CN109055459A - 用于木质纤维素的全菌糖化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：(1)种子液优化：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株在以葡萄糖为唯一碳源的培养基，进行传代驯化；然后接种到添加了预处理后的木质纤维素原料的葡萄糖培养基中进行诱导驯化。(2)原料预浸渍：将预处理后的木质纤维素原料和培养基溶液混合均匀。(3)全菌糖化：将步骤(1)优化的全菌糖化种子液接种到步骤(2)得到的预浸渍后的反应体系中，进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液。该方法不但大大缩短了种子培养阶段的周期，降低了种子液的成本，也缩短了全菌糖化的周期，从而为工业化的进程奠定了基础。

Description

用于木质纤维素的全菌糖化方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种木质纤维素的生物转化方法，具体涉及一种用于木 质纤维素的全菌糖化方法。
背景技术
近年来，从生物质中获取可再生的能源、材料或化学品得到世界各国的普遍关注。利用 木质纤维素类生物质为原料生产第二代生物基燃料或化学品，成为能否大规模替代石油基产 品的关键。
木质纤维素类生物质是地球上蕴藏最为丰富的可再生生物质资源，将其转化为能源、化 学品或材料具有巨大的应用和发展前景。特别的，我国是农业大国，每年的农作物秸秆产量 超过9亿吨。另一方面，秸秆焚烧引起的环境污染与交通安全事故等问题，也促使国家推出 一系列秸秆综合利用的规划、方案与措施。所以，推动农业废弃生物质综合利用的产业化发 展，对我国绿色循环经济的建立和社会的可持续发展意义重大。
然而，生物质糖化所用的酶制剂技术目前被发达国家公司垄断，由此而造成的酶的高成 本成为制约木质纤维素工业化应用的关键问题。此外，技术上的困难也阻碍了木质纤维素生 物转化技术的发展和应用。因此，开发低成本、高效率的糖化技术，对发展中国家尤为必要。
与依赖于酶制剂的糖化工艺相比，整合生物加工技术的“一锅法”全菌催化的生物糖化 策略具有简化流程、降低设备要求等优势，是最适合纤维素类生物质生物转化利用的工艺路 线。“一锅法”技术的核心在于采用高效的全菌催化剂，即一种具有木质纤维素底物降解能 力、可以高效将纤维素底物水解转化为可发酵糖的微生物。目前，木质纤维素全菌催化糖化 主要利用基于热纤梭菌这一产纤维小体的高温厌氧菌作为全菌催化剂。纤维小体是一种具有 复杂结构和组分的胞外多酶复合体，是自然界中已知的最高效的纤维素降解体系之一。木质 纤维素全菌催化糖化包括全菌催化剂预培养(种子培养阶段)和全菌糖化的两步半连续生产 模式。在种子培养阶段，目前通常有两种方法：(1)以市售纤维二糖或者纤维素作为碳源进 行培养，种子生长较快，但价格昂贵；(2)以预处理生物质原料为碳源进行种子培养，这一 方法虽然可以降低成本，但种子培养周期较长。
葡萄糖是发酵行业常用的微生物培养碳源，价格较低，而且是纤维素糖化的产物。然而， 目前，葡萄糖还不能应用于全菌催化剂的预培养。这是由于，当以葡萄糖为唯一碳源对热纤 梭菌进行培养时，不但会有几十小时的生长延滞期，而且会导致纤维小体的产量显著降低， 从而导致生产周期长，此外，所获得的全菌催化剂的纤维素降解活力较低。Yoav等人将热纤 梭菌菌株在以葡萄糖为唯一碳源的培养基里进行驯化(Yoav,S.,Barak,Y.,Shamshoum,M.,et al.,Biotechnology for biofuels 2017,10:222)，解决了葡萄糖作为单一碳源所导致的生长延滞 期的问题。然而，该报道只是为了更快的得到菌体和纤维小体，并没有解决纤维小体产量显 著降低以及所获得的全菌催化剂的纤维素降解活力较低的问题。此外，在全菌糖化阶段，将 种子液接种进具有高固含量预处理木质纤维素底物的大规模糖化体系后，一般需要2-5天的 缓冲期才开始酶解糖化过程，也会导致生产周期长，从而增加生产过程的人工、能耗成本。
因此，木质纤维素全菌催化糖化中种子培养阶段的种子液制备的技术难题，以及全菌糖 化步骤中存在的周期长、成本高的问题，是基于全菌催化的木质纤维素生物糖化技术难以大 规模应用于工业生产的主要瓶颈之一。
发明内容
针对现有技术中木质纤维素全菌糖化中所存在周期长、种子液制备成本高的问题，本发 明提供了用于木质纤维素的全菌糖化方法，该方法不但大大缩短了种子培养阶段的周期，降 低了种子液的成本，也缩短了全菌糖化的周期，从而为工业化的进程奠定了基础。
本发明的技术方案：
用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液优化：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株在以葡萄糖为唯一碳源的培养基， 即葡萄糖培养基中，进行传代驯化；然后接种到添加了预处理后的木质纤维素原料的葡萄糖 培养基中进行诱导驯化。从而获得高生长速度、高纤维小体产量、高纤维小体比活力的全菌 糖化种子液。
所述的葡萄糖培养基含有葡萄糖的浓度为1-20g/L；所述传代驯化进行2-5次，每次传代 为将产纤维小体菌株培养后按照0.2-2％(体积分数)接种至新鲜培养基中进行培养。所述木 质纤维素原料的添加量为0.1-2.0g/L；所述诱导驯化的温度条件为34-65℃；所述诱导驯化的 时间为12-48小时。向葡萄糖培养基中添加预处理后的木质纤维素原料，即预处理底物，是 为了诱导匹配的纤维小体合成。
本发明所获得的种子液的纤维小体的比活力与纤维素为碳源生产的纤维小体一致、高于 以纤维二糖为碳源生产的纤维小体，其纤维小体产量与纤维素为碳源生产的纤维小体一致， 其种子生长速度与以纤维二糖为碳源生长的种子一致，高于纤维素为碳源生长的种子，远高 于预处理木质纤维素为碳源生长的种子。
(2)原料预浸渍：按照1:3-1:50的固液重量体积比，将预处理后的木质纤维素原料和培 养基溶液在容器中在0.5-100r/min的转速条件下混合均匀并持续1-48h；所述预处理后的木质 纤维素原料与步骤(1)中相同，目的是在糖化开始前实现底物与培养基进行充分的混合，有 利于全菌催化剂的生长和活力，从而实现更快速的糖化。所述容器为带有搅拌桨的厌氧发酵 设备或者厌氧旋转混匀器；所述带有搅拌桨的厌氧发酵设备通过搅拌实现混合均匀，而厌氧 旋转混匀器则通过容器的整体滚动翻转实现混合均匀。
(3)全菌糖化：将步骤(1)优化的全菌糖化种子液接种到步骤(2)得到的预浸渍后的 反应体系中，并在0.5-100r/min的转速条件下进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述 的全菌糖化种子液的接种量为0.1-10％的体积分数。糖化过程中可通过流加氢氧化钠的方式 使pH控制在5.8-6.2。
其中，所述的产纤维小体菌株为热纤梭菌、黄色溶纤梭菌、嗜纤维梭菌、解纤维梭菌、 解纤维醋弧菌、溶纤维假拟杆菌、白色瘤胃球菌或黄化瘤胃球菌。所述的预处理为碱法、酸 法、水热法、汽爆法和磺化法预处理技术中的一种或多种的组合。所述木质纤维素原料为玉 米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、玉米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合。
其中，步骤(1)所述的葡萄糖培养基为每升水中添加磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾 1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、葡萄糖1-20g/L、pH 6.5-7.5。
本发明的有益效果：
(1)本发明所述的用于木质纤维素的全菌糖化方法，以相对廉价的葡萄糖添加低浓度的 预处理木质纤维素生物质为碳源，用于培养热纤梭菌等产纤维小体菌株，作为全菌糖化的种 子液；与现有技术相比，所述全菌糖化的种子液实现了成本降低和周期缩短的效果，克服了 现有技术中二者不可兼得的难题。
(2)本发明所述的木质纤维素的全菌糖化方法，采用原料预浸渍的技术，显著缩短全菌 糖化的适应缓冲期，提高全菌糖化的效率，从而降低整个糖化过程的周期和成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：
用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液优化：
在厌氧条件下，将热纤梭菌在以5g/L的葡萄糖为唯一碳源的培养基，即葡萄糖培养基中， 按照1％体积分数的接种比例，进行3次传代培养；然后接种到添加0.1g/L干重的预处理玉 米秸秆的葡萄糖培养基中，在55℃的温度条件下诱导驯化48h，从而获得高生长速度、高纤 维小体产量、高纤维小体比活力的全菌糖化种子液。所述的葡萄糖培养基除含有5g/L葡萄糖 外，每升水中还具有磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、 氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、pH 6.5-7.5。 向葡萄糖培养基中添加预处理后的木质纤维素原料，即预处理底物，是为了诱导匹配的纤维 小体合成。所述的预处理方法为文献(中国造纸，2015,34,1-6)中采用的磺化法预处理。
在步骤(1)结束后，检测种子液的纤维小体比活力、产量和细胞生物量。其中：(1)纤维小体产量的检测为：利用纤维素吸附法提取种子液中的纤维小体，以Bradford法进行蛋 白质定量，从而获得纤维小体产量(每单位体积种子液中纤维小体的毫克数)。(2)纤维小 体比活力的检测为：以预处理玉米秸秆为底物，检测提取的纤维小体的水解活力。水解实验 在55℃条件下持续24小时，然后用DNS法检测水解释放的还原糖的浓度。根据还原糖和纤 维小体产量计算纤维小体比活力(U/mg)，其中酶活单位(U)定义为在测定条件下，每小 时水解纤维素底物生成1mg还原糖所需要的蛋白量(mg)。(3)细胞生物量的检测为：将种子液离心后的沉淀用氢氧化钠进行水解，然后利用Bradford法检测沉淀中细胞蛋白的浓度 (每单位体积种子液中沉淀蛋白的毫克数)，根据生长曲线以及沉淀蛋白浓度分析生长至对 数中期所需时间(小时)，判断生长速度。
(2)原料预浸渍：按照1:6.5的固液重量体积比，将1kg预处理后的木质纤维素原料和 6.5L的培养基溶液在50r/min的转速条件下混合均匀，并持续4h；所述预处理后的木质纤维 素原料与步骤(1)中相同，目的是在糖化开始前实现底物与培养基进行充分的混合，有利于 全菌催化剂的生长和活力，从而实现更快速的糖化。所述混合均匀为通过容器中搅拌装置的 搅拌实现混合均匀。
(3)全菌糖化：将步骤(1)优化的全菌糖化种子液按照10％体积分数的接种量接种到 步骤(2)得到的预浸渍后的反应体系中，并继续在50r/min的转速条件下进行糖化反应，得 到含有葡萄糖的糖液。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中 纤维素到可溶性糖的转化率。
其中，转化率低于10％(质量比)的时间定义为木质纤维素底物的水解的延滞期(天)。 转化率达到80％(质量比)的时间定义为木质纤维素底物的水解周期(天)。
实施例2：
与实施例1不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，不经驯化及预浸渍步骤，包括 以下步骤：
(1)种子液培养：将热纤梭菌在以5g/L预处理玉米秸秆为碳源的培养基(葡萄糖培养 基除葡萄糖以外的成分)中培养48h。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方法检测种子液的纤维小体比活力、产量和细胞生物量。
(2)全菌糖化：按照10％体积分数的接种量，将种子液直接接种到含有1kg预处理后的 玉米秸秆和6.5L的培养基溶液的反应体系中进行全菌糖化，预处理原料及全菌糖化的条件与 实施例1相同。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤维素 到可溶性糖的转化率。
实施例3：
与实施例1不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液优化：
在厌氧条件下，将热纤梭菌在以10g/L的葡萄糖为唯一碳源的培养基，即葡萄糖培养基 中，按照1％体积分数的接种比例，进行3次传代培养；然后接种到添加0.5g/L干重的预处 理小麦秸秆的葡萄糖培养基中，在58℃的温度条件下诱导驯化36h，从而获得高生长速度、 高纤维小体产量、高纤维小体比活力的全菌糖化种子液。所述的预处理方法为CN201610133959 中采用的水热与磺化法联合预处理法。
(2)原料预浸渍：按照1:5的固液重量体积比，将1kg预处理后的木质纤维素原料和5L的培养基溶液在25r/min的转速条件下混合均匀，并持续36h；所述预处理后的木质纤维素原料与步骤(1)中相同。
(3)全菌糖化：将步骤(1)优化的全菌糖化种子液以10％体积分数的接种量接种到步 骤(2)得到的预浸渍后的反应体系中，并继续在25r/min的转速条件下进行糖化反应，得到 含有葡萄糖的糖液。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤 维素到可溶性糖的转化率。
实施例4：
与实施例1不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液优化：
在厌氧条件下，将热纤梭菌在以20g/L的葡萄糖为唯一碳源的培养基，即葡萄糖培养基 中，按照1％体积分数的接种比例，进行2次传代培养；然后接种到添加2g/L干重的预处理 灌木枝条的葡萄糖培养基中，在60℃的温度条件下诱导驯化24h，从而获得高生长速度、高 纤维小体产量、高纤维小体比活力的全菌糖化种子液。所述的预处理方法为文献(Bin Li,et al.Recent progress on the pretreatment and fractionation oflignocelluloses for Biorefinery at QIBEBT.Journal of Bioresources andBioproducts,2017,2(1),4-9) 中的碱法预处理技术。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方法检测种子液的纤维小体比活 力、产量和细胞生物量。
(2)原料预浸渍：按照1:8的固液重量体积比，将1kg预处理后的木质纤维素原料和8L 的培养基溶液在45r/min的转速条件下混合均匀，并持续28h；所述预处理后的木质纤维素 原料与步骤(1)中相同。(3)全菌糖化：将步骤(1)优化的全菌糖化种子液以6％体积分数的接种量接种到步骤(2)得到的预浸渍后的反应体系中，并继续在45r/min的转速条件下进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量。
实施例5：
与实施例4不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，不经驯化及预浸渍步骤，包括 以下步骤：
(1)种子液培养：将热纤梭菌在以20g/L微晶纤维素为碳源的培养基(葡萄糖培养基 除葡萄糖以外的成分)中培养24h。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方法检测种子液的纤维小体比活力、产量和细胞生物量。
(2)全菌糖化：按照8％体积分数的接种量，将种子液直接接种到含有1kg预处理后的灌木枝条和8L的培养基溶液的反应体系中进行全菌糖化，预处理原料及全菌糖化的条件与 实施例4相同。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤维素 到可溶性糖的转化率。
实施例6：
与实施例1不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液优化：
在厌氧条件下，将热纤梭菌以5g/L的葡萄糖为唯一碳源的培养基，即葡萄糖培养基中， 按照0.1％体积分数的接种比例，进行5次传代培养；然后接种到添加0.5g/L干重的预处理木 片的葡萄糖培养基中，在60℃的温度条件下诱导驯化24h，从而获得高生长速度、高纤维小 体产量、高纤维小体比活力的全菌糖化种子液。所述的预处理方法为文献(Biotechnology for Biofuels，2014，7:116)中的碱法与水热相结合的预处理技术。
(2)原料预浸渍：按照1:8的固液重量体积比，将100kg预处理后的木质纤维素原料和 800L的培养基溶液在1.5r/min的转速条件下混合均匀，并持续24h；所述预处理后的木质纤 维素原料与步骤(1)中相同。所述混合均匀为通过容器的整体滚动翻转实现混合均匀。
(3)全菌糖化：将步骤(1)优化的全菌糖化种子液以8％体积分数的接种量接种到步骤 (2)得到的预浸渍后的反应体系中，并继续在1.5r/min的转速条件下进行糖化反应，得到含 有葡萄糖的糖液。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤维 素到可溶性糖的转化率。
实施例7：
与实施例1不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液优化：
在厌氧条件下，将热纤梭菌以5g/L的葡萄糖为唯一碳源的培养基，即葡萄糖培养基中， 按照2％体积分数的接种比例，进行2次传代培养；然后接种到添加1g/L干重的预处理稻草 的葡萄糖培养基中，在60℃的温度条件下诱导驯化48h，从而获得高生长速度、高纤维小体 产量、高纤维小体比活力的全菌糖化种子液。所述的预处理方法为文献(纤维素科学与技术， 2002，3，47-52)中的汽爆预处理技术。
(2)原料预浸渍：按照1:11的固液重量体积比，将100kg预处理后的木质纤维素原料 和1100L的培养基溶液在0.5r/min的转速条件下混合均匀，并持续48h；所述预处理后的木 质纤维素原料与步骤(1)中相同。所述混合均匀为通过容器的整体滚动翻转实现混合均匀。
(3)全菌糖化：将步骤(1)优化的全菌糖化种子液以2％体积分数的接种量接种到步骤 (2)得到的预浸渍后的反应体系中，并在1.6r/min的转速条件下进行糖化反应，得到含有葡 萄糖的糖液。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤维素到 可溶性糖的转化率。
实施例8：
与实施例1不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液优化：
在厌氧条件下，将热纤梭菌以5g/L的葡萄糖为唯一碳源的培养基，即葡萄糖培养基中， 按照0.5％体积分数的接种比例，进行4次传代培养；然后接种到添加2g/L干重的预处理废 纸的葡萄糖培养基中，在60℃的温度条件下诱导驯化12h，从而获得高生长速度、高纤维小 体产量、高纤维小体比活力的全菌糖化种子液。所述的预处理方法为文献(Bioresource Technology，2004，91，93-100)中的水热预处理技术。在步骤(1)结束后，采用实施例1 的方法检测种子液的纤维小体比活力、产量和细胞生物量。
(2)原料预浸渍：按照1:10的固液重量体积比，将0.2kg预处理后的木质纤维素原料和 2L的培养基溶液在5.0r/min的转速条件下混合均匀，并持续40h；所述预处理后的木质纤维 素原料与步骤(1)中相同。所述混合均匀为通过容器的整体滚动翻转实现混合均匀。
(3)全菌糖化：将步骤(1)优化的全菌糖化种子液以4％体积分数的接种量接种到步骤 (2)得到的预浸渍后的反应体系中，并继续在5.0r/min的转速条件下进行糖化反应，得到含 有葡萄糖的糖液。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤维 素到可溶性糖的转化率。
实施例9：
与实施例8不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，不经驯化及预浸渍步骤，包括 以下步骤：
(1)种子液培养：将热纤梭菌在以5g/L纤维二糖为碳源的培养基(葡萄糖培养基除葡 萄糖以外的成分)中培养12h。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方法检测种子液的纤维小体比活力、产量和细胞生物量。
(2)全菌糖化：按照4％体积分数的接种量，将种子液直接接种到含有0.2kg预处理后 的废纸和2L的培养基溶液的反应体系中进行全菌糖化，预处理原料及全菌糖化的条件与实施 例8相同。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤维素到可 溶性糖的转化率。
实施例10：
与实施例1不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液优化：
在厌氧条件下，将黄色溶纤梭菌以10g/L的葡萄糖为唯一碳源的培养基，即葡萄糖培养 基中，按照1％体积分数的接种比例，进行3次传代培养；然后接种到添加0.5g/L干重的预 处理麦秸的葡萄糖培养基中，在65℃的温度条件下诱导驯化24h，从而获得高生长速度、高 纤维小体产量、高纤维小体比活力的全菌糖化种子液。所述的预处理方法同实施例1中的磺 化预处理技术。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方法检测种子液的纤维小体比活力、产 量和细胞生物量。
(2)原料预浸渍：按照1:15的固液重量体积比，将0.2kg预处理后的木质纤维素原料和 3L的培养基溶液在20r/min的转速条件下混合均匀，并持续12h；所述预处理后的木质纤维 素原料与步骤(1)中相同。所述混合均匀为通过容器中搅拌装置的搅拌实现混合均匀。
(3)全菌糖化：将步骤(1)优化的全菌糖化种子液以5％体积分数的接种量接种到步骤 (2)得到的预浸渍后的反应体系中，并继续在20r/min的转速条件下进行糖化反应，得到含 有葡萄糖的糖液。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤维 素到可溶性糖的转化率。
实施例11：
与实施例10不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，不经驯化及预浸渍步骤，包括 以下步骤：
(1)种子液培养：将黄色溶纤梭菌在以10g/L微晶纤维素为碳源的培养基(葡萄糖培养 基除葡萄糖以外的成分)中培养24h。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方法检测种子液 的纤维小体比活力、产量和细胞生物量。
(2)全菌糖化：按照5％体积分数的接种量，将种子液直接接种到含有0.2kg预处理后 的麦秸和3L的培养基溶液的反应体系中进行全菌糖化，预处理原料及全菌糖化的条件与实施 例10相同。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤维素到 可溶性糖的转化率。
实施例12：
与实施例1不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液优化：
在厌氧条件下，将嗜纤维梭菌以10g/L的葡萄糖为唯一碳源的培养基，即葡萄糖培养基 中，按照1％体积分数的接种比例，进行3次传代培养；然后接种到添加0.5g/L干重的预处 理麦秸的葡萄糖培养基中，在37℃的温度条件下诱导驯化36h，从而获得高生长速度、高纤 维小体产量、高纤维小体比活力的全菌糖化种子液。所述的预处理方法同实施例1中的磺化 预处理技术。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方法检测种子液的纤维小体比活力、产量 和细胞生物量。
(2)原料预浸渍：按照1:20的固液重量体积比，将0.2kg预处理后的木质纤维素原料和 4L的培养基溶液在20r/min的转速条件下混合均匀，并持续10h；所述预处理后的木质纤维 素原料与步骤(1)中相同。所述混合均匀为通过容器中搅拌装置的搅拌实现混合均匀。
(3)全菌糖化：将步骤(1)优化的全菌糖化种子液以1％体积分数的接种量接种到步骤 (2)得到的预浸渍后的反应体系中，并继续在20r/min的转速条件下进行糖化反应，得到含 有葡萄糖的糖液。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤维 素到可溶性糖的转化率。
实施例13：
与实施例12不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，不经驯化及预浸渍步骤，包括 以下步骤：
(1)种子液培养：将嗜纤维梭菌在以10g/L微晶纤维素为碳源的培养基(葡萄糖培养基 除葡萄糖以外的成分)中培养36h。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方法检测种子液的 纤维小体比活力、产量和细胞生物量。
(2)全菌糖化：按照1％体积分数的接种量，将种子液直接接种到含有0.2kg预处理后 的麦秸和4L的培养基溶液的反应体系中进行全菌糖化，预处理原料及全菌糖化的条件与实施 例12相同。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤维素到 可溶性糖的转化率。
实施例14：
与实施例1不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液优化：
在厌氧条件下，将解纤维梭菌以10g/L的葡萄糖为唯一碳源的培养基，即葡萄糖培养基 中，按照1％体积分数的接种比例，进行3次传代培养；然后接种到添加0.5g/L干重的预处 理麦秸的葡萄糖培养基中，在34℃的温度条件下诱导驯化36h，从而获得高生长速度、高纤 维小体产量、高纤维小体比活力的全菌糖化种子液。所述的预处理方法同实施例2中的预处 理技术。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方法检测种子液的纤维小体比活力、产量和细 胞生物量。
(2)原料预浸渍：按照1:40的固液重量体积比，将0.1kg预处理后的木质纤维素原料和 4L的培养基溶液在75r/min的转速条件下混合均匀，并持续5h；所述预处理后的木质纤维素 原料与步骤(1)中相同。所述混合均匀为通过容器中搅拌装置的搅拌实现混合均匀。
(3)全菌糖化：将步骤(1)优化的全菌糖化种子液以0.5％体积分数的接种量接种到步 骤(2)得到的预浸渍后的反应体系中，并继续在75r/min的转速条件下进行糖化反应，得到 含有葡萄糖的糖液。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤 维素到可溶性糖的转化率。
实施例15：
与实施例12不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，不经驯化及预浸渍步骤，包括 以下步骤：
(1)种子液培养：将解纤维梭菌在以10g/L纤维二糖为碳源的培养基(葡萄糖培养基除 葡萄糖以外的成分)中培养36h。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方法检测种子液的纤 维小体比活力、产量和细胞生物量。
(2)全菌糖化：按照0.5％体积分数的接种量，将种子液直接接种到含有0.1kg预处理后 的麦秸和4L的培养基溶液的反应体系中进行全菌糖化，预处理原料及全菌糖化的条件与实施 例14相同。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤维素到 可溶性糖的转化率。
实施例16：
与实施例1不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液优化：
在厌氧条件下，将解纤维醋弧菌以10g/L的葡萄糖为唯一碳源的培养基，即葡萄糖培养 基中，按照1％体积分数的接种比例，进行3次传代培养；然后接种到添加0.5g/L干重的预 处理玉米芯的葡萄糖培养基中，在37℃的温度条件下诱导驯化36h，从而获得高生长速度、 高纤维小体产量、高纤维小体比活力的全菌糖化种子液。所述的预处理方法同实施例5中的 汽爆法预处理技术。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方法检测种子液的纤维小体比活力、 产量和细胞生物量。
(2)原料预浸渍：按照1:50的固液重量体积比，将0.1kg预处理后的木质纤维素原料和 5L的培养基溶液在100r/min的转速条件下混合均匀，并持续1h；所述预处理后的木质纤维 素原料与步骤(1)中相同。所述混合均匀为通过容器中搅拌装置的搅拌实现混合均匀。
(3)全菌糖化：将步骤(1)优化的全菌糖化种子液以0.1％体积分数的接种量接种到步 骤(2)得到的预浸渍后的反应体系中，并继续在100r/min的转速条件下进行糖化反应，得 到含有葡萄糖的糖液。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中 纤维素到可溶性糖的转化率。
实施例17：
与实施例16不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，不经驯化及预浸渍步骤，包括 以下步骤：
(1)种子液培养：将解纤维醋弧菌在以10g/L纤维二糖为碳源的培养基(葡萄糖培养基 除葡萄糖以外的成分)中培养36h。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方法检测种子液的 纤维小体比活力、产量和细胞生物量。
(2)全菌糖化：按照0.1％体积分数的接种量，将种子液直接接种到含有0.1kg预处理后 的玉米芯和5L的培养基溶液的反应体系中进行全菌糖化，预处理原料及全菌糖化的条件与实 施例16相同。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤维素 到可溶性糖的转化率。
实施例18：
与实施例1不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液优化：
在厌氧条件下，将溶纤维假拟杆菌以5g/L的葡萄糖为唯一碳源的培养基，即葡萄糖培养 基中，按照2％体积分数的接种比例，进行2次传代培养；然后接种到添加1g/L干重的预处 理废纸的葡萄糖培养基中，在42℃的温度条件下诱导驯化40h，从而获得高生长速度、高纤 维小体产量、高纤维小体比活力的全菌糖化种子液。所述的预处理方法同实施例5中的汽爆 法预处理技术。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方法检测种子液的纤维小体比活力、产 量和细胞生物量。
(2)原料预浸渍：按照1:25的固液重量体积比，将0.2kg预处理后的木质纤维素原料和 5L的培养基溶液在1.6r/min的转速条件下混合均匀，并持续12h；所述预处理后的木质纤维 素原料与步骤(1)中相同。所述混合均匀为通过容器的整体滚动翻转实现混合均匀。
(3)全菌糖化：将步骤(1)优化的全菌糖化种子液以5％体积分数的接种量接种到步骤 (2)得到的预浸渍后的反应体系中，并继续在1.6r/min的转速条件下进行糖化反应，得到含 有葡萄糖的糖液。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤维 素到可溶性糖的转化率。
实施例19：
与实施例18不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，不经驯化及预浸渍步骤，包括 以下步骤：
(1)种子液培养：将溶纤维假拟杆菌在以10g/L预处理废纸为碳源的培养基(葡萄糖培 养基除葡萄糖以外的成分)中培养40h。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方法检测种子 液的纤维小体比活力、产量和细胞生物量。
(2)全菌糖化：按照5％体积分数的接种量，将种子液直接接种到含有0.2kg预处理后 的木质纤维素原料和5L的培养基溶液的反应体系中进行全菌糖化，预处理原料及全菌糖化的 条件与实施例18相同。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物 中纤维素到可溶性糖的转化率。
实施例20：
与实施例1不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液优化：
在厌氧条件下，将白色瘤胃球菌以20g/L的葡萄糖为唯一碳源的培养基，即葡萄糖培养 基中，按照1％体积分数的接种比例，进行2次传代培养；然后接种到添加2g/L干重的预处 理玉米芯的葡萄糖培养基中，在37℃的温度条件下诱导驯化40h，从而获得高生长速度、高 纤维小体产量、高纤维小体比活力的全菌糖化种子液。所述的预处理方法同实施例5中的汽 爆法预处理技术。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方法检测种子液的纤维小体比活力、 产量和细胞生物量。
(2)原料预浸渍：按照1:3的固液重量体积比，将0.2kg预处理后的木质纤维素原料和 0.6L的培养基溶液在2r/min的转速条件下混合均匀，并持续48h；所述预处理后的木质纤维 素原料与步骤(1)中相同。所述混合均匀为通过容器的整体滚动翻转实现混合均匀。
(3)全菌糖化：将步骤(1)优化的全菌糖化种子液以10％体积分数的接种量接种到步 骤(2)得到的预浸渍后的反应体系中，并继续在2r/min的转速条件下进行糖化反应，得到 含有葡萄糖的糖液。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤 维素到可溶性糖的转化率。
实施例21：
与实施例20不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，不经驯化及预浸渍步骤，包括 以下步骤：
(1)种子液培养：将白色瘤胃球菌在以20g/L预处理玉米芯为碳源的培养基(葡萄糖培 养基除葡萄糖以外的成分)中培养40h。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方法检测种子 液的纤维小体比活力、产量和细胞生物量。
(2)全菌糖化：按照10％体积分数的接种量，将种子液直接接种到含有0.2kg预处理后 的木质纤维素原料和0.6L的培养基溶液的反应体系中进行全菌糖化，预处理原料及全菌糖化 的条件与实施例20相同。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底 物中纤维素到可溶性糖的转化率。
实施例22：
与实施例1不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液优化：
在厌氧条件下，将黄化瘤胃球菌以20g/L的葡萄糖为唯一碳源的培养基，即葡萄糖培养 基中，按照1％体积分数的接种比例，进行2次传代培养；然后接种到添加2g/L干重的预处 理玉米芯的葡萄糖培养基中，在40℃的温度条件下诱导驯化48h，从而获得高生长速度、高 纤维小体产量、高纤维小体比活力的全菌糖化种子液。所述的预处理方法为文献(生物加工 过程，2010，3，66-72)中的稀酸水解预处理技术。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方 法检测种子液的纤维小体比活力、产量和细胞生物量。
(2)原料预浸渍：按照1:5的固液重量体积比，将0.4kg预处理后的木质纤维素原料和 2L的培养基溶液在10r/min的转速条件下混合均匀，并持续36h；所述预处理后的木质纤维 素原料与步骤(1)中相同。所述混合均匀为通过容器的整体滚动翻转实现混合均匀。
(3)全菌糖化：将步骤(1)优化的全菌糖化种子液以10％体积分数的接种量接种到步 骤(2)得到的预浸渍后的反应体系中，并继续在10r/min的转速条件下进行糖化反应，得到 含有葡萄糖的糖液。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤 维素到可溶性糖的转化率。
实施例23：
与实施例22不同的是，用于木质纤维素的全菌糖化方法，不经驯化及预浸渍步骤，包括 以下步骤：
(1)种子液培养：将黄化瘤胃球菌在以20g/L预处理玉米芯为碳源的培养基(葡萄糖培 养基除葡萄糖以外的成分)中培养48h。在步骤(1)结束后，采用实施例1的方法检测种子 液的纤维小体比活力、产量和细胞生物量。
(2)全菌糖化：按照10％体积分数的接种量，将种子液直接接种到含有0.4kg预处理后 的木质纤维素原料和2L的培养基溶液的反应体系中进行全菌糖化，预处理原料及全菌糖化的 条件与实施例22相同。在此过程中，每12小时取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物 中纤维素到可溶性糖的转化率。
表1.实施例1-22全菌糖化过程中的指标参数
注：
1.生长速度是指生长到对数中期所需的时间。
2.延滞期是指全菌糖化过程中底物中纤维素到可溶性糖的转化率低于10％(质量比)的时间。
3.水解周期是指全菌糖化过程中底物中纤维素到可溶性糖的转化率达到80％(质量比)的时间。
由表1可知，
(1)根据四组实施例8-9、14-15、和16-17的对比可知，采用本申请所述的用于木质纤 维素的全菌糖化方法，所得到的种子液的纤维小体的比活力为4.6-17.8U/mg；纤维小体的产 量为4.6-6.3mg/mL；种子生长速度为10-36小时。糖液中葡萄糖的产量为10.6-54.8g/L；延 滞期为0.5-1.0天；糖化周期为6.5-14天。
采用纤维二糖为碳源的情况下，纤维小体的比活力为1.3-4.1U/mg；纤维小体的产量为 1.4-2.1mg/mL；种子生长速度为12-36小时。糖液中葡萄糖的产量为10.7-50.3g/L；延滞期为 2-3天；糖化周期为10-17.5天。
说明，与采用纤维二糖为碳源的情况相比，采用本申请所述的用于木质纤维素的全菌糖 化方法所获得的种子液的纤维小体的比活力和纤维小体的产量均大大提高；延滞期和糖化周 期大大缩短；种子生长速度以及糖液中葡萄糖的产量几乎持平。
(2)根据四组实施例4-5、10-11、和12-13的对比可知，用本申请所述的用于木质纤维 素的全菌糖化方法，所得到的种子液的纤维小体的比活力为4.1-17.7U/mg；纤维小体的产量 为13.9-25.5mg/mL；种子生长速度为16-32小时。糖液中葡萄糖的产量为26.6-62.5g/L；延 滞期为0.5-1.5天；糖化周期为7.5-13.5天。
采用微晶纤维素为碳源的情况下，纤维小体的比活力为3.3-17.1U/mg；纤维小体的产量 为15.0-21.3mg/mL；种子生长速度为24-40小时。糖液中葡萄糖的产量为23.9-63.1g/L；延 滞期为2.5-4.5天；糖化周期为12-18天。
说明，与采用微晶纤维素为碳源的情况相比，采用本申请所述的用于木质纤维素的全菌 糖化方法所获得的种子液的纤维小体的比活力、纤维小体的产量和糖液中葡萄糖的产量几乎 持平；而种子生长速度大大提高，延滞期和糖化周期大大缩短。
(3)根据四组实施例1-2、18-19、20-21和22-23的对比可知，采用本申请所述的用于 木质纤维素的全菌糖化方法，所得到的种子液的纤维小体的比活力为4.1-14.8U/mg；纤维小 体的产量为7.9-15.2mg/mL；种子生长速度为40-48小时。糖液中葡萄糖的产量为27.1-112.5 g/L；延滞期为0.5-1.5天；糖化周期为9.5-18.5天。
采用木质纤维素为碳源的情况下，纤维小体的比活力为5.1-15.3U/mg；纤维小体的产量 为8.1-14.8mg/mL；种子生长速度为66-72小时。糖液中葡萄糖的产量为24.7-103.1g/L；延滞 期为2.5-5.0天；糖化周期为15-26.5天。
说明，与采用木质纤维素为碳源的情况相比，采用本申请所述的用于木质纤维素的全菌 糖化方法所获得的种子液的纤维小体的比活力、纤维小体的产量和糖液中葡萄糖的产量几乎 持平；而种子生长速度大大提高，延滞期和糖化周期大大缩短。
综上可知，(1)本发明所获得的种子液的纤维小体的比活力与微晶纤维素为碳源生产的 纤维小体一致、高于以纤维二糖为碳源生产的纤维小体；(2)本发明所获得的种子液的纤维 小体产量与纤维素为碳源生产的纤维小体一致；高于以纤维二糖为碳源生产的纤维小体；(3) 本发明所获得的种子液的种子生长速度与以纤维二糖为碳源生长的种子一致，高于纤维素为 碳源生长的种子，远高于预处理木质纤维素为碳源生长的种子；(4)本发明中的延滞期和糖 化周期与以纤维二糖/微晶纤维素/预处理木质纤维素为碳源相比，均大大缩短。
这说明，本发明所述的用于木质纤维素的全菌糖化方法，以相对廉价的葡萄糖添加低浓 度的预处理木质纤维素生物质为碳源，用于培养热纤梭菌等产纤维小体菌株，作为全菌糖化 的种子液；与现有技术相比，所述全菌糖化的种子液实现了成本降低和周期缩短的效果，克 服了现有技术中二者不可兼得的难题。此外，本发明所述的木质纤维素的全菌糖化方法，采 用了原料预浸渍的技术，显著缩短了全菌糖化的适应缓冲期(延滞期)，特别是当高固含量 的条件下，提高全菌糖化的效率，从而降低整个糖化过程的周期和成本。

Claims (10)

1.用于木质纤维素的全菌糖化方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)种子液优化：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株在葡萄糖培养基中进行传代驯化；然后接种到添加了预处理后的木质纤维素原料的葡萄糖培养基中进行诱导驯化，从而获得优化后的全菌糖化种子液；所述葡萄糖培养基是以葡萄糖为唯一碳源的培养基；
(2)原料预浸渍：按照一定的固液重量体积比，将预处理后的木质纤维素原料和培养基溶液在容器中混合均匀，并持续一定时间；所述预处理后的木质纤维素原料与步骤(1)中相同；
(3)全菌糖化：将步骤(1)优化的全菌糖化种子液接种到步骤(2)得到的预浸渍后的反应体系中，并在0.5-100r/min的转速条件下进行糖化反应，得到含有葡萄糖的糖液。
2.根据权利要求1所述的用于木质纤维素的全菌糖化方法，其特征在于：步骤(1)所述葡萄糖培养基中葡萄糖的浓度为1-20g/L；所述传代驯化进行2-5次；所述木质纤维素原料的添加量为0.1-2.0g/L。
3.根据权利要求1所述的用于木质纤维素的全菌糖化方法，其特征在于：所述诱导驯化的温度条件为34-65℃；所述诱导驯化的时间为12-48小时。
4.根据权利要求1所述的用于木质纤维素的全菌糖化方法，其特征在于：步骤(2)所述的木质纤维素原料与培养基溶液的固液重量体积比为1:3-1:50；所述的木质纤维素原料和培养基溶液在0.5-100r/min的转速条件下混合均匀并持续1-48h。
5.根据权利要求4所述的用于木质纤维素的全菌糖化方法，其特征在于：所述容器为带有搅拌桨的厌氧发酵设备或者厌氧旋转混匀器。
6.根据权利要求1所述的用于木质纤维素的全菌糖化方法，其特征在于：步骤(3)所述的全菌糖化种子液的接种量为0.1-10％的体积分数。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的用于木质纤维素的全菌糖化方法，其特征在于：其中，所述的产纤维小体菌株为热纤梭菌、黄色溶纤梭菌、嗜纤维梭菌、解纤维梭菌、解纤维醋弧菌、溶纤维假拟杆菌、白色瘤胃球菌或黄化瘤胃球菌。
8.根据权利要求1-6中任意一项所述的用于木质纤维素的全菌糖化方法，其特征在于：所述的预处理为碱法、稀酸法、水热法、汽爆法和磺化法预处理技术中的一种或多种的组合。
9.根据权利要求1-6中任意一项所述的用于木质纤维素的全菌糖化方法，其特征在于：所述木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、、玉米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合。
10.根据权利要求1-6中任意一项所述的用于木质纤维素的全菌糖化方法，其特征在于：步骤(1)所述的葡萄糖培养基为每升水中添加磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L、葡萄糖1-20g/L、pH 6.5-7.5。
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