CN109073660B

CN109073660B - 可用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性的预测性标志物

Info

Publication number: CN109073660B
Application number: CN201780025616.6A
Authority: CN
Inventors: F·格鲁斯; C·科布; N·普法伊费尔
Original assignee: Maintect GmbH
Current assignee: Maintect GmbH
Priority date: 2016-02-29
Filing date: 2017-02-28
Publication date: 2022-10-28
Anticipated expiration: 2037-02-28
Also published as: WO2017148904A1; EP3423835A1; CN115951066A; EP3423835C0; US20220155295A1; CN109073660A; EP3423835B1; US20190072550A1; US11099185B2

Abstract

本发明涉及使用生物标志物来确定患有湿性AMD的个体对VEGF拮抗剂治疗的反应性，诊断和区分干性和湿性AMD并确定干性AMD疾病转化为湿性AMD疾病的风险。

Description

可用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性的预测性标志物

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年2月29日提交的美国临时专利申请62/300,952的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明属于医学诊断领域，并且也属于个性化治疗领域。本文描述的发明可用作诊断测定法来鉴定具有干性或湿性AMD的那些受试者。在一个具体方面，本发明涉及预测患有湿性AMD的个体是否会在临床上对利用VEGF拮抗剂的治疗起反应。本发明的一些方面还涉及关于干性和湿性AMD疾病的诊断和治疗性治疗的其它诊断和预后方法。

背景技术

年龄相关性黄斑变性(AMD)是北美和西欧老年人失明的主要原因，并且随着50岁以上个体的百分比增加而成为重大的健康问题(Hymann,Epidemology,1992)。AMD靶向视网膜色素上皮(RPE)，其为光敏性光感受器与血管脉络膜之间的单层细胞。随着AMD进展，晚期AMD发展成两种不同的临床表现，并且两种形式甚至可在同一患者中发生。一种形式被称为干性或萎缩性形式，其特征在于小玻璃疣在RPE中的积聚，这导致RPE的丧失和黄斑区中视网膜的退化。干性形式更频繁发生(80％的AMD患者)并且导致视觉功能的轻微丧失。其发作不太突然，并且其发生没有伴随新血管形成。更严重的湿性新生血管形式不太常见，但导致约80-90％的严重视力丧失的病例。湿性形式的特征在于来源于脉络膜脉管***的新生血管“膜”，其侵入布鲁赫膜、渗漏并且经常引起RPE和/或神经视网膜的脱离。这些新的毛细血管是异常可渗透的，使得血清和血液能够在RPE和/或感觉神经视网膜下积聚。渗漏的血管导致黄斑瘢痕形成。湿性AMD患者的视力丧失可能很快并导致功能性失明。在患有湿性AMD的患者中，由脉络膜新血管和纤维组织形成的复合物可在3-24个月内破坏光感受器。干性形式可变成湿性形式。干性AMD形式的有效疗法是罕见的，而湿性形式可通过激光光凝术、光动力疗法或使用VEGF拮抗剂来治疗。为了尽可能快地采取行动以从治疗中获得最佳结果，湿性形式的早期诊断是必要的。目前，抗VEGF疗法在世界范围内被用作治疗湿性AMD的主要疗法。用于治疗湿性AMD的几种VEGF拮抗剂已被批准用于人使用，包括雷珠单抗

和阿柏西普

对于抗VEGF治疗剂的施用观察到某种异质性，并且抗VEGF疗法对于每个AMD患者并不是完全有效的。尽管接受了治疗，一些患者仍然会失去视力。这种异质性证明了对预测性生物标志物的需求。如果可以在治疗中尽可能早地确定抗VEGF治疗的功效，使得无反应者可以改变治疗或治疗方案，那么对于AMD患者将是非常有帮助的。用玻璃体内注射雷珠单抗治疗的眼睛中有10-17％被发现是无反应者(Otsuji等，Clinical Ophthalmology,2013；Suzuki等，British Journal of Ophthalmology,2014；Kruger Falk等，Amercian Journalof Ophthalmology 2013)。无反应者的百分比取决于所使用的标准和确定方法而变化。早期的出版物发现甚至更高百分比的抗VEGF治疗的无反应者。还报道了无反应者具有初始临床特征和某些风险因素，诸如延长的AMD、先前的光动力疗法、纤维血管色素上皮脱离、病变大小、患者的年龄。

目前没有办法确定患者是否会对抗VEGF治疗产生积极反应。据报道，候选单核苷酸多态性(SNP)可能用作AMD的预后或预测标志物，并且发现了LOC387715 A69S TT基因型与抗VEGF治疗结果之间的统计学显著关联性(Kitchens等，Clinical Oph-thalmology2013)。越来越多的证据表明患者的遗传特征谱可以决定患者对治疗性治疗的反应性。影响例如对特定药物的反应的遗传因素的确定可用于为患者提供个体化治疗方案。这种个体化治疗方案提供了使对患者的治疗益处最大化的潜力，同时使与替代治疗方案相关的相关副作用降至最低。

需要鉴定可用于预测湿性AMD患者是否可能对特定疗法有反应的因素。还需要鉴定诊断干性和湿性AMD的因素，特别是鉴定区分AMD的两种形式的因素，此外还需要预测目前经诊断患有干性AMD的患者是否会发展所述疾病的湿性形式。

发明内容

在第一方面，本发明涉及预测患有湿性AMD的个体是否会在临床上对VEGF拮抗剂的治疗有反应。本发明的第二方面涉及诊断干性和湿性AMD，特别地涉及区分AMD的两种形式的因素。第三方面，本发明涉及预测干性AMD疾病患者从干性AMD转变为湿性AMD的风险。

本发明的第一方面基于以下发现：特定的生物标志物可用于选择可能对VEGF拮抗剂治疗有反应的患有湿性AMD的个体。令人惊讶地发现，与对照相比，来自患有湿性AMD的个体的样品中的IgG自身抗体模式可用于预测该个体是否对抗VEGF治疗有反应。因此，本发明允许治疗提供者在施用VEGF拮抗剂之前以及在用VEGF拮抗剂治疗期间鉴定作为抗VEGF治疗的反应者的患有湿性AMD的那些个体和作为这种治疗的无反应者的那些个体。

与本发明的第一方面相关的这些自身抗体，即用于区分抗VEGF治疗的反应者与无反应者之间的这些自身抗体，为了本发明的目的被称为A组抗体。A组抗体由针对以下物质的抗体组成或包括所述抗体：MAPK3、OGFR、PolyRp2、染色体17、EIFA1、GPX4、SRP14、γ-突触核蛋白、Jo-1、前白蛋白、GPD2、AP1M1、ENO1-H7、PRG2、ATP合酶、GNB1-A3、TUBB3、HSP 60、ICA1、SELO、SOD、ENO2。

另外，发现这些A组自身抗体可用于预测从干性AMD转变为湿性AMD疾病的风险。

本发明的其它方面基于以下发现：与来自患有干性AMD的个体的样品相比，来自患有湿性AMD的个体的样品中的IgG自身抗体模式不同。因此，鉴定了可区分干性与湿性AMD患者的一组自身抗体。

与本发明第二方面相关的这些自身抗体，即用于区分干性与湿性AMD的自身抗体，为了本发明的目的被称为B组抗体。B组抗体由针对以下物质的抗体组成或包括所述抗体：α-突触核蛋白、SELO、SPRY、GAPDH-H2、膜联蛋白-V、THAP、VTI-B、HSP10、ESD、PKC80、ACO2-C2、OGFR、PBP-I2、CAZ-C3、EIFA1、MAPK3、ENO1-H7、染色体17、乌头酸水合酶、GPX4。

本发明的一些自身抗体是A组和B组两组的成员。

在本发明的第三方面，发现A组的成员和B组的成员，即作为A组或B组成员的自身抗体以及作为A组和B组两者的成员的自身抗体在预测从干性AMD转变为湿性AMD疾病的风险方面是有用的。

将A组和B组的抗体分配至与其诊断意义相关的以下亚组。

关于A组：

第一优先级自身抗体的亚组A-1包含MAPK3、OGFR、SRP14、ENO2、SOD、前白蛋白、Jo-1、PolyRp2、染色体17、EIFA1；

第二优先级自身抗体的亚组A-2包括GPX4、γ-突触核蛋白、GPD2、AP1M1、ENO1-H7、PRG2；

第三优先级自身抗体的亚组A-3包含ATP合酶、GNB1-A3、TUBB3、HSP60、ICA1、SELO。

关于B组：

第一优先级自身抗体的亚组B-1包含α-突触核蛋白、SELO、SPRY、GAPDH-H2、膜联蛋白-V、THAP、VTI-B、HSP10；

第二优先级自身抗体的亚组B-2包括ESD、PKC80、ACO2-C2、OGFR、PBP-I2、CAZ-C3、EIFA1、MAPK3；

第三优先级自身抗体的亚组B-3包含ENO1-H7、染色体17、乌头酸水合酶、GPX4。

如从下文中可以明显看出，在本发明不同方面的各种实施方案中，指定组或亚组的一种或几种自身抗体与和AMD相关的诊断或预后方法的特定步骤相关。为了本发明的目的，短语选自一组或一个亚组的抗体(特别是针对一系列指定的抗原性蛋白的一组或一个亚组的抗体)中的一种或几种抗体，单独地和以与抗体或抗原的该特定组或亚组的一种或不止一种直至所有的另外的抗体或抗原的所有可能的组合，包含所述指定的组或亚组的自身抗体一种的每一种-或相应的抗原性蛋白的每一种。因此，相反地，应理解，短语选自特定组或亚组的抗体中的一种或几种抗体可包括作为所述特定组或亚组的成员列出的每一种抗体，或者可包括其任何部分，例如，除属于特定组的一种或不止一种抗体外的所有成员。

出于本发明的目的，除非另有说明或除非从上下文中明显看出，否则术语诊断和诊断的涉及干性和湿性AMD的诊断以及还有干性和湿性AMD的预期疗程的预后(包括但不限于对特定AMD治疗，特别是利用VEGF-拮抗剂的湿性AMD的治疗的反应性)，以及特别地涉及从干性AMD转变为湿性AMD的风险。

出于本发明的目的，术语自身抗体、抗体和免疫球蛋白应可互换使用。自身抗体是响应于个体自身组织的抗原性组分并对其产生反应而形成的抗体。自身抗体针对个体自身蛋白质(自身抗原)中的一种或多种。

在本发明的第一方面的一个实施方案中，提供了用于确定患有湿性AMD的个体对VEGF拮抗剂治疗的反应性的方法。

在本发明的第一方面的一个实施方案中，提供了通过测量来自个体的样品的自身抗体含量并将其与健康对照的所述抗体含量进行比较，确定患有湿性AMD的所述个体对VEGF拮抗剂治疗的反应性的方法。

在一个实施方案中，本发明提供了确定患有湿性AMD的个体对VEGF拮抗剂治疗的反应性的方法，该方法包括：

(i)从患有湿性AMD的个体中分离样品；

(ii)测定选自针对MAPK3、OGFR、PolyRp2、染色体17、EIFA1、GPX4、SRP14、γ-突触核蛋白、Jo-1、前白蛋白、GPD2、AP1M1、ENO1-H7、PRG2、ATP合酶，GNB1-A3、TUBB3、HSP 60、ICA1、SELO、SOD、ENO2的A组抗体中的一种或几种抗体的量：以及

(iii)如果样品相较于对照值，特别是源自健康受试者和/或源自作为VEGF拮抗剂治疗的反应者和/或作为VEGF拮抗剂治疗的无反应者的AMD患者的对照值，具有升高或降低水平的A组抗体MAPK3、OGFR、PolyRp2、染色体17、EIFA1、GPX4、SRP14、γ-突触核蛋白、Jo-1、前白蛋白、GPD2、AP1M1、ENO1-H7、PRG2、ATP合酶、GNB1-A3、TUBB3、HSP 60、ICA1、SELO、SOD、ENO2抗体中的任一种，则将个体指定为VEGF拮抗剂反应者。

在一个优选实施方案中，本发明在第一方面提供了测定湿性AMD患者对VEGF拮抗剂治疗的反应性的方法，该方法包括：

(i)从患有湿性AMD的个体中分离样品；

(ii)测定选自针对MAPK3、OGFR、SRP14、ENO2、SOD、前白蛋白、Jo-1、PolyRp2、染色体17、EIFA1的抗体的亚组A-1中的抗体的量；以及

(iii)如果样品相较于对照值，特别是源自健康受试者和/或源自作为VEGF拮抗剂治疗的反应者和/或作为VEGF拮抗剂治疗的无反应者的AMD患者的对照值，具有升高或降低水平的步骤2中使用的抗体，则将个体指定为VEGF拮抗剂反应者。

在本发明的另一个实施方案中，提供了用于确定患有湿性AMD的受试者是否应该用VEGF拮抗剂治疗的方法，该方法包括：

(a)从受试者中分离样品；

(b)测定样品中选自针对MAPK3、OGFR、PolyRp2、染色体17、EIFA1、GPX4、SRP14、γ-突触核蛋白、Jo-1、前白蛋白、GPD2、AP1M1、ENO1-H7、PRG2、ATP合酶，GNB1-A3、TUBB3、HSP60、ICA1、SELO、SOD、ENO2的抗体之中的一种或几种抗体的量：以及

(c)确定受试者应该用VEGF拮抗剂治疗。

在本发明的一个优选实施方案中，提供了用于确定患有湿性AMD的受试者是否应该用VEGF拮抗剂治疗的方法，该方法包括：

(a)从受试者分离样品；

(b)测定样品中选自针对MAPK3、OGFR、SRP14、ENO2、SOD、前白蛋白、Jo-1、PolyRp2、染色体17、EIFA1in的抗体的亚组A-1之中的抗体的量；以及

(c)确定受试者应该用VEGF拮抗剂治疗。

在本发明的这些和其它实施方案中，提供了用于确定患有湿性AMD的受试者是否应该用VEGF拮抗剂治疗的方法中，当样品中一种或几种A组自身抗体的水平与对照值，特别是源自健康受试者的对照值相比，升高或降低至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、150％、200％、250％，优选25％-150％，更优选50-100％时，应当用VEGF拮抗剂治疗所述受试者。

在本发明的一些实施方案中，可使用Western印迹或免疫印迹测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、实时PCR、微阵列、侧向流动、微流体、基于珠粒的测定、质谱法来测定抗体的量。

在用于测定抗体量的本发明的一些实施方案中，结合伴侣不限于其生理抗原性结合伴侣，而且还包括例如肽，诸如整个生理多肽的片段或其的其它变体。

在本发明的一些实施方案中，包括用于确定患有湿性AMD的受试者是否应该用VEGF拮抗剂治疗的方法，该方法可用样品进行，所述样品是流体样品，诸如血液、血清、泪液、唾液、尿液、细胞样品诸如口腔细胞、眼的房水或玻璃体。

在本发明的第一方面的一些实施方案中，提供了用于确定AMD患者为抗VEGF治疗的反应者的试剂盒。

在本发明的一些实施方案中，提供了用于确定患有湿性AMD的个体是否是VEGF拮抗剂反应者的诊断试剂盒，该试剂盒包含用于测量选自针对以下物质的A组抗体中的一种或多种自身抗体的量的一种或多种试剂：MAPK3、OGFR、PolyRp2、染色体17、EIFA1、GPX4、SRP14、γ-突触核蛋白、Jo-1、前白蛋白、GPD2、AP1M1、ENO1-H7、PRG2、ATP合酶，GNB1-A3、TUBB3、HSP 60、ICA1、SELO、SOD、ENO2和使用说明书，或特别是用于测量选自亚组A-1和/或亚组A-2和/或亚组A-3的一种或多种自身抗体的量的说明书。

在另一个实施方案中，提供了用于确定患有湿性AMD的个体是否是VEGF拮抗剂反应者的诊断试剂盒，所述试剂盒包含携带眼部抗原(ocular antigen)和/或携带A组和/或B组中的任一组的一种或几种抗原的抗原携带元件。眼部抗原定义为在眼的任何组织中表达的抗原。

在一些实施方案中，抗原携带元件是微阵列载玻片诸如侧向流动测试条或微流体芯片或是其一部分。在另外的实施方案中，这种诊断试剂盒包括辅助材料，诸如分析工具和/或用于图像读取器的软件，其中该软件用于定量测量的自身免疫反应性的一个或多个步骤。在另外的实施方案中，包括用于获取体液样品的辅助材料，诸如例如印迹纸、反应物和/或反应容器，用于在将抗原携带元件与体液或反应物(用于在与抗原携带元件一起孵育之前处理体液样品或用于从在其上收集其的吸附材料中洗脱体液)孵育后检测和测量自身免疫反应性。

本发明的第二方面涉及诊断湿性和干性AMD以及基于如上所述的称为B组抗体的一组自身抗体来区分AMD疾病的这两种形式的方法。虽然干性形式更频繁且不太严重，但干性AMD患者发生更严重形式的湿性AMD的风险增加。因此，在本发明的第二方面，分析了干性和湿性AMD特有的自身免疫反应性。特别地，比较来自待测个体的样品和对照值之间的B组抗体的量，所述对照值可通过分析来自健康个体和/或来自患有干性AMD的个体和/或患有湿性AMD的个体的相同B组抗体的自身免疫反应性来获得。

在本发明的第二方面的一个实施方案中，提供了确定个体是否患有干性AMD和/或湿性AMD的方法，该方法包括：

-从受试者中分离样品；

-测定选自针对α-突触核蛋白、SELO、SPRY、GAPDH-H2、膜联蛋白-V、THAP、VTI-B、HSP10、ESD、PKC80、ACO2-C2、OGFR、PBP-I2、CAZ-C3、EIFA1、MAPK3、ENO1-H7、染色体17、乌头酸水合酶、GPX4的B组抗体之中的一种或几种抗体的量，以及

-如果所选的B组自身抗体的量相较于对照值，特别是源自健康受试者和/或源自患有干性AMD和/或患有湿性AMD的受试者的对照值有增加或减少，特别地增加或减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％，则确定所述个体患有干性和/或湿性AMD疾病。

在一个优选实施方案中，提供了用于诊断湿性和干性AMD以及区分AMD的两种形式的方法，该方法包括：

-从受试者中分离样品；

-测定针对α-突触核蛋白、SELO、SPRY、GAPDH-H2、膜联蛋白-V、THAP、VTI-B、HSP10的B组自身抗体的亚组B-1的一种或几种抗体的量；

-如果所选的B组自身抗体的量相较于对照值，特别是多个对照值而言增加或减少，特别是增加或减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％，则确定该个体患有干性和/或湿性AMD疾病。

在本发明的第三方面，提供了用于确定被诊断为患有干性AMD的患者发生湿性AMD的概率的方法。作为A组成员的自身抗体和作为B组成员的自身抗体，即作为或A组或B组成员的自身抗体和作为A组和B组两者成员的自身抗体经发现可用于预测从干性AMD转变为湿性AMD疾病的风险。

在本发明的第三方面的一个实施方案中，提供了用于确定患有干性AMD的个体有发展湿性AMD的风险的方法，该方法包括：

-从受试者中分离样品；

-测定选自作为A组或B组的成员的自身抗体中的一种或几种抗体的量，其中A组抗体针对MAPK3、OGFR、PolyRp2、染色体17、EIFA1、GPX4、SRP14、γ突触核蛋白、Jo-1、前白蛋白、GPD2、AP1M1、ENO1-H7、PRG2、ATP合酶、GNB1-A3、TUBB3、HSP 60、ICA1、SELO、SOD、ENO2，并且其中B组抗体针对α-突触核蛋白、SELO、SPRY、GAPDH-H2、膜联蛋白-V、THAP、VTI-B、HSP10、ESD、PKC80、ACO2-C2、OGFR、PBP-I2、CAZ-C3、EIFA1、MAPK3、ENO1-H7、染色体17、乌头酸水合酶、GPX4；

-如果所选抗体的量相较于对照值，特别是源自健康受试者和/或源自患有干性AMD和/或患有湿性AMD的受试者的对照值而言减少或增加，特别是减少或增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％，则确定该个体有发展湿性AMD的风险。

-从受试者中分离样品；

-确定选自作为A组和B组的优选亚组A-1和/或B-1的成员的自身抗体中的一种或几种抗体的量，

其中亚组A-1的抗体针对MAPK3、OGFR、SRP14、ENO2、SOD、前白蛋白、Jo-1、PolyRp2、染色体17、EIFA1；以及

其中亚组B-1的抗体针对α-突触核蛋白、SELO、SPRY、GAPDH-H2、膜联蛋白-V、THAP、VTI-B、HSP10；

在本发明的第三方面的这些和其它实施方案中的一些实施方案中，提供了用于确定患有干性AMD的个体有发展湿性AMD的风险的方法，该方法包括：

-从受试者中分离第一样品；

-在第一样品后约2周，或约1个月，或约2个月，或约6个月，或约12个月，或至少约12个月的时间段内从受试者中分离第二样品；

-测定来自如上所述的A组或B组或者其亚组的一种或多种选定抗体的量。

-如果第二样品相较于第一样品而言其中的所选抗体的量有减少或增加，特别是减少或增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％，则确定该个体有发展湿性AMD的风险。

附图简述

当考虑下面的详细描述时，将更好地理解本发明，并且除了上述目的外的目的将变得显而易见。本描述参考了附图，其中：

图1显示开始使用Lucentis治疗的湿性AMD患者的IgG免疫反应性的纵向分析。在开始Lucentis治疗之前和开始之后2个、3个、4个、6个和12个月采集样品。

图2：患有干性AMD和湿性AMD的患者相较于对照的免疫反应性比较。所有免疫反应性。

图3：患有干性AMD和湿性AMD的患者相较于对照的免疫反应性比较。20个最显著的反应性。

图4：患有湿性AMD的患者的免疫反应性比较。将患者分为显示视力丧失(-1)、视力无变化(0)或视力改善(1)的患者。所有免疫反应性。

图5：患有湿性AMD的患者的免疫反应性比较。将患者分为显示视力丧失(-1)、视力无变化(0)或视力改善(1)的患者。20个最显著的反应性。

图6：数据挖掘程序(C&RT和人工神经网络)的结果被用作此分析的输入。进行生存分析(Kaplan-Meier分析，存活累积比例)以评估数据挖掘程序的分类在这12个月的研究中如何强烈影响存活时间(到视力丧失的时间)。

发明详述

当用批准的VEGF拮抗剂(雷珠单抗、阿柏西普)治疗时，对于许多患有湿性AMD的患者可以获得良好的结果，这意味着视力的增益或至少视力的稳定性。然而，仍有一定比例的患者对这些批准的疗法没有反应。这些患者遭受进一步的视力丧失，并因而被称为无反应者。

如果使用VEGF拮抗剂的治疗不仅在改善而且在稳定性方面是有用且有效的，患者可被视为反应者，意味着在3次连续随访(始于3次抗VEGF注射后)后少于15个ETDRS字母(ETDRS代表早期治疗糖尿病视网膜病变研究)的视力(VA)损失。患者可以被视为获得视力并随时间保持增益的反应者。获得视力增益但不保持增益，丧失视力至不低于基线的患者也被视为反应者。反应者也被视为获得视力但不保持增益，丧失视力至比基线低不到15个ETDRS字母的患者。未获得视力增益但保持稳定，视力丧失不低于基线的患者也被视为反应者。未获得视力增益但其视力丧失与基线相比不超过15个ETDRS字母的患者也被视为反应者。

如果VEGF拮抗剂治疗没有得到基于形态学和功能参数所评估的整体临床益处，并且存在即时或晚期视力丧失，则患者可被认为是无反应者。无反应者是在连续3次随访(在3次抗VEGF注射后开始随访)中总共丧失超过15个ETDRS字母的患者。无反应者也被认为是与基线和/或基线时记录的最佳视力相比丧失超过30个ETDRS字母的患者。无反应者也被定义为其最佳矫正视力(BCVA)在logMAR评分中恶化的患者。除功能性定义外，无反应者也由眼底发现包括OCT(光学相干断层扫描)来确定。无反应者也被定义为渗出性眼底发现(色素上皮脱离、视网膜下液、黄斑水肿、出血)在治疗后增加或出现的患者，或在初始抗VEGF注射后12个月内中央视网膜厚度(CTR)增加超过100μm的患者。

已知健康个体中三分之二的血清免疫球蛋白是天然存在的自身抗体。分析了患有湿性和/或患有干性AMD的患者的自身抗体模式以及接受VEGF拮抗剂疗法的患有湿性AMD的患者的自身抗体模式。

令人惊讶地发现，相较于健康患者，患有干性或湿性AMD的患者的血清中针对A组抗体(包括MAPK3、OGFR、PolyRp2、染色体17、EIFA1、GPX4、SRP14、γ-突触核蛋白、Jo-1、前白蛋白、GPD2、AP1M1、ENO1、PRG2、ATP合酶、GNB1-A3、TUBB3、HSP60、ICA1和SELO、SOD、ENO2)的自身抗体的量显著不同。因此患者血清中的选自针对MAPK3，OGFR，PolyRp2，染色体17，EIFA1，GPX4，SRP14，γ-突触核蛋白，Jo-1，前白蛋白，GPD2，AP1M1，ENO1-H7，PRG2，ATP合酶、GNB1-A3，TUBB3，HSP 60，ICA1和SELO，SOD，ENO2的自身抗体之中的一种或多种自身抗体的量可用作工具，在开始VEGF拮抗剂疗法之前确定患有干性或湿性AMD的患者是否会对VEGF拮抗剂疗法产生反应。

还发现，在雷珠单抗疗法后视力获得增益的湿性AMD患者中，针对OGFR、γ-突触核蛋白、前白蛋白和PRG2的抗体的血清水平显著升高，而在雷珠单抗疗法后显示视力丧失的患者中，所述抗体的水平显著降低。

此外，例如在处于Lucentis治疗的12个月期间在视力改善的患者中针对PolyRp2、GNB1-A3和TUBB3的免疫反应性被下调，而在视力未改善的患者中所述免疫反应性被上调。

患有湿性AMD的患者血清中的自身抗体的可检测量随时间而变化。可以确定最佳给药方案与自身抗体水平之间的正相关性。因此当需要将VEGF拮抗剂用于患者时，选自针对MAPK3、OGFR、PolyRp2、染色体17、EIFA1、GPX4、SRP14、γ-突触核蛋白、Jo-1、前白蛋白、GPD2、AP1M1、ENO1-H7、PRG2、ATP合酶、GNB1-A3、TUBB3、HSP60、ICA1和SELO、SOD、ENO2的A组自身抗体之中的一种或几种自身抗体的量也是预测标志物。

令人惊讶的是还发现，自身抗体模式能够区分患有湿性或干性AMD的患者。特别地，选自针对α-突触核蛋白、SELO、SPRY、GAPDH-H2、膜联蛋白-V、THAP、VTI-B、HSP10、ESD、PKC80、ACO2-C2、OGFR、PBP-I2、CAZ-C3、EIFA1、MAPK3、ENO1-H7、染色体17、乌头酸水合酶、GPX4的B组自身抗体之中的一种或几种自身抗体的自身抗体水平变化。

此外，还发现选自如上定义的A组或B组自身抗体之中的一种或几种自身抗体的自身抗体水平的变化具有指示干性AMD形式向湿性AMD形式的转化的预后价值。

VEGF是一种充分表征的刺激血管生成的信号蛋白。“VEGF拮抗剂”是指能够中和、阻断、抑制、消除、减少或干扰VEGF活性(包括其与一种或多种VEGF受体的结合)的分子。可以玻璃体内(例如，通过注射)或局部(例如以滴眼液的形式)施用VEGF拮抗剂。VEGF拮抗剂包括抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF从而隔离其与一种或多种受体的结合的受体分子和衍生物、抗VEGF受体抗体和VEGF受体拮抗剂，诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂和融合蛋白。本发明还提供了非抗体型VEGF拮抗剂。

a)抗体型VEGF拮抗剂

在一个实施方案中，VEGF拮抗剂是抗体。在一个实施方案中，VEGF拮抗剂是VEGF受体的模拟物。在一个实施方案中，VEGF拮抗剂是雷珠单抗。在一个实施方案中，VEGF拮抗剂是贝伐单抗。

b)非抗体型VEGF拮抗剂

在一个实施方案中，VEGF拮抗剂是非抗体型VEGF拮抗剂。在本发明的一个方面，非抗体型VEGF拮抗剂是免疫粘附素。一种这样的免疫粘附素是阿柏西普(aflibercept)

其最近被批准用于人使用并且也被称为VEGF-trap(Holash等，PNAS USA,2002；Riely&Miller,Clinical Cancer Research,2007)。阿柏西普是用于本发明的优选非抗体型VEGF拮抗剂。阿柏西普是重组人可溶性VEGF受体融合蛋白，其由与人IgG1的Fc部分融合的人VEGF受体1和2的细胞外结构域的部分组成。其是一种二聚体糖蛋白，蛋白质分子量为97千道尔顿(kDa)，含有糖基化，构成总分子质量的额外15％，导致为115kDa的总分子量。通过在重组CHO K1细胞中表达，其可方便地作为糖蛋白产生。每个单体可具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

并且可在每个单体内的残基30-79、124-185、246-306和352-410之间，以及单体之间的残基211与211和214与214之间形成二硫键。

目前处于临床前开发阶段的另一种非抗体型VEGF拮抗剂免疫粘附素是类似于VEGF-trap的重组人可溶性VEGF受体融合蛋白，其含有来自VEGFR2/KDR的细胞外配体结合结构域3和4，以及来自VEGFR1/Flt-1的结构域2；这些结构域与人IgG Fc蛋白片段融合(Li等，Molecular Vision,2011)。该拮抗剂与同种型VEGF-A、VEGF-B和VEGF-C结合。使用两种不同的生产方法制备该分子，导致最终蛋白质上的不同糖基化模式。两种糖型称为KH902(康柏西普)和KH906。融合蛋白可具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：

MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKPFVAFGSGMESLVEATVGERVRLPAKYLGYPPPEIKWYKNGIPLESNHTIKAGHVLTIMEVSERDTGNYTVILTNPISKEKQSHVVSLVVYVPPGPGDKTHTCPLCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

并且，与VEGF-trap一样，可呈现为二聚体。该融合蛋白和相关分子在EP1767546中进行了进一步表征。

其它非抗体型VEGF拮抗剂包括具有VEGF拮抗剂活性的抗体模拟物(例如

分子、affilins、affitin、Anticalin、高亲和性多聚体(avimers)、Kunitz结构域肽和单体(monobodies))。这包括重组结合蛋白，其包含结合VEGF-A并阻止其与VEGFR-2结合的锚蛋白重复结构域。这种分子的一个实例是

MP0112。锚蛋白结合结构域可具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：

GSDLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNTADSTGWTPLHLAVPWGHLEIVEVLLKYGADVNAKDFQGWTPLHLAAAIGHQEIVEVLLKNGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQKAA

在WO2010/060748和WO2011/135067中更详细地描述了重组结合蛋白，其包含结合VEGF-A并阻止其与VEGFR-2结合的锚蛋白重复结构域。

具有VEGF拮抗剂活性的其它特定抗体模拟物是40kD的聚乙二醇化的anticalinPRS-050和单体血管生成素(angiocept)(CT-322)。

可以修饰非抗体型VEGF拮抗剂以进一步改善其药代动力学特性或生物利用度。例如，可以化学修饰(例如，聚乙二醇化)非抗体型VEGF拮抗剂以延长其体内半衰期。或者或另外，其可通过糖基化或添加不存在于VEGF拮抗剂所源自的天然蛋白质的蛋白质序列中的其它糖基化位点来修饰。

通过添加或缺失氨基酸可产生具有改善的所需应用特征的上述VEGF拮抗剂的变体。通常，这些氨基酸序列变体将具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少60％，至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％，包括例如80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％和100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。关于该序列的同一性或同源性在本文中定义为在对齐序列和引入缺口(如果需要的话)以实现最大百分比序列同一性并且不将任何保守取代视为序列同一性的部分后，候选序列中与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3相同的氨基酸残基的百分比。

序列同一性可通过标准方法确定，所述标准方法通常用于比较两种多肽的氨基酸位置中的相似性。使用诸如BLAST或FASTA的计算机程序，对齐两个多肽以使它们各自的氨基酸(沿着一个或两个序列的全长或沿着一个或两个序列的预定部分)最佳匹配。该程序提供默认的开口罚分和默认的缺口罚分，以及评分矩阵诸如PAM 250[标准评分矩阵；参见Dayhoff等，于Atlas of Protein Sequence and Structure，第5卷，增刊3(1978)中]可与计算机程序结合使用。例如，百分比同一性因而可计算为：相同匹配的总数乘以100，然后除以匹配范围内较长序列的长度和引入较长序列以对齐两个序列的缺口数之和。

自身抗体模式(来自患有AMD的个体的样品中一定量的抗体的存在或不存在)可以单独地或组合地用作生物标志物以预测该个体对VEGF拮抗剂治疗的反应性。可以在来自目标个体的样品中确定这些生物标志物的存在。样品可以是任何样品，包括但不限于流体样品诸如血液、血清、泪液、唾液、尿液、细胞样品诸如口腔细胞、房水或眼睛的玻璃体。

如本文中所用，“预测”表示本文所述的方法提供信息以使医疗保健提供者能够确定患有湿性AMD的个体会对VEGF拮抗剂治疗(抗VEGF疗法)起反应的可能性。在目标样品中的一种或多种相关生物标记物的阳性测定后，将向个体施用VEGF拮抗剂。

为了测定自身抗体的水平，可使用本领域的任何已知方法。定量自身抗体含量的方法包括但不限于标准免疫分析技术，诸如Western印迹或免疫印迹测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、实时PCR、微阵列、侧向流动、微流体测定、基于珠粒的检测、非靶向蛋白质组学(涉及例如质量分析仪诸如离子阱检测、傅立叶变换-离子回旋共振、飞行时间(TOF)质谱)、靶向蛋白质组学(涉及例如利用三重四极杆质谱(TQMS)、免疫亲和质谱、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)、基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI)的选定反应监测(SRM)的使用)或其它抗体芯片技术。

本发明不受用于确定自身抗体的量的方法的类型限制。

通过使用本发明的方法，如果样品中选自针对MAPK3、OGFR、PolyRp2、染色体17、EIFA1、GPX4、SRP14、γ-突触核蛋白、Jo-1、前白蛋白、GPD2、AP1M1、ENO1-H7、PRG2、ATP合成酶、GNB1-A3、TUBB3、HSP 60、ICA1、SELO、SOD、ENO2的抗体之中的A组自身抗体中的一种或几种的量与对照(健康个体)相比增加或减少至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、150％、200％、250％，优选25％-150％，更优选50-100％，则将个体分类为VEGF拮抗剂反应者。

通过使用本发明的方法，如果在约2周、约1个月、约2个月、约6个月、约12个月、至少约12个月的一段时间内获取的两个样品中检测和定量的选自A组抗体的抗体中的一种或几种自身抗体的量或所述样品中选自B组抗体的抗体中的一种或几种自身抗体的量与对照(健康个体)相比减少至少20％、30％、40％、50％、60％、75％、优选至少30％，更优选至少50％，则患有干性AMD的个体被分类为有由干性AMD向湿性AMD转变的风险，所述A组抗体包含针对MAPK3、OGFR、PolyRp2、染色体17、EIFA1、GPX4、SRP14、γ-突触核蛋白、Jo-1、前白蛋白、GPD2、AP1M1、ENO1-H7、PRG2、ATP合成酶、GNB1-A3、TUBB3、HSP 60、ICA1、SELO、SOD、ENO2的抗体，所述B组抗体包含针对α-突触核蛋白、SELO、SPRY、GAPDH-H2、膜联蛋白-V、THAP、VTI-B、HSP10、ESD、PKC80、ACO2-C2、OGFR、PBP-I2、CAZ-C3、EIFA1、MAPK3、ENO1-H7、染色体17、乌头酸水合酶、GPX4的抗体。

本文所述的方法可用作诊断测定法，以鉴定可能对VEGF拮抗剂有反应的患有湿性AMD的受试者。本发明的方法可用于确定受试者是否应施用VEGF拮抗剂以降低湿性AMD的严重性。本文描述的方法还可用作预后测定，以鉴定有发展湿性AMD的风险并且将受益于接受VEGF拮抗剂的患有干性AMD的受试者。预后测定可用于预测性目的或预防性目的，以治疗有发展湿性AMD的风险的个体。

本发明还包括用于测定针对MAPK3、OGFR、PolyRp2、染色体17、EIFA1、GPX4、SRP14、γ-突触核蛋白、Jo-1、前白蛋白、GPD2、AP1M1、ENO1-H7、PRG2、ATP合酶、GNB1-A3、TUBB3、HSP60、ICA1和SELO、SOD、ENO2的一种或几种自身抗体水平的试剂盒。

用于进行本发明的方法

I.干性与湿性AMD中的免疫反应性的比较

通过质谱(MS)方法分析了“湿”AMD患者血清中针对视网膜抗原的自身抗体模式，并将其与健康对照受试者和具有“干性”AMD的患者进行比较。已知健康个体中2/3的血清免疫球蛋白是天然存在的自身抗体，因此甚至在健康人中也存在复杂的特征谱，并且已从几种其它疾病例如青光眼或Sicca综合征中了解到循环自身抗体的疾病特异性变化。在使用基于MS的方法和高密度Protagen抗原微阵列成功地从头筛选免疫反应性后，构建了含有61种抗原的定制抗原微阵列(表2)。每个微阵列以一式三份含有每种抗原。根据遵循所有纳入和排除标准的方案将患者纳入研究。

表1：描述性统计的细分表。CTRL＝健康志愿者，17＝干性AMD，18＝开始新的抗VEGF治疗的湿性AMD，19＝继续抗VEGF治疗的湿性AMD

在329个样品中进行针对这61种抗原的IgG的免疫反应性的分析。对于所有样品，可发现复杂的免疫反应性模式。

表2：定制微阵列上的抗原列表：

在患有干性AMD、湿性AMD的患者中分析免疫反应性，并将其与健康对照进行比较。表3显示了ANOVA分析的结果及其对应于最显著抗原的相应p值。

干性和湿性AMD患者的免疫反应性彼此之间以及与对照之间存在高度显著的差异。虽然作为天然自身免疫力的一部分，在健康受试者中也可显示针对测试抗原的复杂抗体模式，两组AMD中的模式都发生了变化。最明显改变的反应性之一是抗α-突触核蛋白。从其它神经退行性疾病中已了解了α-突触核蛋白。其它是热休克蛋白(例如HSP 10)以及还有膜联蛋白V，其在凋亡过程中起主要作用。其它一些在湿性和干性AMD中是对立调节的，诸如VTI-B、PBP-12和OGFR。途径比较分析揭示了特别地在免疫疾病中发现的蛋白质功能，尤其是在柠檬酸循环中起作用的乌头酸酶2，还有烯醇酶1、膜联蛋白V、丝裂原活化蛋白激酶C(MAPK3)和α-突触核蛋白。α-突触核蛋白内的突变例如与帕金森病、阿尔茨海默病和几种其它神经退行性疾病相关。膜联蛋白5是一种磷脂酶A2和蛋白激酶C抑制蛋白，其具有钙通道活性，并且在细胞信号传导、炎症、生长和分化中具有潜在作用。除了免疫标志物以外，可以观察到在炎症中起主要作用的生物功能，如例如，α-突触核蛋白、乌头酸酶2、烯醇化酶1和GADPH(甘油醛-磷酸脱氢酶)，其在细胞凋亡过程中起作用并且还已知在阿尔茨海默病中起作用。有人提出膜联蛋白V具有抗细胞凋亡和抗炎功能，在我们的研究中免疫反应性的比较揭示了干性AMD组中具有更高的反应性。可以清楚地证明，在湿性和干性AMD组均存在巨大的免疫反应性差异。

表3：湿性AMD、干性AMD患者中的和与对照相比的IgG免疫反应性的ANOVA(方差分析)。该表揭示了最重要的抗原(根据p值)。(AV＝平均值；SE＝标准误差；p＝p值)

II.湿性AMD中IgG免疫反应性的纵向分析

为了回答向身体注射基本上是外来蛋白质的Lucentis是否能够引起显著免疫反应的问题，进行IgG免疫反应性的纵向分析。图1显示湿性AMD患者的IgG模式分析。在开始lucentis治疗之前和之后2、3、4、6和12个月采集样品。表4显示在开始lucentis治疗后最显著的抗体反应性变化。总之，在lucentis治疗后未观察到免疫反应性的明显增加。对于MAPK3显示了最显著的变化。单一抗原在单因素ANOVA中均未显示显著的变化。然而，马哈拉诺比斯距离可在同时采用完整抗体/抗原模式的多因素分析中，尤其是在较晚的时间点之间揭示几个显著差异。此外，在多变量规范根分析(multivariate canonical rootanalysis)中未检测到组间差异。

表4：开始lucentis治疗的湿性AMD患者中12个月的IgG免疫反应性的纵向分析。Wilks'λ：在0(完全区别)至1(无区别)的范围内的值，部分λ(Partialλ)：与相应变量对模型的区分能力的独特贡献相关的Wilks'λ。

	Wilks'-λ	部分-λ	p-值
				TAU-n	0,793690	0,946549	0,143135
ACO2-C2-n	0,802293	0,936398	0,084057
				MAPK3-n	0,810685	0,926705	0,049457
ATP合酶-n	0,788763	0,952462	0,192688
				GPD2-n	0,784479	0,957663	0,248013
AP1M1-n	0,777703	0,966006	0,364065

III.湿性AMD中IgG免疫反应性的分析：治疗成功的影响

比较了取决于治疗成功的患有湿性AMD的患者的免疫反应性。根据视力(logmar)，将患者分为在12个月的lucentis治疗期间视力丧失(-1)、视力无改变(0)或视力改善(1)的患者。在来自在Lucentis治疗期间表现出视力改善的患者与无视力改善的患者的免疫反应性之间可观察到非常显著的变化。图4和图5比较了IgG反应性并揭示了最显著的变化。此外，ANOVA可以证明大量抗原的高度显著变化(表5和表6)。多变量规范根分析可揭示群体之间的良好差异。

表5：取决于治疗的湿性AMD患者的免疫反应性的ANOVA。将患者分为表现出视力丧失(-1)、视力无变化(0)或视力改善(1)的患者。(AV＝平均值，SE＝标准误差，p＝p值)

表6：取决于治疗的湿性AMD患者的免疫反应性的ANOVA。将患者分为表现出视力丧失(-1)、视力无变化(0)或视力改善(1)的患者。(AV＝平均值，SE＝标准误差，p＝p值)

另外，进行一般回归模型(GRM)以分析是否存在取决于治疗成功的对抗体模式的纵向效应。可以检测到几种显示出显著纵向效应的抗原。

因此，免疫反应性可以具有预测价值，以确定lucentis在AMD患者中的治疗效果。涉及的是抗原诸如MAPK3、γ-突触核蛋白、不同的热休克蛋白和许多其它抗原。几种免疫反应性在相反的方向上受到调节。例如。针对OGFR、γ-突触核蛋白、前白蛋白和PRG2的免疫反应性在于12个月的lucentis治疗期间视力得以改善的患者中被上调，而在所述治疗期间视力未得以改善的患者中被下调。此外，例如，针对PolyRp2、GNB1-A3和TUBB3的免疫反应性在于12个月的lucentis治疗期间视力得以改善的患者中被下调，而在所述治疗期间视力未得以改善的患者中被上调。此外，例如一些热休克蛋白在针对它们的IgG免疫反应性方面显示巨大的差异。

途径分析显示9种蛋白质(即，ATP合酶、真核翻译起始因子4A1(EIFA1)、烯醇化酶1、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、HSP60、MAPK3、阿片类生长因子受体(OGFR)、γ-突触核蛋白和β微管蛋白(TUBB3))与细胞生长和增殖相关。针对OGFR的免疫反应性在于lucentis疗法下视力得以改善的患者中被上调，而在视力丧失的情况下观察到下调。

IV.免疫反应性对于治疗成功的预测价值

根据视力(log mar)，将患者分为在12个月的lucentis治疗期间视力丧失(-1)、视力无改变(0)或视力改善(1)的患者。在来自在Lucentis治疗期间表现出视力改善的患者与在Lucentis治疗期间未表现出视力改善的患者的那些免疫反应性之间可以观察到非常显著的变化。如果免疫反应性可能对lucentis治疗具有预测价值，那么数据挖掘模型可用于仅基于其抗体模式来区分那些患者。

进行C&RT模型(一般分类/回归树模型)。此外，训练人工神经网络以识别与成功的lucentis治疗相关的那些抗体模式。训练后，这些模式可以灵敏度和特异度约为95％被识别。尽管如此，重要的是要考虑到这项试点研究中的患者数量很少，需要在更大的群组中进行进一步的验证研究，以详细说明预测价值。最大区分能力归因于例如OGFR、SPR14、前白蛋白等，其在前面的分析中也是重要的免疫反应性。

V.免疫反应性对视力丧失过程的预测价值

将数据挖掘程序(C&RT和人工神经网络)的结果用作该分析的输入。进行生存分析(Kaplan-Meier分析，累积比例存活)以评估数据挖掘程序的分类在这12个月的研究中如何强烈地影响存活时间(至视力丧失的时间)。

Kaplan-Meier曲线显示了基于其抗体模式的该先验分类对lucentis治疗随时间的结果的巨大影响。

被归类为良好的lucentis反应者的患者在生存分析中几乎没有视力丧失，而另一组(不良lucentis反应者)显示出强烈的视力丧失。

VI.其它临床参数对免疫反应性的影响

进行方差分析的一个组成部分，以评估参数视力改变、视网膜出血、黄斑水肿和脉络膜新生血管化(CNV)对免疫反应性的效应。这些临床参数对针对每种抗原的免疫反应性水平没有非常明显的单一效应。对于所有抗原，对视力、视网膜出血、黄斑水肿或CNV的变化的效应非常小并且不显著。然而，这些参数(例如1*2*3*4)之间的相互作用可对抗体模式具有更大的影响。

质谱分析

抗原-抗体特征谱的分析可以使用最近开发的蛋白质组学技术:结合基于SELDI-TOF(＝表面增强激光解吸/电离-飞行时间)质谱(MS)或Maldi-TOF或ESI-MSMS的ProteinChip***的蛋白质G Dynabeads以可靠和灵敏的方式进行。磁珠被设计用来通过细胞壁组分捕获免疫球蛋白，在与各种体液(诸如血清)一起孵育期间结合多种IgG抗体。在随后与匀浆化抗原一起孵育期间，有可能通过与抗体的次级结合来捕获相关抗原。在洗脱后，可使用具有不同分离芯片表面(阳离子和阴离子交换剂、疏水表面和金属离子亲和色谱表面)的ProteinChips通过SELDI-TOF MS分析抗原。根据研究组，可以统计分析和比较得到的质谱，以获得显著更高或更低的抗原-抗体-反应性峰。使用高灵敏度的MALDI-TOF/TOF(＝基质辅助激光解吸/电离-飞行时间)MS进行潜在生物标志物的鉴定。

Protagen阵列

为了分析抗体模式和鉴定潜在的自身抗体生物标志物候选物，我们选择了高灵敏度的抗原微阵列，其为该目标领域中一种有前景的方法。该方法已成功用于发现靶向***癌特异性生物标志物的自身抗体，以及筛选患有多发性硬化或自身免疫性肝炎的不同病理亚型的患者的血清中的自身反应性抗体。为了筛选研究血清中的自身抗体反应性，我们使用先进的高密度微阵列方法。将用lucentis治疗前的患者(n＝10)血清与用lucentis治疗后的相同患者(n＝10)的血清进行比较。对于每个组，产生两个血清库(每个库10份血清)，将其在硝酸纤维素包被的载玻片上孵育，所述载玻片具有来自如下所述的

文库(

Protagen,Dortmund,Germany)的3800份固定化的随机选择的人蛋白质。在轨道振荡器(Micromix 5,DPC,Los Angeles,CA,USA)上于4℃进行孵育和洗涤步骤。用单垫FAST-框架杂交室(Whatman,Maidstone,UK)覆盖载玻片，并用含有0.5％BSA的PBS封闭1小时。然后用含有0.5％Tween20的PBS(PBS-T)洗涤载玻片3次，每次10分钟。将患者的血清在PBS中以1:375稀释，并在Protagen-Slides上孵育过夜。用PBS-T进行3次洗涤步骤(每次10分钟)后，在黑暗中用荧光标记的二抗(在PBS中以1:500稀释的山羊抗人IgG，Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,USA)处理载玻片1小时。在3次最终洗涤步骤(2次用PBS-T，1次用HPLC级超纯水，每次10分钟)后，将载玻片真空干燥。通过使用高灵敏度激光微阵列扫描仪，生成16-bit TIFF(标记信息文件格式)。用ImaGene软件(ImaGene 5.5,Biodiscovery,CA,USA)定量斑点强度。在使用Protagen提供的算法针对内部标准将数据标准化后，计算并比较组差异。为了使所得的抗原-抗体复合物可视化，用第二荧光标记的抗体(Dylight 650)处理载玻片，然后进行共聚焦激光扫描。在数据标准化后，比较斑点强度，并分析了组间差异。

分析

将血液样品以1000g离心10分钟，将上清液在-80℃下储存以用于后续分析。将磁性蛋白G珠粒(Dynal,Oslo,Norway)与患者的血清一起孵育。在几次洗涤步骤后，使用乙醇胺将患者的抗体与珠粒共价结合。将珠粒-抗体复合物与匀浆化的视网膜抗原一起孵育。洗脱结合于患者自身抗体的抗原，将其浓缩，并通过具有两个不同的色谱表面(CM10阳离子交换和H50反相)的SELDI飞行时间(TOF)MSProteinChips进行分析。将样品在PBS-IIcProteinChip读数器上用SEL-TOF MS ProteinChip***(Biorad,Hercules)进行测量。将原始数据传输到CiphergenExpress 2.1数据库软件(Biorad,Hercules)以进行处理和分析。最近开发的蛋白质组学软件项目(PSP)将使用不同的统计方法(经训练的神经元网络、树算法和多变量统计)对光谱进行统计评估，以保证观察研究组的抗体模式的高特异度和灵敏度。PSP还将使用上述算法搜索指导基于统计的分析的高度重要的生物标志物。生物标志物的鉴定将通过MALDI-TOF/TOF MS分析完成。我们的目标是为“湿”AMD产生至少8种高度特异性的生物标志物(显著性水平α＝0.05，功效(1-β)＝90％)。

样本容量的统计计算是在与University in Mainz的Institute of MedicalBiometry,Epidemiology and Informatics(IMBEI)(IMBEI)密切合作下进行的，并且也是基于以往研究的经验：计算的病例数(25)足以检测对血清抗体特征谱的影响，给定的显著性水平α＝0.05且功效(1-β)＝90％。统计分析将证明血清内针对视网膜抗原的抗体组成是否发生变化。与对照组的比较将显示修饰是否有益，即血清组成是否变得与健康受试者的血清更相似。使用MALDI-TOF/TOFMS(Bruker)进行的后续生物标志物鉴定可揭示针对全身性效应的有价值的提示。

电泳分离后，将蛋白质进行胰蛋白酶消化，在基质上结晶，并在MALDI靶上进行分析。将获得的肽质量指纹数据输出到BioTools中并用于内部Mascot数据库搜索(SwissProt和NCBI)，从而导致蛋白质鉴定。

抗原微阵列

在本研究中，我们使用购自Sigma-Aldrich(Germany)和BioMol(Hamburg,Germany)的高度纯化的蛋白质作为抗原。抗原选择基于我们小组先前在青光眼患者中进行的自身抗原鉴定以及查阅与自身免疫疾病中自身抗原鉴定相关的文献。用任选地含有1.5％海藻糖的PBS缓冲液将抗原稀释至1μg/μl，以获得最佳印刷条件。用基于压电分配的非接触印刷技术(sciFLEXARRAYER S3,Scienion,Berlin,Germany)和常用的基于pin的接触印刷技术(OmniGrid100,Digilab Genomic Solutions,Ann Arbor,USA)两者进行抗原点样(spotting of antigen)。就斑点形态和斑点间的变化性比较评估结果。为了印刷整套研究微阵列，使用基于压电的点样技术。将每种抗原以一式三份点样到硝酸纤维素-载玻片(Oncyte，硝酸纤维素16多垫载玻片，Grace Bio-Labs,Bend,USA)上。作为阳性和阴性对照，我们使用小鼠抗人IgG/A/M或人IgG(10μg/μl)和点样缓冲液。点样过程在室温和30％的湿度下进行。通过在完全相同的位置上3次点样330μl，将大约1nl的每种抗原稀释液施加到硝酸纤维素表面上。使用sci-Drop-VOLUME和autodrop-检测软件(Scienion,Berlin,Germany)在每种抗原的点样过程之前和之后监测点样体积的准确性和液滴的正确定位。

孵育和洗涤步骤在4℃下于轨道振荡器(Titramax 100,Heidolph,Schwabach,Germany)上进行。用16-垫FAST框架杂交室(Whatmann,Maidstone,UK)覆盖载玻片，并用含有4％BSA的PBS或Super G阻断缓冲液(Grace Biolabs)封闭1小时。然后用含有0.5％Tween(PBS-T)的PBS洗涤载玻片3次。将患者血清在PBS中以1:250稀释，并在PBS中以1:10的比例稀释房水。将100-120μl的这些稀释液在制备的抗原载玻片上随机孵育过夜。在用PBS-T进行几次洗涤步骤后，将载玻片与荧光Cy-5标记的二抗(在PBS-T中以1:500稀释的山羊抗人IgG，Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,USA)一起在黑暗处孵育1小时。用PBS-T进行2次洗涤步骤，然后用HPLC级水进行两次最终洗涤步骤。使用微阵列扫描仪(Affymetrix 428 TM阵列扫描仪，High Wycombe,UK)在扫描前将所有微阵列空气干燥。使用Spotfinder 3.1.1软件(TM4,Dana-Faber Cancer Institute,Boston,USA)或ImaGene5软件分析载玻片的生成的16-bit TIFF图像(标记信息文件格式)。按照公式：点强度＝平均强度SP-((sumbkg-sumtop5bkg)/(像素数-像素数top 5bkg))进行背景扣除，其中SP代表任意点，bkg代表对应背景，top5bkg代表前5％的背景像素。如下计算变异系数(CV)：CV＝SDSP3/meanSPX...SPn，其中SDSP3表示一个样品的一种抗原的三个重复斑点间的标准偏差，并且meanSPX...SPn是所有斑点强度的平均值。

实施例：

如上所述，在研究群组中进行分析之前进行人工神经网络。如上所述分析自身抗体反应性。

将这些抗体反应性的强度值标准化，并计算强度值与参考值的百分比差异的计算。

基于来自人工神经网络的算法，针对单个患者执行个体评分，所述个体评分在该分析之前未包括在人工神经网络的训练(计算)中。

在1μl血清中分析患者#22928(来自研究)的不同自身免疫反应性，并将其用作在研究之前训练的数据挖掘算法的输入。

对于该个体患者，将置信水平计算为0.0087(-1：视力丧失)；0.156(0：无视力改变)和0.835(1：视力增益)。因此，基于自身反应性，患者将以最高概率对抗VEGF治疗作出反应。

尽管显示并描述了本发明的当前优选实施方式，但应明确地理解，本发明不限于此，而是可以在所附权利要求的范围内以其它方式进行各种实施和实践。

序列表

<110> Grus Franz

Korb Christina

Pfeiffer Norbert

<120> 可用于治疗湿性AMD的预测性标志物

<130> P173267PC00

<150> US62/300,952

<151> 2016-02-29

<160> 3

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 431

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<220>

<223> 重组序列

<400> 1

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

85 90 95

Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile

100 105 110

Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr

115 120 125

Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys

130 135 140

His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly

145 150 155 160

Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr

165 170 175

Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met

180 185 190

Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr

195 200 205

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

210 215 220

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

225 230 235 240

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

245 250 255

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

260 265 270

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

275 280 285

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

290 295 300

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

305 310 315 320

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

325 330 335

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

340 345 350

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

355 360 365

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

370 375 380

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

385 390 395 400

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

405 410 415

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

420 425 430

<210> 2

<211> 552

<212> PRT

<213> 人

<220>

<223> 重组序列

<400> 2

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu

20 25 30

Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu

35 40 45

Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu

50 55 60

Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile

65 70 75 80

Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu

85 90 95

Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys

100 105 110

Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val

115 120 125

Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val

130 135 140

Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn

145 150 155 160

Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg

165 170 175

Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr

180 185 190

Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys

195 200 205

Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg

210 215 220

Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu

225 230 235 240

Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Leu Pro Ala Lys Tyr Leu

245 250 255

Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro Leu

260 265 270

Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu

275 280 285

Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro

290 295 300

Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr Val

305 310 315 320

Pro Pro Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala

325 330 335

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

340 345 350

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

355 360 365

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

370 375 380

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

385 390 395 400

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

405 410 415

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

420 425 430

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

485 490 495

Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

500 505 510

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

515 520 525

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

530 535 540

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

545 550

<210> 3

<211> 126

<212> PRT

<213> 人

<220>

<223> 重组序列

<400> 3

Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln

1 5 10 15

Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Thr

20 25 30

Ala Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Val Pro Trp Gly

35 40 45

His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn

50 55 60

Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Ile

65 70 75 80

Gly His Gln Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val

85 90 95

Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp

100 105 110

Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Ala Ala

115 120 125

Claims

1.用于测定针对OGFR的自身抗体的量的试剂以及任选地选自针对MAPK3、PolyRp2、染色体17、EIFA1、GPX4、SRP14、γ-突触核蛋白、Jo-1、前白蛋白、GPD2、AP1M1、ENO1-H7、PRG2、ATP合酶、GNB1-A3、TUBB3、HSP 60、ICA1、SELO、SOD、ENO2的A组抗体中的一种或几种另外的自身抗体的量的试剂在制备用于预测患有湿性AMD的个体对VEGF拮抗剂治疗的反应性的制剂中的用途，其中所述预测包括：

(i)提供来自患有湿性AMD的个体的样品；

(ii)采用所述试剂测定针对OGFR的自身抗体的量，以及任选地选自针对MAPK3、PolyRp2、染色体17、EIFA1、GPX4、SRP14、γ-突触核蛋白、Jo-1、前白蛋白、GPD2、AP1M1、ENO1-H7、PRG2、ATP合酶、GNB1-A3、TUBB3、HSP 60、ICA1、SELO、SOD、ENO2的A组抗体中的一种或几种另外的自身抗体的量；以及

(iii)如果所述样品相较于对照具有增加或减少量的如(ii)中所述抗体，则将所述个体分类为VEGF拮抗剂响应者，其中所述样品中抗体的水平增加或减少至少10％。

2.根据权利要求1所述的用途，其中在步骤(ii)中测定针对OGFR的自身抗体的量，以及任选地选自针对MAPK3、SRP14、ENO2、SOD、前白蛋白、Jo-1、PolyRp2、染色体17、EIFA1的A组抗体的亚组A-1中的一种或几种另外的抗体的量。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述样品中抗体的水平相较于源自健康个体的对照值增加或减少25％-150％。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述样品中抗体的水平相较于源自健康个体的对照值增加或减少50-100％。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述样品中抗体的水平相较于源自健康个体的对照值增加或减少至少20％、30％、40％、50％、100％、150％、200％或250％。

6.权利要求1-3中任一项所述的用途，其中使用Wes tern印迹或免疫印迹测定、酶联免疫吸附测定、放射免疫测定、实时PCR、微阵列、侧向流动、微流体、基于珠粒的测定、质谱法来测定抗体的量。

7.权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述样品是流体样品、细胞样品或眼的玻璃体。

8.权利要求7所述的用途，其中所述样品是血液、血清、泪液、唾液、尿液或房水。

9.权利要求7所述的用途，其中所述样品是口腔细胞。

10.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中步骤(ii)包括测定针对OGFR的自身抗体的量以及选自针对MAPK3、PolyRp2、染色体17、EIFA1、GPX4、SRP14、γ-突触核蛋白、Jo-1、前白蛋白、GPD2、AP1M1、ENO1-H7的抗体中的一种或几种抗体的量。

11.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中步骤(ii)包括测定针对OGFR的自身抗体的量以及选自针对PolyRp2、γ-突触核蛋白、前白蛋白、PRG2、GNB1-A3、TUBB3的抗体中的一种或几种抗体的量。

12.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中步骤(ii)包括测定针对OGFR的自身抗体的量以及选自针对SPR14和前白蛋白的抗体中的一种或两种抗体的量。

13.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中步骤(ii)包括确定几种选定抗体的量。

14.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中用于测量一种或几种自身抗体的量的试剂包含携带眼部抗原的抗原携带元件。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述抗原携带元件是微阵列载玻片或是其一部分。