CN109097416A - 木质纤维素一锅法生物转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了木质纤维素一锅法生物转化的方法，包括以下步骤：(1)机械处理：将木质纤维素原料粉碎，清洗，投放到密闭反应器中，加水，浸泡。(2)化学处理：向反应器中加入亚硫酸铵，磺化处理完毕后，使黑液流出；(3)物料清洗：向反应器中加入水，混合均匀；通入高压氮气，使黑液流出；(4)糖化：向容器中加入糖化培养基，高温高压灭菌；接种产纤维小体菌株种子液，糖化得到含有葡萄糖的糖液。(5)发酵：向获得的发酵培养基中接入活化的好氧异养微生物种子液，发酵。本发明所述的方法，简化了工艺步骤和对设备的要求，且降低碳源成本和用酶成本，同时解决了农林废弃物的综合利用问题，具有巨大的环境效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种木质纤维素的生物转化方法，具体涉及一种用于木质纤维素的全菌糖化方法。
背景技术
近年来，从生物质中获取可再生的能源、材料或化学品得到世界各国的普遍关注。利用木质纤维素类生物质为原料生产第二代生物基燃料或化学品，成为能否大规模替代石油基产品的关键。木质纤维素类生物质是地球上蕴藏最为丰富的可再生生物质资源，将其转化为能源、化学品或材料具有巨大的应用和发展前景。特别的，我国是农业大国，每年的农作物秸秆产量超过9亿吨。另一方面，秸秆焚烧引起的环境污染与交通安全事故等问题，也促使国家推出一系列秸秆综合利用的规划、方案与措施，推动农业废弃生物质综合利用的产业化发展。
木质纤维素到燃料或者化学品的转化通常需要经过预处理、糖化、发酵三个步骤单元，不同步骤单元通常技术条件有很大区别，而且整个操作过程复杂、能耗高、同时产生大量废水。因此，国际上出现了将糖化与发酵环节整合的相关技术，包括分步水解发酵工艺(SHF)、同步糖化发酵工艺(SSF)以及整合生物加工技术(CBP)三种。其中，SHF和SSF都需要首先在独立的反应器中进行真菌来源的游离纤维素酶体系的生产，然后对预处理后原料进行纤维素的酶水解及发酵。CBP将纤维素酶的生产与酶解发酵等各个相对独立的技术环节整合为同一步骤，在同一反应器中进行(Curr Opin Biotechnol 2005,16:577-583)，具有简化流程、降低设备要求等优势。
此外，研究人员还进行了预处理技术与下游工艺整合技术的研究。Kataeva等人发现，极端嗜热菌Caldicellulosiruptor bescii可以水解不经过预处理的底物(Energy&Environmental Science.2013.6:2186-2195。发明专利申请201010149132.2公开了“一种纤维素原料糖化的方法”。该方法是基于一种高温嗜热厌氧菌分泌的纤维小体，该纤维素小体能够有效降解结构复杂的结晶纤维素。该申请能够使不经过物理或化学的方法预处理的纤维素材料，直接进行发酵或酶处理，并高效水解为还原糖。但是，二者均存在效率过低，且终产物成分复杂的问题，尚不具有应用的价值。发明专利申请201610202657.5公开了“利用生物质‘一锅法’制备可发酵糖或生物乙醇的方法”；该方法包括以下步骤：(1)将机械处理并过筛后的生物质加入至低温氢氧化钠/尿素溶液体系中搅拌至室温；(2)加入酸调节pH，加入酶水解；测定酶解液中糖含量，计算生物质原料中糖的酶解转化率；(3)酶水解24～48h后，向酶解液中接种菌种，发酵制备生物乙醇，测定目标产品的产率。该申请将预处理、酶水解、发酵一锅法完成，操作便捷，耗时短，减少了过程中木质纤维素底物的流失及大量废水的产生。然而，该方法需要加入酸进行碱液的中和，化学品用量大，而且终产物的得率较低。此外，该申请酶解过程采用游离纤维素酶制剂，由于现有的酶制剂技术被发达国家公司垄断，因此采用纤维素酶制剂的生产工艺普遍成本高昂，不具备经济性。
磺化法是工业上使用较多的脱除木质素的方法，即采用亚硫酸盐或亚硫酸氢盐将木质素磺化，磺化后的木质素由于亲水性的增加而更易脱除。吕佳青等采用亚硫酸铵预处理麦草备料废渣(中国造纸，2015,34,1-6)，在165℃下用16％亚硫酸铵预处理，经PFI磨浆得到的底物，酶水解总糖转化率可达67％。Yu等人研究发现(Bioresource Technology,2016,199, 188-193)，用5.21％亚硫酸镁，在170℃下处理60min，大约90％的木质素和80％的半纤维素可以脱除，酶水解后的纤维素转化率可达90％。然而，磺化法预处理后的木质纤维素原料中富含游离的木质素成分，即形成黑液，且pH值高，对酶制剂具有显著的抑制性，通常需要下料后用专门的洗浆设备进行反复清洗，才能进行下一步酶解糖化；而且单独使用磺化预处理木质纤维素原料，酶水解后得到的也是混合糖，半纤维素利用效率较低。发明专利申请 201610133959.1公开了“一种预处理分离木质纤维素类生物质的方法”，所述方法包括以下步骤：1)先将木质纤维素类生物质机械破碎到合适的粒径大小，然后进行预浸渍；2)将步骤1)中得到的固体与水或水蒸气混合进行水热预处理；3)将步骤2)中得到的经水热预处理并清洗后的固体物料与磺化预处理药液混合进行磺化预处理。该申请将水热预处理和磺化预处理组合起来，既可以有效脱除半纤维素，也可以有效脱除木质素，从而使底物纤维素含量显著提高，并大大改善其酶水解效率。
与依赖于酶制剂的工艺相比，基于纤维小体全菌催化的生物糖化策略具有简化流程、降低设备要求等优势，是最适合纤维素类生物质生物转化利用的工艺路线。纤维小体是一种具有复杂结构和组分的胞外多酶复合体，是自然界中已知的最高效的纤维素降解体系之一。目前，木质纤维素全菌催化糖化主要利用基于热纤梭菌这一产纤维小体的高温厌氧菌作为全菌催化剂。至今，尚没有木质纤维素全菌催化糖化“一锅法”技术的报道。
发明内容
针对现有技术中木质纤维素利用中所存在的步骤繁琐、技术匹配性差、成本高昂、污染严重等问题，本发明提供了木质纤维素一锅法生物转化的方法，具有成本低、过程简单等优势，而且减少了废水排放，在工业上应用前景良好。
木质纤维素一锅法生物转化的方法，包括以下步骤：
(1)机械处理：将木质纤维素原料进行机械粉碎，用水清洗，然后从密闭反应器上方的投料口投放到密闭反应器中，按照固液重量体积比1:2-1:6添加水，混合均匀，浸泡。
其中，所述机械粉碎后木质纤维素原料的碎片粒径不超过2cm，浸泡时间为2-4h。所述木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、玉米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合。
(2)化学处理：向密闭反应器中加入适量亚硫酸铵，在160-190℃的温度条件下进行磺化处理1-4h。反应完毕后，打开密闭反应器底部的卸料口，使黑液经由卸料口所配备的过滤装置流出至储藏罐中；所述储藏罐通过管路与密闭反应器相连接。当密闭反应器中的压力降至大气压时，利用储藏罐顶部的真空泵抽真空，使储藏罐中形成负压，黑液进一步流出；直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
其中，所述密闭反应器中亚硫酸铵的终浓度为9-15％(w/v)。
(3)物料清洗：向密闭反应器中加入水，混合均匀；向密闭反应器中通入高压氮气，使反应器内压力达到10-12个标准大气压，然后打开密闭反应器底部的卸料口，使黑液经由卸料口所配备的过滤装置流出至储藏罐中。当密闭反应器中的压力降至大气压时，利用储藏罐顶部的真空泵抽真空，使储藏罐中形成负压，黑液进一步流出；至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。所述加入水的量为步骤(2)处理之后物料体积的1-2倍。
其中，物料清洗步骤可以重复1-4次，直至物料的pH不高于7.5。通过抽滤洗涤去除黑液，不但免除了酸的添加，减少了化学品的使用；而且黑液通过改性可以制备有机肥还田，提高工艺经济性，减少废水排放。此外，磺化预处理后的物料经抽滤洗涤之后，完全符合糖化步骤的要求，这是实现“一锅法”的关键步骤。
(4)糖化：按照1:2-1:25的固液重量体积比，向密闭容器中加入糖化培养基，高温高压灭菌；接种产纤维小体菌株种子液，采用间歇式搅拌方式，在34-65℃的温度条件和5.8-6.5 的pH下进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液。采用间歇搅拌的混匀方式，在保证传质效率的前提下，可以极大的降低糖化阶段的能耗和对设备的损耗，提高糖化效率。
其中，所述间歇式搅拌为：每1-6小时搅拌5-10分钟，所述间歇式搅拌的转速为0.5-20rpm。糖化过程中，通过流加氢氧化钠使pH控制在5.8-6.5。
所述产纤维小体菌株为热纤梭菌、黄色溶纤梭菌、嗜纤维梭菌、解纤维梭菌、解纤维醋弧菌、溶纤维假拟杆菌、白色瘤胃球菌或黄化瘤胃球菌；接种量为2-10％(v/v)。
所述糖化培养基为每升水中添加磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、pH 6.5-7.5。
(5)发酵：当密闭反应器中葡萄糖浓度达到25-180g/L时，通入无菌空气，添加培养基组分，获得发酵培养基；然后接入活化的好氧异养微生物种子液，搅拌均匀，在15-38℃的温度条件、补氮、pH6.5-9.0下发酵1.5-7天，获得好氧异养微生物发酵液，测定生物量。
其中，所述的产油微生物为裂殖壶菌、微拟球藻、高山被孢霉、小球藻、红发夫酵母或假丝酵母，接种量为5-10％(v/v)。所述搅拌的转速100-200rpm、通气量为0.2-2vvm。
所述的培养基组分为：酵母提取物0.2-30g/L，蛋白胨0.2-20g/L，玉米浆6-30g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-5g/L，海水晶0-30g/L，维生素B1 3-200mg/L，维生素B63-200 mg/L，维生素B12 1-50mg/L，生物素1-50mg/L。
木质纤维素一锅法生物转化装置，包括密闭反应器5和与真空装置7相连通的储藏罐8；所述密闭反应器5的上部设有进气口2和进料口3，所述密闭反应器5的内部设有加热装置、控温装置以及与电机1相连的搅拌桨4，所述密闭反应器5的底部设有卸料口6；所述卸料口 6与储藏罐8的入口相连通；所述卸料口6上设置过滤装置，所述储藏罐8的底部设置出口。采用该装置，可以实现木质纤维素的一锅法生物转化，克服了现有技术中缺少与一锅法匹配的装置的难题。
本发明的有益效果：
(1)本发明所述的木质纤维素的一锅法生物转化的方法，将预处理、糖化和发酵过程串联，并在同一个反应器中进行，极大的简化了工艺步骤和对设备的要求。
(2)本发明采用基于产纤维小体细菌的纤维素酶制剂实现木质纤维素的糖化，免除了游离酶制剂的添加，显著降低了糖化阶段的用酶成本。
(3)本发明利用木质纤维素生物质为原料联合油脂发酵生产，一方面降低碳源成本，另一方面还解决了农林废弃物的综合利用问题，具有巨大的环境效益和社会效益。
附图说明
附图1是本发明所述的木质纤维素一锅法生物转化装置的结构示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：木质纤维素一锅法生物转化法
木质纤维素一锅法生物转化的方法，包括以下步骤：
(1)机械处理：将玉米秸秆进行机械粉碎，直至碎片粒径不超过2cm；用水清洗，然后从密闭反应器上方的投料口投放到密闭反应器中，按照固液重量体积比1:2添加水，混合均匀，浸泡4h。
(2)化学处理：向密闭反应器中加入亚硫酸铵，至其终浓度为11％(w/v)，在175℃的温度条件下进行磺化处理3.5h。反应完毕后，打开密闭反应器底部的卸料口，使黑液经由卸料口所配备的过滤装置流出至储藏罐中；所述储藏罐通过管路与密闭反应器相连接。当密闭反应器中的压力降至大气压时，利用储藏罐顶部的真空泵抽真空，使储藏罐中形成负压，黑液进一步流出；直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
(3)物料清洗：向密闭反应器中加入1倍物料体积的水；向密闭反应器中通入高压氮气，使反应器内压力达到12个标准大气压，然后打开密闭反应器底部的卸料口，使黑液经由卸料口所配备的过滤装置流出至储藏罐中。当密闭反应器中的压力降至大气压时，利用储藏罐顶部的真空泵抽真空，使储藏罐中形成负压，黑液进一步流出；至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。物料清洗步骤重复2次，直至物料的pH不高于7.5。
(4)糖化：按照1:6的固液重量体积比，向密闭容器中加入糖化培养基，高温高压灭菌；接种热纤梭菌种子液，接种量为5％(v/v)；采用间歇式搅拌方式，在60℃的温度条件和5.8-6.5 的pH下进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液。
所述间歇式搅拌为：每1小时搅拌5分钟，所述间歇式搅拌的转速为5rpm。糖化过程中，通过流加氢氧化钠使pH控制在5.8-6.5。
所述糖化培养基为每升水中添加磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、pH 6.5-7.5。
(5)发酵：当密闭反应器中葡萄糖浓度达到70-80g/L时，通入无菌空气，添加培养基组分，获得发酵培养基。然后接入活化的裂殖壶菌种子液，接种量为5％(v/v)，搅拌均匀；在转速100rpm、通气量为0.2vvm、25℃的温度条件、补氮、pH6.5下发酵3天，获得好氧异养微生物发酵液，测定生物量。
所述的培养基组分为：酵母提取物0.2-30g/L，蛋白胨0.2-20g/L，玉米浆6-30g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-5g/L，海水晶0-30g/L，维生素B1 3-200mg/L，维生素B63-200 mg/L，维生素B12 1-50mg/L，生物素1-50mg/L。
实施例2：木质纤维素一锅法生物转化法
与实施例1不同的是，木质纤维素一锅法生物转化的方法，包括以下步骤：
(1)机械处理：将麦秸进行机械粉碎，直至碎片粒径不超过2cm；用水清洗，然后从密闭反应器上方的投料口投放到密闭反应器中，按照固液重量体积比1:3添加水，混合均匀，浸泡2-4h。
(2)化学处理：向密闭反应器中加入亚硫酸铵，至其终浓度为12％(w/v)，在180℃的温度条件下进行磺化处理4h。反应完毕后，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
(3)物料清洗：向密闭反应器中加入1倍物料体积的水；向密闭反应器中通入高压氮气，使反应器内压力达到12个标准大气压，然后打开卸料口，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
上述物料清洗步骤重复4次，直至物料的pH不高于7.5。
(4)糖化：按照1:3.5的固液重量体积比，向密闭容器中加入糖化培养基，高温高压灭菌；接种热纤梭菌种子液，接种量为6％(v/v)；采用间歇式搅拌方式，在60℃的温度条件和5.8-6.5的pH下进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液。
所述间歇式搅拌为：每2小时搅拌5分钟，所述间歇式搅拌的转速为2rpm。糖化过程中，通过流加氢氧化钠使pH控制在5.8-6.5。
(5)发酵：当密闭反应器中葡萄糖浓度达到140-150g/L时，通入无菌空气，添加培养基组分，获得发酵培养基。然后接入活化的微拟球藻种子液，接种量为8％(v/v)，搅拌均匀；在转速150rpm、通气量为1.0vvm、30℃的温度条件、补氮、pH8.0下发酵6天，获得好氧异养微生物发酵液，测定生物量。
所述的培养基组分为：酵母提取物0.2-30g/L，蛋白胨0.2-20g/L，玉米浆6-30g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-5g/L，海水晶0-30g/L，维生素B1 3-200mg/L，维生素B63-200 mg/L，维生素B12 1-50mg/L，生物素1-50mg/L。
实施例3：木质纤维素一锅法生物转化法
与实施例1不同的是，木质纤维素一锅法生物转化的方法，包括以下步骤：
(1)机械处理：将灌木条枝进行机械粉碎，直至碎片粒径不超过2cm；用水清洗，然后从密闭反应器上方的投料口投放到密闭反应器中，按照固液重量体积比1:4添加水，混合均匀，浸泡2-4h。
(2)化学处理：向密闭反应器中加入亚硫酸铵，至其终浓度为13％(w/v)，在185℃的温度条件下进行磺化处理1h。反应完毕后，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
(3)物料清洗：向密闭反应器中加入1.5倍物料体积的水；向密闭反应器中通入高压氮气，使反应器内压力达到12个标准大气压，然后打开卸料口，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
上述物料清洗步骤重复4次，直至物料的pH不高于7.5。
(4)糖化：按照1:5的固液重量体积比，向密闭容器中加入糖化培养基，高温高压灭菌；接种热纤梭菌种子液，接种量为8％(v/v)；采用间歇式搅拌方式，在60℃的温度条件和5.8-6.5 的pH下进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液。
所述间歇式搅拌为：每3小时搅拌10分钟，所述间歇式搅拌的转速为0.5rpm。糖化过程中，通过流加氢氧化钠使pH控制在5.8-6.5。
(5)发酵：当密闭反应器中葡萄糖浓度达到90-110g/L时，通入无菌空气，添加培养基组分，获得发酵培养基。然后接入活化的高山被孢霉种子液，接种量为10％(v/v)，搅拌均匀；在转速200rpm、通气量为2.0vvm、28℃的温度条件、补氮、pH7.5下发酵6.5天，获得好氧异养微生物发酵液，测定生物量。
所述的培养基组分为：酵母提取物0.2-30g/L，蛋白胨0.2-20g/L，玉米浆6-30g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-5g/L，海水晶0-30g/L，维生素B1 3-200mg/L，维生素B63-200 mg/L，维生素B12 1-50mg/L，生物素1-50mg/L。
实施例4：木质纤维素一锅法生物转化法
与实施例1不同的是，木质纤维素一锅法生物转化的方法，包括以下步骤：
(1)机械处理：将木片进行机械粉碎，直至碎片粒径不超过2cm；用水清洗，然后从密闭反应器上方的投料口投放到密闭反应器中，按照固液重量体积比1:5添加水，混合均匀，浸泡2-4h。
(2)化学处理：向密闭反应器中加入亚硫酸铵，至其终浓度为14％(w/v)，在190℃的温度条件下进行磺化处理1.5h。反应完毕后，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
(3)物料清洗：向密闭反应器中加入1.5倍物料体积的水；向密闭反应器中通入高压氮气，使反应器内压力达到10个标准大气压，然后打开卸料口，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
上述物料清洗步骤重复4次，直至物料的pH不高于7.5。
(4)糖化：按照1:8的固液重量体积比，向密闭容器中加入糖化培养基，高温高压灭菌；接种热纤梭菌种子液，接种量为10％(v/v)；采用间歇式搅拌方式，在60℃的温度条件和5.8-6.5的pH下进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液。
所述间歇式搅拌为：每6小时搅拌10分钟，所述间歇式搅拌的转速为20rpm。糖化过程中，通过流加氢氧化钠使pH控制在5.8-6.5。
(5)发酵：当密闭反应器中葡萄糖浓度达到60-70g/L时，通入无菌空气，添加培养基组分，获得发酵培养基。然后接入活化的小球藻种子液，接种量为6％(v/v)，搅拌均匀；在转速150rpm、通气量为0.5vvm、15℃的温度条件、补氮、pH7.0下发酵2.5天，获得好氧异养微生物发酵液，测定生物量。
所述的培养基组分为：酵母提取物0.2-30g/L，蛋白胨0.2-20g/L，玉米浆6-30g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-5g/L，海水晶0-30g/L，维生素B1 3-200mg/L，维生素B63-200 mg/L，维生素B12 1-50mg/L，生物素1-50mg/L。
实施例5：木质纤维素一锅法生物转化法
与实施例1不同的是，木质纤维素一锅法生物转化的方法，包括以下步骤：
(1)机械处理：将稻草进行机械粉碎，直至碎片粒径不超过2cm；用水清洗，然后从密闭反应器上方的投料口投放到密闭反应器中，按照固液重量体积比1:6添加水，混合均匀，浸泡2-4h。
(2)化学处理：向密闭反应器中加入亚硫酸铵，至其终浓度为15％(w/v)，在160℃的温度条件下进行磺化处理2h。反应完毕后，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
(3)物料清洗：向密闭反应器中加入2倍物料体积的水；向密闭反应器中通入高压氮气，使反应器内压力达到10个标准大气压，然后打开卸料口，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
上述物料清洗步骤重复4次，直至物料的pH不高于7.5。
(4)糖化：按照1:10的固液重量体积比，向密闭容器中加入糖化培养基，高温高压灭菌；接种热纤梭菌种子液，接种量为2％(v/v)；采用间歇式搅拌方式，在60℃的温度条件和5.8-6.5的pH下进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液。
所述间歇式搅拌为：每4小时搅拌5分钟，所述间歇式搅拌的转速为10rpm。糖化过程中，通过流加氢氧化钠使pH控制在5.8-6.5。
(5)发酵：当密闭反应器中葡萄糖浓度达到50-60g/L时，通入无菌空气，添加培养基组分，获得发酵培养基。然后接入活化的假丝酵母种子液，接种量为8％(v/v)，搅拌均匀；在转速150rpm、通气量为1.2vvm、38℃的温度条件、补氮、pH9.0下发酵5天，获得好氧异养微生物发酵液，测定生物量。
所述的培养基组分为：酵母提取物0.2-30g/L，蛋白胨0.2-20g/L，玉米浆6-30g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-5g/L，海水晶0-30g/L，维生素B1 3-200mg/L，维生素B63-200 mg/L，维生素B12 1-50mg/L，生物素1-50mg/L。
实施例6：木质纤维素一锅法生物转化法
与实施例1不同的是，木质纤维素一锅法生物转化的方法，包括以下步骤：
(1)机械处理：将废纸进行机械粉碎，直至碎片粒径不超过2cm；用水清洗，然后从密闭反应器上方的投料口投放到密闭反应器中，按照固液重量体积比1:2添加水，混合均匀，浸泡2-4h。
(2)化学处理：向密闭反应器中加入亚硫酸铵，至其终浓度为9％(w/v)，在165℃的温度条件下进行磺化处理2.5h。反应完毕后，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
(3)物料清洗：向密闭反应器中加入2倍物料体积的水；向密闭反应器中通入高压氮气，使反应器内压力达到11个标准大气压，然后打开卸料口，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
上述物料清洗步骤重复4次，直至物料的pH不高于7.5。
(4)糖化：按照1:2的固液重量体积比，向密闭容器中加入糖化培养基，高温高压灭菌；接种黄色溶纤梭菌种子液，接种量为6％(v/v)；采用间歇式搅拌方式，在65℃的温度条件和5.8-6.5的pH下进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液。
所述间歇式搅拌为：每5小时搅拌10分钟，所述间歇式搅拌的转速为15rpm。糖化过程中，通过流加氢氧化钠使pH控制在5.8-6.5。
(5)发酵：当密闭反应器中葡萄糖浓度达到160-180g/L时，通入无菌空气，添加培养基组分，获得发酵培养基。然后接入活化的红发夫酵母种子液，接种量为10％(v/v)，搅拌均匀；在转速150rpm、通气量为2.0vvm、18℃的温度条件、补氮、pH7.5下发酵7天，获得好氧异养微生物发酵液，测定生物量。
所述的培养基组分为：酵母提取物0.2-30g/L，蛋白胨0.2-20g/L，玉米浆6-30g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-5g/L，海水晶0-30g/L，维生素B1 3-200mg/L，维生素B63-200 mg/L，维生素B12 1-50mg/L，生物素1-50mg/L。
实施例7：木质纤维素一锅法生物转化法
与实施例1不同的是，木质纤维素一锅法生物转化的方法，包括以下步骤：
(1)机械处理：将麦秸进行机械粉碎，直至碎片粒径不超过2cm；用水清洗，然后从密闭反应器上方的投料口投放到密闭反应器中，按照固液重量体积比1:3添加水，混合均匀，浸泡2-4h。
(2)化学处理：向密闭反应器中加入亚硫酸铵，至其终浓度为10％(w/v)，在170℃的温度条件下进行磺化处理3h。反应完毕后，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
(3)物料清洗：向密闭反应器中加入1.2倍物料体积的水；向密闭反应器中通入高压氮气，使反应器内压力达到11个标准大气压，然后打开卸料口，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
上述物料清洗步骤重复4次，直至物料的pH不高于7.5。
(4)糖化：按照1:15的固液重量体积比，向密闭容器中加入糖化培养基，高温高压灭菌；接种嗜纤维梭菌种子液，接种量为6％(v/v)；采用间歇式搅拌方式，在37℃的温度条件和5.8-6.5的pH下进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液。
所述间歇式搅拌为：每3小时搅拌8分钟，所述间歇式搅拌的转速为12rpm。糖化过程中，通过流加氢氧化钠使pH控制在5.8-6.5。
(5)发酵：当密闭反应器中葡萄糖浓度达到30-50g/L时，通入无菌空气，添加培养基组分，获得发酵培养基。然后接入活化的裂殖壶菌种子液，接种量为5％(v/v)，搅拌均匀；在转速100rpm、通气量为0.8vvm、28℃的温度条件、补氮、pH7.0下发酵3天，获得好氧异养微生物发酵液，测定生物量。
所述的培养基组分为：酵母提取物0.2-30g/L，蛋白胨0.2-20g/L，玉米浆6-30g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-5g/L，海水晶0-30g/L，维生素B1 3-200mg/L，维生素B63-200 mg/L，维生素B12 1-50mg/L，生物素1-50mg/L。
实施例8：木质纤维素一锅法生物转化法
与实施例1不同的是，木质纤维素一锅法生物转化的方法，包括以下步骤：
(1)机械处理：将麦秸进行机械粉碎，直至碎片粒径不超过2cm；用水清洗，然后从密闭反应器上方的投料口投放到密闭反应器中，按照固液重量体积比1:4添加水，混合均匀，浸泡2-4h。
(2)化学处理：向密闭反应器中加入亚硫酸铵，至其终浓度为11％(w/v)，在175℃的温度条件下进行磺化处理3.5h。反应完毕后，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
(3)物料清洗：向密闭反应器中加入1.2倍物料体积的水；向密闭反应器中通入高压氮气，使反应器内压力达到11个标准大气压，然后打开卸料口，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
上述物料清洗步骤重复4次，直至物料的pH不高于7.5。
(4)糖化：按照1:10的固液重量体积比，向密闭容器中加入糖化培养基，高温高压灭菌；接种解纤维梭菌种子液，接种量为6％(v/v)；采用间歇式搅拌方式，在34℃的温度条件和5.8-6.5的pH下进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液。
所述间歇式搅拌为：每3小时搅拌10分钟，所述间歇式搅拌的转速为8rpm。糖化过程中，通过流加氢氧化钠使pH控制在5.8-6.5。
(5)发酵：当密闭反应器中葡萄糖浓度达到40-60g/L时，通入无菌空气，添加培养基组分，获得发酵培养基。然后接入活化的裂殖壶菌种子液，接种量为8％(v/v)，搅拌均匀；在转速100rpm、通气量为1.5vvm、35℃的温度条件、补氮、pH7.0下发酵5.5天，获得好氧异养微生物发酵液，测定生物量。
所述的培养基组分为：酵母提取物0.2-30g/L，蛋白胨0.2-20g/L，玉米浆6-30g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-5g/L，海水晶0-30g/L，维生素B1 3-200mg/L，维生素B63-200 mg/L，维生素B12 1-50mg/L，生物素1-50mg/L。
实施例9：木质纤维素一锅法生物转化法
与实施例1不同的是，木质纤维素一锅法生物转化的方法，包括以下步骤：
(1)机械处理：将麦秸进行机械粉碎，直至碎片粒径不超过2cm；用水清洗，然后从密闭反应器上方的投料口投放到密闭反应器中，按照固液重量体积比1:5添加水，混合均匀，浸泡2-4h。
(2)化学处理：向密闭反应器中加入亚硫酸铵，至其终浓度为12％(w/v)，在180℃的温度条件下进行磺化处理4h。反应完毕后，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
(3)物料清洗：向密闭反应器中加入1.8倍物料体积的水；向密闭反应器中通入高压氮气，使反应器内压力达到10.5个标准大气压，然后打开卸料口，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
上述物料清洗步骤重复4次，直至物料的pH不高于7.5。
(4)糖化：按照1:4.5的固液重量体积比，向密闭容器中加入糖化培养基，高温高压灭菌；接种解纤维醋弧菌种子液，接种量为8％(v/v)；采用间歇式搅拌方式，在37℃的温度条件和5.8-6.5的pH下进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液。
所述间歇式搅拌为：每4小时搅拌8分钟，所述间歇式搅拌的转速为6rpm。糖化过程中，通过流加氢氧化钠使pH控制在5.8-6.5。
(5)发酵：当密闭反应器中葡萄糖浓度达到110-130g/L时，通入无菌空气，添加培养基组分，获得发酵培养基。然后接入活化的裂殖壶菌种子液，接种量为8％(v/v)，搅拌均匀；在转速100rpm、通气量为1.8vvm、25℃的温度条件、补氮、pH7.0下发酵3.5天，获得好氧异养微生物发酵液，测定生物量。
所述的培养基组分为：酵母提取物0.2-30g/L，蛋白胨0.2-20g/L，玉米浆6-30g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-5g/L，海水晶0-30g/L，维生素B1 3-200mg/L，维生素B63-200 mg/L，维生素B12 1-50mg/L，生物素1-50mg/L。
实施例10：木质纤维素一锅法生物转化法
与实施例1不同的是，木质纤维素一锅法生物转化的方法，包括以下步骤：
(1)机械处理：将玉米芯进行机械粉碎，直至碎片粒径不超过2cm；用水清洗，然后从密闭反应器上方的投料口投放到密闭反应器中，按照固液重量体积比1:6添加水，混合均匀，浸泡2-4h。
(2)化学处理：向密闭反应器中加入亚硫酸铵，至其终浓度为13％(w/v)，在185℃的温度条件下进行磺化处理1h。反应完毕后，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
(3)物料清洗：向密闭反应器中加入1.8倍物料体积的水；向密闭反应器中通入高压氮气，使反应器内压力达到10.5个标准大气压，然后打开卸料口，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
上述物料清洗步骤重复4次，直至物料的pH不高于7.5。
(4)糖化：按照1:5的固液重量体积比，向密闭容器中加入糖化培养基，高温高压灭菌；接种溶纤维假拟杆菌种子液，接种量为8％(v/v)；采用间歇式搅拌方式，在42℃的温度条件和5.8-6.5的pH下进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液。
所述间歇式搅拌为：每6小时搅拌10分钟，所述间歇式搅拌的转速为15rpm。糖化过程中，通过流加氢氧化钠使pH控制在5.8-6.5。
(5)发酵：当密闭反应器中葡萄糖浓度达到60-80g/L时，通入无菌空气，添加培养基组分，获得发酵培养基。然后接入活化的高山被孢霉种子液，接种量为10％(v/v)，搅拌均匀；在转速200rpm、通气量为1.5vvm、26℃的温度条件、补氮、pH7.0下发酵3.5天，获得好氧异养微生物发酵液，测定生物量。
所述的培养基组分为：酵母提取物0.2-30g/L，蛋白胨0.2-20g/L，玉米浆6-30g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-5g/L，海水晶0-30g/L，维生素B1 3-200mg/L，维生素B63-200 mg/L，维生素B12 1-50mg/L，生物素1-50mg/L。
实施例11：木质纤维素一锅法生物转化法
与实施例1不同的是，木质纤维素一锅法生物转化的方法，包括以下步骤：
(1)机械处理：将废纸进行机械粉碎，直至碎片粒径不超过2cm；用水清洗，然后从密闭反应器上方的投料口投放到密闭反应器中，按照固液重量体积比1:3添加水，混合均匀，浸泡2-4h。
(2)化学处理：向密闭反应器中加入亚硫酸铵，至其终浓度为14％(w/v)，在190℃的温度条件下进行磺化处理1.5h。反应完毕后，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
(3)物料清洗：向密闭反应器中加入2倍物料体积的水；向密闭反应器中通入高压氮气，使反应器内压力达到11.5个标准大气压，然后打开卸料口，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
上述物料清洗步骤重复4次，直至物料的pH不高于7.5。
(4)糖化：按照1:25的固液重量体积比，向密闭容器中加入糖化培养基，高温高压灭菌；接种白色瘤胃球菌种子液，接种量为8％(v/v)；采用间歇式搅拌方式，在37℃的温度条件和5.8-6.5的pH下进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液。
所述间歇式搅拌为：每1小时搅拌6分钟，所述间歇式搅拌的转速为5rpm。糖化过程中，通过流加氢氧化钠使pH控制在5.8-6.5。
(5)发酵：当密闭反应器中葡萄糖浓度达到25-35g/L时，通入无菌空气，添加培养基组分，获得发酵培养基。然后接入活化的高山被孢霉种子液，接种量为6％(v/v)，搅拌均匀；在转速200rpm、通气量为1.5vvm、38℃的温度条件、补氮、pH6.5下发酵1.5天，获得好氧异养微生物发酵液，测定生物量。
所述的培养基组分为：酵母提取物0.2-30g/L，蛋白胨0.2-20g/L，玉米浆6-30g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-5g/L，海水晶0-30g/L，维生素B1 3-200mg/L，维生素B63-200 mg/L，维生素B12 1-50mg/L，生物素1-50mg/L。
实施例12：木质纤维素一锅法生物转化法
与实施例1不同的是，木质纤维素一锅法生物转化的方法，包括以下步骤：
(1)机械处理：将玉米芯进行机械粉碎，直至碎片粒径不超过2cm；用水清洗，然后从密闭反应器上方的投料口投放到密闭反应器中，按照固液重量体积比1:4添加水，混合均匀，浸泡2-4h。
(2)化学处理：向密闭反应器中加入亚硫酸铵，至其终浓度为15％(w/v)，在160℃的温度条件下进行磺化处理2h。反应完毕后，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
(3)物料清洗：向密闭反应器中加入2倍物料体积的水；向密闭反应器中通入高压氮气，使反应器内压力达到11.5个标准大气压，然后打开卸料口，使黑液流出至储藏罐中，直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口。
上述物料清洗步骤重复4次，直至物料的pH不高于7.5。
(4)糖化：按照1:3的固液重量体积比，向密闭容器中加入糖化培养基，高温高压灭菌；接种黄化瘤胃球菌种子液，接种量为8％(v/v)；采用间歇式搅拌方式，在37℃的温度条件和5.8-6.5的pH下进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液。
所述间歇式搅拌为：每1小时搅拌6分钟，所述间歇式搅拌的转速为2rpm。糖化过程中，通过流加氢氧化钠使pH控制在5.8-6.5。
(5)发酵：当密闭反应器中葡萄糖浓度达到100-120g/L时，通入无菌空气，添加培养基组分，获得发酵培养基。然后接入活化的高山被孢霉种子液，接种量为8％(v/v)，搅拌均匀；在转速200rpm、通气量为2.0vvm、15℃的温度条件、补氮、pH7.5下发酵7天，获得好氧异养微生物发酵液，测定生物量。
所述的培养基组分为：酵母提取物0.2-30g/L，蛋白胨0.2-20g/L，玉米浆6-30g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-5g/L，海水晶0-30g/L，维生素B1 3-200mg/L，维生素B63-200 mg/L，维生素B12 1-50mg/L，生物素1-50mg/L。
实施例13：木质纤维素一锅法生物转化装置
木质纤维素一锅法生物转化装置，包括密闭反应器5和与真空装置7相连通的储藏罐8；所述密闭反应器5的上部设有进气口2和进料口3，所述密闭反应器5的内部设有加热装置、控温装置以及与电机1相连的搅拌桨4，所述密闭反应器5的底部设有卸料口6；所述卸料口6与储藏罐8的入口相连通；所述卸料口6上设置过滤装置，所述储藏罐8的底部设置出口。采用该装置，可以实现木质纤维素的一锅法生物转化，克服了现有技术中缺少与一锅法匹配的装置的难题。
表1实施例1-12木质纤维素一锅法生物转化的结果
由表1可知，采用本发明所述的木质纤维素一锅法生物转化法，纤维素糖化率为80.9-90.8％，采用所述糖液培养裂殖壶菌、微拟球藻、高山被孢霉、小球藻、红发夫酵母和假丝酵母，所获得的生物量可以达到或高于现有分步进行的技术的水平。葡萄糖的转化率，即糖液中的葡萄糖到生物量的转化率为31.2-51.2％，达到现有发酵技术的较高水平。
本发明所述的木质纤维素一锅法生物转化法，将预处理、糖化和发酵过程串联在同一个反应器中进行，在生物量和葡萄糖转化率达到现有技术的较高水平的前提下，简化了工艺步骤和对设备的要求，降低了生产成本，对于产业化具有重要的意义。而且，本发明免除了游离酶制剂的添加，显著降低了糖化阶段的用酶成本。
Claims (10)
1.木质纤维素一锅法生物转化法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)机械处理：将木质纤维素原料进行机械粉碎，清洗，投放至密闭反应器中，按照固液重量体积比1:2-1:6添加水，混合均匀，浸泡；
(2)化学处理：向密闭反应器中加入适量亚硫酸铵，在160-190℃的温度条件下进行磺化处理1-4h；反应完毕后，打开密闭反应器底部的卸料口，使黑液流至储藏罐中；当密闭反应器中的压力降至大气压时，利用储藏罐顶部的真空泵抽真空，使储藏罐中形成负压，黑液进一步流出；直至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口；
(3)物料清洗：向密闭反应器中加入水，混合均匀；向密闭反应器中通入高压氮气，使反应器内压力达到10-12个标准大气压，然后打开密闭反应器底部的卸料口，使黑液流至储藏罐中；当密闭反应器中的压力降至大气压时，利用储藏罐顶部的真空泵抽真空，使储藏罐中形成负压，黑液进一步流出；至密闭反应器中物料的含水量达到30％-50％，关闭卸料口；
(4)糖化：按照1:2-1:25的固液重量体积比，向密闭反应器中加入糖化培养基，高温高压灭菌；接种产纤维小体菌株种子液，采用间歇式搅拌方式，在34-65℃的温度条件和5.8-6.5的pH下进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液；
(5)发酵：当密闭反应器中葡萄糖浓度达到25-180g/L时，通入无菌空气，添加培养基组分，获得发酵培养基；然后接入活化的好氧异养微生物种子液，搅拌均匀，在15-38℃的温度条件、补氮、pH6.5-9.0下发酵1.5-7天，获得好氧异养微生物发酵液，测定生物量。
2.根据权利要求1所述的木质纤维素一锅法生物转化法，其特征在于：步骤(3)中所述加入水的量为步骤(2)处理之后物料体积的1-2倍；所述步骤(3)重复1-4次，直至物料的pH不高于7.5。
3.根据权利要求2所述的木质纤维素一锅法生物转化法，其特征在于：步骤(1)所述机械粉碎后木质纤维素原料的碎片粒径不超过2cm，浸泡时间为2-4h；所述木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、玉米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合。
4.根据权利要求2所述的木质纤维素一锅法生物转化法，其特征在于：步骤(2)所述密闭反应器中亚硫酸铵的终浓度为9-15％(w/v)。
5.根据权利要求2所述的木质纤维素一锅法生物转化法，其特征在于：步骤(4)所述的间歇式搅拌为：每1-6小时搅拌5-10分钟，所述间歇式搅拌的转速为0.5-20rpm。
6.根据权利要求2所述的木质纤维素一锅法生物转化法，其特征在于：步骤(4)所述的产纤维小体菌株为热纤梭菌、黄色溶纤梭菌、嗜纤维梭菌、解纤维梭菌、解纤维醋弧菌、溶纤维假拟杆菌、白色瘤胃球菌或黄化瘤胃球菌；接种量为2-10％(v/v)。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的木质纤维素一锅法生物转化法，其特征在于：所述的糖化培养基具体为：每升水中添加磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、pH 6.5-7.5。
8.根据权利要求1-6中任意一项所述的木质纤维素一锅法生物转化法，其特征在于：步骤(5)所述的好氧异养微生物为裂殖壶菌、微拟球藻、高山被孢霉、小球藻、红发夫酵母或假丝酵母，接种量为5-10％(v/v)；所述搅拌的转速100-200rpm、通气量为0.2-2vvm。
9.根据权利要求1-6中任意一项所述的木质纤维素一锅法生物转化法，其特征在于：步骤(5)所述的培养基组分为：酵母提取物0.2-30g/L，蛋白胨0.2-20g/L，玉米浆6-30g/L，磷酸二氢钾0.5-8g/L，硫酸镁0.5-5g/L，海水晶0-30g/L，维生素B1 3-200mg/L，维生素B6 3-200mg/L，维生素B12 1-50mg/L，生物素1-50mg/L。
10.木质纤维素一锅法生物转化装置，其特征在于：包括密闭反应器5和与真空装置7相连通的储藏罐8；所述密闭反应器5的上部设有进气口2和进料口3，所述密闭反应器5的内部设有加热装置、控温装置以及与电机1相连的搅拌桨4，所述密闭反应器5的底部设有卸料口6；所述卸料口6与储藏罐8的入口相连通；所述卸料口6上设置过滤装置，所述储藏罐8的底部设置出口。
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