生化股份有限公司研发中心 | 截短型溶血链球菌溶菌素o及利用其的检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
KEHOE, MICHAEL A. ET AL.: "Nucleotide Sequence of the Streptolysin 0 (SLO) Gene : Structural Homologies between SLO and Other Membrane- Damaging, Thiol-Activated Toxins", INFECTION AND IMMUNITY, vol. 55, no. 12, 1987, pages 3228 - 3232, XP055443650 * |
KOSUKE KATO: "2. Tanpakushitsu no Seishitsu wa?", MOKUTEKIBETSU DE ERABERU TANPAKUSHITSU HATSUGEN PROTOCOL, 2010, pages 16 - 25, XP009517088, Retrieved from the Internet <URL:https://www.yodosha.co.jp/bookdata/9784758101752/9784758101752_01.pdf> * |
PINKNEY, M. ET AL.: "Different Forms of Streptolysin O Produced by Streptococcus pyogenes and by Escherichia coli Expressing Recombination Toxin: Cleavage by Streptococcal Cysteine Protease", INFECTION AND IMMUNITY, vol. 63, no. 7, 1995, pages 2776 - 2779, XP055443646 * |
WEIS, SILVIA ET AL.: "Streptolysin O: the C-terminal, tryptophan-rich domain carries functional sites for both membrane binding and self-interaction but not for stable oligomerization", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1510, 2001, pages 292 - 299, XP085070801 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020076691A (ja) * | 2018-11-09 | 2020-05-21 | 東洋紡株式会社 | 抗ストレプトリジンo測定試薬 |
JP2020076692A (ja) * | 2018-11-09 | 2020-05-21 | 東洋紡株式会社 | 抗ストレプトリジンo測定用ラテックス粒子の製造方法 |
JP7225713B2 (ja) | 2018-11-09 | 2023-02-21 | 東洋紡株式会社 | 抗ストレプトリジンo測定用ラテックス粒子の製造方法 |
WO2022158373A1 (ja) * | 2021-01-19 | 2022-07-28 | デンカ株式会社 | タンパク質、溶血性連鎖球菌ワクチン、dna、ベクター、形質転換体、タンパク質を製造する方法、バキュロウイルス、アグロバクテリウム、ラテックス粒子、キット及び抗ストレプトリジンo抗体の測定方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2022088356A (ja) | 2022-06-14 |
CN109153705A (zh) | 2019-01-04 |
US20200325186A1 (en) | 2020-10-15 |
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