CN109142586B - 一种液相色谱法测定阿托伐他汀钙中间体ats-9及其杂质b含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明解决的技术问题是提供一种定量准确、方便可靠且重复性好的液相色谱法测定阿托伐他汀钙中间体ATS‑9及其杂质B含量的方法，包括ATS‑9中杂质B的分离；取阿托伐他汀钙中间体ATS‑9粗品，ATS‑9对照品，以及分离得到的ATS‑9中的杂质B（即ATS‑9二聚物）与苯甲酰氯反应；将得到的衍生化产物配置供试品和对照品溶液；高效液相色谱HPLC分析等步骤。采用该方法能使ATS‑9及其杂质B相互之间能够很好地分离，该方法也能检测其他有关物质。

Description

一种液相色谱法测定阿托伐他汀钙中间体ATS-9及其杂质B含 量的方法

技术领域

本发明属于药物含量及其杂质的测定方法技术领域，具体涉及一种液相色谱法测定阿托伐他汀钙中间体ATS-9及其杂质B含量的方法。

背景技术

(4R,6R)-6-胺乙基-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯，也称ATS-9，是合成阿托伐他汀钙的关键中间体，阿托伐他汀钙是竞争性、选择性HMG-CoA还原酶抑制剂，能大大降低总胆固醇和低密度脂蛋白的含量。作为合成阿托伐他汀钙的重要中间体，ATS-9的品质直接影响阿托伐他汀钙的品质。

目前已公开的ATS-9的合成和分析方法包括：1、以(4R,6R)-6-叠氮乙基-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸甲酯为原料。Junjie Liu等报道的ATS-9的合成方法，以(4R,6R)-6-叠氮乙基-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸甲酯为原料，经过水解再与二碳酸二叔丁酯酯化，最后再催化生成产物ATS-9(Tetrahedron Letters 45(2004)2439-2441)。2、以(R)-2-氯-环氧乙烷为原料。Fanjun Xiong等报道的ATS-9的合成方法，以(R)-2-氯-环氧乙烷为原料，经过多步反应合成ATS-9(Tetrahedron:Asymmetry,25,1205-1208)。3、Blackley用FactorFour VF-5MS(30m×0.25mm)毛细管色谱柱对ATS-9进行GC-MS测定(US8563753B2)，但对其含量测定没有报道。4、徐桂清等(ZL 201510497319.4)利用AgilentDB624毛细管气相色谱柱，采用GC方法、内标定量法测供试液中ATS-9的含量。

由于杂质B沸点高，气相色谱无法检测出杂质B。杂质B又会在阿托产品中对应反应生成阿托伐他汀钙二聚物杂质，因此为对ATS-9及其中杂质B含量进行准确测定，进而对其品质进行控制，以有效保证阿托伐他汀钙的品质，建立一种能够准确测定阿托伐他汀钙中间体ATS-9及其杂质B含量的方法非常必要。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种定量准确、方便可靠且重复性好的液相色谱法测定阿托伐他汀钙中间体ATS-9及其杂质B含量的方法，采用该方法能使ATS-9及其杂质B相互之间能够很好地分离并准确计算供试品溶液中ATS-9及其杂质B的含量。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种液相色谱法测定阿托伐他汀钙中间体ATS-9及其杂质B含量的方法，其特征在于具体步骤为：

步骤S1：ATS-9中杂质B的分离，将ATS-9粗品用流动相溶解后，负载在色谱柱上，然后用流动相洗脱分离，分段收集洗脱液，减压浓缩至干，浓缩液加入二氯甲烷溶解，用饱和柠檬酸洗涤，有机相减压浓缩至干，得到纯度为99％的杂质B，所述流动相为二氯甲烷-甲醇混合溶剂；

步骤S2：取ATS-9供试品、ATS-9对照品和步骤S1分离得到的杂质B分别加入溶剂，再加入苯甲酰氯和碱液，于0～20℃进行反应，反应结束后萃取，有机相旋干即得ATS-9供试品衍生化产物、ATS-9对照品衍生化产物和杂质B衍生化产物，所述碱液为饱和碳酸氢钠溶液；

步骤S3：取ATS-9供试品衍生化产物、ATS-9对照品衍生化产物和杂质B衍生化产物分别加入溶剂乙腈配制成浓度均为1mg/mL的ATS-9供试品衍生化产物溶液、ATS-9对照品衍生化产物溶液和杂质B衍生化产物溶液；

步骤S4：分别注入液相色谱仪，记录色谱图至洗脱程序结束，根据色谱图的峰面积计算各成分的含量，其中色谱条件如下：

色谱柱：YMC-Pack ODS-AM(4.6×250mm，5μm)；

流动相1：乙腈-四氢呋喃混合溶剂，乙腈与四氢呋喃的体积比2:1，流动相2：柠檬酸盐溶液，取10.5g柠檬酸加水900mL溶解后，用氨水调pH值至5.0，再加水至1000mL制得柠檬酸盐溶液；

流速：1mL·min^-1；

检测波长：244nm；

柱温：30℃；

进样量：20μL；

洗脱程序：流动相1:流动相2＝4:6，v/v；

保留时间：15min。

优选的，步骤S1中所述流动相中二氯甲烷与甲醇的体积比优选为150:1。

优选的，步骤S2中所述溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯中的一种或多种。

本发明利用YMC-Pack ODS-AM(4.6×250mm，5μm)色谱柱，采用HPLC方法使主成分与有关物质分离并准确计算供试品溶液中ATS-9的含量，本发明方法能够快速、准确、简便的检测ATS-9的含量及其高沸点杂质B的含量。

附图说明

图1为ATS-9对照品衍生化产物色谱图；

图2为杂质B衍生化产物色谱图；

图3为ATS-9供试品衍生化产物色谱图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

本发明方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：

1、所用的仪器及试剂如下：

UliMate 3000HPLC***，包括DPG3600A泵(带脱气机)，TCC-3100柱温箱(带六通阀)，WPS 3000TSL自动进样器，VWD-3400RS可变波长检测器，RF2000荧光剂监测器，Chromeleon 7S色谱工作站，电子分析天平(梅特勒，十万分之一)；

ATS-9对照品(实验室分离纯品，纯度≥99％)，ATS-9供试品(实验室自制)，ATS-9杂质B(实验室分离纯品，纯度≥98％)，乙腈，四氢呋喃等均为色谱纯。

实施例1

2、色谱条件：色谱柱：YMC-Pack ODS-AM(4.6×250mm,5μm)；流动相1：乙腈-四氢呋喃(体积比2:1)，流动相2：柠檬酸盐(取10.5g柠檬酸，加水900mL溶解后，用氨水调pH值至5.0，再加水至1000mL)；流速：1.5mL·min^-1；检测波长：244nm；柱温：30℃；进样量：20μL；洗脱程序：流动相1:流动相2＝2:8，v/v；保留时间：15min。

3、供试品溶液的配制：取ATS-9对照品衍生化产物适量，加溶剂乙腈溶解并定量稀释制成每1mL中含1mg的溶液，作为供试品溶液；

混合对照品溶液的配制：精密称取ATS-9杂质B衍生化产物与ATS-9对照品衍生化产物各适量，加乙腈溶解并定量稀释制成每1mL约含杂质B 3μg与ATS-9对照品衍生化产物10μg的溶液，作为混合对照品溶液。

4、高效液相色谱HPLC分析：取混合对照品20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图至洗脱程序结束，平行测定两次，在该色谱条件下，出峰位置靠前，分离效果差。

实施例2

2、色谱条件：色谱柱：YMC-Pack ODS-AM(4.6×250mm,5μm)；流动相1：乙腈-四氢呋喃混合溶剂(体积比2:1)，流动相2：柠檬酸盐(取10.5g柠檬酸，加水900mL溶解后，用氨水调pH值至5.0，再加水至1000mL)；流速：0.5mL·min^-1；检测波长：244nm；柱温：30℃；进样量：20μL；洗脱程序：流动相1:流动相2＝2:8，v/v；保留时间：15min。

3、供试品溶液的配制：取ATS-9对照品衍生化产物适量，加溶剂乙腈溶解并定量稀释制成每1mL中含1mg的溶液，作为供试品溶液；

混合对照品溶液的配制：精密称取ATS-9杂质B衍生化产物与ATS-9对照品衍生化产物各适量，加乙腈溶解并定量稀释制成每1mL约含杂质B 3μg与ATS-9对照品衍生化产物10μg的溶液，作为混合对照品溶液。

4、高效液相色谱HPLC分析：取混合对照品20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图至洗脱程序结束，平行测定两次，在该色谱条件下，出峰位置靠后，ATS-9衍生化产物峰与ATS-9杂质B衍生化产物峰接近分离度低，影响结果准确性。

实施例3

2、色谱条件：色谱柱：YMC-Pack ODS-AM(4.6×250mm,5μm)；流动相1：乙腈-四氢呋喃混合溶剂(体积比2:1)，流动相2：柠檬酸盐(取10.5g柠檬酸，加水900mL溶解后，用氨水调pH值至5.0，再加水至1000mL)；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：244nm；柱温：35℃；进样量：20μL；洗脱程序：流动相1:流动相2＝2:8，v/v；保留时间：20min。

3、供试品溶液的配制：取ATS-9对照品衍生化产物适量，加溶剂乙腈溶解并定量稀释制成每1mL中含1mg的溶液，作为供试品溶液；

混合对照品溶液的配制：精密称取ATS-9杂质B衍生化产物与ATS-9对照品衍生化产物各适量，加乙腈溶解并定量稀释制成每1mL约含杂质B 3μg与ATS-9对照品衍生化产物10μg的溶液，作为混合对照品溶液。

4、高效液相色谱HPLC分析：取混合对照品20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图至洗脱程序结束，平行测定两次，在该色谱条件下，出峰位置适中，ATS-9衍生化产物峰与ATS-9杂质B衍生化产物峰接近分离效果差。

实施例4

2、色谱条件：色谱柱：YMC-Pack ODS-AM(4.6×250mm，5μm)；流动相1：乙腈-四氢呋喃混合溶剂(体积比2:1)，流动相2：柠檬酸盐(取10.5g柠檬酸，加水900mL溶解后，用氨水调pH值至5.0，再加水至1000mL)；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：244nm；柱温：35℃；进样量：20μL；洗脱程序：流动相1:流动相2＝7:3；保留时间：20min。

3、供试品溶液的配制：取ATS-9对照品衍生化产物适量，加溶剂乙腈溶解并定量稀释制成每1mL中含1mg的溶液，作为供试品溶液；

混合对照品溶液的配制：精密称取ATS-9杂质B衍生化产物与ATS-9对照品衍生化产物各适量，加乙腈溶解并定量稀释制成每1mL约含杂质B 3μg与ATS-9对照品衍生化产物10μg的溶液，作为混合对照品溶液。

4、高效液相色谱HPLC分析：取混合对照品20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图至洗脱程序结束，平行测定两次，在该色谱条件下，出峰位置适中，分离效果差。

实施例5

色谱条件：色谱柱：YMC-Pack ODS-AM(4.6×250mm,5μm)；流动相1：乙腈-四氢呋喃混合溶剂(体积比2:1)，流动相2：柠檬酸盐(取10.5g柠檬酸，加水900mL溶解后，用氨水调pH值至5.0，再加水至1000mL)；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：244nm；柱温：30℃；进样量：20μL；洗脱程序：流动相1:流动相2＝4:6；保留时间：15min；

3、供试品溶液的配制：取ATS-9对照品衍生化产物适量，加溶剂乙腈溶解并定量稀释制成每1mL中含1mg的溶液，作为供试品溶液；

混合对照品溶液的配制：精密称取ATS-9杂质B衍生化产物与ATS-9对照品衍生化产物各适量，加乙腈溶解并定量稀释制成每1mL约含杂质B 3μg与ATS-9对照品衍生化产物10μg的溶液，作为混合对照品溶液。

4、高效液相色谱HPLC分析：取混合对照品20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图至洗脱程序结束，平行测定两次，在该色谱条件下，出峰位置适中，ATS-9衍生化产物峰与ATS-9杂质B衍生化产物峰分开，分离效果好，所得结果准确，该色谱条件最佳。

实施例6

对本发明方法测定ATS-9含量的方法学考察

1、***适用性实验：精密称取ATS-9对照品衍生化产物，ATS-9杂质B对照品衍生化产物各适量，加溶剂乙腈溶解并稀释制成每1mL含ATS-9对照品衍生化产物1mg，ATS-9杂质B对照品衍生化产物10μg的溶液。色谱图见附图。出峰顺序依次为ATS-9杂质B衍生化产物，ATS-9衍生化产物。

2、溶液的稳定性实验：加乙腈溶解，并稀释成每1mL中含1mg的溶液，分别在0、1、2、3、4、5、6h进行测定。结果表明，样品的溶液中ATS-9杂质B衍生化产物峰面积和ATS-9衍生化产物峰面积在6h内稳定，有关物质量、个数未变。

3、检出限和定量限：精密称取ATS-9对照品衍生化产物适量，用乙腈溶解并逐级稀释，当浓度为1×10^﹣4mg·mL^-1,进样量为20μL，S/N为3，故检出限为2ng。精密称取ATS-9杂质B对照品衍生化产物适量，用乙腈溶解并逐级稀释，当浓度为1.5×10^﹣3mg·mL^-1,进样量为20μL，S/N为10，故检出限为30ng。

4、重复性试验：精密称取ATS-9对照品衍生化产物适量，按照色谱条件配成供试品溶液进行测定，每份平均测定3次。ATS-9对照品衍生化产物平均含量为99.72％，RSD为0.49％，结果表明，该方法重复性良好。

5、线性关系考察：精密称取ATS-9对照品衍生化产物约15mg，ATS-9杂质B对照品衍生化产物约10mg，分别置于50mL容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密称取5mL，置于50mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0、1.6、2.0、2.4、3.0mL,分别置于25mL容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取20μL，注入液相色谱仪。以浓度X对峰面积Y进行线性回归，ATS-9对照品衍生化产物、ATS-9杂质B对照品衍生化产物回归方程分别为：

Y＝54.02X-10.21，r＝0.9961；

Y＝55.12X+2.62，r＝0.9972。

实施例7

ATS-9粗品含量测定

其中最佳色谱条件如下：

色谱柱：YMC-Pack ODS-AM(4.6×250mm,5μm)

流动相1：乙腈-四氢呋喃混合溶剂(体积比2:1)，流动相2：柠檬酸盐(取10.5g柠檬酸，加水900mL溶解后，用氨水调pH值至5.0，再加水至1000mL)；

流速：1mL·min^-1；

检测波长：244nm；

柱温：30℃；

进样量：20μL；

洗脱程序：流动相1:流动相2＝4:6，v/v；

保留时间：15min。

测定方法步骤如下：

(1)将ATS-9粗品10g(36.5mmol)加入反应瓶，加入50mL二氯甲烷，0℃搅拌，缓慢加入苯甲酰氯5g，加入30mL饱和碳酸氢钠溶液，反应结束后，用二氯甲烷萃取，有机相旋干，即得其衍生化产物。取ATS-9粗品衍生化产物适量，加溶剂乙腈溶解并定量稀释制成每1mL含1mg的溶液，作为供试品溶液；

将ATS-9对照品2g(7.3mmol)加入反应瓶，加入10mL二氯甲烷，0℃搅拌，缓慢加入苯甲酰氯1g，加入6mL饱和碳酸氢钠溶液，反应结束后，用二氯甲烷萃取，有机相旋干，即得其衍生化产物。取ATS-9对照品衍生化产物适量，加溶剂乙腈溶解并定量稀释制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；

将ATS-9杂质B 2g(4.2mmol)加入反应瓶，加入10mL二氯甲烷，0℃搅拌，缓慢加入苯甲酰氯0.6g，加入6mL饱和碳酸氢钠溶液，反应结束后，用二氯甲烷萃取，有机相旋干，即得其衍生化产物。取ATS-9杂质B衍生化产物适量，加溶剂乙腈溶解并定量稀释制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；

(2)取供试品溶液和对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，平行测定2次，记录色谱图至洗脱程序结束，根据色谱图的峰面积计算各成分的含量。

实施例8

(1)将ATS-9粗品5g(18.2mmol)加入反应瓶，加入100mL乙酸乙酯，20℃搅拌，缓慢加入苯甲酰氯13g，加入50mL饱和碳酸氢钠溶液，反应结束后，用二氯甲烷萃取，有机相旋干，即得其衍生化产物。取ATS-9粗品衍生化产物适量，加溶剂乙腈溶解并定量稀释制成每1mL含1mg的溶液，作为供试品溶液；

将ATS-9对照品4g(14.5mmol)加入反应瓶，加入80mL乙酸乙酯，20℃搅拌，缓慢加入苯甲酰氯10g，加入40mL饱和碳酸氢钠溶液，反应结束后，用乙酸乙酯萃取，有机相旋干，即得其衍生化产物。取ATS-9对照品衍生化产物适量，加溶剂乙腈溶解并定量稀释制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；

将ATS-9杂质B 4g(8.4mmol)加入反应瓶，加入80mL乙酸乙酯，20℃搅拌，缓慢加入苯甲酰氯6g，加入40mL饱和碳酸氢钠溶液，反应结束后，用乙酸乙酯萃取，有机相旋干，即得其衍生化产物。取ATS-9杂质B衍生化产物适量，加溶剂乙腈溶解并定量稀释制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；

(2)取供试品溶液和对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，平行测定2次，记录色谱图至洗脱程序结束，根据色谱图的峰面积计算各成分的含量。

实施例9

(1)将ATS-9粗品5g(18.2mmol)加入反应瓶，加入50mL二氯甲烷，5℃搅拌，缓慢加入苯甲酰氯7.6g，加入40mL饱和碳酸氢钠溶液，反应结束后，用二氯甲烷萃取，有机相旋干，即得其衍生化产物。取ATS-9粗品衍生化产物适量，加溶剂乙腈溶解并定量稀释制成每1mL含1mg的溶液，作为供试品溶液；

将ATS-9对照品2g(7.3mmol)加入反应瓶，加入20mL二氯甲烷，5℃搅拌，缓慢加入苯甲酰氯3g，加入20mL饱和碳酸氢钠溶液，反应结束后，用乙酸乙酯萃取，有机相旋干，即得其衍生化产物。取ATS-9对照品衍生化产物适量，加溶剂乙腈溶解并定量稀释制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；

将ATS-9杂质B 2g(4.2mmol)加入反应瓶，加入20mL二氯甲烷，5℃搅拌，缓慢加入苯甲酰氯1.7g，加入20mL饱和碳酸氢钠溶液，反应结束后，用二氯甲烷萃取，有机相旋干，即得其衍生化产物。取ATS-9杂质B衍生化产物适量，加溶剂乙腈溶解并定量稀释制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；

(2)取供试品溶液和对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，平行测定2次，记录色谱图至洗脱程序结束，根据色谱图的峰面积计算各成分的含量。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

Claims (1)

1.一种液相色谱法测定阿托伐他汀钙中间体ATS-9及其杂质B含量的方法，其特征在于具体步骤为：

步骤S1：ATS-9中杂质B的分离，将ATS-9粗品用流动相溶解后，负载在色谱柱上，然后用流动相洗脱分离，分段收集洗脱液，减压浓缩至干，浓缩液加入二氯甲烷溶解，用饱和柠檬酸洗涤，有机相减压浓缩至干，得到纯度为99%的杂质B，所述流动相为体积比150:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂；

步骤S2：取ATS-9供试品、ATS-9对照品和步骤S1分离得到的杂质B分别加入溶剂，该溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯中的一种或两种，再加入苯甲酰氯和碱液，于0~20℃进行反应，反应结束后萃取，有机相旋干即得ATS-9供试品衍生化产物、ATS-9对照品衍生化产物和杂质B衍生化产物，所述碱液为饱和碳酸氢钠溶液；

步骤S3：取ATS-9供试品衍生化产物、ATS-9对照品衍生化产物和杂质B衍生化产物分别加入溶剂乙腈配制成浓度均为1mg/mL的ATS-9供试品衍生化产物溶液、ATS-9对照品衍生化产物溶液和杂质B衍生化产物溶液；

步骤S4：分别注入液相色谱仪，记录色谱图至洗脱程序结束，根据色谱图的峰面积计算各成分的含量，其中色谱条件如下：

色谱柱：YMC-Pack ODS-AM，4.6×250mm，5μm；

流动相1：乙腈-四氢呋喃混合溶剂，乙腈与四氢呋喃的体积比2:1，流动相2：柠檬酸盐溶液，取10.5g柠檬酸加水900mL溶解后，用氨水调pH值至5.0，再加水至1000mL制得柠檬酸盐溶液；

流速：1mL·min^-1；

检测波长：244nm；

柱温：30℃；

进样量：20μL；

洗脱程序：流动相1:流动相2=4:6，v/v；

保留时间：15min。

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