CN104974343A - 改性聚乙烯亚胺及其在制备基因转染载体试剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及聚合物改性领域，具体涉及一种改性聚乙烯亚胺及其在制备基因转染载体试剂中的应用。本发明将具有疏水性的松香酸或脱氢松香酸接枝到聚乙烯亚胺上，得到改性聚乙烯亚胺。该改性聚乙烯亚胺能的疏水基团在水中由于分子间作用力形成具有强大疏水性的致密的疏水核，亲水的聚乙烯亚胺则形成亲水外壳，从而形成具有壳核结构的纳米胶束，和DNA结合后形成粒径很小的纳米粒。复合纳米粒子粒径变小后，结构就会更加紧密，这样更容易穿过磷脂双分子层的细胞膜结构，从而能够提高转染效率。可以应用于制备基因转染载体，具有生物安全性高，转染效率高，成本低廉的特点。

Description

改性聚乙烯亚胺及其在制备基因转染载体试剂中的应用

技术领域

本发明涉及聚合物改性领域，具体涉及一种改性聚乙烯亚胺及其在制备基因转染载体试剂中的应用。

背景技术

基因转染技术是指将具备一定功能的外源核酸转运到靶细胞中，并在细胞中表达，以获得预期目的，因此作为一种关键技术被广泛地应用基因治疗，农业生物技术，生物制药工程等领域。将外源的基因导入生物细胞内需要借助基因转染载体，目前常用的载体分为病毒载体和非病毒载体两大类。尽管病毒载体转染率高，但其对外源基因的容纳量少(约为4.5～30kbp)、稳定性差，且病毒DNA在人体内有复制的可能，可诱导机体产生免疫反应，存在致病致癌的风险，具有潜在的健康安全问题。非病毒载体包括阳离子聚合物和脂质体等，脂质体虽然有较高的生物兼容性的优点，但其缺点在于其在体内不够稳定。

目前研究得较多的基因转导载体是阳离子聚合物，主要有聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)、聚酰胺－酰亚胺(PAMAM)、壳聚糖、聚赖氨酸等。这些聚合物能与基因有效地形成共价键，并对基因有一定的保护作用，从而避免外源基因被核酸酶降解。

聚乙烯亚胺是一种水溶性高分子聚合物，其表面具有大量的正电荷，能够携带基因穿透靶细胞的细胞膜，达到基因转运进靶细胞作用，具有稳定性高，成本低，转染率高的优点，因此成为基因转染研究中最广泛应用的非病毒载体材料之一。然而聚乙烯亚胺对细胞的毒性较大，特别是高分子量聚乙烯亚胺，虽然具有很强的穿透细胞膜能力和很高基因转染效率，但毒性更大，严重影响其在生物，医学和农业领域的应用。

松香酸是一种天然的树脂酸，来源广泛，作为一种重要的工业原料，其具有生物相容性高，成本低廉和一定的疏水性等特点。因此其应用范围极广，在表面活性剂，医药等均有使用。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种改性聚乙烯亚胺，该改性聚乙烯亚胺为一种松下酸(包括松香酸和脱氢松香酸)接枝聚乙烯亚胺的阳离子聚合物，作为非病毒基因转染载体，能有效降低聚乙烯亚胺的细胞毒性，具有很高的生物兼容性和基因转染能力，并且能形成稳定性高的纳米胶束。

本发明的另一目的在于提供上述改性聚乙烯亚胺的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述改性聚乙烯亚胺在制备基因转染载体试剂中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种改性聚乙烯亚胺，其结构如式Ⅰ所示：

其中，所述的取代基R为

x、y分别代表重复单元数目，x为0～50000；y为0～50000；

所述的改性聚乙烯亚胺主链聚乙烯亚胺的分子量优选为6000～40000；取代基R的取代度优选为0.5％～20％；

所述的改性聚乙烯亚胺的制备方法，包括如下步骤：

(1)将活化剂和松香酸或脱氢松香酸混合充分溶解于有机溶剂，在0～25℃反应6～24h；

(2)将聚乙烯亚胺充分溶解于有机溶剂后，将步骤(1)所制备的溶液滴入聚乙烯亚胺溶液中，加入缩合剂和N,N-二异丙基乙基胺，并通氮气保护，在0～25℃反应8～24h；反应完毕后，干燥，透析再干燥，得到改性聚乙烯亚胺；

步骤(1)所述的活化剂优选为N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基硫代琥珀酰亚胺；

步骤(1)所述的活化剂和松香酸或脱氢松香酸的摩尔比为(1.2：1)～(2：1)；

步骤(1)所述的有机溶剂优选为四氢呋喃、甲醇和异丙醇中的至少一种；

步骤(2)所述的聚乙烯亚胺分子量为6000～40000；

步骤(2)所述的缩合剂优选为O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸；

步骤(2)所述的聚乙烯亚胺与松香酸或脱氢松香酸的摩尔比为(1：0.01)～(1：0.5)；

步骤(2)所述的聚乙烯亚胺与N,N-二异丙基乙基胺的摩尔比为(1：0.01)～(1：0.5)；

步骤(2)所述的聚乙烯亚胺与缩合剂的摩尔比为(1：0.01)～(1：0.3)；

步骤(2)所述的有机溶剂优选为四氢呋喃、甲醇和异丙醇中的至少一种；

上述方法制备得到的改性聚乙烯亚胺能够溶解于水，在水中形成稳定的纳米胶束(粒径为20～400nm)，能够负载基因，实验数据表明对比聚乙烯亚胺，其保持具有较高的基因转染能力，同时，对细胞的毒性显著降低，具有较高的生物安全性，可以应用于制备基因转染载体，具有生物安全性高，转染效率高，成本低廉的特点。

所述的改性聚乙烯亚胺在制备基因转染载体试剂中的应用；

本发明的原理是：由于聚乙烯亚胺具有亲水性，本发明将具有疏水性的松香酸或脱氢松香酸接枝到聚乙烯亚胺上，该改性聚乙烯亚胺能的疏水基团在水中由于分子间作用力形成具有强大疏水性的致密的疏水核，亲水的聚乙烯亚胺则形成亲水外壳，从而形成具有壳核结构的纳米胶束，和DNA结合后形成粒径很小的纳米粒。复合纳米粒子粒径变小后，结构就会更加紧密，这样更容易穿过磷脂双分子层的细胞膜结构，从而能够提高转染效率。聚乙烯亚胺改性的另一个目的是通过接枝侧链中和一部分正电荷，并形成胶束，降低暴露在水中的表面积，从而减小聚乙烯的阳离子毒性。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明制备的疏水基团接枝聚乙烯亚胺具有尺寸小的特点，可通过调节长松香酸或脱氢松香酸的投料比来获得不同的疏水链接枝率从而调节疏水基团接枝羧甲基壳聚糖的粒径大小。疏水基团接枝聚乙烯亚胺能够在水中形成稳定的胶束，增强其稳定性，从而降低聚乙烯亚胺的细胞毒性，并且提高其基因转染能力，另外，其疏水内核具有载药潜力：具有负载疏水性药物分子并紧密的包裹的潜力。

(2)本发明的改性聚乙烯亚胺的主要原料之一为松香酸或脱氢松香酸，其来源丰富，成本低廉，为化工制药等工业广泛应用的原料之一。

(3)本发明的改性聚乙烯亚胺由于部分氨基被取代，能形成纳米胶束，从而降低细胞毒性，并且提高了基因的转染能力。

(4)本发明的改性聚乙烯亚胺可作为一种安全高效的基因转染载体，也可以负载药物，因此在基因治疗，农业生物技术(包括利用RNAi调控害虫免疫)，生物制药工程和发酵工程等领域有巨大的应用的价值。

附图说明

图1是聚乙烯亚胺(分子量10000)转染细胞荧光表达结果分析图，其中，1～8代表不同的DNA/聚乙烯亚胺质量比，1代表1：1；2代表1：2；3代表1：1；4代表1：4；5代表1：5；6代表1：6；7代表1：7；8代表1：8。

图2是改性聚乙烯亚胺样品1转染细胞荧光表达结果分析图，其中，1～8代表不同的DNA/改性聚乙烯亚胺质量比，1代表1：1；2代表1：2；3代表1：1；4代表1：4；5代表1：5；6代表1：6；7代表1：7；8代表1：8。

图3是改性聚乙烯亚胺样品2转染细胞荧光表达结果分析图，其中，1～8代表不同的DNA/改性聚乙烯亚胺质量比，1代表1：1；2代表1：2；3代表1：1；4代表1：4；5代表1：5；6代表1：6；7代表1：7；8代表1：8。

图4是改性聚乙烯亚胺样品3转染细胞荧光表达结果分析图，其中，1～8代表不同的DNA/改性聚乙烯亚胺质量比，1代表1：1；2代表1：2；3代表1：1；4代表1：4；5代表1：5；6代表1：6；7代表1：7；8代表1：8。

图5是聚乙烯亚胺(分子量10000)/DNA的复合物凝胶电泳图，其中，泳道1为DNA/材料质量比为1：5；泳道2为DNA/材料质量比为1：4；泳道3为DNA/材料质量比为1：3；泳道4为DNA/材料质量比为1：2；泳道5为DNA/材料质量比为1：1；泳道6为DNA/材料质量比为2：1；泳道7为DNA/材料质量比为3：1；泳道8为质粒DNA；泳道9为DNA marker。

图6是改性聚乙烯亚胺样品2/DNA的复合物凝胶电泳图，其中，泳道1为DNA/材料质量比为1：5；泳道2为DNA/材料质量比为1：4；泳道3为DNA/材料质量比为1：3；泳道4为DNA/材料质量比为1：2；泳道5为DNA/材料质量比为1：1；泳道6为DNA/材料质量比为2：1；泳道7为DNA/材料质量比为3：1；泳道8为质粒DNA；泳道9为DNA marker。

图7是改性聚乙烯亚胺样品3/DNA的复合物凝胶电泳图，其中，泳道1为DNA/材料质量比为1：5；泳道2为DNA/材料质量比为1：4；泳道3为DNA/材料质量比为1：3；泳道4为DNA/材料质量比为1：2；泳道5为DNA/材料质量比为1：1；泳道6为DNA/材料质量比为2：1；泳道7为DNA/材料质量比为3：1；泳道8为质粒DNA；泳道9为DNA marker。

图8是聚乙烯亚胺与改性聚乙烯亚胺的毒性实验结果分析图，其中，(a)：浓度分别为0μg/200μL，0.25μg/200μL，1μg/200μL，4μg/200μL，16μg/200μL的聚乙烯亚胺的毒性实验结果分析；(b)：浓度分别为0μg/200μL，0.25μg/200μL，1μg/200μL，4μg/200μL，16μg/200μL的改性聚乙烯亚胺样品1的毒性实验结果分析；(c)：浓度分别为0μg/200μL，0.25μg/200μL，1μg/200μL，4μg/200μL，16μg/200μL的改性聚乙烯亚胺样品2的毒性实验结果分析；(d)：浓度分别为0μg/200μL，0.25μg/200μL，1μg/200μL，4μg/200μL，16μg/200μL的改性聚乙烯亚胺样品3的毒性实验结果分析。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)将0.24g的N-羟基琥珀酰亚胺和0.60g脱氢松香酸混合充分溶解于50mL的四氢呋喃，在25℃反应6h；

(2)将10g聚乙烯亚胺(分子量为10000)充分溶解于200mL的四氢呋喃后，将步骤(1)所制备的溶液滴入聚乙烯亚胺溶液中，加入0.84g O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和0.28g N,N-二异丙基乙基胺，并通氮气保护，在25℃反应16h；反应完毕后，冻干，透析再冻干，得到改性聚乙烯亚胺(取代基R的取代度为0.1％，分子量为6000)；

所述的改性聚乙烯亚胺在水溶液中经激光散射检测其粒径为46nm。

实施例2

(1)将0.36g的N-羟基琥珀酰亚胺和0.90g脱氢松香酸混合充分溶解于50mL的四氢呋喃，在15℃反应12h；

(2)将10g聚乙烯亚胺(分子量为6000)充分溶解于200mL的四氢呋喃后，将步骤(1)所制备的溶液滴入聚乙烯亚胺溶液中，加入1.26g O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和0.42g N,N-二异丙基乙基胺，并通氮气保护，在25℃反应8h；反应完毕后，冻干，透析再冻干，得到改性聚乙烯亚胺(取代基R的取代度为3％，分子量为11000)；

所述的改性聚乙烯亚胺在水溶液中经激光散射检测其粒径为58nm。

实施例3

(1)将0.48g的N-羟基琥珀酰亚胺和1.2g脱氢松香酸混合充分溶解于50mL的四氢呋喃，在0℃反应24h；

(2)将10g聚乙烯亚胺(分子量为40000)充分溶解于有200mL的四氢呋喃后，将步骤(1)所制备的溶液滴入聚乙烯亚胺溶液中，加入1.68g O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和0.56g N,N-二异丙基乙基胺，并通氮气保护，在25℃反应24h；反应完毕后，冻干，透析再冻干，得到改性聚乙烯亚胺(取代基R的取代度为12％，分子量为19000)；

所述的改性聚乙烯亚胺在水溶液中经激光散射检测其粒径为76nm。

实施例4

(1)将0.6g的N-羟基琥珀酰亚胺和1.5g松香酸混合充分溶解于50mL的甲醇，在25℃反应12h；

(2)将10g聚乙烯亚胺(分子量为10000)充分溶解于有200mL四氢呋喃后，将步骤(1)所制备的溶液滴入聚乙烯亚胺溶液中，加入2.10g O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和0.70gN,N-二异丙基乙基胺，并通氮气保护，在0℃反应16h；反应完毕后，冻干，透析再冻干，得到改性聚乙烯亚胺(取代基R的取代度为10％，分子量为25000)；

所述的改性聚乙烯亚胺在水溶液中经激光散射检测其粒径为92nm。

实施例5

(1)将1.2g的N-羟基琥珀酰亚胺和3g松香酸混合充分溶解于50mL的异丙醇，在25℃反应12h；

(2)将10g聚乙烯亚胺(分子量为10000)充分溶解于有200mL的四氢呋喃后，将步骤(1)所制备的溶液滴入聚乙烯亚胺溶液中，加入4.2g O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和1.4gN,N-二异丙基乙基胺，并通氮气保护，在18℃下反应16h；反应完毕后，冻干，透析再冻干，得到改性聚乙烯亚胺。(取代基R的取代度为13％，分子量为29000)；

所述的改性聚乙烯亚胺在水溶液中经激光散射检测其粒径为121nm。

实施例6

(1)将2.4g的N-羟基琥珀酰亚胺和6g脱氢松香酸混合充分溶解于50mL的四氢呋喃，在25℃反应12h；

(2)将20g聚乙烯亚胺(分子量为10000)充分溶解于有200mL的四氢呋喃后，将步骤(1)所制备的溶液滴入聚乙烯亚胺溶液中，加入8.4g O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和2.8g N,N-二异丙基乙基胺，并通氮气保护，在25℃反应16h；反应完毕后，冻干，透析再冻干，得到改性聚乙烯亚胺(取代基R的取代度为16％，分子量为32000)；

所述的改性聚乙烯亚胺在水溶液中经激光散射检测其粒径为169nm。

实施例7

(1)将4.8g的N-羟基琥珀酰亚胺和12g脱氢松香酸混合充分溶解于50mL的四氢呋喃，在25℃反应12h；

(2)将10g聚乙烯亚胺(分子量为10000)充分溶解于有200mL的四氢呋喃后，将步骤(1)所制备的溶液滴入聚乙烯亚胺溶液中，加入16.8g O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和5.6g N,N-二异丙基乙基胺，并通氮气保护，在25℃反应16h。反应完毕后，冻干，透析再冻干，得到改性聚乙烯亚胺(取代基R的取代度为20％，分子量为40000)；

所述的改性聚乙烯亚胺在水溶液中经激光散射检测其粒径为56nm。

实施例8

1.B16F0细胞的培养

(1)细胞的复苏：从液氮罐中迅速取出装有小鼠黑色素瘤细胞(B16F0，购自中山眼科中心)的冻存管，立即放入37～40℃的水中温浴，直到内容物完全溶解。在超净工作台里将细胞悬液吸出，加8mL胎牛血清的培养基，200g离心8min。弃上清，用新鲜培养基稀释后，转入培养瓶，37℃静置培养。隔天更换培养基，继续培养。

(2)细胞的传代：吸出培养瓶内的旧培基，用无血清培养基冲洗一遍。向瓶内加入2mL消化液(胰蛋白酶与EDTA混合液)，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，作用1～2min后，吸出，200g离心5min。用新鲜培养基稀释，分种到新的培养瓶内。

(3)受体细胞的接种：传代后细胞生长较密时，即可进行接种。吸去培养瓶瓶中的培养液，用无血清培养基冲洗后，加入消化液2mL，消化1～2min后，吸出，200g离心5min，加体积分数10％的FBS 1640培养基8～10mL吹打，加入48孔板中，每孔加培养基l mL，37℃下培养24h。待细胞生长稳定时，即可用于转染实验。

2.质粒提取

(1)LB液体培养基制备：称取胰蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、NaCl 5g，加入水中搅拌溶解，调pH至7.2，500mL定容分装，高压灭菌。

(2)含GFP基因的表达载体pEGFP-N3(Clontech)细菌的接种：用灭菌接种环蘸取细菌菌液于15mL LB液体培养基中，37℃振荡12～16小时。

(3)提取质粒：

①10～15mL LB/ampicillin(50μg/mL)菌液加入50mL离心管；

②室温条件下，5000g离心10min；

③去上清，加入500μL SolutionⅠ/Rnase A(4℃冰箱)；

④转移到2mL离心管，加500μL SolutionⅡ，上下颠倒7～10次，室温条件下轻轻混匀；

⑤加250μL ice-cold Buffer N3，上下颠倒数次，轻轻混匀，直到白色沉淀出现，室温条件下，≥12000g离心10min；

⑥吸取上清，转入一个1.5mL离心管，加1/10体积的ETR Solution，上下颠倒数次，置于冰上10min，期间上下颠倒数次；

⑦42℃温浴5min(重新变混浊)，12000g离心3min；

⑧转移上清至一新的2mL离心管，加1/2体积的完全乙醇，上下轻轻混匀6～7次，室温放置1～2min；

⑨从步骤⑧中取700μL至一干净的柱子，装在一个2mL的收集管，室温条件下，10000g离心1min，倒去流出液；

⑩重复步骤⑨，直到步骤⑧中的溶液全部加完，弃流出液；

加500μL Buffer HB洗涤，室温条件下，10000g离心1min；

去流出液，加700μL DNA Wash Buffer洗涤，室温条件下，10000g离心1min；

重复步骤；

弃流出液，≥13000g离心3min；

将柱子放入新的1.5mL离心管，加80～100μL Endotoxin-Free ElutionBuffer或50～100μL双蒸水，室温静置2min，13000g离心1min。

(4)质粒浓度测定：使用紫外分光光度计进行测定。

3.细胞转染

取8×4×0.5μg的质粒，溶解于8×4×80uL的培养基中，将其分装到8×4个离心管中，每管80μL。将8×4个离心管分为4组。每组按0.5μg，1.0μg，1.5μg，……，4.0μg加入相应的材料(聚乙烯亚胺或改性聚乙烯亚胺材料)。混匀，室温放置30min。

从48孔板中吸去培养液，每孔用无血清的1640培养基清洗一次，吸出培养基，将上述材料与DNA的复合物加入孔板中，37℃下培养。4～6h之后，吸出培养液，并加入10％FBS 1640培养基培养。

培养24h之后，用荧光显微镜在10倍镜、488nm激发波长下观察荧光。

(5)实验结果及分析：

不同材料的荧光观测结果(以488nm激发的转染质粒表达的GFP蛋白发出的绿色荧光作为转染效率指示。)

聚乙烯亚胺(分子量10000)最佳转染比例DNA/聚乙烯亚胺在(1：2)～(1：5)之间(图1)。改性聚乙烯亚胺样品1～3号(实施例1制备)的最佳转染比例DNA/改性聚乙烯亚胺在(1：3)～(1：6)之间(图2～4)。四种材料在DNA/材料为1：6之后，转染效果都有下降的趋势(图1～4)。

对比未经改性的聚乙烯亚胺与改性聚乙烯亚胺样品1～3号材料，改性聚乙烯亚胺样品1～3号的转染效果要好于未经改性的聚乙烯亚胺。聚乙烯亚胺经改性之后，自聚集成稳定的纳米胶束，和DNA结合后形成粒径很小的纳米粒，有利于复合物的稳定形成；另一方面，材料经过改性，减少了正电荷，削弱了材料与DNA的静电作用，这样复合物在进入细胞核之后，更容易分解，从而促进了基因的表达。

未经改性的聚乙烯亚胺与改性聚乙烯亚胺样品1～3号材料在比例增加时，转染效果都有下降的趋势，这可能是因为，材料浓度过高而导致的细胞毒性作用。对比来看，聚乙烯亚胺实验组的这种趋势更加明显。这说明未经改性的聚乙烯亚胺材料有较强的阳离子毒性，而本发明改性聚乙烯亚胺样品1～3号材料经的聚乙烯亚胺经接枝疏水基团之后，毒性明显减弱。

实施例9

(1)制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖1g，用100mL 1×TAE电泳缓冲液溶解，于电炉上加热至沸腾，待凝胶冷却至50℃左右，加入一滴EB，混匀后将胶倒入插好梳子的制胶板上，冷却后拔去梳子备用。

(2)加样电泳：取聚乙烯亚胺、改性聚乙烯亚胺样品1～3号材料(实施例8细胞转染中的材料)，每个材料都按3:1-1:1-1:5的比例梯度与质粒混合，另外用纯质粒作对照。溶液吹打混匀后，室温下静置30min，形成复合物。加入Loading Buffer后点样，140V电泳20min，在电泳仪上观测电泳条带。

(3)观察照相：电泳结束，在紫外灯下观察，采用凝胶成像***拍照保存。

在实施例8实验中，本发明的改性聚乙烯亚胺显示出明显的细胞转染效果，因此实施例9的电泳实验针对这四种材料分析探讨材料与DNA的结合原理。

由于聚乙烯亚胺带正电荷，DNA带负电荷，所以二者可通过静电吸引复合，也可以通过共价键接合和物理包裹的方式连接。电泳结果显示，质粒分别连接四种材料后，都表现出在一定比例时未出孔或者电泳速度落后于对照质粒。

如图5～7所示，将本发明的改性聚乙烯亚胺样品1到3号与聚乙烯亚胺原料电泳结果对比，聚乙烯亚胺当DNA/材料质量比为2：1时没有出现电泳条带，表明DNA/材料复合物形成。而改性聚乙烯亚胺样品1到3号材料都是在DNA/材料质量比为1：1时质粒未出孔，开始形成复合物。这是由改性聚乙烯亚胺样品1到3号的松香酸改性产生这样的差异，经过改性后，聚乙烯亚胺形成纳米胶束，与DNA结合比例增加(材料：DNA从1：2增大到1：1)。

实施例10

1.细胞的接种

B16F0细胞培养稳定后，再一次进行接种。吸去培养瓶瓶中的培养液，用无血清培养基冲洗后，加入消化液2mL，消化1～2min后，吸出，200g离心5min，加10％FBS 1640培养基8～10mL吹打，加入48孔板中的20个孔，每孔加培养基l mL，37℃下培养24h。待细胞生长稳定时，即可用于细胞毒性实验。

2.加材料培养

取5×4个离心管，分4组对应4个材料：聚乙烯亚胺、改性聚乙烯亚胺样品1～3号材料(实施例8细胞转染中的材料)。每组按0μg，0.25μg，1.0μg，4.0μg，16μg加相应的材料。每管加培养基至200μL。

从48孔板中吸去培养液，每孔用无血清的1640培养基清洗一次，吸出培养基，将上述材料与培养基的混合物加入孔板中，37℃下培养。12h之后，观察细胞生长形态。

如图8所示，与聚乙烯亚胺对照组相比，改性聚乙烯亚胺材料浓度为0.25μg/200μL的细胞生长几乎不受影响，细胞形态都比较正常；当材料浓度为1μg/200μL时，一些细胞的形态开始发生变化，甚至裂解；当材料浓度为4μg/200μL时，细胞基本上都被裂解，只有少量的正常细胞存活；当材料浓度达到16μg/200μL时，细胞全部被裂解。总的规律是：随着材料浓度的增大，细胞生长受影响越大，正常的细胞数量越少。

对比各组材料，未经改性的聚乙烯亚胺(分子量为10000)的毒性要强很多，非常明显，但是对比四种材料浓度都为4μg/200μL时的图片可知，a组的细胞几乎都裂解了，b、c和d组的细胞都还有一定数量的正常细胞，由此看见，本发明的改性聚乙烯亚胺样品1到3号经PEI接枝疏水基修饰之后，减少了正电荷，形成纳米胶束，明显地降低聚乙烯亚胺的细胞毒性，因而改性之后到达了降低毒性的作用，这也印证了第一部分四种材料荧光结果的差异。

另外，在第一部分的荧光实验中，所用材料浓度在4μg/200μL以下，而且DNA与材料结合后，本身会中和材料的正电荷，从而使材料的阳离子毒性减小，所以在荧光实验中材料所表现出的毒性较小，而且材料转染最佳浓度在1μg/200μL左右，这样在转染实验中，材料对细胞的毒性是非常小的。因此本发明的改性聚乙烯亚胺作为基因转染载体具有非常高的生物相容性和安全性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种改性聚乙烯亚胺，其特征在于：所述的改性聚乙烯亚胺的结构如式Ⅰ所示：

                            式Ⅰ；

其中，所述的取代基R为或

x、y分别代表重复单元数目，x为0～50000；y为0～50000。

2.根据权利要求1所述的改性聚乙烯亚胺，其特征在于：

所述的改性聚乙烯亚胺主链聚乙烯亚胺的分子量为6000～40000；取代基R的取代度为0.5％～20％。

3.权利要求1或2所述的改性聚乙烯亚胺的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将活化剂和松香酸或脱氢松香酸混合充分溶解于有机溶剂，在0～25℃反应6～24h；

(2)将聚乙烯亚胺充分溶解于有机溶剂后，将步骤(1)所制备的溶液滴入聚乙烯亚胺溶液中，加入缩合剂和N,N-二异丙基乙基胺，并通氮气保护，在0～25℃反应8～24h；反应完毕后，干燥，透析再干燥，得到改性聚乙烯亚胺。

4.根据权利要求3所述的改性聚乙烯亚胺的制备方法，其特征在于：

步骤(1)所述的活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基硫代琥珀酰亚胺；

步骤(2)所述的缩合剂为O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸。

5.根据权利要求3所述的改性聚乙烯亚胺的制备方法，其特征在于：

步骤(1)所述的活化剂和松香酸或脱氢松香酸的摩尔比为(1.2：1)～(2：1)。

6.根据权利要求3所述的改性聚乙烯亚胺的制备方法，其特征在于：

步骤(2)所述的聚乙烯亚胺与松香酸或脱氢松香酸的摩尔比为(1：0.01)～(1：0.5)。

7.根据权利要求3所述的改性聚乙烯亚胺的制备方法，其特征在于：

步骤(2)所述的聚乙烯亚胺与N,N-二异丙基乙基胺的摩尔比为(1：0.01)～(1：0.5)。

8.根据权利要求3所述的改性聚乙烯亚胺的制备方法，其特征在于：

步骤(2)所述的聚乙烯亚胺与缩合剂的摩尔比为(1：0.01)～(1：0.3)。

9.根据权利要求3所述的改性聚乙烯亚胺的制备方法，其特征在于：

步骤(1)所述的有机溶剂为四氢呋喃、甲醇和异丙醇中的至少一种；

步骤(2)所述的聚乙烯亚胺分子量为6000～40000；

步骤(2)所述的有机溶剂为四氢呋喃、甲醇和异丙醇中的至少一种。

10.权利要求1或2所述的改性聚乙烯亚胺在制备基因转染载体试剂中的应用。