CN109111575B - 一种金属-有机框架纳米颗粒的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种金属‑有机框架纳米颗粒的制备方法和应用,所述方法为将铁盐用无水乙醇溶解,黏康酸用DMF溶解后再用无水乙醇稀释,然后将上述两种溶液搅拌混匀,50~150°C微波加热1~60min,自然冷却后离心,洗涤,冷冻干燥得到MOF纳米颗粒。本发明与阳离子化合物及阳离子脂质体相比,化合物制备简单,大大简化了制备流程,提高了产率,而且避免了使用价格昂贵的磷脂,降低了成本。制备得到的MOF纳米颗粒生物相容性好,体内易降解,不会在体内引起毒副作用,低浓度MOF甚至可以促进细胞增殖。通过腹腔注射微环DNA‑MOF溶液,可以在腹腔内表达目标基因,有希望治疗腹部器官病变或肿瘤,具有较大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域。更具体地,涉及一种金属-有机框架纳米颗粒的制备方法和应用。
背景技术
基因治疗是指将外源基因导入靶细胞,治疗基因缺陷或者基因异常而引起的疾病。但基因本身无法顺利进入到靶细胞内,必须依靠基因载体。病毒是一类常见的基因载体,包括腺病毒载体(AV),腺相关病毒载体(AAV),逆转录病毒等,它利用病毒对宿主细胞的感染将外源基因导入细胞内且高效表达。虽然病毒载体具有较高的转染效率,但病毒载体装载基因容量有限,而且具有免疫原性,存在潜在的生物安全性隐患。近年来,微环DNA(Minicircle DNA,mcDNA)的出现,成为基因载体中的一大亮点,微环DNA是一个环状的表达盒子,是通过DNA重组技术,把标准质粒的骨架DNA去除后的产物,只含有一个基因表达框而没有外在的细菌骨架序列,其优点是能有效延长靶基因在细胞内的表达时间、携带的基因量大且几乎无毒性。但是由于裸露的DNA在生理环境中会被迅速清除,不能有效进入靶细胞,仍需合适的投递***将微环DNA递送至靶向组织或器官。
常用的基因投递***包括磷酸钙,阳离子脂质体,阳离子多聚物(聚乙烯亚胺PEI,树状大分子PAMAM)等。这类投递***免疫原性较低、基因装载容量大,但是转染效率低,大大限制了其临床应用。现有技术中的体内无病毒转染技术一般是通过阳离子脂质体或阳离子聚合物介导,将目的基因递送至体内器官或组织。但是阳离子脂质体原料昂贵且毒性较大。阳离子聚合物,一般包括聚乙烯亚胺(PEI)、树状大分子、聚氨基酯等,通过正负电荷吸引包裹DNA,商品化试剂如如Polyplus公司的in vivo-jetPEI系列。阳离子脂质体与阳离子聚合物在体外细胞系上转染效率很高,但体内转染效率不高而且生物毒性大,
因此,研究开发高效,具有良好生物相容性且具有靶向性的基因投递***能够解决基因药物临床应用的关键问题。
金属有机框架材料(Metal Organic Frameworks, MOF)又叫金属有机配位聚合物,是一种新型的功能化晶体材料。它是由有机桥配体通过配位键的方式将无机金属中心连接起来形成无限延伸的网络网状结构的晶体材料。由于有机和无机不同成分组成的结构不同使得其结构多样并可调节,在许多方面有着潜在的应用。例如储存和分离气体,以及化学传感、光学、催化方面的应用都有许多研究。一定结构的MOF材料又具有生物相容性和可降解性,因此在生物学方向也有潜在的应用前景,MOF在药物递送及生物成像方面的应用已有报道。
但是目前,还尚未有将金属有机纳米颗粒用于微环DNA体内转染的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服微环DNA体外及体内有效递送中存在的缺陷和不足,通过微波溶剂热制备得到一种金属-有机框架纳米颗粒,所述金属-有机纳米颗粒生物相容性好,体内易降解,不会在体内引起毒副作用,低浓度时甚至可以促进细胞增殖。所述金属-有机框架纳米颗粒可介导微环DNA在腹腔内高效转染,在腹腔内表达目标基因蛋白,从而治疗腹部器官病变或肿瘤。
本发明的目的是提供一种金属-有机框架纳米颗粒的制备方法。
本发明的第二目的是提供所述金属-有机框架纳米颗粒在介导基因体内转染中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的:
一种金属-有机框架纳米颗粒的制备方法,将铁盐用无水乙醇溶解,黏康酸用DMF溶解后再用无水乙醇稀释,然后将上述两种溶液搅拌混匀,50~150°C微波加热1~60min,自然冷却后离心,洗涤,冷冻干燥得到MOF纳米颗粒。
优选地,所述铁盐可以为六水合氯化铁、无水氯化铁、四水合氯化铁或硝酸铁,但本发明并不仅限于此。
优选地,所述黏康酸为反式-反式黏康酸。
优选地,所述铁盐与粘康酸的摩尔比为1:0.1~10。
优选地,所述水热反应的条件为100°C微波加热60min。
优选地,所述离心为14000g离心10min。
具体的,金属-有机框架纳米颗粒的制备方法包括如下步骤:
S1.将六水合氯化铁溶解到污水乙醇中,得到黄色透明溶液A;
S2.将反,反-粘康酸加入到二甲基甲酰胺(DMF)中,搅拌至完全溶解,得到澄清透明溶液,再加无水乙醇稀释,得到溶液B;
S3.将溶液A转移到溶液B中,充分搅拌3分钟,得到溶液C;
S4.将溶液C倒入微波水热反应釜中,100°C,微波加热60min,等溶液自然冷却到60°C以下时取出;
S5.将上述溶液在14000g下离心10min,再用无水乙醇洗三次,最后冷冻干燥即得到MOF纳米颗粒。
同时,本发明还请求保护上述制备方法制备得到的金属-有机框架纳米颗粒,是由金属离子(Fe)和反,反-粘康酸配位形成具有八面体稳定结构的次级构建单元(SBU),次级结构单元再构筑固体结构。Fe离子和有机物之间靠化学配位键作用链接,而这种作用力在水溶液条件下是会解离的。所以本发明中提到的铁基MOF,都是可以在体内降解的。以一般纳米/微米材料的降解规律来看,降解速率跟颗粒大小及孔隙率等条件有关,颗粒越大,降解速度越慢,孔隙率越高,降解速度越快。
本发明研究发现,制备得到的MOF纳米颗粒生物相容性好,体内易降解,不会在体内引起毒副作用,低浓度时甚至可以促进细胞增殖,是一种可以介导基因转染的MOF材料;通过将制备的金属-有机框架纳米颗粒与DNA混合,通过腹腔注射进入体内,可高效转染,在腹腔内可表达DNA产物。
因此,本发明还保护金属-有机框架纳米颗粒在介导基因体内转染中的应用。
同时,本发明还请求保护所述金属-有机框架纳米颗粒在制备微环DNA转染制剂中的应用。
具体地,所述应用为将金属-有机框架纳米颗粒分散在PBS中,再与微环DNA混合。
更具体地,将MOF颗粒样品分散在水中,超声10~20分钟,形成A溶液;将带有目标表达基因的微环DNA分散在水中,形成B溶液;将B溶液加入A溶液中,形成C溶液,即得微环DNA转染制剂。
优选地,所述金属-有机框架纳米颗粒与微环DNA的质量比为0.5~1mg:20μg。
本发明研究发现,与MOF载药不同,当用MOF载药,需要MOF的比表面积比较大,通过物理吸附或者化学键的作用和药物分子结合,以达到载药的目的。但是当MOF介导DNA在腹腔内转染,需要有棒状、针状等二维材料,能够轻微刺激腹腔内间皮细胞,加强细胞对DNA的吞噬作用,以促进转染。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明的金属-有机框架纳米颗粒与阳离子化合物及阳离子脂质体相比,化合物制备简单,大大简化了制备流程,提高了产率,而且避免了使用价格昂贵的磷脂,降低了成本,通过控制水热反应的温度和/或时间,可以调控金属有机框架化合物粒径和形貌。制备得到的MOF纳米颗粒生物相容性好,体内易降解,不会在体内引起毒副作用,低浓度MOF甚至可以促进细胞增殖。通过腹腔注射微环DNA-MOF溶液,可以在腹腔内表达目标基因,有希望治疗腹部器官病变或肿瘤,具有较大的应用前景。
附图说明
图1为样品的扫描电子显微镜图片。其中A为样品10,B为样品8,C为样品1。
图2为样品1的粒径分布图片。
图3为机金属框架化合物样品1与HEPG2细胞共培养24小时候后细胞存活率。
图4为样品1与mcDNA-Luc混合后由腹腔注射到小鼠体内。一段时间后用IVIS小动物成像仪观察mcDNA-Luc在小鼠体内的转染情况。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
一种金属-有机框架纳米颗粒的制备方法,包括如下步骤:
S1.将0.277g六水合氯化铁溶解到10ml乙醇中,得到黄色透明溶液A;
S2.将0.277g反式-反式黏康酸加3mL二甲基甲酰胺(DMF),搅拌至完全溶解,得到澄清透明溶液,再加10mL乙醇,得到溶液B;
S3.将溶液A转移到溶液B中,充分搅拌3分钟,得到溶液C;
S4.将溶液C倒入反微波水热应釜中,100°C,微波加热60min,等溶液自然冷却到60°C以下时取出;
S5.将上述溶液在14000g下离心10min,再用无水乙醇洗三次,最后冷冻干燥即得到MOF纳米颗粒;将此样品命名为样品1。
实施例2
一种金属-有机框架纳米颗粒的制备方法,除了步骤S4微波水热反应的条件为80°C,微波加热1min外,其它条件与实施例1基本相同;制备得到MOF纳米颗粒,将此样品命名为样品2。
实施例3
一种金属-有机框架纳米颗粒的制备方法,除了步骤S4微波水热反应的条件为90°C,微波加热1min外,其它条件与实施例1基本相同;制备得到MOF纳米颗粒,将此样品命名为样品3。
实施例4
一种金属-有机框架纳米颗粒的制备方法,除了步骤S4微波水热反应的条件为100°C,微波加热5min外,其它条件与实施例1基本相同;制备得到MOF纳米颗粒,将此样品命名为样品4。
实施例5
一种金属-有机框架纳米颗粒的制备方法,除了步骤S4微波水热反应的条件为70°C,微波加热1min外,其它条件与实施例1基本相同;制备得到MOF纳米颗粒,将此样品命名为样品5。
实施例6
一种金属-有机框架纳米颗粒的制备方法,除了步骤S4微波水热反应的条件为100°C,微波加热30min外,其它条件与实施例1基本相同;制备得到MOF纳米颗粒,将此样品命名为样品6。
实施例7
一种金属-有机框架纳米颗粒的制备方法,除了步骤S4微波水热反应的条件为100°C,微波加热10min外,其它条件与实施例1基本相同;制备得到MOF纳米颗粒,将此样品命名为样品7。
实施例8
一种金属-有机框架纳米颗粒的制备方法,除了步骤S4微波水热反应的条件为150°C,微波加热1min外,其它条件与实施例1基本相同;制备得到MOF纳米颗粒,将此样品命名为样品8。
实施例9
一种金属-有机框架纳米颗粒的制备方法,除了步骤S4微波水热反应的条件为100°C,微波加热10min外,其它条件与实施例1基本相同;制备得到MOF纳米颗粒,将此样品命名为样品9。
实施例10
一种金属-有机框架纳米颗粒的制备方法,除了步骤S4微波水热反应的条件为50°C,微波加热1min外,其它条件与实施例1基本相同;制备得到MOF纳米颗粒,将此样品命名为样品10。
实施例11
一种金属-有机框架纳米颗粒的制备方法,除了步骤S4微波水热反应的条件为100°C,微波加热1min外,其它条件与实施例1基本相同;制备得到MOF纳米颗粒,将此样品命名为样品11。
性能测试
一、MOF样品表征实验
1、透射电子显微镜(TEM)观察:将上述制备得到的样品1~11分散在酒精溶液中,超声10min以上,至样品完全分散。将磷酸钙样品滴在铜网上,用FEI Tecnai G2 F20 S-Twin型号电子显微镜在110V电压下获得样品透射照片,有机金属框架纳米颗粒大小由马尔文激光粒度散射仪测量得出。
2、结果如图1所示,可以通过反应时间或者反应温度的不同,制备出不同形貌及尺寸的样品,反应时间越长,得到MOF样品的粒径越大,最大可大1微米左右。不过反应温度对样品粒径影响不大,但对样品形貌有影响,且影响没有规律性。在100oC反应1h时,可得到两头尖的锥形化合物。样品1的粒径分布结果如图2所示,由动态光散射仪测出的(DLS)平均粒径为187.8nm,而且粒径分布比较均一。
二、MOF样品生物相容性、降解性实验
1、将样品1配制成不同浓度MOF颗粒分散在PBS中,与5000个HEPG2细胞共培养24小时,在这期中不换液处理。24小时后由CCK8试剂盒测试添加不同浓度MOF细胞的细胞存活率。
2、结果如图3A所示,低浓度到高浓度MOF颗粒与293T细胞共孵育48小时,均未显示出明显毒性。细胞存活率在100%左右。更有意思的是,低浓度MOF甚至可以促进细胞增殖。从3B图可以看出,在PBS溶液中,MOF(样品1)160小时内就能降解一般,而且降解产生的Fe粒子和有机酸均不会对身体造成毒性,表明制备得到的MOF颗粒具有良好的生物相容性、降解性。同时,样品2-样品11的生物相容性和降解性能均良好。
三、MOF样品介导微环DNA腹腔转染(荧光素酶)实验
1、将1mg MOF颗粒样品1分散在200μl水中,超声10分钟,形成A溶液。将20μg带有荧光素酶(luciferase)表达基因的微环DNA分散在200μl水中,形成B溶液。将B溶液加入A溶液中,形成C溶液。将C溶液通过腹腔注射注射进小鼠体内,24小时候用IVIS小动物成像仪观测荧光素酶在体内的表达情况。
2、结果如图4所示,通过腹腔注射MOF/DNA混合溶液,会在小鼠腹腔内形成明显的基因转染,转染效率随时间延长而降低,转染时间持续在96小时以上。实验中我们发现,实施例1~12中的MOF样品都可以介导DNA在体内转染,这主要是由于MOF样品特殊的两头尖的形貌决定的。
Claims (6)
1.一种金属-有机框架纳米颗粒的制备方法,其特征在于,将铁盐用无水乙醇溶解,黏康酸用DMF溶解后再用无水乙醇稀释,然后将上述两种溶液搅拌混匀,50~150℃微波加热1~60min,自然冷却后离心,洗涤,冷冻干燥得到MOF纳米颗粒;
所述铁盐为六水合氯化铁、无水氯化铁、四水合氯化铁或硝酸铁;
所述黏康酸为反式-反式黏康酸;
所述铁盐与黏康酸的质量比1:1。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述离心为14000g离心10min。
3.权利要求1至2任一项所述方法制备得到的金属-有机框架纳米颗粒。
4.权利要求3所述的金属-有机框架纳米颗粒在制备微环DNA转染制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,将权利要求3所述金属-有机框架纳米颗粒分散在PBS中,再与微环DNA混合。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述金属-有机框架纳米颗粒与微环DNA的质量比为0.5~1mg:20μg。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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