CN109771669B - 一种多巴胺功能化纳米银粒子的dna释放载体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体及其制备方法，所述多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体包括纳米银粒子、聚多巴胺以及阳离子聚合物，其中，所述聚多巴胺包覆于所述纳米银粒子的表面而形成多巴胺功能化的纳米银粒子，所述阳离子聚合物接枝于所述多巴胺功能化的纳米银粒子的表面，而形成所述多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体。本发明通过将阳离子聚合物接枝于多巴胺功能化的纳米银粒子表面，显著降低了其细胞毒性。

Description

一种多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体及其制备方法。

背景技术

近年来，与基因相关疾病的发病率呈上升趋势，因此，找到一种成本低且行之有效的治疗方法变得尤为重要。基因疗法是其中最有效的方法之一，无论是后天获得的疾病(如艾滋病或癌症)，还是遗传疾病。基因疗法包括将质粒DNA(pDNA)或小的干扰RNA(siRNA)转移到目标细胞中，必须将其传递到目标细胞的内部，同时还要在人体的生物防御***中存活下来，因此其成功与否有赖于基因载体的发展。

目前基因载体主要分为两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体虽然转染效率相对较高，但因其较大的毒性而限制发展。因此，非病毒基因载体研究受到越来越高的重视，其相较于病毒载体具有可大量制备、无传染性、不限制载体容量以及化学结构可控等优点，因此研究人员为寻求新的材料作载体进行了大量工作，包括多聚阳离子有机高分子化合物、阳离子脂质体、无机纳米粒子等，但目前所使用的非病毒载体普遍存在细胞毒性大的问题。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体及其制备方法，旨在降低DNA载体的细胞毒性。

为实现上述目的，本发明提出一种多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体，包括纳米银粒子、聚多巴胺以及阳离子聚合物，其中，所述聚多巴胺包覆于所述纳米银粒子的表面而形成多巴胺功能化的纳米银粒子，所述阳离子聚合物接枝于所述多巴胺功能化的纳米银粒子的表面，而形成所述多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体。

优选地，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、PLL和聚酰胺-胺型树枝状高分子中的任意一种。

优选地，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺。

为实现上述目的，本发明还提出一种如上所述的多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体的制备方法，包括以下步骤：

步骤S10、将纳米银粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，然后加入多巴胺盐酸盐，搅拌反应46～50h后，分离出反应后的沉淀物，得Ag/聚多巴胺复合纳米粒子；

步骤S20、将所述Ag/聚多巴胺复合纳米粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，然后加入阳离子聚合物，搅拌反应至使所述阳离子聚合物接枝于所述Ag/聚多巴胺复合纳米粒子表面后，分离出反应后的固体产物，得Ag/聚多巴胺/阳离子聚合物复合纳米粒子，即为多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体。

优选地，在步骤S10中：所述纳米银粒子与所述多巴胺盐酸盐的摩尔比为1：(1～2)。

优选地，步骤S10包括：

在超声作用下，将所述纳米银粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，超声处理25～35min后，加入多巴胺盐酸盐并继续超声25～35min，得待反应液；

将所述待反应液在室温下搅拌反应46～50h后，采用磁分离收集沉淀物，经过洗涤、干燥处理，得Ag/聚多巴胺复合纳米粒子。

优选地，在步骤S20中：所述Ag/聚多巴胺复合纳米粒子与所述阳离子聚合物的摩尔比为1：(1～2)。

优选地，步骤S20中的所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺，且步骤S20包括：

在超声作用下，将所述Ag/聚多巴胺复合纳米粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，超声处理25～35min后，加入聚乙烯亚胺并继续超声25～35min，得待反应溶液；

将所述待反应液在室温下搅拌反应46～50h后，采用磁分离收集沉淀物，经过洗涤、干燥处理，得Ag/聚多巴胺/聚乙烯亚胺复合纳米粒子，即为多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体。

优选地，步骤S20中的所述阳离子聚合物为聚酰胺-胺型树枝状高分子，且步骤S20包括：

在超声作用下，将所述Ag/聚多巴胺复合纳米粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，超声处理25～35min后，得悬浮液；

将聚酰胺-胺型树枝状高分子分散于Tris-HCl缓冲液中后，加入到所述悬浮液中，得待反应液；

将所述待反应液在室温下超声反应22～26h后，采用磁分离收集沉淀物，经过洗涤、干燥处理，得Ag/聚多巴胺/聚乙烯亚胺复合纳米粒子，即为多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体。

本发明提供的技术方案中，以纳米银粒子、聚多巴胺和阳离子聚合物制得多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体，该DNA释放载体中，聚多巴胺包覆于纳米银粒子的表面而形成多巴胺功能化的纳米银粒子，然后阳离子聚合物接枝于该多巴胺功能化的纳米银粒子的表面，而形成所述多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体，通过将阳离子聚合物接枝于多巴胺功能化的纳米银粒子表面，显著降低了其用作DNA载体的细胞毒性，提高了使用安全性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体的制备方法的一实施例的流程示意图；

图2至图7为各实施例制备的多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体的电泳测试结果图；

图8至图10为各实施例制备的多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体的细胞毒性检测结果图；

图11至图13为各实施例制备的多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体的转染效果检测结果图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

现有非病毒载体包括阳离子脂质体、阳离子聚合物、树枝状高分子和纳米粒子等，但上述非病毒载体存在稳定性差、合成步骤繁琐、毒性大、合成成本高以及结构不稳定的问题，研究现状远远不能满足基因治疗领域所需的要求。为改善现有非病毒载体细胞毒性大的问题，本发明提出一种多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体，包括纳米银粒子、聚多巴胺以及阳离子聚合物，其中，所述聚多巴胺包覆于所述纳米银粒子的表面而形成多巴胺功能化的纳米银粒子，所述阳离子聚合物接枝于所述多巴胺功能化的纳米银粒子的表面，而形成所述多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体。

本发明提供的技术方案中，以纳米银粒子、聚多巴胺和阳离子聚合物制得多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体，该DNA释放载体中，聚多巴胺包覆于纳米银粒子的表面而形成多巴胺功能化的纳米银粒子，然后阳离子聚合物接枝于该多巴胺功能化的纳米银粒子的表面，而形成所述多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体，通过将阳离子聚合物接枝于多巴胺功能化的纳米银粒子表面，显著降低了其用作DNA载体的细胞毒性，提高了使用安全性。

进一步地，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺(简称PEI)、聚赖氨酸(简称PLL)和聚酰胺-胺型树枝状高分子(简称PAMAM)中的任意一种，更优选为所述阳离子聚合物为PEI，所制得的多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体的细胞毒性更低，例如，在具体制备时，可选用分子量为30000Da(也即30kDa)的PEI(以下简称PEI-30k)作为所述阳离子聚合物(在本文的下述实施例中均以所述阳离子聚合物为PEI-30k为例进行说明)。

针对上述提出的多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体，本发明还提供了该多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体的制备方法，图1所示为本发明提供的多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体的制备方法的一实施例。请参阅图1，在本实施例中，所述多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体的制备方法包括以下步骤：

步骤S10、将纳米银粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，然后加入多巴胺盐酸盐，搅拌反应46～50h后，分离出反应后的沉淀物，得Ag/聚多巴胺复合纳米粒子；

在步骤S10的搅拌反应过程中，多巴胺盐酸盐(3-Hydroxytyraminehydrochloride，简称DA，分子式为C₈H₁₁NO₂·HCl，分子量为189.64，CAS号为62-31-7)发生自聚合，而在所述纳米银粒子表面形成聚多巴胺(简称PDA)薄膜，也即，通过步骤S10制得的Ag/聚多巴胺复合纳米粒子(以下均简称Ag/PDA复合纳米粒子)中，所述PDA包覆于所述纳米银粒子的表面。为使增大所述PDA在所述纳米银粒子表面的包覆面积，所述多巴胺盐酸盐的摩尔数应不少于所述纳米银粒子的摩尔数，在本实施例中：所述纳米银粒子与所述多巴胺盐酸盐的摩尔比为1：(1～2)，在此范围内，所述PDA既能将所述纳米银粒子的表面完全包覆，又不会导致过多浪费。

其搅拌反应时的搅拌方式可以采用机械搅拌或超声等常规方式，在本实施例中均以机械搅拌为例进行说明，步骤S10在具体实施时包括以下步骤：

步骤S11、在超声作用下，将所述纳米银粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，超声处理25～35min后，加入多巴胺盐酸盐并继续超声25～35min，得待反应液；

借助于超声分散作用，有利于提高所述纳米银粒子和所述多巴胺盐酸盐在所述Tris-HCl缓冲液中的分散效率和分散均匀度，在具体操作时，可设置超声的频率为35～45Hz，更优选为40Hz。其中，所选用的Tris-HCl缓冲液的pH值为8～9，更优选为所述Tris-HCl缓冲液的pH值为8.5。

步骤S12、将所述待反应液在室温下搅拌反应46～50h后，采用磁分离收集沉淀物，经过洗涤、干燥处理，得Ag/PDA复合纳米粒子。

在超声分散完成后，将所述待反应液转入三口烧瓶、锥形瓶或反应釜等反应容器中进行机械搅拌，并在室温下搅拌反应46～50h，待反应完成后，反应后的沉淀物中因含有所述纳米银粒子而带有磁性，此时采用将反应后的溶液置于磁场作用下的方式，即可利用磁分离收集其中的沉淀物，相比于过滤、离心等常规的固液分离方式，其分离效率更高、且操作更为简便。分离完成后，使用乙醇和去离子水进行多次洗涤后再冷冻干燥，得Ag/PDA复合纳米粒子。在本发明的其他实施例中，还可以选用真空干燥、微波干燥等常规的干燥方式，而采用冷冻干燥具有干燥效率高、不容易对物质自身性质造成过多影响的特点，以下均以所述干燥方式为冷冻干燥为例进行说明，在具体实施时，以干燥至水分彻底挥发为准，例如，可以设置为在-50～-60℃下冷冻干燥10～14h。

步骤S20、将所述Ag/PDA复合纳米粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，然后加入阳离子聚合物，搅拌反应至使所述阳离子聚合物接枝于所述Ag/聚多巴胺复合纳米粒子表面后，分离出反应后的固体产物，得Ag/PDA/阳离子聚合物复合纳米粒子，即为多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体。

在步骤S20的搅拌反应过程中，所述阳离子聚合物接枝于所述Ag/PDA复合纳米粒子表面，也即，通过步骤S20制得的Ag/PDA/阳离子聚合物复合纳米粒子中，所述阳离子聚合物包覆于所述Ag/PDA复合纳米粒子的表面。为使增大所述阳离子聚合物在所述Ag/PDA复合纳米粒子表面的包覆面积，所述阳离子聚合物的摩尔数应不少于所述Ag/PDA复合纳米粒子的摩尔数，在本实施例中：所述Ag/PDA复合纳米粒子与所述阳离子聚合物的摩尔比为1：(1～2)，在此范围内，所述阳离子聚合物既能将所述纳米银粒子的表面完全包覆，又不会导致过多浪费。

在本实施例中所选用的阳离子聚合物为PEI(以PEI作为阳离子聚合物制备的Ag/PDA/阳离子聚合物复合纳米粒子，以下均简称为Ag/PDA/PEI复合纳米粒子)，对应地，步骤S20具体包括以下步骤：

步骤S21a、在超声作用下，将所述Ag/PDA复合纳米粒子分散于Tris-HCl缓冲液中，超声处理25～35min后，加入PEI并继续超声25～35min，得待反应溶液；

同样地，借助于超声分散作用，有利于提高所述Ag/PDA复合纳米粒子在所述Tris-HCl缓冲液中的分散效率和分散均匀度，在具体操作时的超声频率同样可以设置为35～45Hz，更优选为40Hz。其中，所选用的Tris-HCl缓冲液的pH值为8～9，更优选为所述Tris-HCl缓冲液的pH值为8.5。

步骤S22a、将所述待反应液在室温下搅拌反应46～50h后，采用磁分离收集沉淀物，经过洗涤、干燥处理，得Ag/PDA/PEI复合纳米粒子，即为多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体。

在超声分散完成后，将所述待反应液转入三口烧瓶、锥形瓶或反应釜等反应容器中进行机械搅拌，并在室温下搅拌反应46～50h，待反应完成后，同样采用磁分离的方式收集其中的沉淀物，分离完成后，使用乙醇和去离子水进行多次洗涤后再冷冻干燥，得Ag/PDA/PEI复合纳米粒子，即为所述多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体。

在本发明的其他实施例中，当选用的阳离子聚合物为PLL或PAMAM时，需要对步骤S20中的部分工艺进行调整，例如，选用PAMAM时(以PAMAM作为阳离子聚合物制备的Ag/PDA/阳离子聚合物复合纳米粒子，以下均简称为Ag/PDA/PAMAM复合纳米粒子)，步骤S20可按照以下方式进行：

步骤S21b、在超声作用下，将所述Ag/PDA复合纳米粒子分散于pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液中，继续超声25～35min得悬浮液；

步骤S22b、将PAMAM分散于pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液中形成混合液，然后将所述混合液加入到上述悬浮液中，得待反应溶液；

步骤S23b、在室温环境下，将所述待反应液在超声波作用下反应22～26h，然后采用磁分离收集反应后的沉淀物，经过洗涤、干燥处理，得Ag/PDA/PAMAM复合纳米粒子，即为多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体。

其中，步骤S21b中的超声处理是为了提高所述Ag/PDA复合纳米粒子在所述Tris-HCl缓冲液中的分散效率和均匀度，而步骤S23b中的超声处理用是为了通过超声搅拌作用促使所述PAMAM反应接枝于所述Ag/PDA复合纳米粒子的表面，在本实施例中，其超声频率均可以设置为35～45Hz，更优选为40Hz。

当选用PLL作为所述阳离子聚合物时，可以按照上述提供的步骤S21a至S22a或步骤S21b至步骤S23b相同或相类似的操作方法进行，使所述PLL接枝于所述Ag/PDA复合纳米粒子的表面即可，在此不做赘述。

本发明提供的多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体的制备方法，通过多巴胺的自聚合，在所述纳米银粒子表面形成PDA薄膜，稳定性高、不易团聚，可长时间保存，改善了现有用于DNA载体的纳米银粒子稳定性差、易团聚的问题；在多巴胺包埋所述纳米银粒子后，利用PDA表面的基团对所述纳米银粒子进行进一步的表面功能化修饰，对纳米银粒子表面进行功能化修饰的实施方式简便易行，避免了现有用于DNA载体的纳米银粒子表面功能化步骤复杂的问题；通过将所述高树枝状分子材料接枝于多巴胺包覆的磁性纳米粒子表面，显著降低了该DNA载体的细胞毒性，改善了现有用于DNA载体的阳离子聚合物、树枝状高分子材料的分子量较大而导致其细胞毒性大的问题，提高了该多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体的使用安全性。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(1)在超声作用(40Hz)下，将纳米银粒子分散于pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液中，超声处理30min后，加入多巴胺盐酸盐(纳米银粒子与多巴胺盐酸盐的摩尔比为1:1)后超声处理30min，然后将超声后的溶液转移至三口烧瓶中进行机械搅拌，在室温下搅拌反应48h后，采用磁分离的方式收集沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-55℃下冷冻干燥14h，得Ag/PDA复合纳米粒子；

(2)在超声作用(40Hz)下，将步骤(1)制得的Ag/PDA复合纳米粒子分散于pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液中，超声处理30min后，加入PEI-30k(Ag/PDA复合纳米粒子与PEI的摩尔比为1:1)后超声处理30min，然后将超声后的溶液转移至三口烧瓶中进行机械搅拌，在室温下搅拌反应48h后，采用磁分离的方式收集沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-55℃下冷冻干燥14h，得Ag/PDA/PEI复合纳米粒子，即获得多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体。

实施例2

(1)在超声作用(40Hz)下，将纳米银粒子分散于pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液中，继续超声25min后，加入多巴胺盐酸盐(纳米银粒子与多巴胺盐酸盐的摩尔比为1:1.2)后继续超声25min，然后将超声后的溶液转移至三口烧瓶中进行机械搅拌，在室温下搅拌反应46h后，采用磁分离的方式收集沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-60℃下冷冻干燥12h，得Ag/PDA复合纳米粒子；

(2)在超声作用(40Hz)下，将步骤(1)制得的Ag/PDA复合纳米粒子分散于pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液中，继续超声25min后，加入PEI-30k(Ag/PDA复合纳米粒子与PEI的摩尔比为1:1.2)后继续超声35min，然后将超声后的溶液转移至三口烧瓶中进行机械搅拌，在室温下搅拌反应50h后，采用磁分离的方式收集沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-60℃下冷冻干燥12h，得Ag/PDA/PEI复合纳米粒子，即获得多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体。

实施例3

(1)在超声作用(40Hz)下，将纳米银粒子分散于pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液中，继续超声25min后，加入多巴胺盐酸盐(纳米银粒子与多巴胺盐酸盐的摩尔比为1:2)后继续超声35min，然后将超声后的溶液转移至三口烧瓶中进行机械搅拌，在室温下搅拌反应50h后，采用磁分离的方式收集沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-60℃下冷冻干燥10h，得Ag/PDA复合纳米粒子；

(2)在超声作用(40Hz)下，将步骤(1)制得的Ag/PDA复合纳米粒子分散于pH值为9.0的Tris-HCl缓冲液中，继续超声35min后，加入PEI-30k(Ag/PDA复合纳米粒子与PEI的摩尔比为1:2)后继续超声25min，然后将超声后的溶液转移至三口烧瓶中进行机械搅拌，在室温下搅拌反应46h后，采用磁分离的方式收集沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，在-60℃下冷冻干燥10h，得Ag/PDA/PEI复合纳米粒子，即获得多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体。

分别取上述实施例1至3制得的多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体作为DNA释放载体样本，进行效果测试，测试方法及结果如下：

(1)载体对DNA的缩合能力和保护能力

将DNA释放载体样品加入到适量的去离子水中溶解，制成一定浓度的样品溶液。

①采用琼脂糖凝胶电泳评价多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体对DNA缩合能力：将适量样品溶液与0.3μg质粒DNA(如绿色荧光蛋白质粒，GFP plasmid DNA，简称pDNA)按不同的质量比混合，得DNA释放载体/pDNA复合物(DNA释放载体与pDNA的质量比分别为0.5:1、1:1、1.5:1、2:1和2.5:1)；反应40min后，加入上样缓冲液，加样于琼脂糖凝胶(1％w/v)，并将凝胶置于pH为7.4的Tris-硼酸(TBE)缓冲液中，进行琼脂糖凝胶电泳，设置电压为90V，时间为40min；同时设置裸DNA和PEI-30k对照。电泳结束后，用溴化乙锭(EB)染色凝胶，使DNA条带显示。染色后用凝胶成像仪观察并拍照，结果如图2至图4所示，其中，图2、图3、图4分别为实施例1、2、3制备的DNA释放载体样品的电泳测试结果图，且图2至图4中，电泳图上方的0.5:1、1:1、1.5:1、2:1和2.5:1表示DNA释放载体与pDNA的质量比。

图2至图4的结果表明，DNA可与实施例制备的多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体发生凝聚而滞留在凝胶泳道中。

②采用琼脂糖凝胶电泳评价多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体对DNA保护能力：设置与①中相同质量比的DNA释放载体/pDNA复合物，反应40min后，加入核酸酶(DNase I，40μ/mL)处理，采用与①相同的方法进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5至图7所示，其中，图5、图6、图7分别为实施例1、2、3制备的DNA释放载体样品的电泳测试结果图，且图5至图7中，电泳图上方的0.5:1、1:1、1.5:1、2:1和2.5:1表示DNA释放载体与pDNA的质量比。

图5至图7的结果表明，实施例制备的多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体可以保护DNA不受核酸酶的水解。

(2)细胞毒性检测

采用噻唑蓝(MTT)比色法对多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体的安全性进行评价，同时设置同等浓度PEI-30k为对照组。将一系列浓度梯度的DNA释放载体样品和PEI-30k分别与A2780细胞(人卵巢癌细胞)共同孵育24h后，加入MTT溶液(0.5mg/mL)继续培养4h，吸取培养液，加入二甲基亚砜，使用酶标仪测定570nm处的吸光度，并计算细胞的存活率，结果如图8至图10以及表1所示，其中，图8至图10依次为实施例1、2、3制备的DNA释放载体样品的细胞毒性检测结果图，且图中Ag@PDA@PEI-30K表示实施例制备的DNA释放载体，PEI-30K表示对照组。

表1各实施例制备的DNA释放载体的细胞毒性检测结果

图8至图10以及表1的结果表明，多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体无明显细胞毒性，且与PEI-30k相比，细胞毒性明显降低，说明本发明实施例制备的多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体可作为一种安全的基因载体。

(3)转染效果检测

通过考察多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体在HEK-293T细胞内对增强绿色荧光蛋白(EGFP)的表达，评价该载体的转染能力：

将DNA释放载体样品与EGFP按质量比为5:1混合，孵育40min后，与HEK-293T细胞共同培养4h，再改用新鲜的含10％胎牛血清的培养液继续培养48h。培养完毕后使用荧光显微镜在蓝光激发下，放大100倍观察EGFP的表达情况，结果如图11至图13(图中的白色点状部分即为观测到的绿色荧光表达)和表2所示，其中，图11至图13依次为实施例1、2、3制备的DNA释放载体样品的转染效果检测结果图。

表2各实施例制备的DNA释放载体的转染效果检测结果

	实施例1	实施例2	实施例3
				转染率(％)	11.28	10.33	9.89

图11至图13以及表2的结果表明，绿色荧光蛋白可以在细胞内实现表达，说明本发明实施例制备的多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体可以作为有效的基因载体。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (3)

1.一种多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S10、在40Hz超声作用下，将纳米银粒子分散于pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液中，超声处理25~30min后，加入多巴胺盐酸盐后超声处理25~35min，然后将超声后的溶液进行搅拌，在室温下搅拌反应46~50h后，采用磁分离收集反应后的沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，冷冻干燥，得Ag/聚多巴胺复合纳米粒子；其中，所述纳米银粒子与所述多巴胺盐酸盐的摩尔比为1：（1~2）；

步骤S20、在40Hz超声作用下，将步骤S10制得的Ag/聚多巴胺复合纳米粒子分散于pH值为8.5~9的Tris-HCl缓冲液中，超声处理25~35min后，加入聚乙烯亚胺并继续超声25~35min，然后将超声后的溶液进行搅拌，在室温下搅拌反应46~50h后，采用磁分离的方式收集沉淀物，用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，冷冻干燥，得多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体；其中，所述Ag/聚多巴胺复合纳米粒子与所述聚乙烯亚胺的摩尔比为1：（1~2）。

2.如权利要求1所述的多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体的制备方法，其特征在于，步骤S10中，在-55℃~-60℃下冷冻干燥10~14h。

3.如权利要求1所述的多巴胺功能化纳米银粒子的DNA释放载体的制备方法，其特征在于，步骤S20中，在-55℃~-60℃下冷冻干燥10~14h。

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