CN109096411A - 一种植物多糖及用于促进猪***体外成熟的用途 - Google Patents

一种植物多糖及用于促进猪***体外成熟的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物多糖及用于促进猪***体外成熟的用途。本发明提供的纯化多糖A、B、D、E、F均一性较好，经HPGPC检测均只含一个主要的色谱峰，峰型对称且较窄；纯化多糖A、B、D、E、F对体外培养的猪***具有显著的促进成熟作用，可以用于体外诱导猪***成熟。

Description

一种植物多糖及用于促进猪***体外成熟的用途
技术领域
本发明属于畜牧领域，涉及一种植物多糖及用于促进猪***体外成熟的用途。
背景技术
水菖蒲Acorus calamus为天南星科Araceae多年水生草本植物，别名菖蒲，臭菖蒲，白菖蒲等。以根茎入药，具有开窍，化痰，健胃，益智，散风，活血等功效。生于海拔2600m以下的水边、沼泽湿地或湖泊浮岛上，在南北两半球的温带、亚热带，与我国各省均有分布。
***体外成熟是胚胎体外生产过程的关键环节，因为它决定***的质量，影响胚胎的发育。通过在培养液中添加激素、细胞因子或生长因子等促进***成熟已取得一定进展，但是体外成熟的***的发育能力仍然不及体内成熟的***，这说明***的体外成熟体系还不完善，仍需要进一步优化。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种植物多糖及用于促进猪***体外成熟的用途。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
一种多糖，通过如下方法制备得到：
S1、粗多糖的提取
将干燥的水菖蒲Acorus calamus根茎粉碎，热水沸腾提取，提取液过滤，滤液浓缩至1/5体积，以Sevag法除蛋白，离心去除中间有机相与水相交界处乳化层，合并上清液，加入无水乙醇沉淀多糖，静置，离心收集沉淀，用蒸馏水复溶、冷冻干燥得粗多糖；
S2、粗多糖的初步纯化
准确称取100mg上述麦胚粗多糖冻干粉充分溶解于10mL无菌水中，将配好的粗多糖溶液全部滴加上样至DEAE-Sepharose Fast Flow(3.6cm×20cm)纤维素阴离子交换层析柱中，依次用0，0.1mol/L的NaCl溶液分别洗脱10个柱体积，洗脱的流速为1.2mL/min，收集0.1mol/L的NaCl溶液洗脱液，冷冻干燥得到初步纯化多糖；
S3、初步纯化多糖的进一步纯化
称取0.1mol/L NaCl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5mL超纯水溶解，然后上样至SephacrylS-200HR凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4mL/min，收集第4～5个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖。
优选地，步骤S1固液比为1:5。
优选地，步骤S1提取3次，每次2h。
优选地，步骤S1以Sevag法除蛋白，3000r/min离心10min去除中间有机相与水相交界处乳化层。
优选地，步骤S1加入4倍体积无水乙醇沉淀多糖。
优选地，步骤S1加无水乙醇后于4℃静置24h。
优选地，步骤S1加无水乙醇静置后以3000r/min离心10min收集沉淀。
上述多糖用于促进猪***体外成熟的用途。
有益效果：
本发明提供的纯化多糖A、B、D、E、F均一性较好，经HPGPC检测均只含一个主要的色谱峰，峰型对称且较窄；纯化多糖A、B、D、E、F对体外培养的猪***具有显著的促进成熟作用，可以用于体外诱导猪***成熟。
附图说明
图1为纯化多糖A的HPGPC图；
图2为纯化多糖B的HPGPC图；
图3为纯化多糖C的HPGPC图；
图4为纯化多糖D的HPGPC图；
图5为纯化多糖E的HPGPC图；
图6为纯化多糖F的HPGPC图；
图7为各组***核成熟率(％)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容。
实施例1：多糖的制备
一、实验材料
干燥的水菖蒲Acorus calamus根茎购自亳州中药材市场。
二、实验方法和结果
1、粗多糖的提取
将干燥的水菖蒲Acorus calamus根茎粉碎，热水沸腾提取，固液比为1:5，提取3次，每次2h；合并提取液，过滤，滤液浓缩至1/5体积，以Sevag法除蛋白，3000r/min离心10min去除中间有机相与水相交界处乳化层，合并上清液，加入4倍体积的无水乙醇沉淀多糖，4℃条件下静置24h，3000r/min离心10min离心收集沉淀，用蒸馏水复溶、冷冻干燥得粗多糖。
2、粗多糖的初步纯化
准确称取100mg上述麦胚粗多糖冻干粉充分溶解于10mL无菌水中，将配好的粗多糖溶液全部滴加上样至DEAE-Sepharose Fast Flow(3.6cm×20cm)纤维素阴离子交换层析柱中，依次用0，0.1，0.2，0.3，0.5，0.7，0.9mol/L的NaCl溶液分别洗脱10个柱体积，洗脱的流速为1.2mL/min，分别收集0.1，0.2，0.3，0.5，0.7，0.9mol/L的NaCl溶液洗脱液，分别冷冻干燥得到不同的初步纯化多糖。
3、初步纯化多糖的进一步纯化
称取0.1mol/L NaCl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5mL超纯水溶解，然后上样至SephacrylS-200HR凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4mL/min，收集第4～5个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖A；
称取0.2mol/L NaCl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5mL超纯水溶解，然后上样至SephacrylS-200HR凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4mL/min，收集第6～7个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖B；
称取0.3mol/L NaCl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5mL超纯水溶解，然后上样至SephacrylS-200HR凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4mL/min，收集第5～6个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖C；
称取0.5mol/L NaCl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5mL超纯水溶解，然后上样至SephacrylS-200HR凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4mL/min，收集第7～8个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖D；
称取0.7mol/L NaCl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5mL超纯水溶解，然后上样至SephacrylS-200HR凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4mL/min，收集第6～7个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖E；
称取0.9mol/L NaCl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5mL超纯水溶解，然后上样至SephacrylS-200HR凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4mL/min，收集第5～6个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖F。
纯化多糖A～F经HPGPC检测均只含一个主要的色谱峰，峰型对称且较窄，表明纯化多糖A～F的均一性较好。纯化多糖A～F的HPGPC图如图1～6所示。
实施例2：多糖的药效
一、实验材料和实验方法
从当地屠宰场搜集初情期前小母猪卵巢，然后用注射器抽取法采集卵巢表面直径2～6mm卵泡的***，挑选那些带有2层以上卵丘细胞、胞质均匀的卵丘细胞-***复合体(COCs)，并随机分配于各试验组中。成熟液为TCM-199与猪***按照体积比9:1混合而成(还含有1％双抗)，多糖实验组分别加入30mg/mL纯化多糖A～F，对照组不添加，做成100μL微滴，上盖矿物油，培养20～30枚***。培养箱条件为：5％CO2的空气、最大相对饱和湿度、38.5℃。COCs经44h成熟培养后，去除卵丘细胞，在50倍实体显微镜下检查第1极体排出情况。将排出第1极体的卵子判断为核成熟卵，并按照如下公式计算各组***核成熟率(％)：***核成熟率(％)＝核成熟卵数÷总检查卵数×100％。
为避免单次实验的误差，每组均设置5个平行。实验结果数据以均值±标准差表示，组间比较采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析和t检验，P＜0.05表示差异有显著统计学意义。
二、实验结果
各组***体外成熟情况如表1和图7所示。纯化多糖A、B、D、E、F可以显著促进猪***体外成熟，而纯化多糖C不具备明显的促进作用。
表1各组***体外成熟情况
组别 ***核成熟率(％)
对照组 16.8±5.3
纯化多糖A组 53.5±7.1
纯化多糖B组 48.3±8.8
纯化多糖C组 18.2±6.5
纯化多糖D组 55.7±6.9
纯化多糖E组 58.1±7.5
纯化多糖F组 50.4±6.2
综上可见，本发明提供的纯化多糖A、B、D、E、F均一性较好，经HPGPC检测均只含一个主要的色谱峰，峰型对称且较窄；纯化多糖A、B、D、E、F对体外培养的猪***具有显著的促进成熟作用，可以用于体外诱导猪***成熟。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (8)

1.一种多糖，其特征在于，通过如下方法制备得到：
S1、粗多糖的提取
将干燥的水菖蒲Acorus calamus根茎粉碎，热水沸腾提取，提取液过滤，滤液浓缩至1/5体积，以Sevag法除蛋白，离心去除中间有机相与水相交界处乳化层，合并上清液，加入无水乙醇沉淀多糖，静置，离心收集沉淀，用蒸馏水复溶、冷冻干燥得粗多糖；
S2、粗多糖的初步纯化
准确称取100mg上述麦胚粗多糖冻干粉充分溶解于10mL无菌水中，将配好的粗多糖溶液全部滴加上样至DEAE-Sepharose Fast Flow(3.6cm×20cm)纤维素阴离子交换层析柱中，依次用0，0.1mol/L的NaCl溶液分别洗脱10个柱体积，洗脱的流速为1.2mL/min，收集0.1mol/L的NaCl溶液洗脱液，冷冻干燥得到初步纯化多糖；
S3、初步纯化多糖的进一步纯化
称取0.1mol/LNaCl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5mL超纯水溶解，然后上样至SephacrylS-200HR凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4mL/min，收集第4～5个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖。
2.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于：步骤S1固液比为1:5。
3.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于：步骤S1提取3次，每次2h。
4.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于：步骤S1以Sevag法除蛋白，3000r/min离心10min去除中间有机相与水相交界处乳化层。
5.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于：步骤S1加入4倍体积无水乙醇沉淀多糖。
6.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于：步骤S1加无水乙醇后于4℃静置24h。
7.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于：步骤S1加无水乙醇静置后以3000r/min离心10min收集沉淀。
8.权利要求1-7任一所述多糖用于促进猪***体外成熟的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111840312A (zh) * 2020-06-30 2020-10-30 芜湖职业技术学院 一种具有增强***及胚胎发育成熟的枸杞多糖组合物

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