KR101424217B1 - 노년 황반변성의 진단, 치료 및 예방용 조성물 및 노년 황반변성에 대한 정보를 얻기 위한 방법 - Google Patents

노년 황반변성의 진단, 치료 및 예방용 조성물 및 노년 황반변성에 대한 정보를 얻기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 노년 황반변성의 진단 및 치료를 위한 단백질 바이오마커에 관한 것이다.

Description

노년 황반변성의 진단, 치료 및 예방용 조성물 및 노년 황반변성에 대한 정보를 얻기 위한 방법{Composition for the diagnosis, therapy and prophylaxis of age-realted macular deteneration and method for obtaining information on age-realted macular deteneration}
본 발명은 노년 황반변성의 진단 및 치료를 위한 단백질 바이오마커에 관한 것이다.
이미 우리나라뿐만 아니라 세계인들의 평균 수명은 80세를 넘어선 고령화 시대에 살고 있다. 우리나라의 경우 특히 급격한 평균수명의 증가와 출산율의 저하 등으로 인하여 세계에서 가장 빠른 속도로 고령화가 진행중이다. 평균 수명이 늘어난 만큼 건강한 삶을 지속하기 위해서는 노화와 외부환경에 의해 발병하는 질병의 치료가 매우 중요하다. 노령화에 의한 가장 흔하면서 대표적 질환이 눈과 관련된 질환이다. 노화에 의한 질환이라 여겨졌던 안과 질환은 변화된 환경적 요인에 의해 발병 연령이 낮아지고 있고 발병률 또한 높아지고 있다. 이미 서구에서 50세 이상 성인의 실명 원인 질환 중 1위인 노년 황반변성은 우리나라에서도 급속히 발생율이 증가하고 있으며, 유병율이 높다.
노년 황반변성 (age-related macular degeneration, AMD)은 50대 이상의 성인에서, 망막과 망막색소상피, 맥락막혈관 (choriocapillaris)이 진행성, 다인자성으로 변성 (degeneration), 위축 (atrophy) 되는 질환이다. AMD는 이미 서구에서는 당뇨망막병증, 녹내장을 제치고 50세 이상 어른의 실명 원인 질환 중 1위를 차지할 만큼 중요한 병이다. 미국에서는 현재 8백만 명 이상이 이 질병의 보다 흔한 형태인 비혈관성 또는 위축성 노년황반변성 (dry AMD)을 가진 것으로 보고 되었고, 매년 3백만 명 이상이 이 질병으로 시력을 잃고 있다. 우리나라에서도 식생활의 서구화와 환경요인, 평균수명의 연장에 따라 급속히 발생율이 증가하고 있다. 현재 65세 이상 인구 약 5백만 명의 5%인 25만명이 노년 황반변성을 앓고 있는 것으로 추정된다. 이러한 노인성 질환은 의료비 부담이라는 경제적 문제 뿐만 아니라,“삶의 질”의 저하라는 커다란 사회적 문제로 부각될 가능성이 있다. 그러므로, 노년황반변성의 조기진단 및 효율적 치료를 위한 연구가 절실히 필요하다.
그러나, AMD의 발생기전은 다인자성이고, 부분적으로만 밝혀져 있다. 유전적 소인 이외에, 환경오염, (과도한) 광선 노출, 산화 스트레스 등 유해 환경이 축적되어가는 것과의 연관성이 보고되었으나, 구체적인 메커니즘은 아직 완전히 알려지지 않았다.
현재 노년 황반변성 환자의 치료 현황은 다음과 같다.
습성 노년 황반 변성인 맥락막 신생혈관 (choroidal neovascularization, CNV)의 치료는 크게 파괴적 치료(destructive therapy)[레이저광응고술, 광역학요법, 외과적수술]와 경로(pathway)-기반(based) 치료(therapy)[항혈관내피세포성장인자억제제, 항-혈관내피세포 성장인자(anti-vascular endothelial growth factor)] 나뉘어진다.
그러나, 현재까지 상기의 어떤 방법도 심각한 시력 손실을 늦추거나 다소의 시력 개선을 가져올 뿐, 근본적인 치료가 되지는 못하고 있다. 특히, 이러한 치료들은 혈관 신생성 노년 황반변성[습성 노년황반변성, 습성(wet) AMD, 또는 신생혈관성(neovascular) AMD] 치료에 국한되고 있으며, AMD 환자의 70-80 %를 차지하는 비혈관 신생성 노년 황반변성인 위축성 변성[건성 노년 황반변성, 건성(dry) AMD, 지리학상 위축(geographic atrophy)]의 치료는 거의 전무한 실정이다.
현재 습성 노년 황반변성의 치료로 제한적인 시력 호전 효과가 입증된 것은 anti-VEGF의 반복적 유리체강내 주사가 유일하다. 이는 습성 노년 황반변성의 맥락막 신생혈관 (choroidal neovascularization, CNV)의 혈관 생성 싸이토카인인 혈관내피세포성장인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF)를 타겟팅하는 치료이다. 그러나, anti-VEGF 치료를 받은 환자의 1/3에서만 제한적인 시력 호전이 입증되었고, 치료받은 환자의 1/6은 법적 실명상태로 진행한다. 또한, 정상성인 망막에 존재하는 VEGF를 지속적으로 억제함으로써 올 수 있는 망막 독성 등의 안전성 문제도 제기되고 있다. 이 치료는 유리체강내 약물의 짧은 반감기로 인하여 자주 반복 주사해야하고, 반복주사함에 따라 유리체출혈, 망막박리, 안내염 같은 합병증 발생 가능성이 증가한다. VEGF는 강력한 혈관확장제 역할을 하기 때문에 심장의 관상동맥의 이완과 혈액 순환을 유지시키는 역할을 한다. AMD 환자들이 고령이기 때문에 심혈관 질환의 위험이 높은 군들이므로 심각한 부작용 위험성도 있다. 따라서 VEGF 이외에 AMD 특이 분자 또는 단백질 마커를 찾아내고 이를 타겟팅하는 물질의 개발이 필요하다.
본 발명은 위에서 언급한 노년 황반변성의 조기진단 및 효율적 치료를 프로테오믹스 기법을 도입하여 바이오 마커를 발굴하는 시스템이다.
몇몇 안내 질환, 특히 전안부의 염증질환에서 방수의 단백질, 사이토카인 성분의 변화를 보고하였으나, 습성 노년 황반변성 환자들의 전체 방수 단백질의 변화는 이전에 조사된 적이 없다. 이전 치료의 기왕력이 없는 습성 노년 황반변성 환자들과 이들과 나이, 성별이 일치하는 백내장 수술 환자들 방수의 전체 단백질을 프로테오믹스 기법으로 분석한다.
특히 여기에는 망막과 망막 색소상피가 산화 스트레스를 포함한 스트레스 조건하에서 일종의 '적응' 및 내인성 신경보호 기전으로 발달시켰을 가능성이 있는 물질들을 프로테오믹스 기법을 통해 발굴하여, 현재까지 치료가 거의 전무한 건성 노년 황반변성의 표적치료와 치료반응 모니터링에서 유용하게 이용하고자 함이 본 발명에서 구현하고자 하는 핵심적인 기술이다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 노년 황반변성의 진단 및 치료를 위한 단백질 바이오마커를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 유전자 정보 번호(GI No.) 4557894의 라이조자임 전구체(lysozyme precursor), 222144229의 오토파지 관련 단백질 7 아이조폼(autophagy-related protein 7 isoform) c, 4503143의 카뎁신(cathepsin) D 프리프로프로테인(preproprotein),208973244의 14-3-3 프로테인 제타(protein zeta)/델타(delta),4504919의 케라틴(keratin), 타입 II 사이토스케레탈 (cytoskeletal) 8,55956899의 케라틴, 타입 I 사이토스케레탈 9,24430190의 케라틴 타입 I 사이토스케레탈 15,88853069의 비트로넥틴 전구체,24234699의 케라틴 타입 I 사이토스케레탈 19,58530842의 데스모프라킨(desmoplakin) 이소폼 II,119392081의 보체 인자(complement factor) I 프리프로테인,118442839의 보체 인자 H-관련 프로테인 1 전구체,25777600의 프로테아좀 26S 비(non)-ATPase 소단위체(subunit) 1,11386161의 콜라겐 알파-2(IX) 체인 전구체,190341024의 SPARC-유사(like) 단백질 1 전구체,4507149의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제,4504517의 열 충격(heat shock) 단백질 베타-1,124256496의 열 충격 70 kDa 단백질 1-유사체,109255234의 290 kDa의 중심체 단백질(centrosomal protein), 및 7669492의 글리셀알데히드-3인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함하는 노년 황반변성 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 유전자 정보 번호(GI No.) 4557894의 라이조자임 전구체(lysozyme precursor), 222144229의 오토파지 관련 단백질 7 아이조폼(autophagy-related protein 7 isoform) c, 4503143의 카뎁신(cathepsin) D 프리프로프로테인(preproprotein),208973244의 14-3-3 프로테인 제타(protein zeta)/델타(delta),4504919의 케라틴(keratin), 타입 II 사이토스케레탈 (cytoskeletal) 8,55956899의 케라틴, 타입 I 사이토스케레탈 9,24430190의 케라틴 타입 I 사이토스케레탈 15,88853069의 비트로넥틴 전구체,24234699의 케라틴 타입 I 사이토스케레탈 19,58530842의 데스모프라킨(desmoplakin) 이소폼 II,119392081의 보체 인자(complement factor) I 프리프로테인,118442839의 보체 인자 H-관련 프로테인 1 전구체,25777600의 프로테아좀 26S 비(non)-ATPase 소단위체(subunit) 1,11386161의 콜라겐 알파-2(IX) 체인 전구체,190341024의 SPARC-유사(like) 단백질 1 전구체,4507149의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제,4504517의 열 충격(heat shock) 단백질 베타-1,124256496의 열 충격 70 kDa 단백질 1-유사체,109255234의 290 kDa의 중심체 단백질(centrosomal protein), 및 7669492의 글리셀알데히드-3인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 대한 항체를 포함하는 노년 황반변성 진단제를 제공한다.
또한 본 발명은 대상(subject)에서 노년 황반변성에 대한 정보를 얻기 위한 방법으로서,
(a) 대상으로부터의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 바이오마커를 측정하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 바이오마커는 본 발명의 청구항 제1항에 기재된 조성물 중에서 선택되는 단계; 및
(b) 측정치 또는 측정치들을 정상인과 비교하여 그 측정치가 정상인보다 높은 경우에 노년 황반변성과 상호관련시키는 단계를 포함하는 노년 황반변성에 대한 정보를 얻기 위한 방법을 제공한다.
본 발명에서 개체(subject)란 노년 황반변성 환자이며, 면역원성 단편이란 본 발명의 바이오 마커 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 바이오마커 단백질의 단편을 의미한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 바이오마커 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 노년 황반변성 질환의 진단제를 제공한다.
본 발명의 항체는 폴리클로날 항체일 수도 있으나, 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.
폴리클로날 항체는 당업자에 알려진 종래방법에 따라 면역원인 바이오마커 단백질 또는 그 단편을 외부숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리 정제한다.
모노클로날 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술[Koeher and Milstein 1975, Nature,256:495)]에 의해 제조될 수 있다. 그 제조방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저 순수한 단백질을 20 ㎍을 얻어서 Balb/C 쥐에 면역화를 시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 쥐에 면역화시킨다. 그 후에 쥐에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, 엘라이져(ELISA)방법을 사용하여 원하는 모노클노날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 모노클로날 항체를 분리 정제한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 개체의 체액에서 본 발명의 바이오마커 단백질 또는 그 면역원성 단편의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 개체의 노년 황반변성에 대한 정보를 얻는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 인간 혈액인 것을 특징으로 하며, 상기 검출 단계는 개체의 간의 혈액 용액으로부터 2차원(2-D) 전기영동으로 바이오마커 단백질 또는 그 면역원성 단편의 존재를 직접 검출하거나, 혈액을 본 발명의 항체와 접촉시켜 항원항체반응을 통해 바이오마커 단백질 또는 그 면역원성 단편의 존재를 간접적으로 확인
하는 것을 포함한다.
항원항체반응으로서 현재 널리 알려진 면역에세이(immunoassay) 법은 효소면역측정법(ELISA, Coated tube), 항체결합 자성 입자(magnetic particle)을 튜브(tube)에 결합시킨 다음 항원(antigen)-추적자(tracer)와 난분해성 오염물질을 서로 경쟁적으로 반응시켜 효소반응을 유발시켜 정량하는 자성 입자(magnetic particle)법, 항체결합 라텍스 입자(latex particle)을 이용한 라텍스 입자(latex particle)법 등이 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 바이오 마커 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 노년 황반변성의 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 진단키트는 당업자에 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조되며, 전형적으로 동결건조형태의 항체와 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함한다. 상기 항체는 방사종, 형광원, 효소 등에 의해 표지화될 수 있다.
본 발명의 단일클론항체는 면역에세이(immunoassay) 키트[ELISA, 항체 코팅된 튜브 테스트(antibody coated tube test), 측방-유도 테스트(lateral-flow test),휴대용 바이오센서(potable biosensor)]에 다양하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통한 다양한 노년 황반변성 검출 스펙트럼을 갖는 단백질칩 개발에도 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 노년 황반변성 환자의 방수 (Aqueous humor)에 증감하는 군에서 선택된 단백질을 유효성분으로 포함하는 노년 황반변성 질환의 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 주사제 등의 제형으로 제조되어 정맥주사 등으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 질환의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준으로 1일 0.001~100 ㎎의 단백질을 투여할 수 있다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 프로테오믹스 기법을 이용하여, 노년황반변성 환자의 방수(aqueous humor)시료로부터 바이오마커를 발굴하기 위함이다.
따라서 치료전 환자군 2명, 동일환자에 대한 치료 후 환자군 2명, 정상군 2명을 대상으로 그룹간 단백질의 변화 양상을 분석하였다. 실험의 재현성을 위해 동일한 시료로 3회 반복 실험을 진행하였고, 그중 2회 이상 검출된 단백질 리스트를 선별하였다. 그 결과 치료 전 환자 시료 1, 2에서 각각 131개, 161개의 단백질이 검출되었고, 동일환자에 대한 치료 후 환자군 1, 2에서 264, 183개의 단백질이 검출되었다. 정상시료 1, 2에서는 161, 144개의 단백질이 검출되었다(도 2).
환자군과 정상군의 그룹간 단백질의 질량적 변화를 확인하기 위하여 비표지 정량화(label-free quantification) 방법을 도입하여 정상군에 비해 치료 전 환자군에서 1.5배 이상 증가한 단백질을 각각 92, 75개 선별하였고 (표 1-2), 치료 후 감소하는 단백질 67, 64개를 선별하였다 (표 3-4). 이중 노년 황반변성 환자의 바이오마커 후보로 의미를 갖는다고 예상되는 대표적인 카뎁신(cathepsin) D, 데스모프라킨(desmoplakin)의 단백질을 대상으로 웨스턴 블럿(western blot)을 수행하여 (도 3) 이들 단백질의 질량적인 변화양상을 확인하였다.
표 1-2는 정상군에 비해 환자군에서 1.5배 이상 증가한 단백질 리스트를 나타낸다.
A.환자 1에서 1.5배 이상 증가한 단백질 리스트
No. GI No . MW Reference
1 4502101 38690 annexin A1
2 109255249 63871.45 keratin, type II cytoskeletal 4
3 213688375 41981.82 actin, aortic smooth muscle
4 4504517 22768.49 heat shock protein beta-1
5 45439327 204552.8 periplakin
6 44890059 68437.3 involucrin
7 4503475 50438.36 eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2
8 31543169 52080.16 histone-lysine N-methyltransferase SUV420H2
9 5454052 27756.7 14-3-3 protein sigma
10 4506773 13233.5 protein S100-A9
11 4501887 41765.8 actin, cytoplasmic 2
12 77539758 11360.38 histone H4
13 291045225 3710441 titin isoform N2-A
14 27436948 70618.16 lamin-A/C isoform 3
15 4504183 23341.02 glutathione S-transferase P
16 214010185 59114.2 amyloid-like protein 2 isoform 4
17 94536793 102933.8 tubulin polyglutamylase TTLL7
18 167466177 92553.75 cell division cycle protein 27 isoform 1
19 186659512 177860.6 calmodulin-regulated spectrin-associated protein 1
20 61743954 628705.2 neuroblast differentiation-associated protein AHNAK isoform 1
21 4504253 15135.42 histone H2A.x
22 157653329 47942.04 procollagen C-endopeptidase enhancer 1
23 109255234 290205.6 centrosomal protein of 290 kDa
24 57864582 282225.7 hornerin
25 41327708 154080.4 crumbs homolog 1 precursor
26 124028519 160892.4 hypothetical protein LOC158401 isoform 2
27 226246665 51091.87 keratin, type II cytoskeletal 72 isoform 2
28 73858564 45095.96 corticosteroid-binding globulin precursor
29 212549782 222518.8 caspase 8 associated protein 2
30 115511024 64831.51 lipase maturation factor 1
31 53729346 82807.91 plakophilin-1 isoform 1b
32 208973244 27727.73 14-3-3 protein zeta/delta
33 47607492 518156.3 plectin isoform 1c
34 32455266 22096.28 peroxiredoxin-1
35 28173554 13899.54 histone H2B type 3-B
36 4505821 16561.8 prolactin-induced protein precursor
37 195947389 101902.1 ectonucleotide pyrophosphatase/
phosphodiesterase family member 2 isoform 3 preproprotein
38 178557739 192629.6 complement C4-B preproprotein
39 5031863 65289.4 galectin-3-binding protein
40 94536788 103344.8 THAP domain-containing protein 9
41 5031579 76061.17 A-kinase anchor protein 8
42 222144229 68573.8 autophagy-related protein 7 isoform c
43 262359929 253301.3 protein ELYS
44 163659918 520794.2 sacsin
45 154146262 571640.9 igGFc-binding protein precursor
46 206597522 106915.3 arf-GAP with SH3 domain,
ANK repeat and PH domain-containing protein 2 isoform b
47 124256496 70331.45 heat shock 70 kDa protein 1-like
48 169211906 22688.56 PREDICTED: hypothetical protein
49 166795236 35686.62 tumor-associated calcium signal transducer 2 precursor
50 12667788 226390.6 myosin-9
51 57013276 50119.64 tubulin alpha-1B chain
52 29788768 49920.98 tubulin beta-2B chain
53 5902072 44536.6 serpin B3
54 60097902 434921.4 filaggrin
55 194248072 70009.18 heat shock 70 kDa protein 1A/1B
56 16507237 72288.52 78 kDa glucose-regulated protein
57 10190712 11654.76 S100 calcium binding protein A14
58 21614499 69369.84 ezrin
59 5803227 27746.77 14-3-3 protein theta
60 27894339 48101.24 keratin 23
61 5032161 12465 transcription elongation factor B polypeptide 1
62 109148552 64377.6 keratin, type II cytoskeletal 3
63 34734068 61538.3 fibulin-1 isoform A precursor
64 21071030 54219.66 alpha 1B-glycoprotein precursor
65 5031839 60008.32 keratin, type II cytoskeletal 6A
66 189083782 81890.13 gelsolin isoform c
67 58530842 259954.2 desmoplakin isoform II
68 239753016 13156.05 PREDICTED: similar to hCG2042913
69 239752583 15863.81 PREDICTED: hypothetical protein XP_002348171
70 209915573 80782.38 amyloid beta A4 protein isoform f precursor
71 239753442 194818.7 PREDICTED: HEAT repeat containing 7B1
72 4557373 61093.34 biotinidase precursor
73 154277116 1010419 nesprin-1 isoform 1
74 169207532 24015.14 PREDICTED: similar to hCG2042717
75 37588869 148420 E3 ubiquitin-protein ligase RNF123
76 24430190 49167.11 keratin, type I cytoskeletal 15
77 50592994 11729.74 thioredoxin
78 116295258 129214.8 integrin alpha-2 precursor
79 5902010 45749.07 transcription termination factor, mitochondrial precursor
80 155969697 59988.35 keratin, type II cytoskeletal 6C
81 24430192 51236.25 keratin, type I cytoskeletal 16
82 12056468 81692.87 junction plakoglobin
83 33620759 39754.96 LRP2-binding protein
84 119703753 60030.33 keratin, type II cytoskeletal 6B
85 7669492 36030.4 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
86 260436922 60504.64 suprabasin isoform 1 precursor
87 4503143 44523.66 cathepsin D preproprotein
88 192807292 55053.49 keratin 24
89 4504489 59540.94 histidine-rich glycoprotein precursor
90 4507725 15877.05 transthyretin precursor
91 116734860 174651.4 amylo-1,6-glucosidase, 4-alpha-glucanotransferase isoform 1
92 25777600 105768.7 proteasome 26S non-ATPase subunit 1
B.환자 2에서 1.5배 이상 증가한 단백질 리스트
No. GI No . MW Reference
1 206597441 50362.9 aldehyde dehydrogenase, dimeric NADP-preferring
2 4504935 55766.54 keratin, type II cuticular Hb5
3 4557287 53120.61 angiotensinogen preproprotein
4 4503571 47139.37 alpha-enolase
5 5902010 45749.07 transcription termination factor, mitochondrial precursor
6 25777600 105768.7 proteasome 26S non-ATPase subunit 1
7 118442839 37625.96 complement factor H-related protein 1 precursor
8 55743122 22995.26 retinol-binding protein 4 precursor
9 213688375 41981.82 actin, aortic smooth muscle
10 261278368 76506.45 lipid phosphate phosphatase-related protein type 4 isoform 2
11 115527097 194191.4 serine/threonine-protein kinase MRCK beta
12 4505529 23587.64 alpha-1-acid glycoprotein 2 precursor
13 190341024 75161.32 SPARC-like protein 1 precursor
14 222144229 68573.8 autophagy-related protein 7 isoform c
15 58530840 331567.8 desmoplakin isoform I
16 11386161 65090.96 collagen alpha-2(IX) chain precursor
17 33620759 39754.96 LRP2-binding protein
18 109255234 290205.6 centrosomal protein of 290 kDa
19 75677365 507374.4 dynein heavy chain 2, axonemal
20 134031945 547136.1 SCO-spondin precursor
21 4507509 23155.55 metalloproteinase inhibitor 1 precursor
22 34787409 166691.8 ral GTPase-activating protein beta subunit
23 74271828 44385.62 mTERF domain-containing protein 3, mitochondrial precursor
24 4501887 41765.8 actin, cytoplasmic 2
25 4557373 61093.34 biotinidase precursor
26 4506145 26541.09 trypsin-1 preproprotein
27 156627579 22522.28 tetranectin precursor
28 4507149 15925.91 superoxide dismutase
29 4505047 38404.8 lumican precursor
30 33413418 42232.73 signal peptide peptidase-like 3
31 4504489 59540.94 histidine-rich glycoprotein precursor
32 162809334 163759.1 pregnancy-zone protein precursor
33 4826762 45176.59 haptoglobin isoform 1 preproprotein
34 144226251 42598.43 chitinase 3-like 1 precursor
35 119392081 65676.66 complement factor I preproprotein
36 4502149 11167.9 apolipoprotein A-II preproprotein
37 4503143 44523.66 cathepsin D preproprotein
38 58530842 259954.2 desmoplakin isoform II
39 89357932 56830.53 keratin, type II cytoskeletal 78
40 62122917 247926.3 filaggrin family member 2
41 209862791 69012.77 zinc finger protein 90
42 77539758 11360.38 histone H4
43 156104891 58205.11 general transcription factor IIF subunit 1
44 4502067 38973.99 protein AMBP preproprotein
45 42734397 43628.38 ubiquitin-conjugating enzyme E2C binding protein
46 117320537 147775.9 1-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate
phosphodiesterase gamma-2
47 61743957 28173.1 C->U-editing enzyme APOBEC-1
48 239755764 128617.5 PREDICTED: hypothetical protein
49 22538442 33846.23 cathepsin Z preproprotein
50 4505821 16561.8 prolactin-induced protein precursor
51 239757666 14577.9 PREDICTED: similar to hCG2040021
52 148276990 134171.8 zinc finger and BTB domain-containing protein 38
53 57529737 119521 PDZ domain containing ring finger 3
54 62526026 19104.11 protein CutA isoform 3
55 5729770 61209.71 tripeptidyl-peptidase 1 preproprotein
56 111125011 41499.8 WNT inhibitory factor 1 precursor
57 239758153 23120.24 PREDICTED: similar to Ig heavy chain
58 153791670 65800.08 keratin, type II cytoskeletal 2 oral
59 190684677 163715.5 mitogen-activated protein kinase-binding protein 1 isoform b
60 57863250 184587.1 terminal uridylyltransferase 4 isoform c
61 4507467 74634.1 transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 precursor
62 4503009 53117.17 carboxypeptidase E preproprotein
63 222446620 124963 hypothetical protein LOC342346
64 115298678 187029.3 complement C3 precursor
65 50659080 47620.63 alpha-1-antichymotrypsin precursor
66 4504619 29111.45 insulin-like growth factor binding protein 7
67 4502261 52568.98 antithrombin-III precursor
68 21071030 54219.66 alpha 1B-glycoprotein precursor
69 4557894 16526.29 lysozyme precursor
70 7669492 36030.4 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
71 239752583 15863.81 PREDICTED: hypothetical protein XP_002348171
72 169207532 24015.14 PREDICTED: similar to hCG2042717
73 239756207 13240.43 PREDICTED: similar to pre-B lymphocyte gene 2
74 110347423 90913.51 spondin-1 precursor
75 205277441 46294.67 serine (or cysteine) proteinase inhibitor,
clade A, member 7 precursor
하기 표 3-4는 정상군에 비해 환자군에서 1.5배이상 증가했다가 치료 1달후 감소한 단백질 리스트이다.
A.환자 1에서 치료 후 감소하는 단백질 리스트
No. GI No . MW Protein name
1 192807292 55053.49 keratin 24
2 31543169 52080.16 histone-lysine N-methyltransferase SUV420H2
3 41327708 154080.4 crumbs homolog 1 precursor
4 109255249 63871.45 keratin, type II cytoskeletal 4
5 94536793 102933.8 tubulin polyglutamylase TTLL7
6 167466177 92553.75 cell division cycle protein 27 isoform 1
7 186659512 177860.6 calmodulin-regulated spectrin-associated protein 1
8 178557739 192629.6 complement C4-B preproprotein
9 5031863 65289.4 galectin-3-binding protein
10 109148552 64377.6 keratin, type II cytoskeletal 3
11 4502101 38690 annexin A1
12 239753016 13156.05 PREDICTED: similar to hCG2042913
13 212549782 222518.8 caspase 8 associated protein 2
14 115511024 64831.51 lipase maturation factor 1
15 4557373 61093.34 biotinidase precursor
16 37588869 148420 E3 ubiquitin-protein ligase RNF123
17 291045225 3710441 titin isoform N2-A
18 214010185 59114.2 amyloid-like protein 2 isoform 4
19 94536788 103344.8 THAP domain-containing protein 9
20 33620759 39754.96 LRP2-binding protein
21 222144229 68573.8 autophagy-related protein 7 isoform c
22 262359929 253301.3 protein ELYS
23 163659918 520794.2 sacsin
24 154146262 571640.9 igGFc-binding protein precursor
25 206597522 106915.3 arf-GAP with SH3 domain,
ANK repeat and PH domain-containing protein 2 isoform b
26 169211906 22688.56 PREDICTED: hypothetical protein
27 166795236 35686.62 tumor-associated calcium signal transducer 2 precursor
28 116734860 174651.4 amylo-1,6-glucosidase, 4-alpha-glucanotransferase isoform 1
29 124028519 160892.4 hypothetical protein LOC158401 isoform 2
30 226246665 51091.87 keratin, type II cytoskeletal 72 isoform 2
31 73858564 45095.96 corticosteroid-binding globulin precursor
32 239752583 15863.81 PREDICTED: hypothetical protein XP_002348171
33 209915573 80782.38 amyloid beta A4 protein isoform f precursor
34 239753442 194818.7 PREDICTED: HEAT repeat containing 7B1
35 154277116 1010419 nesprin-1 isoform 1
36 109255234 290205.6 centrosomal protein of 290 kDa
37 34734068 61538.3 fibulin-1 isoform A precursor
38 189083782 81890.13 gelsolin isoform c
39 195947389 101902.1 ectonucleotide pyrophosphatase/
phosphodiesterase family member 2 isoform 3 preproprotein
40 4504183 23341.02 glutathione S-transferase P
41 169207532 24015.14 PREDICTED: similar to hCG2042717
42 116295258 129214.8 integrin alpha-2 precursor
43 5031579 76061.17 A-kinase anchor protein 8
44 25777600 105768.7 proteasome 26S non-ATPase subunit 1
45 157653329 47942.04 procollagen C-endopeptidase enhancer 1
46 44890059 68437.3 involucrin
47 4503143 44523.66 cathepsin D preproprotein
48 4504517 22768.49 heat shock protein beta-1
49 4504489 59540.94 histidine-rich glycoprotein precursor
50 4505821 16561.8 prolactin-induced protein precursor
51 4503475 50438.36 eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2
52 4501887 41765.8 actin, cytoplasmic 2
53 5902010 45749.07 transcription termination factor, mitochondrial precursor
54 45439327 204552.8 periplakin
55 4507725 15877.05 transthyretin precursor
56 21071030 54219.66 alpha 1B-glycoprotein precursor
57 61743954 628705.2 neuroblast differentiation-associated protein AHNAK isoform 1
58 4504253 15135.42 histone H2A.x
59 32455266 22096.28 peroxiredoxin-1
60 50592994 11729.74 thioredoxin
61 10190712 11654.76 S100 calcium binding protein A14
62 21614499 69369.84 ezrin
63 213688375 41981.82 actin, aortic smooth muscle
64 47607492 518156.3 plectin isoform 1c
65 24430190 49167.11 keratin, type I cytoskeletal 15
66 4506773 13233.5 protein S100-A9
67 208973244 27727.73 14-3-3 protein zeta/delta
B. 환자2에서 치료후 감소하는 단백질 리스트
No. GI No . MW Reference
1 4504935 55766.54 keratin, type II cuticular Hb5
2 25777600 105768.7 proteasome 26S non-ATPase subunit 1
3 115527097 194191.4 serine/threonine-protein kinase MRCK beta
4 5902010 45749.07 transcription termination factor, mitochondrial precursor
5 55743122 22995.26 retinol-binding protein 4 precursor
6 261278368 76506.45 lipid phosphate phosphatase-related protein type 4 isoform 2
7 190341024 75161.32 SPARC-like protein 1 precursor
8 222144229 68573.8 autophagy-related protein 7 isoform c
9 134031945 547136.1 SCO-spondin precursor
10 34787409 166691.8 ral GTPase-activating protein beta subunit
11 74271828 44385.62 mTERF domain-containing protein 3, mitochondrial precursor
12 4501887 41765.8 actin, cytoplasmic 2
13 4507149 15925.91 superoxide dismutase
14 205277441 46294.67 serine (or cysteine) proteinase inhibitor,
clade A, member 7 precursor
15 4502149 11167.9 apolipoprotein A-II preproprotein
16 209862791 69012.77 zinc finger protein 90
17 77539758 11360.38 histone H4
18 156104891 58205.11 general transcription factor IIF subunit 1
19 4502067 38973.99 protein AMBP preproprotein
20 42734397 43628.38 ubiquitin-conjugating enzyme E2C binding protein
21 61743957 28173.1 C->U-editing enzyme APOBEC-1
22 239755764 128617.5 PREDICTED: hypothetical protein
23 22538442 33846.23 cathepsin Z preproprotein
24 4505821 16561.8 prolactin-induced protein precursor
25 109255234 290205.6 centrosomal protein of 290 kDa
26 57863250 184587.1 terminal uridylyltransferase 4 isoform c
27 4503571 47139.37 alpha-enolase
28 206597441 50362.9 aldehyde dehydrogenase, dimeric NADP-preferring
29 4507467 74634.1 transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 precursor
30 222446620 124963 hypothetical protein LOC342346
31 239752583 15863.81 PREDICTED: hypothetical protein XP_002348171
32 162809334 163759.1 pregnancy-zone protein precursor
33 4505529 23587.64 alpha-1-acid glycoprotein 2 precursor
34 58530840 331567.8 desmoplakin isoform I
35 4503009 53117.17 carboxypeptidase E preproprotein
36 118442839 37625.96 complement factor H-related protein 1 precursor
37 239758153 23120.24 PREDICTED: similar to Ig heavy chain
38 4503143 44523.66 cathepsin D preproprotein
39 213688375 41981.82 actin, aortic smooth muscle
40 89357932 56830.53 keratin, type II cytoskeletal 78
41 117320537 147775.9 1-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate
phosphodiesterase gamma-2
42 148276990 134171.8 zinc finger and BTB domain-containing protein 38
43 4557894 16526.29 lysozyme precursor
44 4504619 29111.45 insulin-like growth factor binding protein 7
45 4502261 52568.98 antithrombin-III precursor
46 75677365 507374.4 dynein heavy chain 2, axonemal
47 4507509 23155.55 metalloproteinase inhibitor 1 precursor
48 4506145 26541.09 trypsin-1 preproprotein
49 156627579 22522.28 tetranectin precursor
50 4505047 38404.8 lumican precursor
51 239756207 13240.43 PREDICTED: similar to pre-B lymphocyte gene 2
52 11386161 65090.96 collagen alpha-2(IX) chain precursor
53 4557287 53120.61 angiotensinogen preproprotein
54 50659080 47620.63 alpha-1-antichymotrypsin precursor
55 4826762 45176.59 haptoglobin isoform 1 preproprotein
56 119392081 65676.66 complement factor I preproprotein
57 190684677 163715.5 mitogen-activated protein kinase-binding protein 1 isoform b
58 4557373 61093.34 biotinidase precursor
59 33413418 42232.73 signal peptide peptidase-like 3
60 62122917 247926.3 filaggrin family member 2
61 239757666 14577.9 PREDICTED: similar to hCG2040021
62 57529737 119521 PDZ domain containing ring finger 3
63 62526026 19104.11 protein CutA isoform 3
64 5729770 61209.71 tripeptidyl-peptidase 1 preproprotein
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이 본 발명에서 동정된 단백질을 이용하여 노년 황반 변성의 진단에 활용할 수 있을 수 있다.
도 1은 1차원 전기영동을 통해 얻은 노년황반변성 환자의 방수단백질 시료를 나타낸 그림이고,
도 2는 동정된 단백질을 그룹별로 분석하여 나타낸 히스토그램을 나타낸 그림이며,
도 3은 카뎁신(Cathepsin) D 와 데스모프라킨(Desmoplakin)의 웨스턴 블럿(western blot) 결과를 나타낸 그림이다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1:1차원 전기영동과 쿠마시 블루(coomassie blue) 염색
노년황반변성 환자들의 방수 (Aqueous humor) 를 50ug씩 취하여 1차원 전기영동 (120V, 1 hr 30min) 하고 아래에 기재된 방법으로 젤을 염색하였다.
1차원 전기영동으로 단백질을 분리한 후, 3차 증류수를 이용하여 15분씩 3회 워싱해주고, 젤 코드 블루 염색 용액(Gel code blue staining solution)으로 1시간 동안 염색해 주었다.(도 2)
실시예 2:단백질의 펩타이드화 단계(아래의 단계를 순차적으로 수행)
상기 염색된 젤을 구획에 따라 6등분하여 탈염색시약[50% 아세토나이트릴(Acetonitrile) 내 50mM 중탄산 암모늄(ammonium bicarbonate)] 을 이용하여 완전히 탈염색해주고, 100% 아세토나이트릴(Acetonitrile)을 이용하여 탈수해 주었다.
탈수시킨 샘플을 스피드(speed)-진공(vacuum)을 이용하여 10분간 완전히 건조시켰다.
건조시킨 젤 안의 단백질은 이황화 결합들로 연결되어있기 때문에, 최종 농도가 10mM 이 되도록 하여 다이티오쓰레이톨 (dithiothreitol, DTT)을 넣어주고 56℃에서 45분간 반응시켰다.
앞선 반응에 의해 끊어진 -SH 기가 다시 서로 붙지 못하게 하기 위해 55mM 아이오도아세트아마이드 (iodoacetamide)를 어둠 속에서 30분씩 반응시켜 -SH 잔기에 알킬레이션을 하였다.
단백질을 가수분해하기 위해 트립신을 단백질과 1:20의 비율로 넣어주고 37℃ 에서 밤새(overnight) 반응시켰다.
밤새(Overnight) 반응 후, 시료를 500uL튜브에 옮겨 담고, 추출 용액(extraction solution)[5% 포름산(formic acid), 50% 아세토나이트릴(acetonitrile)]을 첨가하여 밤새(overnight) 해준 튜브에 50uL를 넣어주고, 상온에서 20분간 반응시켰다. (위의 과정을 2회 반복)
위의 과정으로 얻은 시료를 스피드(speed)-진공(vacuum)을 이용하여 용액(solution)이 전부 날아갈 때까지 말려주었다.
실시예 3: LC - ESI - MS / MS 및 데이터 분석
LTQ 이온트랩 질량분석기를 이용하여 앞의 과정에서 얻어진 샘플을 분석하였다.
C18 미세관(microcapillary) 컬럼 (12cm x 75um) 을 질량분석기에 연결하였고, 샘플을 컬럼에 주입하여 RP-HPLC를 이용하여 질량분석기에서 분석하였다.
이동상은 용매(solvent) A[3차 증류수 / 0.1% 포름산(formic acid)]와 용매(solvent) B[아세토나이트릴(acetonitrile)/ 0.1% 포름산(formic acid)] 를 5-45분 동안 구배(gradient)[3-40% 용매(solvent) B]로 흘려주었다. (표 3)
컬럼의 유속(flow rate)은 250nL/min이며, MS에서 강도(intensity)가 가장 큰 5개의 피크를 MS/MS 하도록 한다. MS/MS는 데이터 의존 스캔 모드(data-dependent scan mode)를 사용하고, 정전분무 전압(electrospray voltage)은 1.95kV, CE[충돌 에너지(Collision eneygy)]는 35%로 적용하였고,
얻어진 MS/MS데이터는 휴먼 데이터베이스를 기반으로, SEQUEST를 통하여 단백질을 동정하였다.
Time Flow (uL/min) Solvent A Solvent B
0 0.2 97 3
5 0.2 97 3
45 0.2 60 40
50 0.2 10 90
60 0.2 10 90
65 0.2 97 3
85 0.2 97 3
표 3은 방수시료분석에 사용된 LC 구배 조건을 나타낸 표이다.

Claims (4)

  1. 유전자 정보 번호(GI No.) 4557894의 라이조자임 전구체(lysozyme precursor),
    222144229의 오토파지 관련 단백질 7 아이조폼(autophagy-related protein 7 isoform) c,
    4503143의 카뎁신(cathepsin) D 프리프로프로테인(preproprotein),
    208973244의 14-3-3 프로테인 제타(protein zeta)/델타(delta),
    4504919의 케라틴(keratin), 타입 II 사이토스케레탈 (cytoskeletal) 8,
    55956899의 케라틴, 타입 I 사이토스케레탈 9,
    24430190의 케라틴 타입 I 사이토스케레탈 15,
    88853069의 비트로넥틴 전구체,24234699의 케라틴 타입 I 사이토스케레탈 19,
    58530842의 데스모프라킨(desmoplakin) 이소폼 II,
    119392081의 보체 인자(complement factor) I 프리프로테인,
    118442839의 보체 인자 H-관련 프로테인 1 전구체,
    25777600의 프로테아좀 26S 비(non)-ATPase 소단위체(subunit) 1,
    11386161의 콜라겐 알파-2(IX) 체인 전구체,
    190341024의 SPARC-유사(like) 단백질 1 전구체,
    4507149의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제,
    4504517의 열 충격(heat shock) 단백질 베타-1,
    124256496의 열 충격 70 kDa 단백질 1-유사체,
    109255234의 290 kDa의 중심체 단백질(centrosomal protein), 및
    7669492의 글리셀알데히드-3인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함하는 노년 황반변성 진단용 조성물
  2. 유전자 정보 번호(GI No.) 4557894의 라이조자임 전구체(lysozyme precursor),
    222144229의 오토파지 관련 단백질 7 아이조폼(autophagy-related protein 7 isoform) c,
    4503143의 카뎁신(cathepsin) D 프리프로프로테인(preproprotein),
    208973244의 14-3-3 프로테인 제타(protein zeta)/델타(delta),
    4504919의 케라틴(keratin), 타입 II 사이토스케레탈 (cytoskeletal) 8,
    55956899의 케라틴, 타입 I 사이토스케레탈 9,
    24430190의 케라틴 타입 I 사이토스케레탈 15,
    88853069의 비트로넥틴 전구체,24234699의 케라틴 타입 I 사이토스케레탈 19,
    58530842의 데스모프라킨(desmoplakin) 이소폼 II,
    119392081의 보체 인자(complement factor) I 프리프로테인,
    118442839의 보체 인자 H-관련 프로테인 1 전구체,
    25777600의 프로테아좀 26S 비(non)-ATPase 소단위체(subunit) 1,
    11386161의 콜라겐 알파-2(IX) 체인 전구체,
    190341024의 SPARC-유사(like) 단백질 1 전구체,
    4507149의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제,
    4504517의 열 충격(heat shock) 단백질 베타-1,
    124256496의 열 충격 70 kDa 단백질 1-유사체,
    109255234의 290 kDa의 중심체 단백질(centrosomal protein), 및
    7669492의 글리셀알데히드-3인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질
  3. 대상(subject)에서 노년 황반변성에 대한 정보를 얻기 위한 방법으로서,
    (a) 대상으로부터의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 바이오마커를 측정하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 바이오마커는 제1항에 기재된 조성물 중에서 선택되는 단계; 및
    (b) 측정치 또는 측정치들을 정상인과 비교하여 그 측정치가 정상인보다 높은 경우에 노년 황반변성과 상호관련시키는 단계를 포함하는 노년 황반변성에 대한 정보를 얻기 위한 방법.
  4. 유전자 정보 번호(GI No.) 4557894의 라이조자임 전구체(lysozyme precursor),
    222144229의 오토파지 관련 단백질 7 아이조폼(autophagy-related protein 7 isoform) c,
    4503143의 카뎁신(cathepsin) D 프리프로프로테인(preproprotein),
    208973244의 14-3-3 프로테인 제타(protein zeta)/델타(delta),
    4504919의 케라틴(keratin), 타입 II 사이토스케레탈 (cytoskeletal) 8,
    55956899의 케라틴, 타입 I 사이토스케레탈 9,
    24430190의 케라틴 타입 I 사이토스케레탈 15,
    88853069의 비트로넥틴 전구체,24234699의 케라틴 타입 I 사이토스케레탈 19,
    58530842의 데스모프라킨(desmoplakin) 이소폼 II,
    119392081의 보체 인자(complement factor) I 프리프로테인,
    118442839의 보체 인자 H-관련 프로테인 1 전구체,
    25777600의 프로테아좀 26S 비(non)-ATPase 소단위체(subunit) 1,
    11386161의 콜라겐 알파-2(IX) 체인 전구체,
    190341024의 SPARC-유사(like) 단백질 1 전구체,
    4507149의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제,
    4504517의 열 충격(heat shock) 단백질 베타-1,
    124256496의 열 충격 70 kDa 단백질 1-유사체,
    109255234의 290 kDa의 중심체 단백질(centrosomal protein), 및
    7669492의 글리셀알데히드-3인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 유효성분으로 포함하는 노년 황반변성 질환의 치료 및 예방용 조성물.
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