CN109072232B - 用于提供单链rna的方法 - Google Patents
用于提供单链rna的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109072232B CN109072232B CN201780024328.9A CN201780024328A CN109072232B CN 109072232 B CN109072232 B CN 109072232B CN 201780024328 A CN201780024328 A CN 201780024328A CN 109072232 B CN109072232 B CN 109072232B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ssrna
- buffer
- rna
- cellulosic material
- dsrna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Virology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明涉及用于提供单链RNA(ssRNA)的方法。此外,本发明涉及可通过本发明的方法获得的ssRNA以及这样的ssRNA在治疗中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及用于提供单链RNA(single-stranded RNA,ssRNA)的方法。此外,本发明涉及可通过本发明的方法获得的ssRNA以及这样的ssRNA在治疗中的用途。
背景技术
在使用T7RNA聚合酶通过体外转录(in vitro transcription,IVT)合成mRNA期间(参见Yin等.,Cell 116(2004),393-404),由于该酶的非常规活性,产生了大量异常产物,包括双链RNA(dsRNA)(参见Triana-Alonso等,JBC 270(1995),6298-6307;Cazenave等,PNAS USA 91(1994),6972-6976;Gong等,JBC 281(2006),23533-23544)。由于dsRNA诱导炎性细胞因子并活化效应酶(参见Karikó.,Curr.Opin.Drug Discov.Devel.10(2007),523-532),导致蛋白质合成抑制,因此从将用作治疗剂的IVT mRNA去除dsRNA是重要的。
迄今为止,已经描述了用于从IVT mRNA中去除dsRNA的两种不同的方法。一种方法是使用无孔(参见Weissman等,Methods Mol.Biol.969(2013),43-54)或多孔(参见US 8,383,340B2)C-18聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)基质通过离子对反相HPLC纯化IVT mRNA。然而,使用HPLC纯化RNA的方法具有若干缺点,例如复杂的设备;有毒溶剂如乙腈的使用;标准纯化运行的持续时间长;难以扩大规模;成本;以及由于剪切导致长RNA的降解。
或者,使用特异性水解dsRNA但不水解ssRNA的大肠杆菌(E.coli)RNaseIII已经建立了基于酶的方法,从而从IVT mRNA制备物中消除了dsRNA污染物(参见WO 2013/102203A1)。然而,RNaseIII在用RNA治疗的患者中可能诱导不期望的反应(例如不期望的免疫反应)。因此,在向患者施用RNA之前有必要除去酶,因此提高了该方法的复杂性和成本。此外,在孵育期间,使用RNaseIII经常导致ssRNA,特别是长ssRNA的部分降解。这可能是由RNaseIII催化的ssRNA中包含的双链二级结构的水解引起的。
1966年,在存在EtOH的情况下,在未修饰的纤维素粉末CF-11和RNA之间发现非离子相互作用,并用于通过色谱法从核糖体RNA(rRNA)分离sRNA(“可溶性RNA”)(Barber,R.Biochim.Biophys.Acta 114(1966),422-424)。当用35%EtOH从柱洗脱sRNA时,可以通过将色谱缓冲液的EtOH浓度降低至15%来选择性洗脱rRNA。
Franklin等(PNAS USA 55(1966),1504-1511)使用相同的分离原理从大肠杆菌的总RNA中分离RNA噬菌体R17的复制中间体(replicative intermediate,RI)RNA。其中,鉴定为RNase A抗性的dsRNA的纤维素结合的RI RNA仅在不含EtOH的缓冲液中有效洗脱。该技术适用于从寄生隐丛赤壳(Cryphonectria parasitica),一种栗树的寄生真菌中分离dsRNA(Day等.,Phytopathology 67(1977),1393)。
Morris和Dodds(Phytopathology 69(1977),854-858)通过在存在15%(v/v)EtOH的情况下从植物和真菌RNA分离物中选择性地拉下病毒dsRNA简化了先前描述的基于纤维素的方法。数十年来已经使用该方法来分离dsRNA并且在这些年中仅进行了微小的修改,例如,使用填充有CF-11纤维素的商业微型柱,以加速该过程并提高样品生产量(参见Castillo等,Virol.J.8(2011),38;Okada等,Arch.Virol.159(2014),807-809)。
本发明的一个目的是提供解决上述一个或更多个问题的方法。特别地,本发明的一个目的是提供一种用于提供ssRNA的替代方法,所述方法与基于HPLC的方法相比,节约成本,简单且耗时少;避免有毒物质;可以很容易地扩大规模;其提供了产量和纯度与使用HPLC获得的ssRNA相当的ssRNA;其不会影响长RNA;和/或不会降解RNA。本发明的这样的目的通过本文中任何地方公开或定义的主题,例如通过所附权利要求书的主题解决。
发明内容
在第一方面,本发明提供了一种用于提供ssRNA的方法,其包括(i)提供包含通过体外转录产生的ssRNA的RNA制备物;(ii)在允许双链RNA(dsRNA)与纤维素材料结合的条件下使所述RNA制备物与所述纤维素材料接触;(iii)在允许dsRNA与纤维素材料结合的条件下使ssRNA与所述纤维素材料分离。
在第一方面的一个实施方案中,所述方法还包括通过体外转录产生包含ssRNA的RNA制备物的步骤。
在第一方面的第一主要实施方案中,步骤(ii)和(iii)在允许dsRNA与纤维素材料结合但不允许ssRNA与纤维素材料结合的条件下进行(第一方面的该主要实施方案在本文中有时称为“阴性”纯化方法,因为它允许dsRNA与纤维素材料选择性结合,而ssRNA保持未结合)。
在阴性纯化方法的一个实施方案中,步骤(ii)包括在摇动和/或搅拌下将包含ssRNA的RNA制备物与纤维素材料混合,优选持续至少5分钟,更优选持续至少10分钟。
在阴性纯化方法的一个实施方案中,在步骤(ii)中,RNA制备物作为包含ssRNA和第一缓冲液的液体提供和/或纤维素材料作为第一缓冲液中的混悬液提供,其中第一缓冲液包含水、乙醇和盐,优选氯化钠,其浓度允许dsRNA与所述纤维素材料结合但不允许ssRNA与所述纤维素材料结合。在一个实施方案中,第一缓冲液中乙醇的浓度为14至20%(v/v),优选14至16%(v/v)。在一个实施方案中,第一缓冲液中盐的浓度为15至70mM,优选20至60mM。在一个实施方案中,第一缓冲液还包含缓冲物质,优选三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS),和/或螯合剂,优选EDTA。
在阴性纯化方法的一个实施方案中,在步骤(ii)和/或(iii)中,在管中提供RNA制备物、纤维素材料和第一缓冲液的混合物,并且步骤(iii)包括(1)向所述管施加重力或离心力使得液相与固相分离;和(2)收集含有ssRNA的上清液或除去纤维素材料。在一个替代实施方案中,在步骤(ii)和/或(iii)中,在旋转柱或过滤装置中提供RNA制备物、纤维素材料和第一缓冲液的混合物,并且步骤(iii)包括(1′)向所述旋转柱或过滤装置施加重力、离心力、压力或真空以使得液相与固相分离;和(2′)收集包含ssRNA的流过液。
在阴性纯化方法的一个实施方案中,步骤(ii)和(iii)重复一次或两次或更多次,其中在步骤(ii)和步骤(iii)的一个循环中的步骤(iii)之后获得的ssRNA制备物用作下一个循环中的步骤(ii)的RNA制备物并且在步骤(ii)和(iii)的每个循环中的步骤(ii)中使用新的纤维素材料。
在第一方面的第二主要实施方案中,步骤(ii)在允许dsRNA和ssRNA与所述纤维素材料结合的条件下进行;并且步骤(iii)在允许dsRNA与所述纤维素材料结合但不允许ssRNA与所述纤维素材料结合的条件下进行(第一方面的该第二主要实施方案有时在本文中称为“阳性”纯化方法,因为首先dsRNA和ssRNA与所述纤维素材料结合,然后ssRNA从所述纤维素材料中选择性释放,而dsRNA保持结合)。
在阳性纯化方法的一个实施方案中,步骤(ii)包括(1)在摇动和/或搅拌下将包含ssRNA的RNA制备物与所述纤维素材料混合,优选持续至少5分钟,更优选持续至少10分钟;和(2)将结合dsRNA和ssRNA的所述纤维素材料与其余部分分离。
在阳性纯化方法的一个实施方案中,在步骤(ii)中,RNA制备物作为包含ssRNA和第二缓冲液的液体提供和/或纤维素材料作为第二缓冲液中的混悬液提供,其中所述第二缓冲液包含水、乙醇和盐,优选氯化钠,其浓度允许dsRNA和ssRNA与所述纤维素材料结合。在一个实施方案中,第二缓冲液中乙醇的浓度为至少35%(v/v),优选38%(v/v)至42%(v/v)。在一个实施方案中,第二缓冲液中盐的浓度为15至70mM,优选20至60mM。在一个实施方案中,第二缓冲液还包含缓冲物质,优选三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS),和/或螯合剂,优选EDTA。
在阳性纯化方法的一个实施方案中,在步骤(ii)(1)和/或(ii)(2)中,在管中提供步骤(ii)(1)中获得的RNA制备物和纤维素材料的混合物,并且步骤(ii)(2)包括(2a)向所述管施加重力或离心力使得液相与固相分离;和(2b)除去上清液或收集结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料。在一个替代实施方案中,在步骤(ii)(1)和/或(ii)(2)中,在旋转柱或过滤装置中提供步骤(ii)(1)中获得的RNA制备物和纤维素材料的混合物,并且步骤(ii)(2)包括(2a′)向所述旋转柱或过滤装置施加重力、离心力、压力或真空使得液相与固相分离;和(2b′)丢弃流过液。
在阳性纯化方法的一个实施方案中,步骤(ii)还包括(3)将第二缓冲液的等分试样添加至结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料中;(4)在摇动和/或搅拌下孵育所得混合物,优选持续至少5分钟,更优选持续至少10分钟;和(5)将结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料与液相分离;以及任选地(6)重复步骤(3)至(5)一次或两次或更多次。
在阳性纯化方法的一个实施方案中,步骤(iii)包括(1)在摇动和/或搅拌下将结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料与第一缓冲液混合,优选持续至少5分钟,更优选持续至少10分钟,其中所述第一缓冲液包含水、乙醇和盐,优选氯化钠,其浓度允许dsRNA与纤维素材料结合但不允许ssRNA与纤维素材料结合;和(2)将包含ssRNA的液相与纤维素材料分离。在一个实施方案中,第一缓冲液中乙醇的浓度为14至20%(v/v),优选14至16%(v/v)。在一个实施方案中,第一缓冲液中盐的浓度为15至70mM,优选20至60mM。在一个实施方案中,第一缓冲液还包含缓冲物质,优选三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS),和/或螯合剂,优选EDTA。
在阳性纯化方法的一个实施方案中,在步骤(iii)中,在管中提供纤维素材料和第一缓冲液的混合物,并且步骤(iii)(2)包括(2a)向管施加重力或离心力以使得液相与固相分离;和(2b)收集包含ssRNA的上清液或除去纤维素材料。在一个替代实施方案中,在步骤(iii)中,在旋转柱或过滤装置中提供纤维素材料和第一缓冲液的混合物,并且步骤(iii)(2)包括(2a′)向旋转柱或过滤装置施加重力、离心力、压力或真空;和(2b′)收集包含ssRNA的流过液。
在阳性纯化方法的一个实施方案中,步骤(ii)和(iii)重复一次或两次或更多次,其中在步骤(ii)和(iii)的一个循环中的步骤(iii)之后获得的ssRNA制备物用作下一个循环中的步骤(ii)的RNA制备物并且在步骤(ii)和(iii)的每个循环中的步骤(ii)中使用新的纤维素材料。
在阳性纯化方法的一个实施方案中,在步骤(ii)中,在柱中提供纤维素材料,步骤(ii)包括在允许dsRNA和ssRNA与纤维素材料结合的条件下将RNA制备物加载至柱上,并且步骤(iii)包括在允许dsRNA与纤维素材料结合但不允许ssRNA与纤维素材料结合的条件下从纤维素材料中洗脱ssRNA。在一个实施方案中,在步骤(ii)中,RNA制备物作为包含ssRNA和第二缓冲液的液体提供并加载至柱上,其中第二缓冲液包含水、乙醇和盐,优选氯化钠,其浓度允许dsRNA和ssRNA与纤维素材料结合。在一个实施方案中,第二缓冲液中乙醇的浓度为至少35%(v/v),优选38至42%(v/v)。在一个实施方案中,第二缓冲液中盐的浓度为15至70mM,优选20至60mM。在一个实施方案中,第二缓冲液还包含缓冲物质,优选三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS),和/或螯合剂,优选EDTA。在一个实施方案中,步骤(iii)使用第一缓冲液作为洗脱剂进行,其中第一缓冲液包含水、乙醇和盐,优选氯化钠,其浓度允许dsRNA与所述纤维素材料结合但不允许ssRNA与所述纤维素材料结合。在一个实施方案中,第一缓冲液中乙醇的浓度为14至20%(v/v),优选14至16%(v/v)。在一个实施方案中,第一缓冲液中盐的浓度为15至70mM,优选20至60mM。在一个实施方案中,第一缓冲液还包含缓冲物质,优选三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS),和/或螯合剂,优选EDTA。
在第一方面的一个实施方案中,通过使用选自T3、T7和SP6RNA聚合酶的RNA聚合酶产生RNA制备物。
在第一方面的一个实施方案中,在步骤(ii)之前,对RNA制备物进行至少一种预纯化处理。在一个实施方案中,所述至少一种预纯化处理包括以下一种或更多种:核酸的沉淀,优选使用氯化锂;核酸与磁珠的结合;超滤;和DNA的降解,优选使用双链特异性核酸酶(DSN)。
在第一方面的一个实施方案中,ssRNA是mRNA或抑制性RNA(例如反义RNA、siRNA或miRNA)。
在第一方面的一个实施方案中,ssRNA的长度为至少2,700nt、优选至少2,800nt、至少2900nt、至少3,000nt、至少3,100nt、至少3,200nt、至少3,300nt、至少3,400nt,例如至少3500nt、至少3,600nt、至少3,700nt、至少3,800nt、至少3,900nt、至少4,000nt、至少4,100nt、至少4,200nt、至少4,300nt、至少4,400nt或至少4500nt。
在第一方面的一个实施方案中,纤维素材料包含纤维素纤维,优选适合用作分配色谱试剂等级的纤维素纤维。在一个实施方案中,在步骤(ii)中与RNA制备物接触之前,纤维素材料作为经洗涤的纤维素材料提供。在一个实施方案中,纤维素材料的洗涤包括(I)在摇动和/或搅拌下将纤维素材料与洗涤溶液混合,优选持续至少5分钟,更优选持续至少10分钟;和(II)除去液体或收集纤维素材料;以及任选地(III)重复步骤(I)和(II)一次或两次或更多次。在一个实施方案中,如果步骤(ii)在允许dsRNA与经洗涤的纤维素材料结合但不允许ssRNA与经洗涤的纤维素材料结合的条件下进行(即,在“阴性”纯化方法的实施方案中),则洗涤溶液具有组分(A)如上文或下文所限定的第一缓冲液,或如果步骤(ii)在允许dsRNA和ssRNA与经洗涤的纤维素结合的条件下进行(即,在“阳性”纯化方法的实施方案中),则洗涤溶液具有组分(B)如上文或下文所定义的第二缓冲液。
在第二方面,本发明提供了通过第一方面的任何方法可获得的ssRNA。在第二方面的一个实施方案中,ssRNA基本上不含dsRNA和/或基本上不含DNA,优选基本上不含dsRNA和DNA。
在第三方面,本发明提供了用于治疗的第二方面的ssRNA。
从以下任选结合附图的详细描述中,本发明的其他方面以及优点和新特征将变得明显。
附图简述
图1:通过纤维素从IVT RNA拉下dsRNA。在存在含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液的情况下,在与纤维素材料一起孵育后,使用dsRNA-特异性J2抗体通过斑点印迹分析50μg的2,500nt长m1Ψ-修饰的IVT RNA的未结合级分和结合级分的dsRNA污染物。为了比较,平行地分析未纯化的RNA(输入)。加载180ng、900ng和1,800ng相应RNA的RNA用于斑点印迹分析。为了对照RNA完整性,将80ng的RNA加载至1.4%(w/v)琼脂糖凝胶上并通过电泳分离。
图2:不同浓度的EtOH对通过纤维素从IVT RNA去除dsRNA的效率的影响。在存在含有16%(v/v)、18%(v/v)或20%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液的情况下,在与纤维素材料一起孵育后,分别使用dsRNA特异性J2抗体或RNA-DNA杂交特异性S 9.6抗体通过斑点印迹分析50μg的1,500nt-长Ψ-修饰的和D2-加帽的IVT RNA的未结合级分和结合级分的dsRNA污染物和RNA/DNA杂交污染物。为了比较,平行地分析未纯化的RNA(输入)。将40ng、200ng和1,000ng相应RNA的RNA加载到两个单独的膜上,其各自在斑点印迹分析中与指定的抗体杂交。
图3:IVT RNA的纤维素纯化与RNaseIII处理和HPLC纯化的比较。使用微型离心机旋转柱和含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液,通过纤维素将100μg的2,500nt长m1Ψ-修饰的IVT RNA纯化1×、2×或3×。使用dsRNA特异性J2抗体通过斑点印迹分析200ng、1,000ng和3,000ng纤维素纯化的RNA的dsRNA污染物。为了比较,将相同量的未纯化的RNA以及经RNaseIII处理的和HPLC纯化的RNA加载至斑点印迹膜上。通过密度测定法定量杂交信号,并将值表示为从未纯化的RNA中去除的dsRNA的百分比。为了对照RNA完整性,将80ng的RNA加载至1.4%(w/v)琼脂糖凝胶上并通过电泳分离。
图4:不同类型的纤维素在从IVT RNA中去除dsRNA的性能方面的比较。在使用不同的纤维素(Sigma,C6288;Macherey-Nagel,MN 100and MN 2100)、微型离心机旋转柱和含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液进行1个纯化循环后,通过斑点印迹分析100μg的1,500nt长m1Ψ修饰的IVT RNA的未结合级分和结合级分。使用dsRNA特异性J2抗体分析80ng、400ng和2,000ng RNA的样品的dsRNA污染物。为了比较,将相同量的未纯化的RNA(输入RNA)加载至斑点印迹膜上。通过密度测定法定量杂交信号,并将值表示为从未纯化的RNA中去除的dsRNA的百分比。为了监测RNA完整性,将80ng的RNA加载至1.4%(w/v)琼脂糖凝胶上并通过电泳分离。
图5:纤维素纯化方法是可扩展的。使用真空驱动的过滤装置和含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液,通过纤维素将5mg的1,900nt长D1-加帽的IVT RNA纯化1×或2×。使用dsRNA特异性J2抗体通过斑点印迹分析40ng、200ng和1,000ng纤维素纯化的RNA的dsRNA污染物。为了比较,将相同量的未纯化的RNA(输入RNA)加载至斑点印迹膜上。通过密度测定法定量杂交信号,并将值表示为从未纯化的RNA中去除的dsRNA的百分比。为了对照RNA完整性,将80ng的RNA加载至1.4%(w/v)琼脂糖凝胶上并通过电泳分离。显示了两种样品的RNA回收率。
图6:使用“阳性”纯化方法纯化具有不同长度的IVT RNA。使用400μg的>10,000nt长的D1-加帽的IVT RNA,1,300nt长的D2-加帽的IVT RNA(A)和2,500nt长的IVT RNA(未加帽的)(B)进行2个循环的纤维素纯化。RNA都不包含核苷修饰。在第一个循环期间,使用含有40%(v/v)EtOH的1×STE使RNA与纤维素完全结合,然后用含有16%(v/v)的缓冲液洗脱,并转移到含有纤维素材料的第二微型离心机旋转柱(“阳性”纯化)。使用dsRNA特异性J2抗体通过斑点印迹分析指定量的纯化RNA的dsRNA污染物。为了比较,将相同量的未纯化的RNA加载至斑点印迹膜上。为了监测RNA完整性,将80ng的RNA加载至1.4%(w/v)琼脂糖凝胶上并通过电泳分离。
图7:使用具有不同离子强度的缓冲液纯化IVT RNA。使用含有25至150mM NaCl(A)或0至50mM NaCl(B)的1×STE缓冲液对250μg(A)或160μg(B)1,300nt长m1Ψ-修饰的IVTRNA进行纤维素纯化。在用含有16%(v/v)EtOH的相应缓冲液洗脱并随后用0%(v/v)EtOH缓冲液洗脱之前,在存在40%(v/v)EtOH的情况下使RNA与纤维素完全结合。使用dsRNA特异性J2抗体通过斑点印迹分析40ng、200ng、1,000ng和3,000ng经洗脱的RNA的dsRNA污染物。由于低回收率,在(B)中仅可加载40ng、200ng和1,000ng经0%(v/v)EtOH洗脱的RNA用于斑点印迹分析。为了比较,将相同量的未纯化的RNA(输入RNA)加载至斑点印迹膜上。通过密度测定法定量杂交信号,并将值表示为从未纯化的RNA中去除的dsRNA的百分比。为了监测RNA完整性,将80ng的RNA加载至1.4%(w/v)琼脂糖凝胶上并通过电泳分离。
图8:通过FPLC进行IVT RNA的纤维素纯化。(A)示出了500μg的1300nt长m1Ψ-修饰的IVT RNA的FPLC-色谱图,其中将RNA加载至填充有4g纤维素材料的XK 16/20柱上。用含有40%(v/v)EtOH的1×STE进行结合,通过将运行缓冲液的EtOH浓度分别降低至16%(v/v)和0%(v/v)来洗脱ssRNA和dsRNA污染物。收集色谱图中灰色框表示的级分(F1:16%EtOH洗出液,F2:0%EtOH洗出液)。(B)使用dsRNA特异性J2抗体通过斑点印迹分析从级分F1和F2回收的40ng、200ng、1,000ng和3,000ng RNA的dsRNA污染物。为了比较,将相同量的未纯化的RNA(输入RNA)加载至斑点印迹膜上。通过密度测定法定量杂交信号,并将值表示为从未纯化的RNA中去除的dsRNA的百分比。为了监测RNA完整性,将80ng的RNA加载至1.4%(w/v)琼脂糖凝胶上并通过电泳分离。
图9:使用不同EtOH浓度进行IVT RNA的纯化以用于ssRNA洗脱。使用含有6%、10%、12%、14%、16、18%、20%或24%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液对200μg的1,500nt长D1-加帽的IVT RNA进行纤维素纯化以洗脱ssRNA。在洗脱之前,在存在40%(v/v)EtOH的情况下,RNA与纤维素完全结合。使用dsRNA特异性J2抗体通过斑点印迹分析200ng、1,000ng和3,000ng的经洗脱的ssRNA的dsRNA污染物(A)。为了比较,将相同量的未纯化的RNA(输入RNA)加载至斑点印迹膜上。为了监测RNA完整性,将80ng的RNA加载至1.4%(w/v)琼脂糖凝胶上并通过电泳分离。(B)通过密度测定法定量杂交信号并将值(表示为从未纯化的RNA中去除的dsRNA的百分比)相对于用于洗脱的EtOH浓度作图(实线),并与从各个洗脱物中回收的RNA的比率进行比较(虚线)。
图10:测定纤维素的RNA结合能力。将0.1g纤维素(Sigma,C6288)与25μg、50μg、100μg、250μg、500μg、750μg、1,000μg或1,500μg的1,500nt长D1加帽的IVT RNA在微型离心机旋转柱中在500μl含有40%(v/v)EtOH的1×STE中孵育。通过离心分离未结合的RNA后,逐步洗脱纤维素结合的RNA,首先用含有16%(v/v)EtOH的1×STE洗脱和最后用H2O(0%(v/v)EtOH)洗脱。沉淀后,通过分光光度法测定从流过液(A,B;40%(v/v)EtOH,实线)、16%(v/v)EtOH洗出液(A,B;虚线)和0%(v/v)EtOH洗出液(A,B;虚线)中回收的RNA量,并相对于用于纯化的RNA的总量作图。值表示为相对于所使用的RNA总量的回收率(A)或回收的RNA的总产量(B)。使用dsRNA特异性J2抗体通过斑点印迹分析从16%(v/v)洗出液中回收的200ng、1,000ng和3,000ng RNA的dsRNA污染物(C)。为了比较,将相同量的未纯化的RNA(输入RNA)加载至斑点印迹膜上。为了监测RNA完整性,将80ng的这些RNA加载至1.4%(w/v)琼脂糖凝胶上并通过电泳分离。通过密度测定法定量杂交信号,并将值(表示为从未纯化的RNA中去除的dsRNA的百分比)相对于用于纯化的RNA的总量作图(D;实线),并与从个体16%(v/v)EtOH洗出液回收的RNA的比率进行比较(D;虚线)。
图11:IVT RNA的纤维素纯化对其可翻译性和免疫原性的影响。编码鼠***(EPO)的D1加帽的IVT RNA(200μg)保持未纯化或通过使用2个旋转柱的2步法纯化,每个柱填充纤维素材料:第1柱:IVT RNA的阳性纯化(即,使用含有40%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液结合dsRNA和ssRNA;使用含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液洗脱ssRNA;第2柱:来自第1柱的洗出液的阴性纯化(即,含有ssRNA的并且通过使用含有16%EtOH的1×STE缓冲液从第1柱获得的洗出液)。从第二柱获得的流过液用异丙醇/乙酸钠沉淀并再溶解在H2O中。在用TransIT(Mirus Bio)配制后,将IVT RNA以3μg RNA/动物的剂量经腹膜内注射到小鼠(n=4)中。在注射后2、6和24小时抽血,并收集血浆样品。对照小鼠仅注射TransIT。使用特异性ELISA测定法(鼠干扰素α特异性ELISA(eBioscience);鼠EPO特异性DuoSet ELISA显色试剂盒(R&D))测量鼠干扰素α(A)和鼠EPO ( B)的水平。
发明详述
尽管下文更详细地描述了本发明,但是应理解,本发明不限于本文中所描述的具体方法、方案和试剂,因为这些可以变化。还应理解,本文中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的,并不旨在限制本发明的范围,本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。除非另有定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
在下文中,将更详细地描述本发明的要素。这些要素与具体实施方案一起列出,然而,应理解,它们可以以任何方式和任何数量组合以形成另外的实施方案。多方面描述的实施例和优选实施方案不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或优选的要素组合的实施方案。此外,除非上下文另外指明,否则本申请中的所有描述的要素的任何排列和组合应被视为通过本申请的说明书公开。例如,如果在一个优选的实施方案中,ssRNA包含由120个核苷酸组成的poly(A)-尾,并且在另一个优选实施方案中,ssRNA分子包含5′-帽类似物,那么在一个优选的实施方案中,ssRNA包含由120个核苷酸组成的poly(A)-尾和5′-帽类似物。同样,如果在一个优选的实施方案中,第一缓冲液中的EtOH浓度为14至16%(v/v),而在另一个优选的实施方案中,第一缓冲液中的螯合剂浓度为15至40mM,则在一个优选的实施方案中,第一缓冲液包含浓度为14至16%(v/v)的EtOH和浓度为15至40mM的螯合剂。
优选地,本文中使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)”,H.G.W.Leuenberger,B.Nagel和H.编辑,Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland,(1995)中所述进行定义。
除非另外指明,否则本发明的实施将使用化学、生物化学和重组DNA技术的常规方法,这些方法在本领域的文献(参见,例如,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,J.Sambrook等.编辑.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor1989)中进行了解释。
在整个本说明书和所附的权利要求书中,除非上下文另有要求,否则词语“包括/包含(comprise)”以及变化形式例如“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprising)”将被理解为表示包括所述的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组,但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。术语“基本上由......组成”是指排除任何实质意义的其他成员、整数或步骤。术语“包含”包括术语“基本上由......组成”,基本上由......组成”又包括术语“由......组成”。因此,在本申请中每次出现时,术语“包含”可以用术语“基本上由......组成”或“由......组成”代替。同样,在本申请中每次出现时,术语“基本上由......组成”可以用术语“由......组成”代替。
除非在本文另外指明或与上下文明显矛盾,否则在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词及类似的引用表示一个/种或更多个/种。本文中值的范围的记载仅旨在用作单独引用落入该范围的每个单独的值的速记方法。除非本文中另外指明,否则将每个单独的值并入本说明书中,如同其在本文中被单独记载一样。除非本文中另外指明或者与上下文明显矛盾,否则本文中描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另外要求,否则本文中提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如,“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本发明,并不对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言均不应被解释为表示对实施本发明必要的任何未要求保护的要素。
在本说明书的整个文本中引用了若干文献。本文中引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等),无论在上文中还是在下文中,均通过引用整体并入本文。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权由于在先发明而先于这样的公开内容。
本文中使用的表述“允许dsRNA与纤维素材料结合的条件”是指这样的条件:其促进(例如,增强)dsRNA向纤维素材料的附着(优选非共价附着或吸附)、抑制与纤维素材料结合的dsRNA从所述纤维素材料释放,和/或降低游离dsRNA的量(即,未与纤维素材料结合的dsRNA)。这些条件可使得它们允许或不允许除dsRNA之外的RNA(例如ssRNA)与纤维素材料结合。因此,在一个实施方案中,表述“允许dsRNA与纤维素材料结合的条件”是“允许dsRNA与纤维素材料结合但不允许ssRNA与纤维素材料结合的条件”。在该实施方案中,条件(i)促进(例如,增强)dsRNA向纤维素材料的附着(优选非共价附着或吸附),抑制与纤维素材料结合的dsRNA从所述纤维素材料的释放,和/或降低游离dsRNA的量(即未与纤维素材料结合的dsRNA的量),和(ii)促进(例如,增强)ssRNA的未结合状态(即未与纤维素材料附着或吸附的ssRNA的状态),降低向纤维素材料附着(优选地,非共价附着或吸附)的ssRNA的量,和/或抑制ssRNA向纤维素材料的附着(优选地,非共价附着或吸附)。在一个替代实施方案中,表述“允许dsRNA与纤维素材料结合的条件”是“允许dsRNA和ssRNA与纤维素材料结合的条件”。在该替代实施方案中,所述条件促进(例如,增强)dsRNA和ssRNA向纤维素材料的附着(优选非共价附着或吸附),抑制与纤维素材料结合的dsRNA和ssRNA从所述纤维素材料的释放,和/或降低游离dsRNA和ssRNA的量(即,未与纤维素材料结合的dsRNA和ssRNA的量)。
允许或不允许dsRNA/ssRNA与纤维素材料结合的上述条件可以通过其中溶解了包含dsRNA/ssRNA的RNA制备物的、或添加至纤维素材料的介质的组成(例如缓冲液的组成)来控制。在这方面,“组成”是指介质中(例如,在缓冲液中)包含的组分的类型和量。
因此,在一个实施方案中,“允许dsRNA与纤维素材料结合但不允许ssRNA与纤维素材料结合的条件”可以通过包含水、乙醇和盐的第一介质(例如,第一缓冲液)实现,其浓度允许dsRNA与纤维素材料结合,但不允许ssRNA与纤维素材料结合。因此,为了满足这些条件,在步骤(ii)中,RNA制备物可以作为包含ssRNA和第一介质(例如第一缓冲液)的液体提供;纤维素材料可以作为第一介质(例如第一缓冲液)中的混悬液提供(例如,作为经洗涤的纤维素材料,其中第一介质(例如第一缓冲液)已用作洗涤溶液);RNA制备物可以作为包含ssRNA和第一介质(例如第一缓冲液)的液体提供,并且纤维素材料可以作为第一介质(例如第一缓冲液)中的混悬液提供;或者RNA制备物可以作为包含ssRNA和第一介质(例如,第一缓冲液)的液体提供,并且纤维素材料可以作为经洗涤的纤维素材料以干燥形式,或作为第一介质(例如第一缓冲液)中的混悬液提供(其中第一介质(例如,第一缓冲液)已经用作洗涤溶液)。
表述“其浓度允许dsRNA与纤维素材料结合但不允许ssRNA与纤维素材料结合”表示第一介质中(例如,在第一缓冲液中)组分(特别是水、乙醇和盐)的浓度足以(i)促进(例如,增强)dsRNA向纤维素材料的附着(优选非共价附着或吸附),抑制与纤维素材料结合的dsRNA从纤维素材料释放进入第一介质(例如,进入第一缓冲液),和/或降低第一介质中(例如,第一缓冲液中)的游离dsRNA的量(即,未与纤维素材料结合的dsRNA的量),和(ii)促进(例如,增强)ssRNA的未结合状态(即,未与纤维素材料附着或吸附的ssRNA的状态),降低向纤维素材料附着(优选地,非共价附着或吸附)的ssRNA的量和/或抑制ssRNA向纤维素材料的附着(优选地,非共价附着或吸附)。
此外,在一个实施方案中,“允许dsRNA和ssRNA与纤维素材料结合的条件”可以通过包含水、乙醇和盐的第二介质(例如,第二缓冲液)实现,其浓度允许dsRNA和ssRNA与纤维素材料结合。因此,为了满足这些条件,在步骤(ii)中,RNA制备物可以作为包含ssRNA和第二介质(例如第二缓冲液)的液体提供;纤维素材料可以作为第二介质(例如第二缓冲液)中的混悬液提供(例如,作为经洗涤的纤维素材料,其中第二介质(例如第二缓冲液)已用作洗涤溶液);RNA制备物可以作为包含ssRNA和第二介质(例如第二缓冲液)的液体提供,并且纤维素材料可以作为第二介质(例如第二缓冲液)中的混悬液提供;或者RNA制备物可以作为包含ssRNA和第二介质(例如,第二缓冲液)的液体提供,并且纤维素材料可以作为经洗涤的纤维素材料以干燥形式或作为第二介质(例如,第二缓冲液)中的混悬液提供(其中第二介质(例如,第二缓冲液)已经用作洗涤溶液)。
表述“其浓度允许dsRNA和ssRNA与纤维素材料结合”意指第二介质中(例如,在第二缓冲液中)的组分(特别是水、乙醇和盐)的浓度足以促进(例如,增强)dsRNA和ssRNA向纤维素材料的附着(优选非共价附着或吸附),抑制与纤维素材料结合的dsRNA和ssRNA从纤维素材料释放到第二介质中(例如,(或释放到第二缓冲液中),和/或降低第二介质中(例如,第二缓冲液中)游离dsRNA和ssRNA的量(即,未与纤维素材料结合的dsRNA和ssRNA的量)。
本发明人出人意料地发现,在存在浓度为14至20%(v/v)的乙醇的情况下,dsRNA而非ssRNA与纤维素材料选择性地结合。因此,在一个实施方案中,“允许dsRNA与纤维素材料结合但不允许ssRNA与纤维素材料结合的条件”可以通过如上所述的含有浓度为14至20%(v/v)、优选14至19%(v/v)、更优选14至18%(v/v),例如14至17%(v/v)、14至16%(v/v)、15至19%(v/v)、15至18%(v/v)、15至17%(v/v)、16至19%(v/v)或16至18%(v/v)的乙醇的第一介质(例如,第一缓冲液)实现。在一个实施方案中,除了上述公开范围内的乙醇之外,第一介质(例如,第一缓冲液)包含浓度为15至70mM,优选20至60mM,例如25至50mM或30至50mM的盐。第一介质(例如第一缓冲液)中的盐优选为氯化钠。然而,基于本申请中提供的信息和数据,技术人员可以容易地确定适合于本发明的方法中使用的第一介质(例如,第一缓冲液)的其他盐及其浓度。第一介质(例如第一缓冲液)的其他任选组分包括缓冲物质(优选TRIS或HEPES,更优选TRIS),和/或螯合剂(优选EDTA或次氮基三乙酸,更优选EDTA)。在一个实施方案中,第一介质(例如第一缓冲液)中缓冲物质的浓度为5至40mM,优选6至30mM,例如8至20mM或10至15mM。在一个实施方案中,第一介质(例如,第一缓冲液)的pH为6.5至8.0,优选6.7至7.8,例如6.8至7.2(例如,当TRIS是缓冲物质时)或7.3至7.7(例如,当HEPES是缓冲物质时)。在一个实施方案中,第一介质(例如第一缓冲液)中螯合剂的浓度为10至50mM,优选15至40mM,例如20至30mM。
在一个实施方案中,第一介质(例如,第一缓冲液)包含水、乙醇、TRIS和EDTA(例如水、乙醇、盐(优选氯化钠)、TRIS和EDTA),优选浓度为上文对第一介质(例如,第一缓冲液)所指明的。然而,基于本申请中提供的信息和数据,技术人员可以容易地确定适合于本发明的方法中使用的第一介质(例如,第一缓冲液)的除TRIS之外的缓冲物质和/或除EDTA之外的螯合剂和/或除氯化钠之外的盐及其浓度。例如,在一个实施方案中,除上述公开范围内(即14至20%(v/v)等)的乙醇之外,第一介质(例如,第一缓冲液)包含量为5至40mM的TRIS,和量为15至70mM的盐(优选氯化钠)。在另一个实施方案中,除上述公开范围内(即14至20%(v/v)等)的乙醇之外,第一介质(例如,第一缓冲液)包含量为5至40mM的HEPES和量为100至150mM(例如,110至140mM或120至130mM)的盐(优选氯化钠)。
在一个实施方案中,“允许dsRNA和ssRNA与纤维素材料结合的条件”可以通过如上所述含有浓度为至少35%(v/v)、优选至少36%(v/v)、至少37%(v/v)、至少38%(v/v)、至少39%(v/v)、至少40%(v/v),例如35至45%(v/v)、36至45%(v/v)、37至45%(v/v)、38至45%(v/v)、38至42%(v/v)或39至41%(v/v)的乙醇的第二介质(例如,第二缓冲液)实现。在一个实施方案中,除了上述公开范围内(即,至少35%(v/v)、至少36%(v/v)、至少包含37%(v/v)、至少38%(v/v)等)的乙醇之外,第二介质(例如,第二缓冲液)包含浓度为15至70mM,优选20至60mM,例如25至50mM或30至50mM的盐。第二介质(例如第二缓冲液)中的盐优选为氯化钠。然而,基于本申请中提供的信息和数据,技术人员可以容易地确定适合于本发明的方法中使用的第二介质(例如,第二缓冲液)的其他盐及其浓度。第二介质的其他任选组分(例如,第二缓冲液)包含缓冲物质(优选TRIS或HEPES,更优选TRIS),和/或螯合剂(优选EDTA或次氮基三乙酸,更优选EDTA)。在一个实施方案中,第二介质(例如第二缓冲液)中缓冲物质的浓度为5至40mM,优选6至30mM,例如8至20mM或10至15mM。在一个实施方案中,第二介质(例如,第二缓冲液)的pH为6.5至8.0,优选6.7至7.8,例如6.8至7.2(例如,当TRIS是缓冲物质时)或7.3至7.7(例如,当HEPES是缓冲物质时)。在一个实施方案中,第二介质(例如第二缓冲液)中螯合剂的浓度为10至50mM,优选15至40mM,例如20至30mM。
在一个实施方案中,第二介质(例如,第二缓冲液)包含水、乙醇、TRIS和EDTA(例如水、乙醇、盐(优选氯化钠)、TRIS和EDTA),优选浓度为上文对第二介质(例如,第二缓冲液)所指明的。然而,基于本申请中提供的信息和数据,技术人员可以容易地确定适合于本发明方法的第二介质(例如,第二缓冲液)中使用的除TRIS之外的缓冲物质和/或除EDTA之外的螯合剂和/或除氯化钠之外的盐及其浓度。在一个实施方案中,除了上述公开范围内(即,至少35%(v/v)、至少36%(v/v)、至少37%(v/v)、至少38%(v/v)等)的乙醇之外,第二介质(例如,第二缓冲液)包含量为5至40mM的TRIS,量为15至70mM的盐(优选氯化钠)。在另一个实施方案中,除了上述公开范围内(即,至少35%(v/v)、至少36%(v/v)、至少37%(v/v)、至少38%(v/v)等)的乙醇之外,第二介质(例如,第二缓冲液)包含量为5至40mM的HEPES,量为100至150mM(例如,110至140mM或120至130mM)的盐(优选氯化钠)。
在一个实施方案中,第一和第二介质(即第一和第二缓冲液)不仅在乙醇浓度方面不同,而且在一种或更多种其他组分(例如盐、任选的缓冲物质和/或任选的螯合剂)的类型和/或浓度方面不同。在一个优选的实施方案中,除乙醇浓度外,第一和第二介质(即第一和第二缓冲液)具有相同的组成(即,关于除水之外的组分(例如盐、任选的缓冲物质和任选的螯合剂)的类型和浓度)。
本文中使用的表述“在允许dsRNA与纤维素材料结合的条件下将ssRNA从纤维素材料分离”意指将包含ssRNA的相(所述相优选为液体)从结合dsRNA的纤维素材料分离。这样的隔离/分离可以通过技术人员已知的几种方式完成,例如,通过仅选择性地去除结合dsRNA的纤维素材料(例如,通过使用与磁珠共价偶联的纤维素作为纤维素材料并使用磁铁)或收集仅包含ssRNA的相(例如,通过使用移液管)。
例如,在一个实施方案中,在管中提供RNA制备物、纤维素材料和第一缓冲液的混合物(在该实施方案中,优选的是(α)RNA制备物作为包含ssRNA和第一缓冲液的液体提供,和/或(β)纤维素材料作为经洗涤的纤维素材料以干燥形式或作为第一介质(例如第一缓冲液)中的混悬液提供(其中第一缓冲液已用作洗涤溶液),和/或(γ)在摇动和/或搅拌下将RNA制备物、纤维素材料和第一缓冲液混合(优选持续至少5分钟,更优选持续至少10分钟,例如5至30分钟或10至20分钟);最优选的是(α)RNA制备物作为包含ssRNA和第一缓冲液的液体提供,(β)纤维素材料作为经洗涤的纤维素材料以干燥形式或作为第一介质(例如,第一缓冲液)中的混悬液提供(其中第一缓冲液已用作洗涤溶液),和(γ)在摇动和/或搅拌下将RNA制备物、纤维素材料和第一缓冲液混合,例如5至30分钟或10至20分钟)。在该实施方案中,优选的是,步骤(iii)包括(1)向管施加重力或离心力(例如,10,000×g至15,000×g,1至5分钟)使得液相与固相分离(优选完全分离));和(2)收集包含ssRNA的上清液(例如,通过使用移液管)或除去纤维素材料(例如,通过使用与磁珠共价偶联的纤维素作为纤维素材料并使用磁铁)。步骤(ii)和(iii)可重复一次或两次或更多次(例如一次、两次或三次)。如果重复步骤(ii)和(iii),则在一个循环中的步骤(iii)之后获得的ssRNA制备物用作下一个(即紧接着的)循环中的步骤(ii)中的RNA制备物,并且在每个循环中使用新的纤维素材料(优选新的经洗涤的纤维素材料)。
在一个替代实施方案中,在旋转柱或过滤装置中提供RNA制备物、纤维素材料和第一缓冲液的混合物(在该实施方案中,优选的是(α)RNA制备物作为包含ssRNA和第一缓冲液的液体提供,和/或(β)纤维素材料作为经洗涤的纤维素材料以干燥形式或作为第一介质(例如,第一缓冲液)中的混悬液提供(其中第一缓冲液已用作洗涤溶液),和/或(γ)在摇动和/或搅拌下将RNA制备物、纤维素材料和第一缓冲液混合(优选持续至少5分钟,更优选持续至少10分钟,例如5至30分钟或10至20分钟);最优选的是(α)RNA制备物作为包含ssRNA和第一缓冲液的液体提供,(β)纤维素材料作为经洗涤的纤维素材料以干燥形式或作为第一介质(例如,第一缓冲液)中的混悬液提供(其中第一缓冲液已用作洗涤溶液),和(γ)在摇动和/或搅拌下将RNA制备物、纤维素材料和第一缓冲液混合,例如5至30分钟或10至20分钟)。在该实施方案中,优选的是,步骤(iii)包括(1′)向旋转柱或过滤装置施加重力、离心力(例如,10,000×g至15,000×g,1至5分钟)、压力(例如,1000hPa至3000hPa)或真空(例如,100hPa至900hPa,例如200hPa至800hPa)使得液相与固相分离(优选完全分离);和(2′)收集包含ssRNA的流过液。步骤(ii)和(iii)可重复一次或两次或更多次(例如一次、两次或三次)。如果重复步骤(ii)和(iii),则在一个循环中的步骤(iii)之后获得的ssRNA制备物用作下一个(即紧接着的)循环中的步骤(ii)中的RNA制备物,并且在每个循环中使用新的纤维素材料(优选新的经洗涤的纤维素材料)。
本文中使用的表述“使结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料与其余部分分离”意指将附着(优选非共价附着或吸附)dsRNA和ssRNA的固相(即纤维素材料)从另一相(所述另一相优选为液体)中分离出来。这样的隔离/分离可以以本领域技术人员已知的若干种方式完成,例如,通过仅选择性地收集结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料(例如,通过使用与磁珠共价偶联的纤维素作为纤维素材料并使用磁铁)或仅选择性地去除另一相(例如,通过使用移液管)。
例如,在一个实施方案中,在管中提供RNA制备物、纤维素材料和第二缓冲液的混合物(在该实施方案中,优选的是(α′)RNA制备物作为包含ssRNA和第二缓冲液的液体提供,和/或(β′)纤维素材料作为经洗涤的纤维素材料以干燥形式或作为第二介质(例如,第二缓冲液)中的混悬液提供(其中第二缓冲液已用作洗涤溶液),和/或(γ′)在摇动和/或搅拌下将RNA制备物、纤维素材料和第二缓冲液混合(优选持续至少5分钟,更优选持续至少10分钟,例如5至30分钟或10至20分钟);最优选的是(α′)RNA制备物作为包含ssRNA和第二缓冲液的液体提供,(β′)纤维素材料作为洗涤的纤维素材料以干燥形式或作为第二介质(例如,第二缓冲液)中的混悬液提供(其中第二缓冲液已被用作洗涤溶液),和(γ′)在摇动和/或搅拌下将RNA制备物、纤维素材料和第二缓冲液混合,例如5至30分钟或10至20分钟)。在该实施方案中,优选的是,步骤(ii)(2)(即“使结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料与其余部分分离”)包括(2a)向管施加重力或离心力(例如,10,000×g至15,000×g,1至5分钟)使得液相与固相分离(优选完全分离);和(2b)去除上清液(例如,通过使用移液管)或收集结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料(例如,通过使用与磁珠共价偶联的纤维素作为纤维素材料并使用磁铁)。步骤(ii)还可包括(3)将第二缓冲液的等分试样(优选等分试样为纤维素材料的体积的0.5至3倍(例如1至2倍))添加至结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料;(4)在摇动和/或搅拌下孵育所得混合物(优选5至20分钟或10至15分钟);和(5)将结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料与液相分离(优选以与上述步骤(2a)和(2b)中定义的相同方式进行所述分离);以及任选地(6)重复步骤(3)至(5)一次或两次或更多次(例如一次、两次或三次)。步骤(iii)可包括(1)在摇动和/或搅拌下将结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料与如上所述的第一缓冲液(例如,具有浓度为14至20%(v/v),优选14至16%(v/v)的EtOH)混合(优选持续至少5分钟,更优选持续至少10分钟,例如5至30分钟或10至20分钟);和(2)将包含ssRNA的液相与纤维素材料分离(优选地,将包含ssRNA的液相与纤维素材料分离的步骤如上所述进行,例如通过向管施加重力或离心力(例如,10,000×g至15,000×g,1至5分钟)使得液相与固相分离(优选完全分离);和(2)收集包含ssRNA的上清液(例如,通过使用移液管)或除去纤维素材料(例如,通过使用与磁珠共价偶联的纤维素作为纤维素材料并使用磁铁)。步骤(ii)和(iii)可重复一次或两次或更多次(例如一次、两次或三次)。如果重复步骤(ii)和(iii),则在一个循环中的步骤(iii)之后获得的ssRNA制备物用作下一个(即紧接着的)循环中的步骤(ii)中的RNA制备物并且在每个循环中使用新的纤维素材料(优选新的经洗涤的纤维素材料)。
在一个替代实施方案中,在旋转柱或过滤装置中提供RNA制备物、纤维素材料和第二缓冲液的混合物(在该实施方案中,优选的是(α′)RNA制备物作为包含ssRNA和第二缓冲液的液体提供,和/或(β′)纤维素材料作为经洗涤的纤维素材料以干燥形式或作为第二介质中(例如,第二缓冲液)的混悬液提供(其中第二缓冲液已用作洗涤溶液)和/或(γ′)在摇动和/或搅拌下将RNA制备物、纤维素材料和第二缓冲液混合(优选持续至少5分钟,更优选持续至少10分钟,例如持续5至30分钟或10至20分钟);最优选的是,(α′)RNA制备物作为包含ssRNA和第二缓冲液的液体提供,(β′)纤维素材料作为经洗涤的纤维素材料以干燥形式或作为第二介质(例如,第二缓冲液)中的混悬液提供(其中第二缓冲液已用作洗涤溶液),和(γ′)在摇动和/或搅拌下将RNA制备物、纤维素材料和第二缓冲液混合,例如5至30分钟或10至20分钟)。在该实施方案中,优选步骤(ii)(2)(即“使结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料与其余部分分离”)包括(2a′)向旋转柱或过滤装置施加重力、离心力(例如,10,000×g至15,000×g,1至5分钟)、压力(例如,1000hPa至3000hPa),或真空(例如,100hPa至900hPa,例如200hPa至800hPa)使得液相与固相分离(优选完全分离);和(2b′)丢弃流过液。步骤(ii)还可包括(3)向结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料添加第二缓冲液的等分试样(优选等分试样为纤维素材料的体积的0.5至3倍(例如1至2倍);(4)在摇动和/或搅拌下孵育所得混合物(优选5至20分钟或10至15分钟);和(5)使结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料与液相分离(优选分离与上述步骤(2a′)和(2b′)中限定的相同方式进行;以及任选地(6)重复步骤(3)至(5)一次或两次或更多次(例如一次、两次或三次)。步骤(iii)可包括(1)在摇动和/或搅拌下将结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料与如上所述的第一缓冲液混合(例如,具有浓度为14至20%(v/v),优选14至16%(v/v)的EtOH)(优选持续至少5分钟,更优选持续至少10分钟,例如5至30分钟或10至20分钟);和(2)将包含ssRNA的液相与纤维素材料分离(优选地,使包含ssRNA的液相与纤维素材料分离的步骤如上所述进行,例如通过向旋转柱或过滤装置施加重力、离心力(例如,10,000×g至15,000×g,1至5分钟)、压力(例如,1000hPa至3000hPa),或真空(例如,100hPa至900hPa,例如200hPa至800hPa)使得液体和分离固相(优选完全分离);以及收集包含ssRNA的流过液。步骤(ii)和(iii)重复一次或两次或更多次(例如一次、两次或三次)。如果重复步骤(ii)和(iii),在一个循环中的步骤(iii)之后获得的ssRNA制备物用作下一个(即紧接着的)循环中的步骤(ii)中的RNA制备物,并且在每个循环中使用新的纤维素材料(优选新的经洗涤的纤维素材料)。
在阳性纯化方法的一个实施方案中,在柱中提供纤维素材料(在该实施方案中,优选的是纤维素材料作为经洗涤的纤维素材料提供,其中如上所述的第二缓冲液(即具有浓度为至少35%(v/v)、至少36%(v/v)、至少37%(v/v)、至少38%(v/v)等的EtOH)已被用作洗涤溶液)。在该实施方案中,优选的是在步骤(ii)中将RNA制备物加载至柱上之前,用如上所述的第二缓冲液(例如,用所述第二缓冲液的等分试样)平衡(即洗涤)包含纤维素材料的柱。此后,将RNA制备物(优选作为包含ssRNA和所述第二缓冲液的液体提供)加载至柱上(优选通过注射),并且优选用所述第二缓冲液(例如,用所述第二缓冲液的另一等分试样,优选为柱中所含纤维素材料体积的0.5至2倍)洗涤柱。该洗涤步骤是优选的,因为它可以洗掉除RNA之外的污染物(这些污染物特别包括用于产生IVT RNA(其任选地被修饰)的起始材料及其降解产物,例如DNA模板;RNA聚合酶(例如T7、T3或SP6);未修饰形式的单核糖核苷酸(例如,rATP、rGTP、rCTP、rUTP及仅具有一个或两个磷酸基团的其类似物)或修饰形式(例如r(1mΨ)TP或rΨTP及只有一个或两个磷酸基团的其类似物);焦磷酸盐;加帽试剂(即引入5′-帽或5′-帽类似物的试剂);和用于产生IVT RNA的添加剂(例如缓冲剂、盐、抗氧化剂、多胺(例如亚精胺))。步骤(iii)优选使用如上所述的第一缓冲液(即,EtOH浓度为14至20%(v/v),优选14至16%(v/v)))作为洗脱剂进行,从而从纤维素材料中释放ssRNA。可以通过使用常规手段(例如,UV/VIS-检测器,例如二极管阵列-检测器),例如在波长260nm(用于检测核酸)和/或215nm(用于检测肽/蛋白质)和/或280nm(用于检测含有芳香族氨基酸的肽/蛋白质)下检测和/或监测从柱洗脱或洗涤的化合物(特定ssRNA,任选地还有dsRNA)。
通过本发明的任何方法获得的ssRNA(特别是无论是否已使用“阴性”或“阳性”纯化方法)可以进行进一步处理,例如沉淀和/或修饰。例如,可使用常规方法(例如,使用“乙酸钠/异丙醇”沉淀法或“LiCl”沉淀法)沉淀通过本发明方法获得的ssRNA,从而产生干燥形式的ssRNA制备物。干燥的ssRNA可以储存(例如,在-70℃下)或者可以溶解在合适的溶剂(例如水或TE缓冲液(10mM TRIS,1mM EDTA))中,然后储存(例如,在-70℃下)或进一步使用(例如,用于制备药物组合物)。作为替代或补充,可以进一步修饰ssRNA,例如,通过去除未加帽的5′-三磷酸酯和/或添加帽结构,然后将其储存(例如,在-70℃下)或使用(例如,用于制备药物组合物)。
如在本申请的实施例中所证明的,本发明的方法提供了若干优点,例如以下一种或更多种。例如,本发明的方法提供了广谱的不同纯化技术,包括简单的离心步骤、微型离心机旋转柱、真空驱动的过滤***和FPLC。与HPLC方法相比,本发明的方法节约成本且简单(不需要复杂的设备),避免有毒物质(例如乙腈),并提供相当高纯度和产量的ssRNA。此外,因为纤维素是天然产物,可以预期本发明的基于纤维素并且有效纯化ssRNA(特别是IVTssRNA)的方法在转移到GMP调节的环境中时面对较低的复杂性。此外,在本申请中已经证明,与常规HPLC方法相比,本发明的方法可以容易地进行扩大规模并且耗时更少。在这方面,应注意常规HPLC方法(例如Weissman等,同上中所公开的那些)通常受到柱尺寸和使用大的柱所涉及的反压(back pressure)问题的限制。本发明方法的情况不同。例如,如在本申请(参见实施例5)中所证明的,当使用本发明的方法时,可以在少于2小时内实现50至100mg IVT RNA的纯化。相反,实施例3中使用的HPLC柱(Semi-Prep RNASep 100×21.1mm,Transgenomic),柱体积为35ml,具有1mg IVT RNA的最大结合能力。与使用本发明的方法仅2小时相比,因为使用这样的HPLC柱的标准纯化运行花费超过60分钟,所以50mg IVT RNA的纯化将花费约50小时。此外,使用常规的基于HPLC的方法纯化长IVT RNA引起一些问题并且经常导致(a)IVT RNA的高损失(特别是当IVT RNA具有至少约2,700nt的长度时(优选至少2,800nt、至少2,900nt、至少3,000nt、至少3,100nt、至少3,200nt、至少3,300nt、至少3,400nt,更优选至少3,500nt、至少3,600nt、至少3,700nt、至少3,800nt、至少3,900nt、至少4,000nt、至少4,100nt、至少4,200nt、至少4,300nt、至少4,400nt,更优选至少4,500nt、至少4,600nt、至少4,700nt、至少4,800nt、至少4,900nt、至少5,000nt),因为在常规的基于HPLC的方法中具有这样长度的IVT RNA不洗脱为确定的尖峰,而是洗脱为宽峰,因此需要在长时间内收集洗出液(包含ssRNA)以最小化ssRNA的损失,和/或更重要的是,(b)IVT RNA的降解(特别是当长IVT RNA(例如,具有至少3,500nt、例如至少4,000nt、至少4,500nt、至少5,000nt、至少5,500nt、至少6,000nt、至少6,500nt、至少7,000nt、至少7,500nt、至少8,000nt、至少8,500nt、至少9,000nt或至少9,500nt的大小)可由于长RNA通过紧密填充的柱材料期间的剪切而被纯化时)。相反,如本申请中所证明的,使用本发明的方法用于纯化尺寸为约10,000nt或更大的IVT RNA不会导致RNA的降解。此外,发现通过使用本发明的方法,可以在确定的尖峰中从纤维素材料洗脱IVT ssRNA(特别是长度至少约2,700nt的IVTssRNA(优选至少2,800nt、至少2,900nt、至少3,000nt、至少3,100nt、至少3,200nt、至少3,300nt、至少3,400nt,更优选至少3,500nt、至少3,600nt、至少3,700nt、至少3,800nt、至少3,900nt、至少4,000nt、至少4,100nt、至少4,200nt、至少4,300nt、至少4,400nt,更优选至少4,500nt、至少4,600nt、至少4,700nt、至少4,800nt、至少4,900nt、至少5,000nt)),从而将待收集的洗出液(包含ssRNA)的量(即体积)降低至最小。最后,与使用大肠杆菌RNaseIII的常规方法相比(其在孵育期间经常导致ssRNA,特别是长ssRNA的部分降解(可能是由于RNaseIII催化的包含在ssRNA中的双链二级结构的水解)),纯化的RNA的完整性使得本发明的方法更优异。
本文中使用的术语“摇动和/或搅拌”是指适合混合(优选充分混合)混合物的任何动作,例如包含固相(例如纤维素材料)和液相(例如介质(例如,缓冲液))、洗涤溶液或在介质(例如缓冲液)中溶解的RNA制备物)的混合物。实现“摇动和/或搅拌”的示例性装置是本领域技术人员已知的并且包括振荡器、混合器(例如,涡旋混合器或静态混合器)、磁力搅拌器(包括搅拌棒)和搅拌棒,根据待混合的混合物的体积,其可具有不同的尺寸。混合物的摇动和/或搅拌可以进行足够的时间以实现彻底混合,例如至少1分钟(例如至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少8分钟、至少10分钟)的时间。用于摇动和/或搅拌混合物的最长时间可长达40分钟(例如长达35分钟、长达30分钟、长达28分钟、长达26分钟、长达24分钟、长达22分钟或长达20分钟)。因此,用于摇动和/或搅拌混合物的示例性时间范围是5至40分钟、5至30分钟、5至20分钟、10至40分钟、10至30分钟、10至20分钟、15至40分钟、15至30分钟或15至20分钟。通常,摇动和/或搅拌的持续时间将取决于例如预期用途(例如,纤维素材料的洗涤或RNA与纤维素材料的结合)和待混合的固体的量等因素。例如,为了洗涤纤维素材料,摇动和/或搅拌的持续时间可以为1至15分钟,例如5至10分钟。对于RNA与纤维素材料的结合,当使用高达1g的纤维素材料时,摇动和/或搅拌的持续时间可以是5至20分钟(例如10至20分钟),或当使用多于1g的纤维素材料时,摇动和/或搅拌的持续时间可以是10至30分钟(例如15至30分钟)。同样地,为了从纤维素材料中释放与纤维素材料结合的RNA(特别是ssRNA),当使用高达1g的纤维素材料时,摇动和/或搅拌的持续时间可以是5至20分钟(例如10至20分钟),或当使用多于1g的纤维素材料时,摇动和/或搅拌的持续时间可以是10至30分钟(例如15至30分钟)。
关于第一和第二介质(例如第一和第二缓冲液)使用的术语“盐”是指由酸和碱的中和反应产生的任何离子化合物。优选地,盐(i)不是缓冲物质,(ii)不是螯合剂,或(iii)既不是缓冲物质也不是螯合剂。示例性的酸包括无机酸(例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸、硼酸和高氯酸)和有机酸(例如,一元羧酸,优选具有1至5个(例如1、2或3)碳原子的那些,例如甲酸、乙酸和丙酸),优选无机酸。示例性的碱包括无机碱(例如NH3、氢氧化铵(NH4OH),以及金属的氧化物和氢氧化物,优选碱金属、土金属和碱土金属的氧化物和氢氧化物(例如,Li、Na、K、Rb、Be、Mg、Ca、Sr、Al和Zn的氧化物和氢氧化物))和有机碱(例如胺类,例如单烷基、二烷基或三烷基胺),优选无机碱,更优选Li、Na、K、Mg、Ca、Al和Zn的氧化物和氢氧化物,更优选Li、Na、K和Zn的氧化物和氢氧化物,例如Li、Na和K的氧化物和氢氧化物。关于第一和第二介质(例如,第一和第二缓冲液)可使用的示例性盐包括LiCl、NaCl和KCl,在这方面,一种特别优选的盐是NaCl。优选地,在第一和第二介质(例如第一和第二缓冲液)中以不会导致RNA在所述介质中沉淀的浓度使用盐。在一个实施方案中,第一和/或第二介质(例如,第一和/或第二缓冲液)中盐的浓度为15至70mM,例如20至60mM,25至50mM或30至50mM,特别是如果缓冲物质是TRIS。在一个实施方案中,第一和/或第二介质(例如,第一和/或第二缓冲液)中盐的浓度为100至200mM,例如110至190mM、120至180mM、130至170mM、140至160mM或145至155mM,特别是如果缓冲物质是HEPES。
本文中使用的术语“缓冲物质”和“缓冲剂”是指即使向溶液中添加强酸或强碱,也能使溶液的pH保持几乎恒定的化合物的混合物。在一个实施方案中,缓冲物质或缓冲剂是弱酸与其共轭碱的混合物。在另一个实施方案中,缓冲物质或缓冲剂是弱碱与其共轭酸的混合物。优选地,缓冲物质不是螯合剂。适用于第一和第二介质(例如,第一和第二缓冲液)的缓冲物质的实例包括三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、2-[(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)氨基]乙磺酸(TES)、哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)(PIPES)和3-(N,N-双[2-羟乙基]氨基)2-羟基丙磺酸(DIPSO),优选TRIS或HEPES,更优选TRIS。通过向相应的碱(例如,TRIS)中添加足量的酸(例如,无机酸如盐酸)或者通过向相应的酸中添加足量的碱(例如,无机碱如氢氧化钠)(例如,如果期望pH高于其为6.76的pKa(例如pH 7.0或7.3至7.7),则添加PIPES)可以获得所期望的pH值(例如pH 6.5至8.0,优选pH 6.6至7.8,例如pH 6.8至7.6、pH 6.8至7.2、pH 6.9至7.5、pH 6.9至7.3、pH7.0至7.7、pH 7.0至7.5,pH 7.0至7.3、pH 7.3至7.8、pH 7.3至7.7或pH 7.3至7.6)。在一个实施方案中,第一和/或第二介质(例如,第一和/或第二缓冲液)中缓冲物质的浓度为5至40mM、例如6至30mM、8至20mM或10至15mM。
关于第一和第二介质(例如,第一和第二缓冲液),本文中使用的术语“螯合剂”是指这样的化合物(优选有机化合物),其是多齿(polydenate)配体并且能够与单个中心原子(优选单个金属阳离子,例如Ca2+或Mg2+)形成两个或更多个(优选三个或更多个,例如四个或更多个)配位键。在这方面,“多齿”是指在单个配体分子中具有多于一个(即,两个或更多个,优选三个或更多个,例如四个或更多个)供体基团的配体,其中供体基团优选包括具有自由电子对的原子(例如,O-、=O、-NH2、-NRH(其中R是有机部分,例如烷基,特别是C1-3烷基)和-NR2(其中每个R独立地是有机部分,例如烷基,特别是C1-3烷基))。优选地,螯合剂不是缓冲物质。螯合剂的实例包括EDTA、次氮基三乙酸、柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五烷-1(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸(PCTA)和1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸(DO3A),优选EDTA或次氮基三乙酸,更优选EDTA。在一个实施方案中,第一和/或第二介质(例如第一和/或第二缓冲液)中螯合剂的浓度为10至50mM,例如15至40mM或20至30mM。
如本文中使用的术语“纤维素材料”是指任何纤维素纤维,优选具有适合用作分配色谱试剂的等级。适用于本发明方法的纤维素材料的具体实例包括CF-11纤维素粉末和可商购的纤维素,例如来自Sigma-Aldrich(例如,目录号#C6288)和Macherey-Nagel(例如,MN100或MN 2100)的那些。在一个实施方案中,纤维素材料在用于本发明方法之前进行洗涤。因此,在本发明方法的一个优选实施方案中,纤维素材料作为经洗涤的纤维素材料,例如以干燥形式或作为洗涤溶液中的混悬液提供(其中所述洗涤溶液可以是如本文中指定的第一或第二介质)(例如第一或第二缓冲液))。纤维素材料的洗涤可包括(I)在摇动和/或搅拌下将纤维素材料与洗涤溶液混合(优选持续至少5分钟,更优选持续至少10分钟,例如5至10分钟);和(II)除去液体(例如,通过使用移液管)或收集纤维素材料(例如,通过使用与磁珠共价偶联的纤维素作为纤维素材料并使用磁铁);以及任选地(III)重复步骤(I)和(II)一次或两次或更多次(例如一次、两次或三次)。例如,当在管中提供纤维素材料和洗涤溶液的混合物时,优选的是向管施加重力或离心力(例如,4,000×g至15,000×g,例如5,000×g至10,000×g,1至5分钟)使得所述液相与固相分离(优选完全分离)并且去除上清液(例如,通过使用移液管)或收集纤维素材料(例如,通过使用与磁珠共价偶联的纤维素作为纤维素材料并使用磁铁)。或者,当在旋转柱或过滤装置中提供纤维素材料和洗涤溶液的混合物时,优选的是向旋转柱或过滤装置施加重力、离心力(例如,4,000×g至15,000×g,例如5,000×g至10,000×g,1至5分钟)、压力(例如,1000hPa至3000hPa)或真空(例如,100hPa至900hPa,例如200hPa至800hPa)使得液相与固相分离(优选完全分离)并丢弃流过液。洗涤缓冲液的组成优选取决于RNA与经洗涤的纤维素材料的选择性结合的预期模式:(1)如果仅dsRNA选择性地结合经洗涤的纤维素材料,而ssRNA保持未结合,则洗涤溶液应该是其使得允许dsRNA与纤维素材料结合,但不允许ssRNA与纤维素材料结合。因此,在(1)的一个优选实施方案中,洗涤溶液具有如上所指明的第一介质(例如,第一缓冲液)的组成。(2)如果dsRNA和ssRNA二者都与经洗涤的纤维素材料结合,则洗涤溶液应该是其使得允许dsRNA和ssRNA与纤维素材料结合。因此,在(2)的一个优选实施方案中,洗涤溶液具有如上所指明的第二介质(例如,第二缓冲液)的组成。
洗涤后,经洗涤的纤维素材料可以作为干燥产品(即,在洗涤溶液已经从本文中所述的经洗涤的纤维素中完全除去后)或作为洗涤溶液中的混悬液储存(或用于本发明的方法中)。然而,如果将储存在洗涤溶液中的经洗涤的纤维素材料用于本发明的方法中,则优选在经洗涤的纤维素材料与RNA制备物接触之前,如果在管中提供经洗涤的纤维素,则从经洗涤的纤维素材料中除去液相(即用于储存的其中混悬纤维素材料的洗涤溶液)(例如,通过施加重力、离心力(如上文关于纤维素材料的洗涤所述的)),或者如果在旋转柱或过滤装置中提供经洗涤的纤维素,则通过施加重力、离心力、压力或真空(如上文关于纤维素材料的洗涤所指明的)除去液相,并且然后所得的经洗涤的纤维素材料按这样(即,以干燥形式)用于本发明的方法中或混悬于洗涤溶液中(其中所述洗涤溶液可以是如本文所指明的第一或第二介质(例如,第一或第二缓冲液))并且然后用于本发明的方法中。
如本文中使用的术语“新的纤维素材料”是指所述新的纤维素材料未与RNA制备物接触。这样的新的纤维素材料可以是未洗涤的或经洗涤的。在一个优选的实施方案中,新的纤维素材料作为如上所指明的经洗涤的纤维素材料提供(例如,以干燥形式或作为洗涤溶液中的混悬液)。因此,根据经洗涤的新纤维素材料的预期用途(即,选择性地结合(1)dsRNA而非ssRNA或(2)dsRNA和ssRNA),通过使用(1)如上所指明的第一介质(例如,第一缓冲液)或(2)如上所指明的第二介质(例如,第二缓冲液)获得经洗涤的新纤维素材料。
本发明方法的步骤(ii)中RNA(包含在RNA制备物中)与纤维素材料的比例使得不超过纤维素材料的RNA结合能力。在一个优选的实施方案中,每100mg纤维素材料的RNA量为至多250μg,更优选至多200μg,例如至多150μg。因此,在一个实施方案中,每100mg纤维素材料的RNA的量为10至250μg,例如20至220μg、30至200μg、40至180μg、50至160μg、60μg 140μg、70至120μg、80至110μg或90至100μg。因此,在一个实施方案中,每1μg RNA的纤维素材料的量可以是至少0.4mg,优选至少0.5mg,例如至少0.67mg。例如,每1μg RNA的纤维素材料的量可以为0.4至10mg,例如0.45至5mg、0.5至3.3mg、0.56至2.5mg、0.63至2mg、0.71至1.67mg、0.83至1.43mg、0.91至1.25mg或1至1.11mg。
本文中使用的术语“管”是指容器,特别是细长容器,其仅具有一个开口,使得化合物和/或液体可被引入容器中和/或从容器中移除。在一个优选的实施方案中,管的开口配置成使得它可以通过合适的装置封闭,例如盖子,该盖子是可拧紧的或者安装到开口中,以这样的方式以便紧密地密封开口。在一个实施方案中,管以这样的方式配置,使得可以向管施加重力或离心力(以便将管中的内容物就它们的比重分开)而不会溢出任何内容物并且不会损坏管的完整性。
本文中使用的术语“旋转柱”和“过滤装置”是指这样的容器,特别是细长容器,其在相对侧具有两个开口以及筛板(frit)或过滤器,其中第一开口使得化合物和/或液体可被引入容器中和/或从容器中移除,而第二开口通过筛板或过滤器与第一开口隔离,使得固体化合物(特别是纤维素材料)通过筛板或过滤器保留在容器内但允许液体通过筛板或过滤器并到达第二开口。筛板或过滤器优选孔径为至多1μm,例如至多0.8μm,至多0.6μm,例如在0.30至0.60μm,例如0.35至0.55μm的范围内。在一个优选的实施方案中,旋转柱或过滤装置的至少第一开口(优选每个开口)配置成使得它可以通过合适的装置封闭,例如盖子,该盖子是可拧紧的或适合于安装到第一或第二开口中,以这样的方式以便紧密地密封开口。在一个实施方案中,旋转柱或过滤装置以这样的方式配置,使得可以向旋转柱或过滤装置施加重力、离心力、压力或真空(以便分离旋转柱或过滤装置中的内容物),而不会损坏旋转柱或过滤装置的完整性。合适的旋转柱的实例包括微型离心机旋转柱(例如可从Macherey-Nagel获得的那些,例如NucleoSpin过滤器(目录号#740606)),合适的过滤装置的实例包括一次性真空驱动的过滤装置(例如可从Merck Chemicals GmbH/Millipore获得的那些,例如,Steriflip-HV,0.45μm孔径,PVDF(目录号#SE1M003M00))。
本文中使用的术语“液体”和“液相”是指标准条件下的流体。液体的具体实例包括介质(例如缓冲液)、洗涤溶液和溶解在介质(例如缓冲液)中的RNA制备物。本文中使用的术语“固体”和“固相”是指物质或物质的混合物,其具有确定的形状和体积,但在标准条件下是非液体和非气体的。固体的具体实例包括纤维素材料。
本文中使用的术语“标准条件”是指20℃的温度和1,013.25hPa的绝对压力。
本文中使用的术语“上清液”是指当液相与固相混合并且允许混合物分离(例如,通过施加重力或离心力)时产生的上层相。如果固相与液相相比具有更高的比重,则液相将是上清液。
本文中使用的术语“流过液”是指通过旋转柱或过滤装置的液相。
本文中使用的术语“等分试样”是指待添加至固体或将要加载至柱的固定相上的液体体积,其中等分试样的体积通常为固体相或固定相的体积的0.1至10倍(例如0.5至5倍、1至4倍、1至3倍或1至2倍)。在一个实施方案中,液体是介质(例如缓冲液)(例如本文中所指明的第一、第二或第三介质(例如,第一、第二或第三缓冲液))或洗涤溶液。在一个实施方案中,固体是纤维素材料,例如经洗涤的纤维素材料。
本文中使用的术语“施加重力”是指容器(例如管、旋转柱或过滤装置)仅经受地球的“正常”重力(约1×g),即,除了“正常”的地球重力之外不向容器施加任何重力(例如,允许介质被动地流过柱的固定相,其中柱以这样的方式布置,使得柱的纵向轴线(即通过柱的两个开口的线)指向地心)。在一个实施方案中,向容器施加重力足够的时间以分离(优选完全分离)包含容器中的相(例如液相与固相)。
本文中使用的术语“施加离心力”是指容器例如管、旋转柱或过滤装置经受地球的正常重力的倍数(即,大于1×g,例如,至少2×g,至少10×g,至少100×g,和至多20,000×g,例如至多15,000×g,至多10,000×g,至多5,000×g,或至多4,000×g)。能够产生这样的离心力的合适装置包括离心机。在一个实施方案中,向容器施加离心力足够的时间以分离(优选完全分离)包含在容器中的相(例如液相与固相)。示例性持续时间为1分钟至30分钟(例如1、2、3、4或5分钟至25分钟,5、6、7、8、9或10分钟至20分钟或10至15分钟)。通常,所施加的离心力的水平和持续时间将取决于例如预期用途(例如,纤维素材料的洗涤、RNA与纤维素材料的结合或从纤维素材料释放RNA)和容器的体积和重量(包括其内容物)等因素。例如,施加高离心力(例如10,000×g至20,000×g)短持续时间(例如,1至5分钟)可足以进行(完全)分离,而低离心力(例如高达100×g)可能需要更长的持续时间(例如20至30分钟)进行(完全)分离。同样地,对于小体积和重量(例如,高达约2ml的体积和约2g的重量),施加高离心力(例如10,000×g至20,000×g)短持续时间(例如,1至5分钟)可足以进行(完全)分离,而对于更大的体积和/或重量,可以仅施加更低的离心力(例如200×g至10,000×g),为了实现(完全)分离,可需要更长的持续时间(例如,20至30分钟)。
本文中使用的术语“施加压力”是指容器(例如旋转柱、过滤装置或柱)经受施加至容器的一个开口的正向力(与标准条件相比)。特别地,当容器是柱时,施加压力意味着例如通过使用一个或更多个泵将液体(例如介质或缓冲液)泵送通过容器。与HPLC方法中施加的压力相比,在本发明的方法中施加的压力低得多,并且优选为至多2MPa(例如至多1MPa,至多5000hPa,至多4000hPa,至多3000hPa、至多2000hPa)。
本文中使用的术语“施加真空”是指容器(例如旋转柱、过滤装置或柱)经受负压(与标准条件相比),其中负压优选施加至容器的开口处。优选地,负压为至多900hPa,例如至多800hPa、至多700hPa、至多600hPa、至多500hPa、至多400hPa、至多300hPa、至多200hPa或至多100hPa。在一个实施方案中,向容器施加真空足够的持续时间以分离(优选完全分离)包含在容器中的相(例如液相与固相)。用于产生负压的装置是本领域技术人员已知的并且包括水喷射真空泵。
本文中使用的表述“重复一次或两次或更多次”是指相应的一个或更多个步骤进行至少一次,例如两次或更多次、三次或更多次、四次或更多次等,优选一次、两次或三次。
本文中使用的表述“步骤(ii)和(iii)的一个循环”是指步骤(ii)和(iii)各自仅进行一次。如果步骤(ii)和(iii)的一个循环完成,则可任选地进行步骤(ii)和(iii)的另一循环(在本文中也称为“下一个循环”)。例如,在步骤(ii)和(iii)的这样的下一个循环中的步骤(ii)中,在步骤(ii)和(iii)的前一循环中的步骤(iii)之后获得的RNA制备物(即优选与前一循环中的步骤(ii)中使用的RNA制备物相比包含较少量的dsRNA的RNA制备物)用作RNA制备物。优选的是在步骤(ii)和(iii)的每个循环中使用新的纤维素材料(以避免被例如dsRNA污染)。因此,通过进行步骤(ii)和(iii)并任选地重复这些步骤一次或两次或更多次,可以从ssRNA制备物中去除dsRNA以达到使得最终获得的ssRNA不含dsRNA和/或基本上不含DNA,优选基本上不含dsRNA和DNA的程度。
表述“与前一循环中的步骤(ii)使用的RNA制备物相比包含较少量的dsRNA的RNA制备物”意指进行步骤(ii)和(iii)的一个循环有效去除dsRNA,使得在一个循环中的步骤(iii)之后获得的RNA制备物中dsRNA的总量小于在前一循环中的步骤(ii)中使用的RNA制备物中的dsRNA的总量。优选地,步骤(ii)和(iii)的第一循环有效去除至少70%,更优选至少75%(例如至少80%、至少85%、至少90%)的包含在步骤(ii)和(iii)的第一循环中的步骤(ii)使用的RNA制备物中的dsRNA。在一个优选的实施方案中,进行步骤(ii)和iii)的总共两个、三个或四个循环有效地除去至少95%,更优选至少96%(例如至少97%、至少98%、至少99%)的包含在步骤(ii)和(iii)的第一循环中的步骤(ii)中使用的RNA制备物中的dsRNA。
本文中使用的术语“洗脱剂”是指能够改变化合物(例如dsRNA或ssRNA)对于固定相(例如纤维素材料)的结合特性的液体。“改变结合特性”意指提高或降低化合物(例如dsRNA或ssRNA)与固定相(例如纤维素材料)结合的能力。优选地,洗脱剂能够降低化合物(例如dsRNA或ssRNA)与固定相(例如纤维素材料)结合的能力。因此,在该优选实施方案中,(1)如果化合物与固定相结合,则使固定相与洗脱剂接触的步骤导致化合物从固定相释放,或(2)如果化合物溶解在洗脱剂中,则洗脱剂降低了化合物与固定相结合的能力,优选地洗脱剂阻止化合物与固定相的结合。本文中使用的术语“洗脱”是指将洗脱剂施加或加载至(上)含有结合化合物(例如ssRNA)的固定相(例如纤维素材料)的柱(包括旋转柱),以便从固定相释放化合物。与纤维素材料结合的ssRNA的优选洗脱剂是如上所指明的第一介质(例如,第一缓冲液),而与纤维素材料结合的dsRNA的优选洗脱剂是第三介质(例如,第三缓冲液),其可能具有与第一或第二介质(例如,第一或第二缓冲液)相同的组分但不含EtOH(例如,第三介质可以是水)。不释放与纤维素材料结合的dsRNA或ssRNA的优选洗涤溶液是如上所述的第二介质(例如,第二缓冲液)。
本文中使用的术语“洗出液”是指当将洗脱剂施加或加载至柱上时离开柱的液体。
本文中使用的术语“柱”是指这样的容器,特别是圆柱形容器,其在相对侧具有两个开口、至少一个筛板和固定相(例如纤维素材料),其中第一开口配置为以便允许将液体(例如介质,例如洗涤溶液或介质,例如第一或第二缓冲液)引入容器中,而第二开口通过筛板与第一开口和固定相隔离,使得(i)固相通过筛板保留在柱内但是(ii)允许液体通过到筛板并到达第二开口。色谱柱可配置为可用于HPLC方法或FPLC方法。然而,用于本发明方法的柱优选配置成可用于FPLC方法。
本文中使用的术语“HPLC”是指高压液相色谱,其中液相在高压(通常至少5MPa,例如5至35MPa)下被泵送通过柱从而分离、鉴定和/或或量化混合物中的至少一种组分。
本文中使用的术语“FPLC”是指快速性能液相色谱,其中允许液相流过柱以便分离、鉴定和/或定量混合物中的至少一种组分。液体通过FPLC柱的流动可以通过施加重力或压力来实现,其中压力优选为至多2MPa(例如至多1MPa、至多5,000hPa、至多4,000hPa、至多3,000hPa、至多2,000hPa或至多1,000hPa)。
本文中关于RNA制备物使用的术语“预纯化处理”是指部分或完全除去RNA制备物的污染物的步骤,其中污染物优选包括除RNA之外的所有化合物,例如用于产生IVT RNA(其任选地被修饰)的起始材料及其降解产物,例如DNA模板;RNA聚合酶(例如T7、T3或SP6);未修饰形式的单核糖核苷酸(例如,rATP、rGTP、rCTP、rUTP及仅具有一个或两个磷酸基团的其类似物)或修饰形式的单核糖核苷酸(例如,r(1Mψ)TP或rΨTP以及仅具有一个或两个磷酸基团的其类似物);焦磷酸酯;加帽试剂(即,引入5′-帽或5′-帽类似物的试剂);和用于产生IVT RNA的添加剂(例如缓冲剂、盐、抗氧化剂和多胺(例如亚精胺))。本领域技术人员已知的合适的预纯化处理的实例包括核酸的沉淀(优选使用氯化锂);核酸(特别是RNA)与磁珠的结合(例如,然后可以通过使用适当的介质洗去不与磁珠结合的污染物);超滤;和DNA的降解,优选使用双链特异性核酸酶(DSN)。例如,可以通过使用“乙酸钠/异丙醇”沉淀法或“LiCl”沉淀法(优选通过“LiCl”沉淀法)沉淀RNA,两者都产生干燥形式的RNA制备物。在每种情况下,由此获得的沉淀的和干燥的RNA可以溶解在适量的水或TE缓冲液(10mM TRIS,1mM EDTA)中,二者优选不含RNase。
“乙酸钠/异丙醇”沉淀法包括以下步骤:将0.1体积的3M乙酸钠(pH 4.0)和1体积的异丙醇添加到RNA制备物中,混合所得的混合物,将混合物在-20℃下孵育1小时,施加离心力(例如,14,000×g,10分钟),从RNA沉淀中除去上清液,用200μl70%(v/v)冰冷的EtOH洗涤RNA沉淀(即,向RNA沉淀添加200μl 70%(v/v)冰冷的EtOH,施加离心力(例如,14,000×g,5分钟),并从RNA沉淀中除去上清液),并干燥(优选空气干燥)RNA沉淀(优选以这样的方式除去乙醇)。
“LiCl”沉淀法包括以下步骤:将氯化锂(LiCl)添加到RNA制备物中,使最终LiCl浓度为2.5M,将混合物在-20℃下孵育30分钟,施加离心力(例如,14,000×g,10分钟),从RNA沉淀中取出上清液,用200μl 70%(v/v)冰冷的EtOH洗涤RNA沉淀(即向RNA沉淀添加200μl的70%(v/v)冰冷将EtOH,施加离心力(例如,14,000×g,5分钟),并从RNA沉淀中除去上清液),并干燥(优选空气干燥)RNA沉淀(优选以这样的方式除去乙醇)。
本文中使用的术语“RNA聚合酶”是指产生初级转录物RNA的DNA依赖性RNA聚合酶。适合用于产生根据本发明的IVT RNA的RNA聚合酶的实例包括T7、T3和SP6 RNA聚合酶。优选的RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。
本文中与ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物一起使用的术语“基本上不含dsRNA”(其中所述ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物已经过本发明的方法处理)意指ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物中dsRNA的量与在所述ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物经过本发明的方法处理之前包含在ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物中的dsRNA的量相比,已降低至少70%(优选至少75%、至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%)。优选地,所述已经过本发明方法处理的ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物具有这样的dsRNA含量,使得当向对象施用时所述ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物在所述对象中基本上不诱导不期望的反应(例如,不期望的炎性细胞因子(例如,IFN-α)的诱导和/或导致抑制由本发明的ssRNA之蛋白质合成的效应酶的不期望的活化。例如,术语“基本上不含dsRNA”和“基本上不诱导不期望的反应”可以意指当向对象施用时,与对照ssRNA(即,未经过本发明的方法处理的ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物)相比,ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物(其中所述ssRNA或RNA制备物已经过本发明的方法处理)诱导炎性细胞因子(特别是IFN-α)的量降低至少60%(例如,至少62%、至少64%、至少66%、至少68%、至少70%、至少72%、至少74%、至少76%、至少78%、至少80%)。优选地,术语“基本上不含dsRNA”和“基本上不诱导不期望的反应”是指当向对象施用ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物(其中所述ssRNA或RNA制备物已经经过本发明的方法处理)并且所述ssRNA编码肽或蛋白质,导致施用后ssRNA翻译成肽或蛋白质持续至少10小时(例如,至少12小时、至少14小时、至少16小时、至少18小时、至少20小时、至少22小时或至少24小时)。例如,基于所述ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物的总重量,ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物中的dsRNA的含量(其中所述ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物已经经过本发明的方法处理)可以是至多5重量%(优选至多4重量%、至多3重量%、至多2重量%、至多1重量%、至多0.5重量%、至多0.1重量%、至多0.05重量%、至多0.01重量%、至多0.005重量%、至多0.001重量%)。
本文中与ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物一起使用的术语“基本上不含DNA”(其中所述ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物已经经过本发明的方法处理)意指基于所述ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物的总重量,ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物中dsRNA的量可以是至多5重量%(优选至多4重量%、至多3重量%、至多2重量%、至多1重量%、至多0.5重量%、至多0.1重量%、至多0.05重量%、至多0.01重量%、至多0.005重量%、至多0.001重量%)。
本文中与ssRNA或包含ssRNA的RNA制备物一起使用的术语“基本上不含dsRNA和DNA”(其中所述包含ssRNA的ssRNA或RNA制备物已经过本发明的方法处理),意指所述ssRNA或RNA包含ssRNA的制备物基本上不含如上所指明的dsRNA(例如,在施用后翻译持续至少10小时和/或dsRNA含量为至多5重量%)并且基本上不含如上所指明的DNA(例如,DNA含量至多为5重量%)。
在本发明的上下文中,术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基的分子,并且优选完全或基本上由核糖核苷酸残基构成。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2′-位具有羟基的核苷酸。术语“RNA”包括分离的RNA,例如部分或完全纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA和重组产生的RNA,并且包括通过添加、删除、替换和/或改变一个或更多个核苷酸与天然存在的RNA不同的经修饰的RNA。这样改变可包括添加非核苷酸材料,例如添加至RNA的末端或内部,例如在RNA的一个或更多个核苷酸处。RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸,例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的/经修饰的核苷酸可称为天然存在的核苷酸的类似物,以及含有这样改变的/经修饰的核苷酸的相应RNA(即,改变的/经修饰的RNA)可称为天然存在的RNA的类似物。如果基于分子中核苷酸残基的总数,分子中核糖核苷酸残基的含量至少为40%(例如至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%),则分子“基本上由核糖核苷酸残基构成”。分子中核苷酸残基的总数是所有核苷酸残基的总和(不论核苷酸残基是否是标准(即天然存在的)核苷酸残基或其类似物)。
RNA可以从细胞中分离,可以由DNA模板制备,或者可使用本领域已知的方法化学合成。在一些优选的实施方案中,RNA在体外由DNA模板合成。在一个特别优选的实施方案中,通过体外转录从DNA模板产生RNA,特别是ssRNA,例如mRNA或抑制性ssRNA(例如,反义RNA、siRNA或miRNA)。体外转录方法是本领域技术人员已知的;参见,例如,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第2版,J.Sambrook等编辑,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor 1989。此外,存在可商购获得的多种体外转录试剂盒,例如,来自Thermo Fisher Scientific(例如TranscriptAidTM T7试剂盒,T7试剂盒,)、New England BioLabs Inc.(例如HiScribeTM T7试剂盒,HiScribeTM T7ARCA mRNA试剂盒)、Promega(例如RiboMAXTM, systems)、Jena Bioscience(例如SP6或T7转录试剂盒)和Epicentre(例如AmpliScribeTM)。在一个特别优选的实施方案中,RNA是体外转录的RNA(IVTRNA)。为了提供经修饰的RNA,可以在合成期间(优选体外转录)并入相应经修饰的核苷酸,例如经修饰的天然存在的核苷酸、非天然存在的核苷酸和/或经修饰的非天然存在的核苷酸,或者可以在RNA中产生的和/或在转录后添加至RNA中的修饰。
根据本发明,优选的RNA是6至100个,优选10至50个,特别是15至30个或15至20个核苷酸的合成寡核苷酸,或超过50个核苷酸,优选100至15,000个,更优选50至10,000个,更优选100至5,000个,特别是200至1,000个核苷酸的更长的转录物。
根据本发明,“RNA”包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、ssRNA、dsRNA和抑制性RNA。
根据本发明,“ssRNA”包括mRNA和抑制性ssRNA(例如反义ssRNA、siRNA或miRNA)。
“ssRNA”意指单链RNA。ssRNA可含有自身互补序列,其允许RNA的一部分折叠并与自身配对以形成双螺旋。ssRNA的大小可以在6个核苷酸至15,000个之间变化,优选10至12,000个,特别是100至10,000个、150至8,000个、200至7,000个、250至6,000个或300至5,000个核苷酸。在一个实施方案中,ssRNA具有至少2,700个核苷酸的长度(例如至少2,800个、至少2,900个、至少3,000个、至少3,100个、至少3,200个、至少3,300个、至少3,400个、至少3,500个、至少3,600个、至少3,700个、至少3,800个、至少3,900个、至少4,000个、至少4,100个、至少4,200个、至少4,300个、至少4,400个、至少4,500个、至少4,600个、至少4,700个、至少4,800个、至少4,900个、至少5,000个核苷酸)。本文中使用的长ssRNA意指具有至少3,500个核苷酸(例如至少3,600个、至少3,700个、至少3,800个、至少3,900个、至少4,000个、至少4,100个、至少4,200个、至少4,300个、至少4,400个、至少4,500个、至少4,600个、至少4,700个、至少4,800个、至少4,900个、至少5,000个、至少5,500个、至少6,000个、至少6,500个、至少7,000个、至少7,500个、至少8,000个、至少8,500个、至少9,000个、至少9,500个核苷酸),优选至多15,000个,例如至多14,000个、至多13,000个或至多12,000个核苷酸的ssRNA。
根据本发明,“dsRNA”意指双链RNA,并且是具有两条部分或完全互补链的RNA。链的大小可以在6个核苷酸至10,000个,优选10至8,000个,特别是200至5,000个,200至2,000个或200至1,000个核苷酸之间变化。
根据本发明,术语“mRNA”意指“信使RNA”并且涉及可通过使用DNA模板产生并可以编码肽或蛋白质的“转录物”。通常,mRNA包含5′-UTR、蛋白质编码区和3′-UTR。在本发明的上下文中,mRNA优选通过体外转录由DNA模板产生。如上所述,体外转录方法是本领域技术人员已知的,并且可获得可商购的多种体外转录试剂盒。mRNA的大小可以从约1,000个核苷酸至15,000个,优选2,000至12,000个,特别是2,700至11,000个,3000至10,000个,3,500至9,000个,4,000至9,000个,4,500至7,000个,或5,000至8,000个核苷酸变化。在一个实施方案中,mRNA具有至少2,700个核苷酸的长度(例如至少2,800个、至少2,900个、至少3,000个、至少3,100个、至少3,200个、至少3,300个、至少3,400个、至少3,500个、至少3,600个、至少3,700个、至少3,800个、至少3,900个、至少4,000个、至少4,100个、至少4,200个、至少4,300个、至少4,400个、至少4,500个、至少4,600个、至少4,700个、至少4,800个、至少4,900个、至少5,000个核苷酸)。长mRNA意指具有至少3,500个核苷酸的大小(例如至少3,600个、至少3,700个、至少3,800个、至少3,900个、至少4,000个、至少4,100个、至少4,200个、至少4,300个、至少4,400个、至少4,500个、至少4,600个、至少4,700个、至少4,800个、至少4,900个、至少5,000个、至少5,500个、至少6,000个、至少6,500个、至少7,000个、至少7,500个、至少8,000个、至少8,500个、至少9,000个、至少9,500个核苷酸),优选至多15,000个,例如至多14,000个、至多13,000个、至多12,000个、至多11,000个或至多10,000个核苷酸的mRNA。
mRNA在细胞中和体外仅具有有限的半衰期。因此,根据本发明,可以根据需要改变RNA的稳定性和翻译效率。例如,可以通过一种或更多种具有稳定作用和/或提高mRNA翻译效率的修饰而稳定mRNA并且提高其翻译。这样的修饰例如描述于WO 2007/036366中,其全部公开内容通过引用并入本文。为了提高根据本发明的mRNA的表达,可以在编码区(即编码表达的肽或蛋白质的序列)内修饰,优选不改变表达的肽或蛋白质的序列,从而提高GC含量以提高mRNA稳定性并进行密码子优化,从而增强细胞中的翻译。
在RNA,优选根据本发明的ssRNA(例如mRNA)的上下文中,术语“修饰”包括不是天然存在于所述RNA中的RNA(优选ssRNA,例如mRNA)的任何修饰。
在本发明的一个实施方案中,根据本发明的ssRNA(优选mRNA)不具有未加帽的5′-三磷酸酯。通过用磷酸酶处理ssRNA(优选mRNA)可以除去这样的未加帽的5′-三磷酸酯。
根据本发明的ssRNA(优选mRNA)可具有经修饰的核糖核苷酸以提高其稳定性和/或降低细胞毒性。例如,在一个实施方案中,在根据本发明的ssRNA(优选mRNA)中,5-甲基胞苷被部分或完全,优选完全替换为胞苷。作为替代或补充,在一个实施方案中,在根据本发明的ssRNA(优选mRNA)中,假尿苷或N(1)-甲基假尿苷被部分或完全,优选完全替换为尿苷。通过假尿苷(部分或完全,优选完全替换为尿苷)修饰的RNA(优选ssRNA,例如mRNA)在本文中称为“Ψ-修饰的”,而术语“1mΨ-修饰的”意指RNA(优选ssRNA例如mRNA)包含N(1)-甲基假尿苷(部分或完全替换,优选完全替换为尿苷)。
在一个实施方案中,术语“修饰”涉及提供具有5′-帽或5′-帽类似物的RNA(优选ssRNA,例如mRNA)。术语“5′-帽”是指在RNA(优选ssRNA,例如mRNA)分子的5′末端上存在的帽结构,并且通常由通过不常见的5′到5′三磷酸键与RNA连接的鸟苷核苷酸组成(优选ssRNA,例如mRNA)。在一个实施方案中,该鸟苷在7-位被甲基化。术语“常规5′-帽”是指天然存在的RNA 5′-帽,优选7-甲基鸟苷帽(m7G)。在本发明的上下文中,术语“5′-帽”包括类似于RNA帽结构的5′-帽类似物,并且被修饰为具有稳定RNA(优选ssRNA,例如mRNA)的能力和/或如果附着于其上,优选在体内和/或在细胞中,则增强RNA(优选ssRNA,例如mRNA)的翻译。
优选地,RNA(优选ssRNA,例如mRNA)的5′末端包括具有以下通式的帽结构:
其中R1和R2独立地是羟基或甲氧基,W、X和Y独立地是氧、硫、硒或BH3。在一个优选的实施方案中,R1和R2是羟基,W、X和Y是氧。在另一个优选的实施方案中,R1和R2中的一个,优选R1是羟基,另一个是甲氧基,且W、X和Y是氧。在另一个优选的实施方案中,R1和R2是羟基,W,X和Y中的一个,优选X是硫、硒或BH3,优选硫,而另两个是氧。在另一个优选的实施方案中,R1和R2中的一个,优选R2是羟基,另一个是甲氧基,W、X和Y中的一个,优选X是硫、硒或BH3,优选硫,而另两个是氧。
在上式中,右侧的核苷酸通过其3′基团与RNA(优选ssRNA,如mRNA)链连接。
其中W、X和Y中的至少一个是硫,即具有硫代磷酸酯部分的那些帽结构以不同的非对映异构形式存在,所有这些形式都涵盖在本文中。此外,本发明包括上式的所有互变异构体和立体异构体。
例如,具有上述结构的帽结构,其中R1是甲氧基,R2是羟基,X是硫,W和Y是氧,以两种非对映异构形式(Rp和Sp)存在。这些可以通过反相HPLC来拆分,并且根据它们从反相HPLC柱的洗脱顺序命名为D1和D2。根据本发明,特别优选m2 7,2′-OGppspG的D1异构体。因此,本文中使用的术语“D1-加帽的”是指用上文中所指明的m2 7,2′-OGppspG的D1异构体加帽的RNA(优选ssRNA,例如mRNA)。类似地,本文中使用的术语“D2-加帽的”是指用上文中所指明的m2 7,2′-OGppspG的D2异构体加帽的RNA(优选ssRNA,例如mRNA)。帽结构的其他实例是本领域技术人员已知的并且包括WO 2008/157688中描述的那些,其全部公开内容通过引用并入本文。
假设具有5′-帽或5′-帽类似物的RNA(优选ssRNA,例如mRNA)可以通过在存在所述5′-帽或5′-帽类似物的情况下体外转录DNA模板来实现,其中所述5′-帽被共转录地并入产生的RNA(优选ssRNA,例如mRNA)链中,或者RNA(优选ssRNA,例如mRNA)可以例如通过体外转录产生,并且可使用加帽酶(例如,痘苗病毒的加帽酶)在转录后将5′-帽与RNA(优选ssRNA,例如mRNA)连接。
RNA(优选ssRNA,例如mRNA)可以包含另外的修饰。例如,根据本发明的ssRNA的另外的修饰可以是天然存在的poly(A)尾的延伸或截短或5′-或3′-非翻译(也称为“5′-或3′-非翻译的”)区(UTR)的改变。
具有未掩蔽的poly-A序列的RNA(优选ssRNA,例如mRNA)比具有掩蔽的poly-A序列的RNA(优选ssRNA,例如mRNA)更有效地翻译。术语“poly(A)尾”或“poly-A序列”涉及腺苷(特别是腺苷酰基)(A)残基的序列,其通常位于RNA(优选ssRNA,例如mRNA)分子的3′末端并且“未掩蔽的poly-A序列”意指RNA(优选ssRNA,例如mRNA)分子的3′末端的poly-A序列以poly-A序列的A结束,并且在后面在poly-A序列的3′末端即下游没有A以外的核苷酸。此外,长度为约120个核苷酸的长poly-A序列导致RNA(优选ssRNA,例如mRNA)的最佳转录物稳定性和翻译效率。
因此,为了提高RNA,优选根据本发明的ssRNA(例如mRNA)的稳定性和/或表达,可以对其进行修饰以便与poly-A序列一起存在,优选具有长度为10至500个,更优选30至300个,甚至更优选65至20个,特别是100至150个腺苷(特别是腺苷酰基)残基。在一个特别优选的实施方案中,poly-A序列的长度为约120个腺苷(特别是腺苷酰基)残基。为了进一步提高RNA,优选根据本发明的ssRNA(例如mRNA)的稳定性和/或表达,可以露出poly-A序列。
另外,将3′-UTR并入RNA(优选ssRNA,例如mRNA)分子的3′-非翻译区可以导致翻译效率的提高。通过并入两个或更多个这样的3′-UTR可以实现协同效应。3′-UTR对于它们并入的RNA(优选ssRNA,例如mRNA)可以是自体的或异源的。在一个特别的实施方案中,3′-UTR来源自珠蛋白基因或mRNA,例如α2-珠蛋白、α1-球蛋白或β-珠蛋白,优选β-珠蛋白,更优选人β-珠蛋白的基因或mRNA。
上述修饰(即并入poly-A序列、露出poly-A序列,并入一个或更多个3′-UTR以及用合成核苷酸替换一个或更多个天然存在的核苷酸(例如,5-甲基胞苷替换为胞苷和/或假尿苷(Ψ)或N(1)-甲基假尿苷(1mΨ)替换为尿苷)的组合,对RNA(优选ssRNA,例如mRNA)的稳定性具有协同影响并且提高了翻译效率。
本文中使用的术语“抑制性RNA”意指与靶mRNA选择性地杂交和/或对靶mRNA特异的RNA,从而抑制(例如,降低)其转录和/或翻译。抑制性RNA包括相对于靶mRNA具有反义方向的序列的RNA分子。合适的抑制性寡核苷酸通常长度在5至数百个核苷酸之间,更通常长度为约20至70个核苷酸或更短,甚至更通常长度为为约10至30个核苷酸。抑制性RNA的实例包括反义RNA、核酶、iRNA、siRNA和miRNA。
本文中使用的术语“反义RNA”是指在生理条件下与包含特定基因或所述基因的mRNA的DNA杂交的RNA,从而抑制所述基因的转录和/或所述mRNA的翻译。核酸或其部分的反义转录物可与天然存在的mRNA形成双链体,从而防止mRNA的积累或翻译。另一种可能性是使用核酶来灭活核酸。反义RNA可以与N末端或5′上游位点(例如翻译起始位点、转录起始位点或启动子位点)杂交。在另外的实施方案中,反义RNA可以与3′-非翻译区或mRNA剪接位点杂交。
反义RNA的大小可以从15个核苷酸至15,000个、优选20至12,000个、特别是100至10,000个、150至8,000个、200至7,000个、250至6,000个、300至5,000个核苷酸,例如15至2,000个、20至1,000个、25至800个、30至600个、35至500个、40至400个、45至300个、50至250个、55至200个、60至150个或65至100个核苷酸。在一个实施方案中,反义RNA的长度为至少2,700个核苷酸(例如至少2,800个、至少2,900个、至少3,000个、至少3,100个、至少3,200个、至少3,300个、至少3,400个、至少3,500个、至少3,600个、至少3,700个、至少3,800个、至少3,900个、至少4,000个、至少4,100个、至少4,200个、至少4,300个、至少4,400个、至少4,500个、至少4,600个、至少4,700个、至少4,800个、至少4,900个、至少5,000个核苷酸)。本文中使用的长反义RNA是指具有至少3,500个核苷酸大小的反义RNA(例如至少3,600个、至少3,700个、至少3,800个、至少3,900个、至少4,000个、至少4,100个、至少4,200个、至少4,300个、至少4,400个、至少4,500个、至少4,600个、至少4,700个、至少4,800个、至少4,900个、至少5,000个、至少5,500个、至少6,000个、至少6,500个、至少7,000个、至少7,500个、至少8,000个、至少8,500个、至少9,000个、至少9,500个核苷酸),优选至多15,000个,例如至多14,000个、至多13,000个、至多12,000个、至多11,000个、或至多10,000个核苷酸。
可根据需要修饰反义RNA的稳定性。例如,可以通过具有稳定作用的一种或更多种修饰来稳定反义RNA。这样的修饰包括修饰的磷酸二酯键(例如甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或氨基磷酸酯键代替天然存在的磷酸二酯键)和2′-取代(例如2′-氟代、2′-O-烷基(例如2′-O-甲基、2′-O-丙基或2′-O-戊基)和2′-O-烯丙基)。例如,在反义RNA的一个实施方案中,硫代磷酸酯键被部分地取代为磷酸二酯键。作为替代或补充,在反义RNA的一个实施方案中,核糖部分在2′-位被O-烷基(例如2′-O-甲基)部分取代。
可以将反义RNA靶向任何靶mRNA序列(“靶序列”)中约19至25个连续核苷酸的任何区段。通常,靶mRNA上的靶序列可以选自对应于靶mRNA的给定cDNA序列,优选从起始密码子下游(即3′方向)开始50至100nt。然而,靶序列可位于5′或3′非翻译区中,或位于起始密码子附近的区域中。
可使用本领域技术人员已知的多种技术获得反义RNA。例如,可使用本领域已知的方法化学合成或重组产生反义RNA。优选地,使用任何合适的启动子从重组环状或线性DNA质粒转录反义RNA。
适于表达反义RNA的质粒、将用于将表达反义RNA的核酸序列***质粒中的方法,以及所述反义RNA的体外转录的IVT方法的选择都在本领域技术范围内。
“反义ssRNA”涉及如上所指明的单链反义RNA。
本文中使用的“小干扰RNA”或“siRNA”是指能够与靶mRNA的一部分特异性结合的RNA分子,优选长度大于10个核苷酸,更优选长度大于15个核苷酸,最优选长度为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。这种结合诱导了一种过程,其中所述靶mRNA的部分被切割或降解,从而抑制所述靶mRNA的基因表达。对于siRNA,最优选的大小范围为19至25个核苷酸。尽管原则上siRNA的有义链和反义链可包含两个互补的单链RNA分子,但是根据本发明的siRNA包含其中两个互补部分是碱基配对的并且通过单链的“发夹”区域共价连接的单个分子。也就是说,有义区和反义区可以通过接头分子共价连接。接头分子可以是多核苷酸或非核苷酸接头,但优选是多核苷酸接头。不期望受任何理论束缚,认为单链siRNA分子的发夹区域在细胞内被“Dicer”蛋白(或其等同物)切割以形成两个单独的碱基配对的RNA分子的siRNA。
siRNA还可以包含3′-突出端。本文中使用的“3′-突出端”是指从RNA链的3′末端延伸的至少一个未配对的核苷酸。因此,在一个实施方案中,siRNA包含长度为1至约6个核苷酸(其包括核糖核苷酸或脱氧核苷酸),优选长度为1至约5个核苷酸,更优选长度为1至约4个核苷酸,特别优选长度为约2至约4个核苷酸的至少一个3′-突出端。在其中siRNA分子的两条链(即,单链siRNA分子在细胞内被“Dicer”蛋白质切割)包含3′-突出端的实施方案中,每条链的突出端的长度可以相同或不同。在一个最优选的实施方案中,3′-突出端存在于siRNA的两条链上,并且长度为2个核苷酸。例如,siRNA的每条链可包含双脱氧胸苷酸(“TT”)或二尿嘧啶酸(“uu”)的3′-突出端。
为了增强siRNA的稳定性,也可以稳定3′突出端以防止降解。在一个实施方案中,通过包含嘌呤核苷酸(例如腺苷或鸟苷核苷酸)来稳定突出端。或者,通过用经修饰的类似物替换嘧啶核苷酸,例如用2′-脱氧胸苷替换3′-突出端中的尿苷核苷酸是允许的,并且不影响RNAi降解的效率。特别地,2′-脱氧胸苷中不存在2′-羟基显著增强了组织培养介质中3′-突出端的核酸酶抗性。
本文中使用的“靶mRNA”是指作为下调靶标的RNA分子。
根据本发明的siRNA可以靶向任何靶mRNA序列(“靶序列”)中约19至25个连续核苷酸的任何区段。用于选择siRNA的靶序列的技术例如在Tuschl T.等,2002年10月11日修订的″The siRNA User Guide″中给出,其全部公开内容通过引用并入本文,“The siRNA UserGuide”可在万维网上由美国纽约洛克菲勒大学RNA分子生物学实验室的Thomas Tuschl博士维护的网站找到并且可通过访问洛克菲勒大学网站并使用关键词“siRNA”进行搜索找到。关于靶序列的选择和/或siRNA的设计的另外的指南可在Protocol Online(www.protocol-online.com)的网页上使用关键词“siRNA”找到。因此,在一个实施方案中,本发明的siRNA的有义链包含与靶mRNA中约19至约25个核苷酸的任何连续区段基本上相同的核苷酸序列。
通常,靶mRNA上的靶序列可以选自对应于靶mRNA的给定cDNA序列,优选从起始密码子下游(即3′方向)开始50至100nt。然而,靶序列可位于5′或3′非翻译区中,或位于起始密码子附近的区域中。
可使用本领域技术人员已知的多种技术获得siRNA。例如,可使用本领域已知的方法化学合成或重组产生siRNA,例如Tuschl等的美国专利申请号2002/0086356中描述的果蝇体外***,其全部公开内容通过引用并入本文。siRNA可以由pol III表达载体表达而不改变靶向位点,因为认为仅当第一转录的核苷酸是嘌呤时,从pol III启动子的RNA的表达是有效的。
优选地,使用任何合适的启动子从重组环状或线性DNA质粒转录siRNA。用于从质粒转录本发明siRNA的合适启动子包括,例如,U6或H1RNA pol III启动子序列和巨细胞病毒启动子。其他合适的启动子的选择在本领域技术范围内。
适于转录siRNA的质粒、将用于将siRNA表达的核酸序列***质粒的方法以及所述siRNA的体外转录的IVT方法的选择都在本领域技术范围内。
本文中使用的术语“miRNA”(微小RNA)涉及非编码RNA,其长度为21至25(例如21至23,优选22)个核苷酸并且其诱导靶mRNA的降解和/或阻止靶mRNA的翻译。miRNA通常存在于植物、动物和一些病毒中,其中它们分别由植物和动物中的真核核DNA和病毒DNA(基因组基于DNA的病毒)编码。miRNA是转录后调节因子,其与靶信使RNA转录物(mRNA)上的互补序列结合,通常导致翻译抑制或靶标降解和基因沉默。
可使用本领域技术人员已知的多种技术获得miRNA。例如,可使用本领域已知的方法化学合成或重组产生反义RNA(例如,通过使用市售的试剂盒,例如Applied BiologicalMaterialsInc.销售的miRNA cDNA合成试剂盒)。优选地,使用任何合适的启动子从重组环状或线性DNA质粒转录反义RNA。例如,在Sato等(Nucleic Acids Res.37(2009):W277-W280),Hamada等(Nucleic Acids Res.39(2011):W100-W1062011),和Reuter and Mathews(BMC Bioinformatics 11(2010):129)给出了用于预测RNA的二级结构的技术。
术语“核苷”涉及可被认为是没有磷酸基团的核苷酸的化合物。虽然核苷是与糖(例如核糖或脱氧核糖)连接的核碱基,但核苷酸由核苷和一个或更多个磷酸基团组成。核苷的实例包括胞苷、尿苷、腺苷和鸟苷。
构成核酸的五种标准核苷是尿苷、腺苷、胸苷、胞苷和鸟苷。五种核苷通常分别缩写为它们的单字母代码U、A、T、C和G。然而,胸苷更常被称为“dT”(“d”代表“脱氧”),因为它含有2′-脱氧呋喃核糖部分而不是尿苷中存在的呋喃核糖环。这是因为胸苷存在于脱氧核糖核酸(DNA)而非核糖核酸(RNA)中。相反,尿苷存在于RNA而非DNA中。其余三种核苷可以存在于RNA和DNA中。在RNA中,它们将表示为A、C和G,而在DNA中它们将表示为dA、dC和dG。
术语RNA(优选ssRNA,例如mRNA)的“稳定性”涉及RNA的“半衰期”。“半衰期”涉及消除一半活性、分子量或分子数所需的时间。在本发明的上下文中,RNA(优选ssRNA,例如mRNA或抑制性ssRNA)的半衰期指示所述RNA的稳定性。
当然,如果根据本发明期望降低RNA(优选ssRNA,例如mRNA或抑制性ssRNA)的稳定性,则可以修饰RNA(优选ssRNA,例如mRNA或抑制性ssRNA),从而干扰如上文所述的提高RNA(优选ssRNA,例如mRNA或抑制性ssRNA)稳定性的元件的功能。
在一个实施方案中,根据本发明的ssRNA是(经修饰的)ssRNA,特别是编码肽或蛋白质的(经修饰的)mRNA。根据本发明,术语“编码肽或蛋白质的ssRNA”是指如果存在于适当的环境中,优选在细胞内,ssRNA在翻译期间可以指导氨基酸的组装以产生,即表达肽或蛋白质。优选地,根据本发明的ssRNA(例如mRNA)能够与细胞翻译机器相互作用,从而允许翻译肽或蛋白质。
根据本发明,术语“表达”以其最一般的含义使用,并且包括例如通过转录和/或翻译产生RNA和/或肽或蛋白质。关于RNA,术语“表达”或“翻译”特别涉及肽或蛋白质的产生。它还包括核酸的部分表达。此外,表达可以是瞬时的或稳定的。
在本发明的上下文中,术语“转录”涉及其中DNA序列中的遗传密码被转录成RNA的方法。随后,RNA可以翻译成蛋白质。根据本发明,术语“转录”包括“体外转录”,其中术语“体外转录”涉及一种这样的方法,其中RNA,特别是ssRNA例如mRNA在无细胞体系中(优选使用适当的细胞提取物)体外合成。优选地,应用克隆载体用于产生转录物。这些克隆载体通常称为转录载体,并且根据本发明涵盖在术语“载体”中。根据本发明,RNA制备物包含通过体外转录,特别是适当DNA模板的体外转录产生的ssRNA。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的具体实例是T7、T3和SP6RNA聚合酶。优选地,体外转录由T7、T3或SP6启动子控制。用于体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸,特别是cDNA,并将其导入合适的载体进行体外转录来获得。可以通过RNA的逆转录获得cDNA。
含有载体模板的cDNA可包含携带不同cDNA***物的载体,其在转录后产生任选地能够表达不同肽或蛋白质的不同RNA分子的群,或者可包含仅携带一种cDNA***物的载体,其在转录后仅产生能够仅表达一种肽或蛋白质的一种RNA种类的群体。因此,可以产生仅能够表达单个肽或蛋白质的RNA或产生不同RNA的组合物,例如RNA文库和能够表达多于一种肽或蛋白质(例如肽或蛋白质的组合物)的全细胞RNA。本发明设想将所有这些RNA引入细胞中。
根据本发明的术语“翻译”涉及细胞的核糖体中的过程,通过该过程mRNA链指导氨基酸序列的组装以产生肽或蛋白质。
本文中使用的术语“肽”包括寡肽和多肽,并且是指包含通过肽键共价连接的两个或更多个,优选3个或更多个,优选4个或更多个,优选6个或更多个,优选8个或更多个,优选10个或更多个,优选13个或更多个,优选16个或更多个,优选21个或更多个以及至多优选8个、10个、20个、30个、40个或50个,特别是100个氨基酸的物质。术语“蛋白质”优选是指大肽,优选指具有多于100个氨基酸残基的肽,但通常术语“肽”和“蛋白质”是同义词并且在本文中可互换使用。
根据本发明,ssRNA例如mRNA可编码肽或蛋白质。因此,ssRNA可含有编码肽或蛋白质的编码区(开放阅读框(open reading frame,ORF))。例如,ssRNA可编码和表达抗原或药学活性肽或蛋白质,例如免疫活性化合物(优选不是抗原)。在这方面,“开放阅读框”或“ORF”是从起始密码子开始并以终止密码子结束的连续一段密码子。
术语“药学活性肽或蛋白质”包括可用于治疗对象的肽或蛋白质,其中肽或蛋白质的表达将在例如改善疾病或病症的症状方面有益。例如,药学活性蛋白质可以替代或增强细胞中的蛋白质表达,所述细胞通常不表达蛋白质或错误表达蛋白质,例如,药学活性蛋白质可通过提供所期望的蛋白质来补偿突变。此外,“药学活性肽或蛋白质”可以在对象中产生有益的结果,例如,可以用于产生向对象接种疫苗抵抗感染性疾病的蛋白质。优选地,当以治疗有效量向对象施用时,“药学活性肽或蛋白质”对对象的病症或疾病状态具有积极或有利的作用。优选地,药学活性肽或蛋白质具有治疗或缓和性质,并且可以被施用以改善、减轻、缓解、逆转、延迟疾病或病症的一种或更多种症状的发作或减轻其严重性。药学活性肽或蛋白质可以具有预防性质,并且可以用于延迟疾病的发作或减轻这种疾病或病理状况的严重性。术语“药学活性肽或蛋白质”包括完整蛋白质或多肽,并且还可以指其药学活性片段。它还可以包括肽或蛋白质的药学活性类似物。术语“药学活性肽或蛋白质”包括作为抗原的肽和蛋白质,即肽或蛋白质在对象中引发免疫应答,其可以是治疗性的或部分或完全保护性的。
药学活性蛋白质的实例包括但不限于细胞因子和免疫***蛋白质,例如免疫活性化合物(例如白细胞介素、集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、***、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素、整合素、地址素(addressin)、选择素、归巢受体、T细胞受体、免疫球蛋白、可溶性主要组织相容性复合物抗原、免疫活性抗原例如细菌、寄生虫或病毒抗原、变应原、自身抗原、抗体),激素(胰岛素、甲状腺激素、儿茶酚胺、***、营养激素、催乳素、催产素、多巴胺、牛生长激素、瘦蛋白等),生长激素(例如人生长激素),生长因子(例如,表皮生长因子、神经生长因子、***等),生长因子受体,酶(组织纤溶酶原活化剂、链激酶(streptokinase)、胆固醇生物合成或降解酶、类固醇生成酶、激酶、磷酸二酯酶、甲基化酶、去甲基化酶、脱氢酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、芳香酶、细胞色素、腺苷酸或鸟苷酸环化酶、神经酰胺酶等),受体(类固醇激素受体、肽受体),结合蛋白(生长激素或生长因子结合蛋白等),转录和翻译因子,抑制肿瘤生长的蛋白质(例如抑制血管生成的蛋白质),结构蛋白(例如胶原蛋白、丝蛋白、纤维蛋白原、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白)和血液蛋白(凝血酶、血清白蛋白、因子VII、因子VIII、胰岛素、因子IX、因子X、组织纤溶酶原活化物、蛋白C、血管性血友病因子、抗凝血酶III、葡糖脑苷脂酶、***粒细胞集落刺激因子(GCSF)或修饰的因子VIII、抗凝血剂等。
在一个实施方案中,药学活性蛋白质是参与调节淋巴样内稳态的细胞因子,优选参与并优选诱导或增强T细胞的发育、致敏、扩增、分化和/或存活的细胞因子。在一个实施方案中,细胞因子是白细胞介素。在一个实施方案中,药学活性蛋白质是选自IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和IL-21的白细胞介素。
术语“免疫活性化合物”涉及改变免疫应答的任何化合物,优选通过诱导和/或抑制免疫细胞的成熟、诱导和/或抑制细胞因子生物合成,和/或通过刺激B细胞产生的抗体来改变体液免疫。免疫活性化合物具有有效的免疫刺激活性,包括但不限于抗病毒和抗肿瘤活性,并且还可以下调免疫应答的其他方面,例如使免疫应答远离TH2免疫应答,这对于治疗广泛的TH2介导的疾病是有用的。免疫活性化合物可用作疫苗佐剂。
在一个实施方案中,将编码抗原例如疾病相关抗原的ssRNA(例如mRNA)施用于哺乳动物,特别是如果需要治疗患有涉及或表达抗原(疾病相关抗原)的疾病的哺乳动物。ssRNA优选被摄入到哺乳动物的抗原呈递细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或其他细胞)中。形成ssRNA的抗原翻译产物,并将产物展示在细胞表面上以供T细胞识别。在一个实施方案中,抗原或通过其任选的方法产生的产物在MHC分子的情况下展示在细胞表面上,用于T细胞通过其T细胞受体识别,从而导致它们的活化。
干扰素是重要的细胞因子,其特征在于抗病毒、抗增殖和免疫调节活性。干扰素是通过与受调节细胞表面上的干扰素受体结合来改变和调节细胞内基因转录,从而阻止细胞内的病毒复制的蛋白质。干扰素可分为两种类型。IFN-γ是唯一的II型干扰素;所有其他都是I型干扰素。I型和II型干扰素的基因结构不同(II型干扰素基因有三个外显子;I型有一个),染色***置(在人中,II型位于染色体-12;I型干扰素基因连接并位于染色体-9上),以及产生它们的组织的类型(I型干扰素普遍合成,II型由淋巴细胞合成)。I型干扰素竞争性地彼此抑制与细胞受体的结合,而II型干扰素具有不同的受体。根据本发明,术语“干扰素”或“IFN”优选涉及I型干扰素,特别是IFN-α和IFN-β。
在一个实施方案中,RNA,特别是在细胞中表达的RNA,是单链自我复制的RNA。在一个实施方案中,自我复制的RNA是正义的单链RNA。在一个实施方案中,自我复制的RNA是病毒RNA或来源自病毒RNA的RNA。在一个实施方案中,自复制RNA是甲病毒基因组RNA或来源自甲病毒基因组RNA。在一个实施方案中,自我复制的RNA是病毒基因表达载体。在一个实施方案中,该病毒是塞姆利基森林病毒。在一个实施方案中,自我复制RNA含有一个或更多个转基因,在一个实施方案中,如果RNA是病毒RNA,则可部分或完全取代病毒序列,例如编码结构蛋白的病毒序列。
本文中使用的术语“RNA制备物”是指包含至少一种上文所述的多种RNA类型(即mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、ssRNA、dsRNA和抑制性ssRNA(例如反义RNA、siRNA或miRNA))的组合物。本文中使用的术语“包含ssRNA的RNA制备物”是指包含至少ssRNA的任何组合物(然而,所述组合物还可包含dsRNA)。术语“包含通过体外转录产生的ssRNA的RNA制备物”是指包含至少ssRNA的任何组合物,其中所述ssRNA已通过体外转录产生。
本文中使用的术语“体外转录”或“IVT”是指转录(即RNA的产生)以无细胞方式进行。即,IVT不使用活细胞/培养的细胞,而是使用从细胞中提取的转录机器(transcriptionmachinery)(例如,细胞裂解物或其分离的组分,包括RNA聚合酶(优选T7、T3或SP6聚合酶))。
本文中使用的术语“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件、环境或条件可发生或可不发生,并且该描述包括所述事件、环境或条件发生的实例和不发生的实例。
“异构体”是具有相同分子式但结构不同的化合物(“结构异构体”)或官能团和/或原子的几何定位不同的化合物(“立体异构体”)。“对映异构体”是一对立体异构体,它们是彼此不可重叠的镜像。“外消旋混合物”或“外消旋物”含有等量的一对对映体,并用前缀(±)表示。“非对映异构体”是立体异构体,它们是彼此不可重叠的镜像。“互变异构体”是相同化学物质的结构异构体,即使在纯时也会相互自发地相互转化。
术语例如“减少”、“降低”或“抑制”涉及引起水平整体降低,优选为5%或更高,10%或更高,20%或更高,更优选为50%或更高,并且最优选为75%或更高的能力。这还包括完全或基本上完全降低,即降低到零或基本上降低到零。
术语例如“提高”、“增强”或“延长”优选涉及提高、增强或延长约至少10%,优选至少20%,优选至少30%,优选至少40%,优选至少50%,优选至少80%,优选至少100%,优选至少200%,特别是至少300%。这些术语还可以涉及从零或不可测量或不可检测水平提高、增强或延长至大于零的水平或可测量或可检测的水平。
本文中使用的术语“天然存在的”是指对象可以在自然界中找到的事实。例如,存在于生物体(包括病毒)中的、可以从自然界中的来源分离、并且在实验室中没有被人特意修饰的蛋白质或核酸是天然存在的。
本发明的ssRNA可以是同位素标记的,即ssRNA的一个或更多个原子被具有相同质子数但中子数不同的相应原子取代。例如,氢原子可以被氘原子取代。可用于本发明的ssRNA的示例性同位素包括氘、11C、13C、14C、15N、18F、32S、36Cl和125I。同位素标记的ssRNA可以通过在体外转录期间使用相应的同位素标记的核苷酸或通过在转录后添加这样相应的同位素标记的核苷酸来产生。
在一个方面,本发明提供了药物组合物,其包含本发明的ssRNA和一种或更多种可药用赋形剂。在一个实施方案中,药物组合物包含本发明的ssRNA、一种或更多种可药用赋形剂和一种或更多种另外的/补充的活性化合物。
在另一些方面,本申请提供了如上所指明的ssRNA或如本文中所述的药物组合物用于治疗。
例如,本发明的ssRNA和药物组合物可用于治疗(包括预防性治疗)选自以下的病症、障碍或疾病:感染性疾病(例如由病毒、细菌、真菌或其他微生物引起的那些);不期望的炎症(例如免疫障碍);和癌症。
因此,在另一些方面,本发明提供了(i)本发明的ssRNA(或包含这样ssRNA以及任选地可药用赋形剂的药物组合物)用于治疗本文中所指明的病症、障碍或疾病的方法,特别是选自感染性疾病(例如由病毒、细菌、真菌或其他微生物引起的疾病);不期望的炎症;和癌症的疾病;和(ii)治疗有此需要的个体的方法,其包括向个体施用药学有效量的本发明的ssRNA(或包含这样ssRNA以及任选地可药用赋形剂的药物组合物)。在一个实施方案中,所述个体患有或易患或存在本文中公开的一种或更多种病症、障碍或疾病的风险。病症、障碍或疾病可选自感染性疾病(例如,由病毒、细菌、真菌或其他微生物引起的那些);不期望的炎症;和癌症。此外,个体优选为哺乳动物,且更优选为人。
癌症(医学术语:恶性肿瘤)是一类这样的疾病,其中一组细胞显示出不受控制的生长(超出正常范围的***)、侵入(侵入和破坏邻近组织),并且有时转移(通过淋巴或血液扩散到体内其他位置)。这三种癌症的恶性特征将它们与良性肿瘤区分开来,良性肿瘤是自限性的,并且不侵入或转移。大多数癌症形成肿瘤,即由细胞的异常生长(称为赘生性细胞或肿瘤细胞)形成的肿胀或病变,但是一些(像白血病)则不会。根据本发明的术语“癌症”包括白血病、***瘤、黑素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌、脑癌、***、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌、头颈癌、胃肠癌、***癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉癌(ENT)、乳腺癌、***癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌及其转移。其实例是肺癌、***癌、***癌、结肠癌、肾细胞癌、***或上述癌症类型或肿瘤的转移。根据本发明的术语癌症还包括癌症转移。
可用本发明的ssRNA和药物组合物治疗的癌症的实例包括恶性黑素瘤,所有类型的癌(结肠癌、肾细胞癌、膀胱癌、***癌、非小细胞和小细胞肺癌等)、淋巴瘤、肉瘤、胚胎瘤、胶质瘤等。
恶性黑素瘤是一种严重的皮肤癌类型。这是由于色素细胞(称为黑素细胞)的不受控制的生长。
根据本发明,“癌”是来源自上皮细胞的恶性肿瘤。该组代表最常见的癌症,包括乳腺癌、***癌、肺癌和结肠癌的常见形式。
淋巴瘤和白血病是来源自造血(血液形成)细胞的恶性肿瘤。
肉瘤是由胚胎中胚层发育的许多组织的一种中的转化细胞产生的癌症。因此,肉瘤包括骨、软骨、脂肪、肌肉、血管和造血组织的肿瘤。
囊胚瘤(blastic tumor)或胚细胞瘤是一种类似未成熟或胚胎组织的肿瘤(通常是恶性肿瘤)。许多这些肿瘤在儿童中最常见。
胶质瘤是一种从脑或脊柱开始的肿瘤类型。它被称为胶质瘤,因为它来自胶质细胞。胶质瘤最常见的部位是脑。
“转移”是指癌细胞从其原始部位扩散到身体的另一部分。转移的形成是一个非常复杂的过程,并且依赖于恶性细胞从原发性肿瘤脱离,侵入细胞外基质,渗透内皮基底膜以进入体腔和血管,然后,在通过血液运输后,浸润靶器官。最后,新肿瘤(即继发性肿瘤或转移性肿瘤)在靶位点处的生长依赖于血管生成。由于肿瘤细胞或组分可保留并产生转移潜能,因此即使在去除原发性肿瘤后肿瘤转移也经常发生。在一个实施方案中,根据本发明的术语“转移”涉及“远端转移”,其涉及远离原发性肿瘤和区域性******的转移。
示例性免疫病变包括但不限于自身免疫疾病(例如,糖尿病、关节炎(包括类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎和银屑病关节炎),多发性硬化,脑脊髓炎,重症肌无力,***性红斑狼疮,自身免疫性甲状腺炎,皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎),银屑癣,干燥综合征,克罗恩病,口疮性溃疡,虹膜炎,结膜炎,角膜结膜炎,溃疡性结肠炎,哮喘,变应性哮喘,脓毒症和感染性休克,炎性肠病,皮肤红斑狼疮,硬皮病,***炎,直肠炎,药疹,麻风逆转反应,麻风结节性红斑(erythema nodosum leprosum),自身免疫性葡萄膜炎,变应性脑脊髓炎,急性坏死出血性脑病,特发性双侧进行性感音神经性耳聋,再生障碍性贫血,纯红细胞性贫血,特发性血小板减少症,多软骨炎,韦格纳肉芽肿病,慢性活动性肝炎,史蒂文斯-约翰逊综合(Stevens-Johnson syndrome)征,肾小球肾炎,特发性口炎,扁平苔癣,格雷夫斯病,结节病,原发性胆汁性肝硬化,后葡萄膜炎和肺间质纤维化),移植物抗宿主病,移植病例和***反应,例如特应性***反应。
示例性病毒包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)、EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)、巨细胞病毒(CMV)(例如,CMV5)、人疱疹病毒(HHV)(例如,HHV6、7或8)、单纯疱疹病毒(HSV)、牛疱疹病毒(BHV)(例如BHV4)、马疱疹病毒(EHV)(例如EHV2)、人T-CeI1白血病病毒(HTLV)5,水痘-带状疱疹病毒(VZV),麻疹病毒,乳多空病毒(JC和BK),肝炎病毒(例如HBV或HCV),黏液瘤病毒,腺病毒,细小病毒,多瘤病毒,流感病毒,***瘤病毒和痘病毒(例如痘苗病毒和***病毒(MCV))和狂犬病病毒属。这样的病毒可能或可能不表达凋亡抑制剂。由病毒感染引起的示例性疾病包括但不限于水痘、巨细胞病毒感染性疾病、生殖器疱疹、乙型肝炎和丙型肝炎、流行性感冒和带状疱疹以及狂犬病。
示例性细菌包括但不限于空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肠杆菌属物种、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)(例如,大肠杆菌O157:H7)、A组链球菌、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、李斯特菌、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis),以及疏螺旋体和立克次氏体。由细菌感染引起的示例性疾病包括但不限于炭疽、霍乱、白喉、食源性疾病(foodbome illness)、麻风病、脑膜炎、消化性溃疡病、肺炎、脓毒症、脓毒症性休克、梅毒、破伤风、肺结核、伤寒和泌尿道感染、莱姆病和落基山斑疹热。
可用本发明的ssRNA和药物组合物治疗的感染性疾病的具体实例包括病毒感染性疾病,例如AIDS(HIV)、甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎、疱疹、带状疱疹(水痘)、德国麻疹(风疹病毒)、黄热病、登革热;黄病毒引起的感染性疾病;流感;出血性感染性疾病(马尔堡或埃博拉病毒);细菌感染性疾病(例如军团病(军团菌,Legionella)、胃溃疡(螺杆菌,Helicobacter)、霍乱(弧菌,Vibrio),大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌或链球菌(破伤风)引起的感染;原生动物病原体感染,例如疟疾、昏睡病、利什曼病、弓形虫病,即由疟原虫(Plasmodium)、锥虫(Trypanosoma)、利什曼原虫(Leishmania)和弓形虫(Toxoplasma)引起的感染;或真菌感染,其由例如新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)或白色念珠菌(Candida albicans)引起。
本发明的ssRNA和药物组合物可以单独使用或与一种或更多种另外的/补充的活性化合物联合使用,所述活性化合物可以在施用本发明的ssRNA或药物组合物之前、同时或之后施用。这样的一个或更多个另外的/补充的活性化合物包括用于癌症患者的化疗药物(例如吉西他滨、依托泊苷、顺铂、卡铂),抗病毒剂,抗寄生虫剂,抗细菌剂,免疫治疗剂(例如,抗原或其片段(特别是其免疫原性片段)和佐剂,以及如果与本发明的ssRNA同时施用,可以存在于本发明的药物组合物中。
特别地,一种或更多种另外的/补充的活性化合物可包含免疫治疗剂,优选诱导或产生靶向的(即特异性的)免疫反应的免疫治疗剂。因此,在一个实施方案中,本发明的ssRNA和药物组合物可以与免疫治疗剂联合使用,优选地,免疫治疗剂诱导或产生靶向的(即特异性的)免疫反应。这样的免疫治疗剂包括针对疾病相关抗原的药剂,例如诱导针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原的细胞的免疫应答的治疗性抗体或药剂。有用的免疫治疗剂包括诱导针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原的细胞的B细胞或T细胞应答的蛋白质或肽。这些蛋白质或肽可包含基本上对应于疾病相关抗原或其一个或更多个片段的序列或与其相同的序列。在一个实施方案中,蛋白质或肽包含来源自疾病相关抗原的MHC呈递肽的序列。除了施用蛋白质或肽之外,还可以施用编码蛋白质或肽的核酸,优选mRNA。编码蛋白质或肽的RNA可以是本发明的ssRNA。作为替代或补充,编码蛋白质或肽的RNA可以是不同于根据本发明的RNA,所述RNA可以在施用本发明的药物组合物的同时和/或之前、和/或之后施用(在这种情况下,RNA可以形成本发明的药物组合物的一部分)。因此,本发明的药物组合物可用于基因疫苗接种,其中通过向对象中引入编码抗原或其片段的合适核酸分子(DNA或mRNA)来刺激免疫应答。
在一个实施方案中,疾病相关抗原是肿瘤相关抗原。在该实施方案中,本发明的ssRNA和药物组合物可用于治疗癌症或癌症转移。优选地,患病器官或组织的特征在于患病细胞,例如表达疾病相关抗原和/或特征在于疾病相关抗原与其表面的结合的癌细胞。用完整或基本上完整的肿瘤相关抗原或其片段(例如编码这样抗原或片段的MHC I类和II类肽或核酸,特别是mRNA)进行免疫使得可以引发MHC I类和/或II类应答,并因此刺激T细胞,例如能够裂解癌细胞和/或CD4+T细胞的CD8+细胞毒性T淋巴细胞。这样的免疫还可以引发体液免疫应答(B细胞应答),导致产生针对肿瘤相关抗原的抗体。此外,抗原呈递细胞(APC)例如树突细胞(DC)可以直接加载MHC I类呈递的肽,或者通过在体外用编码肿瘤抗原或肿瘤抗原肽的核酸转染并施用于患者。
根据本发明,肿瘤相关抗原优选包括就类型和/或表达水平而言其特征在于肿瘤或癌症以及肿瘤或癌细胞的任何抗原。在一个实施方案中,术语“肿瘤相关抗原”涉及在正常条件下,即在健康对象中,特异性地在有限数目的器官和/或组织中或在特定发育阶段中表达的蛋白质,例如,肿瘤相关抗原可以在正常条件下在胃组织中特异性表达,优选在胃黏膜中、在生殖器官中,例如在睾丸中、在滋养细胞组织中例如在胎盘中,或在生殖系细胞中,并且在一种或更多种肿瘤或癌组织中表达或异常表达。在本文上下文中,“有限数目”优选表示不超过3个,更优选不超过2个或1个。本发明上下文中的肿瘤相关抗原包括例如分化抗原,优选细胞类型特异性分化抗原,即在特定分化阶段在特定细胞类型中特异性表达的正常条件下的蛋白质、癌症/睾丸抗原,即正常条件下在睾丸和有时在胎盘中特异性表达的蛋白质,以及种系特异性抗原。在本发明的上下文中,肿瘤相关抗原优选与癌细胞的细胞表面相关,并且优选不在正常组织中表达或在正常组织中仅很少表达。优选地,由肿瘤相关抗原或肿瘤相关抗原的异常表达鉴定癌细胞。在本发明的上下文中,在对象(例如患有癌症疾病的患者)中癌细胞表达的肿瘤相关抗原优选是所述对象中的自身蛋白。在一些优选的实施方案中,本发明上下文中的肿瘤相关抗原在正常条件下,特别是在非必需的组织或器官中表达,即当被免疫***损伤时不会导致对象死亡的组织或器官,或在免疫***不能或不乎不能接近的身体器官或结构中。在一个实施方案中,肿瘤相关抗原的氨基酸序列在正常组织中表达的肿瘤相关抗原和在癌组织中表达的肿瘤相关抗原之间是相同的。优选地,肿瘤相关抗原在MHC分子的情况下由表达它的癌细胞呈递。
作为肿瘤免疫疗法中的靶结构,理想地满足本发明所构想的肿瘤相关抗原之标准的分化抗原的实例特别在肿瘤疫苗接种是密封蛋白家族的细胞表面蛋白,例如CLDN6和CLDN18.2。这些分化抗原在多种来源的肿瘤中表达,并且由于它们的选择性表达(在毒性相关的正常组织中不表达)和定位于质膜,因此特别适合作为与抗体介导的癌症免疫疗法相关的靶结构。
可用于本发明的抗原的其他实例是p53、ART-4、BAGE、β-连环蛋/m、Bcr-abLCAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、CLAUDIN-12、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gap100、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT(或hTRT)、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A,优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12、MAGE-B、MAGE-C、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NF1、NY-ESO-1、NY-BR-1、p190小BCR-abL、Pml/RARa、PRAME、蛋白酶3、PSA、PSM、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、SURVIVIN、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE和WT,优选WT-1。
“抗原”应理解为意指可引起抗体的形成和/或细胞免疫应答的活化的任何结构。抗原的实例是多肽、蛋白质、细胞、细胞提取物、碳水化合物/多糖、多糖缀合物、脂质和糖脂。这些抗原可以是肿瘤抗原或病毒、细菌、真菌和原生动物抗原或变应原。术语“抗原”还包括衍生化抗原作为次要物质,其仅通过转化(例如,在分子中间,通过用体蛋白质完成)变为抗原性和致敏性,以及缀合抗原,其通过人工并入原子基团(例如,异氰酸酯、重氮盐)显示出新的组成特异性。抗原可以以与合适载体偶联的半抗原的形式存在于根据本发明的疫苗中。合适的载体是本领域普通技术人员已知的并且包括例如人血清白蛋白(HSA)、聚乙二醇(PEG)。半抗原可以通过现有技术中熟知的方法与载体偶联,例如,在多肽载体通过酰胺键与Lys残基偶联的情形。
术语“免疫原性”是指特定物质,特别是RNA(优选ssRNA,例如mRNA)在对象例如人体内引发免疫应答的能力。换言之,免疫原性是诱导免疫应答的能力。
“诱导免疫应答”可意味着在诱导免疫应答之前没有免疫应答,但它也可意味着在诱导免疫应答之前存在一定水平的免疫应答,并且在诱导免疫应答后所述免疫应答增强。因此,“诱导免疫应答”包括“增强免疫应答”。优选地,在对象中诱导免疫应答后,保护所述对象免于发生例如癌症或感染性疾病的疾病,或通过诱导免疫应答来改善疾病状况。
术语“免疫疗法”涉及优选涉及特异性免疫应答和/或免疫效应功能的治疗。
术语“免疫接种”或“疫苗接种”描述了出于治疗或预防原因治疗对象的过程。
术语“对象”、“患者”或“个体”涉及脊椎动物。例如,在本发明的上下文中的脊椎动物是哺乳动物、鸟类(例如家禽)、爬行动物、两栖动物、硬骨鱼类和软骨鱼类,特别是任何前述的驯养动物以及圈养动物例如动物园的动物,并且优选哺乳动物。在本发明的上下文中的哺乳动物包括但不限于人、非人灵长类动物、驯养的哺乳动物,例如狗、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马等,实验室哺乳动物,例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠等以及圈养的哺乳动物例如动物园的哺乳动物。本文中使用的术语“对象”还包括人。
术语例如“转移”、“转染”或“引入细胞”在本文中可互换使用,并且涉及将核酸,特别是外源或异源核酸,特别是ssRNA引入细胞中。根据本发明,细胞可以形成器官、组织和/或生物体的一部分。
根据本发明的药物组合物通常以“可药用的量”和以“可药用的制备物”应用。术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性剂的作用相互影响的材料的无毒性。
根据本发明,核酸(例如ssRNA)的施用作为裸核酸实现,或者与一种或更多种可药用赋形剂组合实现。优选地,核酸的施用是以裸核酸的形式。优选地,RNA与稳定物质例如RNase抑制剂组合施用。本发明还设想将核酸重复引入细胞中以允许长时间持续表达。
可以用与ssRNA可结合的任何赋形剂(特别是载体)转染细胞,例如通过与ssRNA形成复合物或形成其中包封或封装ssRNA的囊泡,导致与裸ssRNA相比ssRNA的稳定性提高。根据本发明有用的赋形剂(特别是载体)包括,例如含脂质的载体例如阳离子脂质、脂质体,特别是阳离子脂质体和胶束以及纳米颗粒。阳离子脂质可以与带负电荷的核酸形成复合物。根据本发明可使用任何阳离子脂质。此外,可以从对象中获取细胞,可以用ssRNA或本发明的药物组合物转染细胞,并且可以将转染的细胞***对象体内。
优选地,将编码肽或多肽的ssRNA引入细胞,特别是引入体内存在的细胞中,导致所述肽或多肽在细胞中表达。在一些特定的实施方案中,优选将核酸靶向特定细胞。在这样的实施方案中,用于将核酸施用于细胞的载体(例如,逆转录病毒或脂质体)显示出靶向分子。例如,可以将对靶细胞上的表面膜蛋白特异的抗体或靶细胞上的受体的配体等分子并入核酸载体中或与其结合。在通过脂质体施用核酸的情况下,可以将与内吞作用相关的表面膜蛋白结合的蛋白质并入脂质体制剂中,以便能够靶向和/或摄取。这样的蛋白质包括对特定细胞类型特异的衣壳蛋白或其片段,针对内化的蛋白质的抗体,靶向细胞内位置的蛋白质等。
当在本文中使用时,术语“赋形剂”旨在表示药物组合物中不是活性剂的所有物质(例如,在所使用的量/浓度方面未表现出任何治疗效果的治疗上无活性的成分),例如,如盐、载体、黏合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、分散剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、润湿剂、调味剂、着色剂、稳定剂(例如RNase抑制剂)或抗氧化剂,所有这些都优选是可药用的。
“可药用盐”包括,例如,酸加成盐,其可以例如通过使用可药用酸,例如盐酸、硫酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸形成。此外,合适的可药用盐可包括碱金属盐(例如钠盐或钾盐);碱土金属盐(例如钙盐或镁盐);铵(NH4+);以及用合适的有机配体形成的盐(例如,季铵和使用反阴离子例如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、烷基磺酸盐和芳基磺酸盐形成的胺阳离子)。可药用盐的示例性实例包括但不限于:乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、精氨酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、丁酸盐、乙二胺四乙酸钙、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、右旋樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、二盐酸盐、十二烷基硫酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐(estolate)、乙磺酸盐(esylate)、乙磺酸盐(ethanesulfonate)、甲酸盐、富马酸盐、半乳酸盐(galactate)、半乳糖醛酸盐、葡萄糖酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘油磷酸盐、乙醇酰阿散酸盐(glycolylarsanilate)、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、羟基萘酸盐、碘化物、异丁酸盐、异硫氰酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲烷磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、2-萘磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、N-甲基葡萄糖铵盐、油酸盐、草酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、邻苯二甲酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、辛二酸盐、琥珀酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘盐(triethiodide)、十一烷酸盐、戊酸盐等(参见,例如,S.M.Berge等,“Pharmaceutical Salts”,J.Pharm.Sci.,66,第1-19页(1977))。非可药用盐可用于制备可药用盐,并包括在本发明中。
根据本发明的组合物可包含可药用载体。本文中使用的“可药用载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、等张剂和吸收延迟剂等。“可药用载体”可以是固体、半固体、液体或其组合的形式。
可药用载体包括无菌水溶液或分散液、无菌非水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。这样的介质和试剂用于药物活性剂的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性剂不相容,否则考虑将其用于本发明的药物组合物中。用于可注射制剂的示例性可药用载体包括水、等张缓冲盐水溶液(例如林格或林格乳酸盐)、乙醇、多元醇(例如甘油)、聚亚烷基二醇(例如丙二醇和液体聚乙二醇)、氢化萘,特别是生物相容的丙交酯聚合物(例如,丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧化乙烯/聚氧丙烯共聚物)。
可药用的抗氧化剂的实例包括:(1)水溶性抗氧化剂,例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等;(2)油溶性抗氧化剂,例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等;和(3)金属螯合剂,例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
用于本发明药物组合物的合适缓冲剂包括乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和磷酸盐。
用于本发明药物组合物的合适防腐剂包括多种抗细菌剂和抗真菌剂,利如苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯、山梨酸和硫柳汞。还可以通过灭菌程序(例如,灭菌过滤,特别是灭菌微滤)来确保防止微生物的存在。
本发明的药物组合物可以通过任何途径,优选肠胃外向个体施用。本文中使用的表述“肠胃外施用”和“经胃肠外施用”是指除肠内施用(本文中使用的“肠内施用”和“经肠内施用”是指施用的药物被胃和/或肠吸收)以外的施用方式。肠胃外施用通常通过注射和/或输注进行,包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、骨内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管内、皮下、表皮下、关节内、包膜下、脑内、脑室内、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外胸骨内和表面施用。
本发明的ssRNA或药物组合物可通过本领域已知的多种方法施用。如本领域技术人员所理解的,施用途径和/或方式将根据所期望结果而变化。
活性剂(即,本发明的ssRNA和任选的一种或更多种另外的/补充的活性化合物)可以与将保护化合物免于快速释放的载体一起制备,例如控释制剂,包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送***。可使用可生物降解的生物相容的聚合物,例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种制剂的方法通常是本领域技术人员已知的。参见,例如,Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
为了通过某些施用途径施用活性剂(即,本发明的ssRNA和任选的一种或更多种另外的/补充的活性化合物),可能需要将活性剂与材料一起包被,或将化合物与材料共施用以防止其失活和/或提高待翻译的活性剂(特别是本发明的ssRNA)的效力。例如,活性剂可以在合适的载体中向个体施用,例如,含脂质的载体(特别是阳离子脂质)、脂质体(例如水包油包水CGF乳剂以及常规的脂质体)(Strejan等.,J.Neuroimmunol.7∶27(1984)),特别是阳离子脂质体)、胶束,其中包封或封装ssRNA的纳米颗粒,或稀释剂。可药用的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。
药物组合物通常在制造和储存条件下必须是无菌和稳定的。该组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质,其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、植物油例如橄榄油和可注射的有机酯,例如油酸乙酯。例如,通过使用例如卵磷脂的包被材料,通过在分散体的情况下保持所期望的粒度以及通过使用表面活性剂,可以保持适当的流动性。在许多情况下,优选在药物组合物中包含等张剂,例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂,例如单硬脂酸盐和明胶,可以实现可注射组合物的延长吸收。
通常,通过将活性剂并入无菌载体中来制备分散体,所述无菌载剂含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干),其产生活性剂的粉末加上来自其先前无菌过滤溶液的任何其他所需成分。
调整剂量方案以提供最佳的所期望的反应(例如,治疗反应)。例如,可以施用单次推注,可以随时间施用几个分开的剂量,或者可以根据治疗情况的紧急程度所指明的按比例降低或提高剂量。将药物组合物配制成单位剂型以便于施用和剂量的均匀性是特别有利的。本文中使用的单位剂型是指适合作为待治疗个体的单位剂量的物理上离散的单位;每个单位含有经计算可与所期望的药物载体一起产生所期望的治疗效果之预定量的活性剂。本发明的单位剂型的规格由以下决定并且直接取决以下:(a)活性剂的独特特征和要实现的特定治疗效果,和(b)在复合这样的活性剂以治疗个体敏感性的技术中固有的局限性。可以与载体材料组合以产生药物组合物(例如单一剂型)的活性剂的量(特别是ssRNA的量)将根据所治疗的个体和特定的施用方式而变化。可以与载体材料组合以产生单个剂型的活性剂的量通常是产生治疗效果的组合物的量。
通常,在100%中(对于药物制剂/组合物),活性剂的量(特别地,如果存在于药物制剂/组合物中,本发明的ssRNA的量,任选地与一种或更多种另外的/补充的活性化合物一起)的范围为约0.01%至约99%,优选约0.1%至约70%,最优选约1%至约30%,其中剩余的优选由一种或更多种可药用赋形剂构成。
单位剂量形式和/或当施用于个体或用于治疗时,活性剂(例如本发明的ssRNA)的量可以为约0.001mg至约1000mg(例如,约0.01mg至约约500mg、约0.1mg至约100mg,例如约1mg至约50mg)每单位,施用或治疗。在某些实施方案中,可使用个体的质量或体表面积计算合适量的这样的活性剂,包括约0.1mg/kg至10mg/kg(例如约0.2mg/kg至5mg/kg),或约0.1mg/m2至约400mg/m2(例如约0.3mg/m2至约350mg/m2或约1mg/m2至约200mg/m2)的量。
无论选择何种施用途径,将可以以合适的水合形式使用的活性剂(即ssRNA和任选的一种或更多种另外的/补充的活性化合物)和/或本发明的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方法配制成可药用的剂型(参见,例如,Remington,″The Science andPractice of Pharmacy″,由Allen,Loyd V.,Jr,编辑,第22版,Pharmaceutical Sciences,September 2012年9月;Ansel等,″Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems″,第7版,Lippincott Williams&Wilkins Publishers,1999.)。
可改变本发明药物组合物中活性剂的实际剂量水平,以便获得有效实现特定患者之所期望治疗反应的活性剂的量、组合物和施用方式而对患者无毒。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素,包括所用的本发明特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所用特定活性剂的***率、治疗持续时间、与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料,所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康状况和既往病史,以及像医学领域中公知的因素。
具有本领域普通技术的医生或兽医可以容易地确定和规定所需药物组合物的有效量。例如,医生或兽医可以以低于为了实现所期望的治疗效果所需水平之药物组合物中使用的活性剂的剂量开始,并逐渐提高剂量直至实现所期望的效果。通常,本发明药物组合物的合适日剂量是活性剂的量,其是有效产生治疗效果的最低剂量。这样的有效剂量通常取决于以上所述因素。优选地,施用是肠胃外,例如静脉内、肌内、腹膜内或皮下,优选施用于靶标位点附近。施用也可以是肿瘤内的。如果需要,药物组合物的有效日剂量可以作为在一天中以适当的间隔(任选地,以单位剂型)分开施用的两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量施用。虽然本发明的活性剂(特别是ssRNA)可以单独施用,但优选将活性剂作为药物制剂/组合物施用。
在一个实施方案中,本发明的ssRNA或药物组合物可以通过输注施用,优选长时间(例如超过24小时)缓慢连续输注以降低毒副作用。施用也可以通过连续输注进行2至24小时,例如2至12小时。这样的方案可以根据需要重复一次或更多次,例如,在6个月或12个月后。
本发明的药物组合物可以配制成用于通过注射进行肠胃外施用,例如通过推注或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型(例如,在小瓶(phial)中,在多剂量容器中)存在并且具有添加的防腐剂。本发明的药物组合物可以采取例如在油性或水性载体中的混悬液、溶液或乳液的形式,并且可以含有配制剂,例如悬浮剂、稳定剂或分散剂。或者,所述药剂可以是粉末形式,用于在使用前用合适的载体(例如无菌无热原水)构建。通常,用于静脉内施用的药物组合物是无菌等张水性缓冲液中的溶液。必要时,药物组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂(例如利多卡因)以缓解注射部位的疼痛。通常,成分单独或以单位剂量形式(例如作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物)在表明活性剂的量的密封容器(例如安瓿或小药囊中)中混合在一起提供。当药物组合物通过输注施用时,可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。当通过注射施用组合物时,可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水以便可以在施用前混合成分。
药物组合物可以与本领域已知的医疗装置一起施用。例如,在一个优选的实施方案中,本发明的药物组合物可以与无针皮下注射装置一起施用,例如US 5,399,163;US 5,383,851;US 5,312,335;US 5,064,413;US 4,941,880;US 4,790,824;或US 4,596,556中公开的装置。可用于本发明的公知的植入物和组件的实例包括在US 4,487,603中描述的那些,其公开了一种用于以受控速率分配药物的可植入微输液泵;US 4,486,194,其公开了一种通过皮肤施用药物的治疗装置;US4,447,233,其公开了一种用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵;US 4,447,224,其公开了一种用于连续药物递送的可变流量可植入输注装置;US 4,439,196,其公开了一种具有多室隔室的渗透药物递送***;和US 4,475,196,其公开了一种渗透性药物递送***。
许多其他这样的植入物、递送***和组件是本领域技术人员已知的。在某些实施方案中,本发明的ssRNA或药物组合物可以配制成确保体内适当的分布。例如,血脑屏障(BBB)排除了许多高亲水性化合物。为了确保本发明的ssRNA或药物组合物穿过BBB(如果需要的话),可以将它们配制在例如脂质体中。对于制备脂质体的方法,参见,例如,US 4,522,811;US 5,374,548;和US 5,399,331。脂质体可包含选择性运输到特定细胞或器官中的一个或更多个部分,从而增强靶向药物递送(参见,例如,V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见,例如,Low等的US5,416,016);甘露糖苷(Umezawa等,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038);抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357:140;M.Owais等(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39:180);和表面活性蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233:134)。
在本发明的一个实施方案中,本发明的ssRNA配制在脂质体中。在一个更优选的实施方案中,脂质体包括靶向部分。在一个最优选的实施方案中,脂质体中的ssRNA通过推注递送至邻近所需区域的部位。这样的基于脂质体的组合物应是易于注射程度的流体,其在制造和储存条件下应该是稳定的,并且应该防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。
用于治疗的“治疗有效剂量”可以通过客观响应来测量,所述客观响应可以是完全的或部分的。完全响应(CR)定义为没有病症、障碍或疾病的临床、放射学或其他证据。部分响应(PR)由疾病降低超过50%引起。中位进展时间(Median time to progression)是表征客观反应的持久性的量度。
用于治疗的“治疗有效剂量”还可以通过其稳定病症、障碍或疾病的进展的能力来测量,例如通过使用适当的动物模型***和/或技术人员已知的体外测定。治疗有效量的活性剂是指单独或与其他剂量一起实现所期望反应或所期望需效果的量。在治疗特定疾病或特定病症的情况下,所期望反应优选涉及抑制疾病进程。这包括减缓疾病的进展,特别是中断或逆转疾病的进展。治疗疾病或病症的所需反应还可以是所述疾病或所述病症发作延迟或预防发作。因此,治疗有效量的活性剂可以治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救,改善、改善或影响个体中病症、障碍或疾病或病症、障碍或疾病的症状或对病症、障碍或疾病的倾向。本领域普通技术人员将能够基于例如待治疗的疾病、障碍或病症,疾病、障碍或病症的严重程度,待治疗个体的参数(包括年龄、生理条件、大小和重量),治疗的持续时间,伴随治疗的类型(如果存在的话),具体的施用途径等类似的因素来确定这样的量。因此,本文中所述的活性剂的施用剂量可取决于多种这样的参数。在个体/患者的反应初始剂量不足的情况下,可使用更高剂量(或通过不同的,更局部的施用途径实现的有效更高剂量)。
本发明的药物组合物可以采取包含本发明的ssRNA和至少一种抗原(如上文中所讨论的抗原)或其片段(特别是其免疫原性片段)或编码所述抗原或片段的核酸(特别是RNA)的疫苗制剂的形式。
如果需要的话,本发明的药物组合物还可以在包装、试剂盒或分配器(dispenserdevice)装置中存在,其可以含有一种或更多种含有活性剂的单位剂型(即,ssRNA和任选的一种或更多种另外的/补充的活性化合物))。该包装可以例如包括金属或塑料箔,例如泡罩包装。包装、试剂盒或分配器装置可附有用于施用的说明书。
一种或更多种另外的/补充的活性化合物可包含免疫调节剂,例如抗-CTL-A4或抗-PD1或抗-PDL1或抗调节的T-细胞试剂,例如抗-CD25抗体或环磷酰胺。
本发明的药物组合物可与补充免疫增强物质例如一种或更多种佐剂一起施用,并且可包含一种或更多种免疫增强物质以进一步提高其有效性,优选地实现免疫刺激的协同效应。
术语“佐剂”涉及延长或增强或加速免疫应答的化合物。在这方面,根据多种类型的佐剂,可能有多种机制。例如,允许DC成熟的化合物(例如,脂多糖或CD40配体)形成第一类合适的佐剂。通常,影响免疫***的“危险信号”(LPS、GP96、dsRNA等)类型或细胞因子(例如GM-CSF)的任何药剂都可以用作佐剂,其可以加强和/或以受控方式影响免疫应答。CpG寡脱氧核苷酸也可以任选地用于本文上下文中,但是如上所讨论的,考虑在某些情况下它们会发生的副作用。然而,在一个实施方案中本发明的ssRNA(优选mRNA)可编码免疫刺激剂并且由所述ssRNA编码的所述免疫刺激剂用作主要免疫刺激剂的情况下,仅需要相对少量的CpG DNA(与仅用CpG DNA进行免疫刺激相比)。特别优选的佐剂是细胞因子,例如单核因子、淋巴因子、白细胞介素或趋化因子,例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、LT-α或生长因子,例如hGH.脂肽,例如Pam3Cys,也适合用作本发明药物组合物中的佐剂。
可以在家中、医生办公室、诊所、医院的门诊部或医院提供治疗。治疗通常在医疗监督下开始以便医务人员能够密切观察治疗效果并进行任何必要的调整。治疗的持续时间取决于患者的年龄和状况,以及患者对治疗的反应。
具有发生病症、障碍或疾病高风险的人可以接受预防性治疗以抑制或延迟病症、障碍或疾病的症状。
术语“治疗”是本领域普通技术人员已知的,并且包括向个体/患者应用或施用活性剂(例如,含有所述活性剂的药物组合物)或向从患有病症、障碍或疾病,或具有病症、障碍或疾病的症状,对病症、障碍或疾病有倾向的对象所分离的细胞、细胞培养物、细胞系、样品、组织或器官应用或施用活性剂(例如,含有所述活性剂的药物组合物)或程序,目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改善、影响或预防病症、障碍或疾病,病症、障碍或疾病的症状或对病症、障碍或疾病的倾向(例如,预防或消除疾病,包括减少对象中的肿瘤的大小或肿瘤数量;阻止或减缓对象中的疾病;抑制或减缓对象中新疾病的发生;降低目前患有或曾患有疾病的对象的症状和/或复发的频率或严重程度;和/或延长,即增加对象的寿命)。特别地,术语“疾病的治疗”包括治愈、缩短持续时间、改善、预防、减缓或抑制进展或恶化,或预防或延迟疾病或其症状的发作。因此,术语“治疗”可以包括病症、障碍或疾病或病症、障碍或疾病的症状的预防性治疗。当用于治疗时,活性剂包括本发明的ssRNA以及本文所述的一种或更多种另外的/补充的活性化合物,并且包括但不限于可以是小分子的其他治疗活性化合物、肽、肽模拟物、多肽/蛋白质、抗体、其他多核苷酸例如DNA或dsRNA、细胞、病毒、核酶和反义寡核苷酸。
通过以下实施例说明本发明,这些实施例说明了本发明的一些优选实施方案,但不应解释为限制权利要求书中限定的本发明的范围。未通过附加的权利要求书涵盖的那些实施例仅用于比较目的。
实施例
缩写
EtOH:乙醇
h:小时
hPa:百帕斯卡
min:分钟
mM:毫摩尔(10-3mol/l)
MPa:兆帕
nt:核苷酸
sec:秒
v/v:体积%
实验步骤
IVT RNA的纤维素纯化
除非另有说明,否则将由中等尺寸纤维(Sigma-Aldrich,目录号C6288)和1×STE缓冲液(10mM TRIS,pH 7.0,50mM NaCl,20mM EDTA)组成的纤维素粉末用于纯化方法。所有实验均在室温下进行。
“阴性”纯化方法
“阴性”纯化方法是基于IVT RNA与含有16%EtOH的1×STE缓冲液中的纤维素的孵育。该条件允许dsRNA与纤维素选择性结合,而ssRNA保留在可溶性级分中。
首先将纤维素以0.2g纤维素/ml的浓度混悬在含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液中,并在剧烈摇动下孵育10分钟。在4,000×g下离心5分钟后,将纤维素以0.2g纤维素/ml(经洗涤的纤维素)的浓度重悬于含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液中。
对于拉下实验,将500μl经洗涤的纤维素浆液转移到1.5ml管中,并在14,000×g下离心5分钟。在去除上清液后,将在100μl含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液中的50μg IVTRNA添加到纤维素中并在剧烈摇动下孵育15分钟。在14,000×g下离心5分钟后,除去上清液并沉淀核酸。然后在剧烈摇动下将纤维素与100μl不含EtOH的1×STE缓冲液孵育15分钟以释放结合的核酸。在14,000×g下离心5分钟后,除去上清液,并沉淀洗脱的核酸。
对于使用微型离心机旋转柱(NucleoSpin Filters,Macherey-Nagel,目录号740606)的纤维素纯化,将600μl洗涤前的纤维素浆料(0.12g纤维素)转移至旋转柱中并在14,000×g下离心60秒。弃去流过液并将500μl含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液添加至旋转柱中并在剧烈摇动下孵育5分钟以重悬纤维素。在14,000×g下离心60秒后,弃去流过液并将300至500μl含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液中的IVT RNA(50至500μg)添加至旋转柱中,并在剧烈摇动下孵育20分钟以重悬纤维素。然后将旋转柱在14,000×g下离心60秒,收集流过液以用于核酸沉淀。当进行多个纤维素纯化循环时,将流过液直接转移到新制备的纤维素旋转柱中,并重复该过程。最后,通过添加300至500μl的1×STE缓冲液,在剧烈振荡下将纤维素结合的核酸孵育20分钟,并在14,000×g下将旋转柱离心60秒。
使用在15ml含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液中的1.5g纤维素和5mg的IVT RNA在50ml管中进行纯化工艺的扩展。将RNA添加至干燥的纤维素并在磁力搅拌下孵育30分钟。使用一次性真空驱动的过滤装置(Steriflip-HV,0.45μm孔径,PVDF,Merck ChemicalsGmbH/Millipore,目录号SE1M003M00)通过过滤回收未结合的核酸。在指明的情况下,通过添加1.5g新的纤维素并重复该过程将滤液用于第二次纯化循环。最后,通过添加等体积的异丙醇使滤液中的核酸沉淀。
“阳性”纯化方法
“阳性”纯化方法的原理是首先通过在含有40%EtOH的1×STE缓冲液中将IVT RNA与纤维素一起孵育将所有RNA与纤维素结合。在第二步中,通过在含有16%EtOH的1×STE缓冲液中孵育来选择性释放ssRNA,而在这些条件下,dsRNA保持与纤维素纤维结合。
使用前,将纤维素以0.2g纤维素/ml的浓度混悬于含有40%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液中,并在剧烈摇动下孵育10分钟。在4,000×g离心5分钟后,将纤维素以0.2g纤维素/ml(经洗涤的纤维素)的浓度重悬于含有40%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液中。
对于使用微型离心机旋转柱(NucleoSpin Filters,Macherey-Nagel,目录号740606)的纤维素纯化,将600μl经洗涤的纤维素浆料(0.12g纤维素)转移至旋转柱并在14,000×g下离心60秒。弃去流过液并将500μl的含有40%(v/v)EtOH的1 ×STE缓冲液添加至旋转柱中并在剧烈摇动下孵育5分钟以重悬纤维素。在14,000×g下离心60秒后,弃去流过液并将含有40%(v/v)EtOH的300至500μl的1×STE缓冲液中的IVT RNA(50至500μg)添加至旋转柱中并在剧烈摇动下孵育20分钟以重悬纤维素。然后将旋转柱在14,000×g下离心60秒,收集流过液以用于核酸沉淀。通过添加300至500μl含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液,在剧烈振荡下孵育20分钟并在14,000×g下将旋转柱离心60秒从纤维素中释放ssRNA。当进行多个循环的纤维素纯化时,将流过液直接转移到新制备的纤维素旋转柱中并重复该过程。最后,通过添加300至500μl的1 ×STE缓冲液,在剧烈振荡下将纤维素结合的核酸孵育20分钟,并在14,000×g下将旋转柱离心60秒。
对于使用纤维素作为固定相的FPLC,首先制备在含有40%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液中的纤维素浆料(0.2g/ml)并搅拌30分钟。使用20ml的该浆液(4g纤维素)来填充XK16/20柱(GE Healthcare Life Sciences,目录号28-9889-37)。柱床的最终高度约为5cm。使用Avant 25***(GE Healthcare Life Sciences)进行色谱分析并监测UV(260nm)吸光度。使用含有40%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液作为结合缓冲液(缓冲液B)和1×STE缓冲液作为洗脱缓冲液(缓冲液A)。用100%缓冲液B以2ml/分钟的流速平衡柱子15分钟。在注射500μg的RNA(样品体积:500μl)后,将流速降至1ml/分钟,持续40分钟。使用40%缓冲液B(16%(v/v)EtOH)以2ml/分钟的流速洗脱ssRNA 40分钟。最后,通过将缓冲液组成改变为0%缓冲液B(0%EtOH),从柱上洗脱dsRNA。收集色谱峰并沉淀核酸用于进一步分析。
核酸的异丙醇沉淀
通过添加0.1体积的3M乙酸钠(pH 4.0)和1体积的异丙醇来沉淀从纤维素纯化获得的RNA。涡旋后,将样品在-20℃下孵育1小时,然后在14,000×g下离心10分钟。RNA沉淀用200μl冰冷的70%(v/v)EtOH洗涤、空气干燥并溶于合适体积的无核酸酶的H2O中。使用Nanodrop***(Eppendorf)通过分光光度法测量RNA浓度。
斑点印迹分析
为了确定dsRNA和RNA-DNA杂交污染物的量,制备了不同浓度RNA样品的连续稀释液,并将提高量的RNA(通常为40ng、200ng和1,000ng)点样(0.5μl)到尼龙印迹膜上(NytranSuPerCharge(SPC)尼龙印迹膜(GE Healthcare Life Sciences,目录号10416216))。然后将膜在含有5%(w/v)脱脂奶粉的TBS-T缓冲液(20mM TRIS pH 7.4,137mM NaCl,0.1%(v/v)TWEEN-20)中封闭1小时。为了检测dsRNA,将膜与在含有1%(w/v)脱脂奶粉的TBS-T缓冲液中以1∶10,000稀释的J2 dsRNA特异性小鼠mAb(English&Scientific Consulting,Szirák,Hungary)孵育1小时。在表明的情况下,使用以1∶10,000的比例稀释的S 9.6RNA-DNA-杂交特异性小鼠mAb IgG2a(KeraFAST,目录号ENH001)来检测RNA-DNA杂交污染物。用TBS-T洗涤后,将膜与在含有1%(w/v)脱脂奶粉的TBS-T缓冲液中以1∶10,000的比例稀释的HRP缀合的驴抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch,目录号715-035-150)一起孵育1小时,用TBS-T洗涤并使用Amersham ECL Prime Western印迹检测试剂(Fisher Scientific,目录号RPN2232)和ChemiDoc MP成像***(BIO-RAD)显色。在表明的情况下,使用Image Lab 5.1软件(BIO-RAD)通过光密度测定法定量杂交信号强度。
琼脂糖凝胶电泳
为了监测纯化的RNA的完整性并验证加载至斑点印迹上的量,使用琼脂糖凝胶电泳。分析了对于斑点印迹制备的40ng/μl系列RNA稀释液的等量的RNA(例如,2μl)。根据Masek等(Anal.Biochem.336(2005),46-50)的方法使RNA样品变性。通过将2μl的RNA(80ng)与6μl的甲酰胺混合并在65℃下孵育5分钟,然后加载至含有0.005%(v/v)GelRedTM核酸凝胶染色剂(Biotium Inc.,目录号41003)的1.4%(w/v)琼脂糖凝胶上。使用TAE(40mM TRIS乙酸盐,1mM EDTA)作为运行缓冲液在100V下进行电泳20分钟,然后使用Gel DocTM EZ成像***(BIO-RAD)对凝胶成像。
实施例1-使用纤维素从IVT RNA拉下dsRNA
为了测试应用纤维素以从IVT RNA去除dsRNA污染物的可行性,首先进行简单的拉下实验。通过将来自IVT反应的氯化锂(LiCl)沉淀预纯化的50μg 2,500nt长的N1-甲基-假尿苷(m1Ψ)修饰的IVT RNA在存在含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液的情况下与0.1g纤维素一起孵育。离心后,沉淀上清液中未结合的RNA。通过将纤维素重悬于不含EtOH的1×STE中,离心并沉淀上清液来回收纤维素结合的RNA。使用dsRNA特异性J2抗体通过斑点印迹分析来自两个级分以及起始RNA材料的RNA的dsRNA含量。通过琼脂糖凝胶电泳监测RNA的完整性。
斑点印迹分析显示,与未处理的输入IVT RNA相比,与纤维素孵育后未结合的RNA级分中的dsRNA含量大大降低(图1)。这是由于在存在16%(v/v)EtOH的情况下,污染性dsRNA与纤维素材料的选择性结合,其允许通过纤维素的沉降从ssRNA中分离dsRNA。在分离后,可使用不含EtOH的缓冲液从纤维素中释放dsRNA污染物。这通过在结合的RNA级分中显示显著量的J2反应性RNA来证实(图1)。此外,RNA的电泳证明在该纤维素纯化过程中RNA完整性得以保留。该实施例证明了成功使用纤维素从IVT RNA中去除dsRNA污染物。
实施例2-不同浓度的EtOH对通过纤维素从IVT RNA去除dsRNA的效率的影响
在下一步骤中,上述纯化方法(参见实施例1)适用于使用微型离心机旋转柱从纤维素中分离未结合的RNA。该技术的优点是通过离心从纤维素中完全除去液体并因此除去未结合的RNA。此外,测试了在IVT RNA与纤维素孵育期间提高EtOH浓度高至18%(v/v)或20%(v/v)是否会提高dsRNA去除的效率。首先,在存在含有16%(v/v)、18%(v/v)或20%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液的情况下,将50μg 1,500nt长假尿苷(Ψ)修饰的和D2-加帽的IVT RNA(通过磁珠从IVT反应中预纯化)与0.1g纤维素在微型离心机旋转柱中孵育。离心后,通过离心所述柱收集未结合的RNA并沉淀。通过将不含EtOH的1×STE添加至柱中,通过剧烈摇动重悬纤维素,最后离心和沉淀来回收纤维素结合的RNA。使用dsRNA特异性J2抗体通过斑点印迹分析来自两个级分以及起始RNA材料的RNA的dsRNA含量。向第二个膜加载相同量的不同RNA级分,并与RNA/DNA杂交特异性S 9.6抗体杂交,以测试这些IVT RNA污染物是否也可以通过纤维素纯化除去。
与未纯化的IVT RNA相比,与纤维素孵育后,所有未结合的RNA级分(流过液)中的dsRNA含量大大降低(图2)。然而,这些级分中RNA/DNA杂交的量仅略微降低,表明在测试条件下RNA/DNA杂交不能有效结合纤维素,因此不能通过使用纤维素从IVT RNA中除去。将EtOH浓度从16%(v/v)提高至18%(v/v)或20%(v/v)不会显著提高dsRNA去除的效率。在结合的RNA级分中的大量J2反应性RNA表明dsRNA的富集(图2),这证实了通过该方法分离dsRNA污染物和ssRNA。该结果进一步示出了“阴性”纤维素纯化方法成功适应微型离心机旋转柱形式。
实施例3-纤维素纯化与RNaseIII处理和HPLC纯化的比较
为了测试使用微型离心机旋转柱的根据上文所述方法(参见实施例2)的多个纤维素纯化循环是否提高了dsRNA去除的效率,使用含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液,将通过来自IVT反应的氯化锂(LiCl)沉淀预纯化的100μg的2,500nt长mlΨ-修饰的IVT RNA如上文所述纯化1x、2x或3x。此外,将通过纤维素纯化的RNA与用大肠杆菌RNaseIII(0.2U/100μgRNA)在37℃下处理30分钟或者根据Weissman等(同上)描述的方案通过HPLC纯化的IVT RNA进行比较。使用dsRNA特异性J2抗体通过斑点印迹分析所有RNA的dsRNA含量,并通过杂交信号的光密度分析进行定量。通过琼脂糖凝胶电泳监测RNA完整性。
提高纤维素纯化循环的数目提高了从IVT RNA中去除的dsRNA的量(图3)。虽然一个纯化循环去除了约90%的dsRNA污染物,但当分别进行2和3次纯化循环时,该量提高至95%和97%。有趣的是,一个纤维素纯化循环消除了与用RNaseIII处理IVT RNA几乎相同量的dsRNA。此外,进行3个纤维素纯化循环非常接近HPLC纯化的效率。因此,纤维素纯化的效率在RNaseIII处理和HPLC纯化之间。
实施例4-比较不同品牌的纤维素从IVT RNA中去除dsRNA的性能
为了测试dsRNA污染物的去除是否仅限于上述实验中使用的特定纤维素品牌(Sigma-Aldrich,目录号C6288)或是否也可使用来自其他供应商的纤维素,我们测试了来自Macherey-Nagel其他两种纤维素类型(MN 100,MN 2100)的性能。首先,在存在含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液的情况下,将通过IVT反应中的氯化锂(LiCl)沉淀预纯化的100μg的1,500nt长的m1Ψ修饰的IVT RNA在微型离心机旋转柱中与0.15g不同类型的纤维素一起孵育。离心后,通过将所述柱离心并沉淀流过液中的RNA来收集未结合的RNA。通过将1×STE添加至柱中来回收纤维素结合的RNA,然后通过剧烈摇动重悬纤维素,最后离心和沉淀。使用dsRNA特异性J2抗体通过斑点印迹分析所有RNA样品的dsRNA含量并通过杂交信号的光密度分析进行定量。通过琼脂糖凝胶电泳监测RNA完整性。
与用于纯化的纤维素无关,与未纯化的输入RNA相比,所有未结合的RNA级分中的dsRNA含量大大降低(图4)。结合的RNA级分中的大量J2-反应性RNA表明dsRNA的富集证实了通过所有所测试的纤维素类型dsRNA污染物和ssRNA的分离。
实施例5-纤维素纯化方法的可扩展性
重要的是测试纤维素纯化方法是否可扩展。因此,进行实验以从通过磁珠从IVT反应预纯化的5mg 1,900nt长D1-加帽的IVT RNA中去除dsRNA污染物。将RNA与1.5g纤维素(Sigma,目录号C6288)在15ml含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液中一起孵育。通过真空驱动的过滤装置(0.45μM孔径)将未结合的RNA与纤维素分离并沉淀。用另外5mg相同的RNA进行2次纯化循环。使用dsRNA特异性J2抗体通过斑点印迹分析两种纯化的RNA的dsRNA含量,并通过光密度分析杂交信号的强度进行定量。通过琼脂糖凝胶电泳监测RNA完整性。
斑点印迹分析的结果显示,在用1.5g纤维素纯化1个循环后,从5mgIVT RNA中除去72%的dsRNA污染物。通过使用1.5g新纤维素的第二个纯化循环,纯化效率可以进一步提高至83%。正如预期的那样,RNA回收率从纯化1个循环后的67%降至第二个循环后的53%,这仍然是可接受的,并且与Weismann等(同上)描述的HPLC纯化方案实现的约50%的回收率相当。该结果清楚地表明,可以扩大本发明的纤维素纯化方法的规模以在单批次纯化中从数mg的IVT RNA中除去dsRNA污染物。
实施例6-使用“阳性”纯化方法纯化具有不同长度的IVT RNA
在下一步中,测试在存在高EtOH浓度的情况下首先将IVT RNA制备物的所有RNA组分与纤维素结合,然后通过将EtOH浓度降低至16%(v/v)来选择性释放ssRNA级分是否可行。在这种条件下,dsRNA污染物应保持与纤维素材料结合,从而与ssRNA分离(“阳性”纯化)。该方法优于“阴性”纯化,因为它还可以允许在存在EtOH的情况下,除去不与纤维素结合的非核酸污染物(例如蛋白质、游离核苷酸)。因此,进行了实验,其中使用含有40%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液在微型离心机旋转柱中将400μg具有不同长度(1,300nt、2,500nt和>10,000nt)和帽结构(D1、D2、无帽)的三种IVT RNA与0.12g纤维素完全结合。用含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液洗脱ssRNA,并转移到含有1.2mg新纤维素的第二个旋转柱中。在剧烈摇动和离心后孵育后,沉淀流过液中的RNA并使用dsRNA特异性J2抗体通过斑点印迹分析dsRNA污染物。通过琼脂糖凝胶电泳监测RNA整合性。
与RNA长度无关,在纤维素纯化后,所有IVT RNA的dsRNA含量显著降低至几乎不可检测的水平(图6),证明了上述“阳性”纯化方法的可行性。出乎意料的是,还可以从dsRNA污染物成功纯化>10,000nt长的IVT RNA(图6A)。这表明纯化不限于较短的RNA(例如1,300至2,500nt),并且表明RNA长度不是成功纯化的限制因素。然而,与1,300nt和2,500nt长的RNA二者的回收率(45至55%回收率)相比,长IVT RNA的回收率较低(35%回收率)。尽管>10,000nt长的IVT RNA的完整性低于两种较短的IVT RNA的完整性,但它不受根据本发明的纤维素纯化方法的负面影响。由于用于这些实验的RNA具有不同的5′帽结构(10,000nt:D1帽,1,300nt:D2帽,2,500nt:无帽),所述实施例证明该结构特征不是通过纤维素成功纯化IVTRNA的关键因素。
实施例7-使用具有不同离子强度的缓冲液纯化IVT RNA
双链核酸的稳定性受环境的离子强度的影响。虽然高盐浓度促进双链结构的形成,但是在低盐浓度下它们与单链核酸的解离增强。为了分析缓冲液离子强度对通过纤维素去除dsRNA效率的影响,在1.5ml管中将通过来自IVT反应的氯化锂(LiCl)沉淀预纯化的1,300nt长m1Ψ-修饰的IVT RNA在500μl含有40%(v/v)EtOH和不同浓度的NaCl(0至150mM)的1×STE缓冲液中与0.1g纤维素孵育。离心后,除去上清液,将纤维素重悬于500μl含有16%(v/v)EtOH的相应1×STE缓冲液中以释放ssRNA。离心后,收集上清液,通过沉淀回收RNA。在最后的步骤中,将纤维素重悬于500μl相应的不含EtOH的1×STE缓冲液中,离心并通过沉淀上清液回收RNA。使用dsRNA特异性J2抗体通过斑点印迹分析来自两个级分(16%EtOH洗出液,0%EtOH洗出液)以及起始RNA材料(IVT RNA)的RNA的dsRNA含量,并通过杂交信号的光密度分析对其进行定量。通过琼脂糖凝胶电泳监测RNA的完整性。
纤维素去除dsRNA的效率受STE缓冲液中NaCl浓度的影响。在存在25mM或50mMNaCl的情况下,从16%EtOH洗出液中消除94%至98%的dsRNA污染物(图7A,B)。将NaCl浓度提高至75mM(图7A)或将其降至10mM(图7B)降低了纯化效率。NaCl浓度高于125mM导致纯化效率显著降低(图7A)。该结果表明所用STE缓冲液的NaCl浓度可影响纯化效率,纯化效率在25至50mM NaCl范围内最高。除了150mM NaCl样品(图7A)之外,所有0%EtOH洗出液与J2抗体的强反应性反映了这些样品中dsRNA污染物的富集。
实施例8-通过FPLC进行IVT RNA的纤维素纯化
因为使用“阳性”纯化方法通过纤维素从dsRNA污染物分离ssRNA是可行的(参见实施例6和7),所以尝试针对FPLC调整纯化方案。将4g纤维素用作固定相以填充XK 16/20柱。在用含有40%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液平衡后,将通过IVT反应中的氯化锂(LiCl)沉淀预纯化的500μl 1,300nt长m1Ψ-修饰的IVT RNA加载至柱上。通过将缓冲液的EtOH浓度分别降低至16%(v/v)和0%(v/v)来洗脱结合的ssRNA和dsRNA,并收集级分。通过沉淀回收RNA,并使用dsRNA-特异性J2抗体通过斑点印迹分析来自两个级分(F1:16%EtOH洗出液,F2:0%EtOH洗出液)以及起始RNA材料(输入RNA)的RNA的dsRNA含量。通过琼脂糖凝胶电泳监测RNA的完整性。
色谱图的洗脱曲线(260nm处的吸光度)显示,在存在40%(v/v)EtOH的情况下,高百分比的负载IVT RNA与纤维素材料结合。在这些条件下,只有少量RNA保持未结合并从柱中洗脱(图8A)。在将EtOH浓度降低至16%(v/v)时,大部分RNA洗脱由UV吸光度中的尖单峰表示。该峰被收集(级分F1)并含有纯化的ssRNA。与未纯化的输入RNA相比,从该级分中除去了约88%的dsRNA含量(图8B)。在将缓冲液的EtOH浓度进一步降低至0%(v/v)后,仅有少量RNA从柱中洗脱(级分F2)。斑点印迹分析显示该RNA部分富含dsRNA(图8B)。这证实了ssRNA与dsRNA的分离,并证明了纤维素作为固定相成功用于IVT RNA的FPLC纯化以去除dsRNA污染物。
实施例9-使用不同EtOH浓度纯化IVT RNA用于ssRNA洗脱
为了优化“阳性”纤维素纯化方法的方案,测试了不同EtOH浓度对dsRNA去除和RNA回收效率的影响。通过磁珠从IVT反应中预纯化的200μg 1,500nt长的D1-加帽的IVT RNA在含有40%(v/v)EtOH的500μl 1×STE缓冲液中与0.1g经洗涤的纤维素在微型离心机旋转柱中一起孵育。用含有6、10、12、14、16、18、20或24%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液洗脱纤维素结合的ssRNA,并通过沉淀从洗出液中回收。使用dsRNA特异性J2抗体通过斑点印迹分析从不同洗出液以及起始RNA材料(输入RNA)获得的RNA的dsRNA含量,并通过杂交信号的光密度分析进行定量。通过琼脂糖凝胶电泳确认RNA的完整性。
在“阳性”纯化方法期间用于洗脱ssRNA的EtOH浓度的最佳范围为14%(v/v)至16%(v/v)(图9A,B)。在这些EtOH浓度下,83%至84%的dsRNA保持与纤维素结合,并且从相应的洗出液中回收58%至64%的ssRNA。将EtOH调高至18%(v/v)或20%(v/v)可进一步改善dsRNA去除的效率(分别为85%或90%),但显著降低RNA回收率(分别为47%或36%)。相反,将EtOH浓度降低至12%(v/v)会降低纯化效率(去除63%的dsRNA)而不显著改善RNA回收。该结果表明,dsRNA去除的效率和来自洗出液的RNA负相关。此外,相对于dsRNA污染物,ssRNA的相对纯度可以通过用于洗脱的EtOH浓度来控制。然而,较高的EtOH浓度导致更有效的dsRNA去除,但代价是ssRNA回收率降低。因此,通过调节用于洗脱ssRNA的EtOH浓度,可以调节dsRNA污染物/RNA回收率以满足IVT RNA对于不同应用的纯度/成本要求。
实施例10-测定纤维素的RNA结合能力
为了扩大“阳性”纤维素纯化方法的规模,重要的是要知道纤维素的RNA结合能力使得由过载引起的RNA损失最小化。为了确定RNA结合能力,我们将固定量的经洗涤的纤维素(100mg,Sigma,C6288)与25μg、50μg、100μg、250μg、500μg、750μg、1,000μg或1,500μg的通过磁珠从IVT反应中预纯化的1,500nt长D1-加帽的IVT RNA在微型离心机旋转柱中在500μl含有40%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液中一起孵育。离心后,用500μl含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液洗脱ssRNA。最后,通过与H2O(0%(v/v)EtOH)一起孵育,释放仍与纤维素结合的RNA。通过沉淀回收流过液(40%(v/v)EtOH)中的RNA和16%(v/v)和0%(v/v)二种洗出液,并通过分光光度法测定回收的RNA的量。此外,使用dsRNA特异性J2抗体通过斑点印迹分析从16%(v/v)EtOH洗出液以及起始RNA材料(输入RNA)获得的RNA的dsRNA含量以监测在个体样本中dsRNA去除的效率。通过琼脂糖凝胶电泳监测这些RNA的完整性。
测试的纤维素(Sigma,C6288)的最大RNA结合能力范围在100μg至250μg RNA每100mg纤维素之间,其对应于每1g纤维素1至2.5mg RNA。这由以下事实反映,即从40%(v/v)EtOH流过液的RNA回收率(图10A)和RNA的产量(图10B),这代表当250μg或更多的RNA用于纯化100mg纤维素时未结合的RNA级分稳定地增加。然而,当使用250μg或更多RNA进行纯化时,16%(v/v)EtOH和0%(v/v)EtOH洗出液中结合的RNA的量不会相应提高,这因此导致从两种级分中降低的RNA回收率(图10A,B)。当使用100μgRNA用于纯化100mg纤维素时(68%RNA回收),实现16%(v/v)EtOH洗出液的最大RNA回收率。此外,在RNA:纤维素的该比例下,实现了88%dsRNA去除的最高纯化效率(图10C,D)。有趣的是,当超过纤维素的结合RNA能力时,从IVT RNA去除的dsRNA的相对量不会显著降低。
实施例11-IVT RNA的纤维素纯化对其可翻译性和免疫原性的影响
如上所述,由于T7RNA聚合酶的异常活性,IVT RNA含有dsRNA污染物。然而,dsRNA通过活化不同的细胞传感器(包括RIG-I、MDA5和TLR3)诱导炎性细胞因子(例如干扰素),并且还通过活化蛋白激酶R(PKR)和寡腺苷酸合成酶(OAS)直接抑制翻译。为了测试经过本发明方法的IVT RNA与未经过本发明方法的IVT RNA相比是否诱导较少的炎性细胞因子和/或可以更有效地翻译,使编码鼠***(EPO)的IVT RNA未纯化或通过使用2个旋转柱,每个填充有纤维素材料(0.12g纤维素(Sigma,C6288))的2步法纯化。首先,使用第一旋转柱使IVT RNA经过如上所述的阳性纯化方法(即,在第一旋转柱中和在存在含有40%EtOH(v/v)的1×STE缓冲液的情况下将IVT RNA与纤维素材料一起孵育以用于将dsRNA和ssRNA与纤维素材料结合;向第一旋转柱施加离心力;丢弃流过液;通过添加含有16%(v/v)EtOH的1×STE缓冲液并将向第一旋转柱施加离心力从第一旋转柱洗脱ssRNA)。然后,使用第二旋转柱使如此获得的含有ssRNA的洗出液经过如上所述的负纯化方法(即,在第二旋转柱中将含有ssRNA的洗出液与纤维素材料一起孵育;向第二旋转柱施加离心力;以及收集流过液)。然后用异丙醇/乙酸钠沉淀从第二旋转柱获得的流过液,并再溶解于H2O中。在用TransIT(Mirus Bio)配制后,将IVT RNA以3μg RNA/动物的剂量经腹膜内注射到小鼠(n=4)中。在注射后2、6和24小时抽血,收集血浆样品。对照小鼠仅注射TransIT。使用特异性ELISA测定法(鼠干扰素α特异性ELISA(eBioscience);鼠EPO特异性DuoSet ELISA显色试剂盒(R&D))测量鼠干扰素α(IFN-α)和鼠EPO的水平。
如图11A所示,与未纯化的IVT RNA相比,经过本发明方法的IVT RNA诱导显著更少的IFN-α。因此,该实施例证明本发明的方法有效地从IVT RNA中除去污染的双链分子。最可能由纤维素纯化的IVT RNA诱导的残留IFN-α是由于含有尿嘧啶的ssRNA活化TLR7。
此外,图11B示出了经过本发明方法的EPO编码IVT RNA制备物,因此缺乏蛋白质合成抑制性dsRNA,非常有效地翻译,甚至在施用根据本发明纯化的IVT RNA后24小时导致血浆中的高EPO水平。相反,由于通过dsRNA的直接作用和IFN-α介导的作用之蛋白质合成抑制,未经过本发明方法但未被纯化的EPO编码IVT RNA制备物的翻译效率较低。
Claims (80)
1.用于提供单链RNA(ssRNA)的方法,其包括:
(i)提供包含通过体外转录产生的ssRNA的RNA制备物;
(ii)在允许双链RNA(dsRNA)与纤维素材料结合并且不允许ssRNA与所述纤维素材料结合的条件下使所述RNA制备物与所述纤维素材料接触;以及
(iii)在允许dsRNA与所述纤维素材料结合并且不允许ssRNA与所述纤维素材料结合的条件下将所述ssRNA与所述纤维素材料分离;
其中在步骤(ii)中,所述RNA制备物作为包含ssRNA和第一缓冲液的液体提供和/或所述纤维素材料作为第一缓冲液中的混悬液提供,其中所述第一缓冲液包含水、乙醇和盐,其浓度允许dsRNA与所述纤维素材料结合但不允许ssRNA与所述纤维素材料结合;
以及
所述第一缓冲液中乙醇的浓度为14至20%(v/v)并且所述第一缓冲液中盐的浓度为15至70 mM。
2.权利要求1所述的方法,其还包括通过体外转录产生包含ssRNA的所述RNA制备物的步骤。
3.权利要求1所述的方法,其中步骤(ii)包括在摇动和/或搅拌下将包含ssRNA的所述RNA制备物与所述纤维素材料混合。
4.权利要求3所述的方法,其中所述混合持续至少5分钟。
5.权利要求3所述的方法,其中所述混合持续至少10分钟。
6.权利要求1所述的方法,其中所述第一缓冲液中的盐是氯化钠。
7.权利要求1所述的方法,其中所述第一缓冲液中乙醇的浓度为14至16%(v/v)。
8.权利要求1所述的方法,其中所述第一缓冲液中盐的浓度为20至60 mM。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述第一缓冲液还包含缓冲物质,和/或螯合剂。
10.权利要求9所述的方法,其中所述缓冲物质是三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。
11.权利要求9所述的方法,其中所述螯合剂是EDTA。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法,其中在步骤(iii)中,在管中提供所述RNA制备物、所述纤维素材料和所述第一缓冲液的混合物,并且步骤(iii)包括(1)向所述管施加重力或离心力以使得液相与固相分离;以及(2)收集包含ssRNA的上清液或除去所述纤维素材料。
13.权利要求1至11中任一项所述的方法,其中在步骤(iii)中,在旋转柱或过滤装置中提供所述RNA制备物、所述纤维素材料和所述第一缓冲液的混合物,并且步骤(iii)包括(1')向所述旋转柱或过滤装置施加重力、离心力、压力或真空以使得液相与固相分离;以及(2')收集包含ssRNA的流过液。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法,其中步骤(ii)和(iii)重复一次或两次或更多次,其中在步骤(ii)和(iii)的一个循环中的步骤(iii)之后获得的ssRNA制备物用作下一个循环中的步骤(ii)的RNA制备物,并且在步骤(ii)和(iii)的每个循环中的步骤(ii)中,使用新的纤维素材料。
15.用于提供单链RNA(ssRNA)的方法,其包括:
(i)提供包含通过体外转录产生的ssRNA的RNA制备物;
(ii)在允许双链RNA(dsRNA)和ssRNA与纤维素材料结合的条件下使所述RNA制备物与所述纤维素材料接触;以及
(iii)在允许dsRNA与所述纤维素材料结合并且不允许ssRNA与所述纤维素材料结合的条件下将所述ssRNA与所述纤维素材料分离;
其中步骤(iii)包括:
(1)将结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料与第一缓冲液混合,其中所述第一缓冲液包含水、乙醇和盐,其浓度允许dsRNA与所述纤维素材料结合但不允许ssRNA与所述纤维素材料结合;以及
(2)将包含ssRNA的液相与所述纤维素材料分离;
以及
所述第一缓冲液中乙醇的浓度为14至20%(v/v)并且所述第一缓冲液中盐的浓度为15至70 mM。
16.权利要求15所述的方法,其还包括以下步骤:产生包含通过体外转录之ssRNA的RNA制备物。
17.权利要求15所述的方法,其中步骤(ii)包括(1)在摇动和/或搅拌下将包含ssRNA的所述RNA制备物与所述纤维素材料混合;以及(2)使结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料与其余部分分离。
18.权利要求17所述的方法,其中所述混合持续至少5分钟。
19.权利要求17所述的方法,其中所述混合持续至少10分钟。
20.权利要求17至19中任一项所述的方法,其中在步骤(ii)中,所述RNA制备物作为包含ssRNA和第二缓冲液的液体提供和/或所述纤维素材料作为第二缓冲液中的混悬液提供,其中所述第二缓冲液包含水、乙醇和盐,其浓度允许dsRNA和ssRNA与所述纤维素材料结合。
21.权利要求20所述的方法,其中所述盐是氯化钠。
22.权利要求20或21所述的方法,其中所述第二缓冲液中乙醇的浓度为至少35%(v/v)。
23.权利要求22所述的方法,其中所述第二缓冲液中乙醇的浓度为38至42%(v/v)。
24.权利要求20至23中任一项所述的方法,其中所述第二缓冲液中盐的浓度为15至70mM。
25.权利要求24所述的方法,其中所述第二缓冲液中盐的浓度为20至60 mM。
26.权利要求20至25中任一项所述的方法,其中所述第二缓冲液还包含缓冲物质,和/或螯合剂。
27.权利要求26所述的方法,其中所述缓冲物质是三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。
28.权利要求26所述的方法,其中所述螯合剂是EDTA。
29.权利要求20至28中任一项所述的方法,其中在步骤(ii)(2)中,在管中提供在步骤(ii)(1)中获得的所述RNA制备物和所述纤维素材料的混合物,并且步骤(ii)(2)包括(2a)向所述管施加重力或离心力以使得液相与固相分离;以及(2b)除去上清液或收集结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料。
30.权利要求20至28中任一项所述的方法,其中在步骤(ii)(2)中,在旋转柱或过滤装置中提供在步骤(ii)(1)中获得的所述RNA制备物和所述纤维素材料的混合物并且步骤(ii)(2)包括(2a')向所述旋转柱或过滤装置施加重力、离心力、压力或真空使得液相与固相分离;以及(2b')丢弃流过液。
31.权利要求20至30中任一项所述的方法,其中步骤(ii)还包括(3)将所述第二缓冲液的等分试样添加至结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料;(4)在摇动和/或搅拌下孵育所得混合物;以及(5)将结合dsRNA和ssRNA的纤维素材料与所述液相分离;以及任选地(6)重复步骤(3)至(5)一次或两次或更多次。
32.权利要求31所述的方法,其中所述孵育持续至少5分钟。
33.权利要求31所述的方法,其中所述孵育持续至少10分钟。
34.权利要求15至33中任一项所述的方法,其中步骤(iii)(1)中将结合dsRNA和ssRNA的所述纤维素材料与所述第一缓冲液的混合包括摇动和/或搅拌。
35.权利要求34所述的方法,其中所述混合持续至少5分钟。
36.权利要求34所述的方法,其中所述混合持续至少10分钟。
37.权利要求15或34所述的方法,其中所述第一缓冲液中的盐是氯化钠。
38.权利要求15或34所述的方法,其中所述第一缓冲液中乙醇的浓度为14至16%(v/v)。
39.权利要求15或34所述的方法,其中所述第一缓冲液中盐的浓度为20至60 mM。
40.权利要求15或34所述的方法,其中所述第一缓冲液还包含缓冲物质,和/或螯合剂。
41.权利要求40所述的方法,其中所述缓冲物质是三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。
42.权利要求40所述的方法,其中所述螯合剂是EDTA。
43.权利要求34至42中任一项所述的方法,其中在步骤(iii)中,在管中提供所述纤维素材料和第一缓冲液的混合物,并且步骤(iii)(2)包括(2a)向所述管施加重力或离心力以使得液相与固相分离;以及(2b)收集包含ssRNA的上清液或除去所述纤维素材料。
44.权利要求34至42中任一项所述的方法,其中在步骤(iii)中,在旋转柱或过滤装置中提供所述纤维素材料和所述第一缓冲液的混合物,并且步骤(iii)(2)包括(2a')向所述旋转柱或过滤装置施加重力、离心力、压力或真空;以及(2b')收集包含ssRNA的流过液。
45.权利要求15至44中任一项所述的方法,其中步骤(ii)和(iii)重复一次或两次或更多次,其中在步骤(ii)和(iii)的一个循环中的步骤(iii)之后获得的ssRNA制备物用作下一个循环中的步骤(ii)的RNA制备物,并且在步骤(ii)和(iii)的每个循环中的步骤(ii)中,使用新的纤维素材料。
46.权利要求15所述的方法,其中在步骤(ii)中,在柱中提供所述纤维素材料,步骤(ii)包括在允许dsRNA和ssRNA与所述纤维素材料结合的条件下将所述RNA制备物加载至所述柱上,并且步骤(iii)包括使用所述第一缓冲液作为洗脱剂从所述纤维素材料中洗脱所述ssRNA。
47.权利要求46所述的方法,其中在步骤(ii)中提供所述RNA制备物并作为包含ssRNA和第二缓冲液的液体加载至柱上,其中所述第二缓冲液包含水、乙醇和盐,其浓度允许dsRNA和ssRNA与所述纤维素材料结合。
48.权利要求47所述的方法,其中所述盐是氯化钠。
49.权利要求47或48所述的方法,其中所述第二缓冲液中乙醇的浓度为至少35%(v/v)。
50.权利要求49所述的方法,其中所述第二缓冲液中乙醇的浓度为38至42%(v/v)。
51.权利要求47至50中任一项所述的方法,其中所述第二缓冲液中盐的浓度为15至70mM。
52.权利要求51所述的方法,其中所述第二缓冲液中盐的浓度为20至60 mM。
53.权利要求47至52中任一项所述的方法,其中所述第二缓冲液还包含缓冲物质,和/或螯合剂。
54.权利要求53所述的方法,其中所述缓冲物质是三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。
55.权利要求53所述的方法,其中所述螯合剂是EDTA。
56.权利要求46所述的方法,其中所述第一缓冲液中的盐是氯化钠。
57.权利要求46或56所述的方法,其中所述第一缓冲液中乙醇的浓度为14至20%(v/v)。
58.权利要求57所述的方法,其中所述第一缓冲液中乙醇的浓度为14至16%(v/v)。
59.权利要求46所述的方法,其中所述第一缓冲液中盐的浓度为20至60 mM。
60.权利要求46至59中任一项所述的方法,其中所述第一缓冲液还包含缓冲物质,和/或螯合剂。
61.权利要求60所述的方法,其中所述缓冲物质是三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。
62.权利要求60所述的方法,其中所述螯合剂是EDTA。
63.权利要求1至62中任一项所述的方法,其中通过使用选自T3、T7和SP6 RNA聚合酶的RNA聚合酶产生所述RNA制备物。
64.权利要求1至63中任一项所述的方法,其中在步骤(ii)之前使所述RNA制备物经过至少一种预纯化处理。
65.权利要求64所述的方法,其中所述至少一种预纯化处理包括以下一种或更多种:核酸的沉淀;核酸与磁珠的结合;超滤;和DNA的降解。
66.权利要求65所述的方法,其中所述核酸的沉淀使用氯化锂来进行。
67.权利要求65所述的方法,其中所述DNA的降解使用双链特异性核酸酶(DSN)来进行。
68.权利要求1至67中任一项所述的方法,其中所述ssRNA是mRNA或抑制性RNA。
69.权利要求68所述的方法,其中所述ssRNA是反义RNA、siRNA或miRNA。
70.权利要求1至69中任一项所述的方法,其中所述ssRNA的长度为至少2700 nt。
71.权利要求70所述的方法,其中所述ssRNA的长度为至少3000 nt。
72.权利要求70所述的方法,其中所述ssRNA的长度为至少3500 nt。
73.权利要求70所述的方法,其中所述ssRNA的长度为至少4500 nt。
74.权利要求1至73中任一项所述的方法,其中所述纤维素材料包含纤维素纤维。
75.权利要求74所述的方法,其中所述纤维素纤维是适合用作分配色谱试剂之等级的纤维素纤维。
76.权利要求1至75中任一项所述的方法,其中在步骤(ii)中与所述RNA制备物接触之前,所述纤维素材料作为经洗涤的纤维素材料提供。
77.权利要求76所述的方法,其中所述纤维素材料的洗涤包括(I)在摇动和/或搅拌下将所述纤维素材料与洗涤溶液混合;以及(II)除去液体或收集所述纤维素材料;以及任选地(III)重复步骤(I)和(II)一次或两次或更多次。
78.权利要求77所述的方法,其中所述混合持续至少5分钟。
79.权利要求77所述的方法,其中所述混合持续至少10分钟。
80.权利要求77至79中任一项所述的方法,其中如果步骤(ii)在允许dsRNA与所述经洗涤的纤维素材料结合但不允许ssRNA与所述经洗涤的纤维素材料结合的条件下进行,则所述洗涤溶液具有组分(A)权利要求6至11中任一项所限定的第一缓冲液,或者如果步骤(ii)在允许dsRNA和ssRNA与所述经洗涤的纤维素材料结合的条件下进行,则所述洗涤溶液具有组分(B)权利要求22至28中任一项所限定的第二缓冲液。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP2016059056 | 2016-04-22 | ||
EPPCT/EP2016/059056 | 2016-04-22 | ||
PCT/EP2017/059293 WO2017182524A1 (en) | 2016-04-22 | 2017-04-19 | Methods for providing single-stranded rna |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109072232A CN109072232A (zh) | 2018-12-21 |
CN109072232B true CN109072232B (zh) | 2022-11-15 |
Family
ID=58699087
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201780024328.9A Active CN109072232B (zh) | 2016-04-22 | 2017-04-19 | 用于提供单链rna的方法 |
Country Status (26)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20190153425A1 (zh) |
EP (2) | EP4008782A1 (zh) |
JP (2) | JP7000343B2 (zh) |
KR (2) | KR102565881B1 (zh) |
CN (1) | CN109072232B (zh) |
AU (1) | AU2017251983B2 (zh) |
BR (1) | BR112018069417A2 (zh) |
CA (1) | CA3020481A1 (zh) |
CY (1) | CY1124845T1 (zh) |
DK (1) | DK3445850T3 (zh) |
ES (1) | ES2900272T3 (zh) |
HR (1) | HRP20211745T1 (zh) |
HU (1) | HUE059314T2 (zh) |
IL (1) | IL262304A (zh) |
LT (1) | LT3445850T (zh) |
MA (1) | MA44732B1 (zh) |
MD (1) | MD3445850T2 (zh) |
MX (1) | MX2018012880A (zh) |
PL (1) | PL3445850T3 (zh) |
PT (1) | PT3445850T (zh) |
RS (1) | RS62612B1 (zh) |
RU (2) | RU2021134269A (zh) |
SG (2) | SG10202010471UA (zh) |
SI (1) | SI3445850T1 (zh) |
WO (1) | WO2017182524A1 (zh) |
ZA (2) | ZA201805949B (zh) |
Families Citing this family (47)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017182524A1 (en) | 2016-04-22 | 2017-10-26 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Methods for providing single-stranded rna |
WO2018188730A1 (en) * | 2017-04-11 | 2018-10-18 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Rna for treatment of autoimmune diseases |
EP3668979A4 (en) | 2017-08-18 | 2021-06-02 | Modernatx, Inc. | METHOD OF HPLC ANALYSIS |
CN214973877U (zh) * | 2019-08-09 | 2021-12-03 | 胡桃钳医疗公司 | 用于形成治疗性多核苷酸的微流体设备及微流体路径装置 |
EP4103228A1 (en) | 2020-02-13 | 2022-12-21 | Institut Pasteur | Nucleic acid vaccine against the sars-cov-2 coronavirus |
BR112022019769A2 (pt) | 2020-03-30 | 2022-12-13 | BioNTech SE | Composições de rna que direcionam claudina-18.2 |
EP3896159A1 (en) * | 2020-04-17 | 2021-10-20 | Bia Separations D.O.O. | A method of single strand rna purification employing an anion exchanger |
EP3896160A1 (en) * | 2020-04-17 | 2021-10-20 | Bia Separations D.O.O. | A method of single-stranded rna purification |
EP3896161A1 (en) * | 2020-04-17 | 2021-10-20 | Bia Separations D.O.O. | A method of single-stranded rna purification |
WO2021255297A1 (en) | 2020-06-19 | 2021-12-23 | Etherna Immunotherapies Nv | Rna purification method |
WO2022218503A1 (en) | 2021-04-12 | 2022-10-20 | BioNTech SE | Lnp compositions comprising rna and methods for preparing, storing and using the same |
JP2023552678A (ja) | 2020-11-16 | 2023-12-19 | ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア | 粒子およびmRNAを含む医薬組成物ならびにそれを調製および貯蔵する方法 |
MX2023005696A (es) | 2020-11-16 | 2023-05-29 | BioNTech SE | Composiciones de lnp que comprenden arn y metodos para preparar, almacenar y usar las mismas. |
WO2022162027A2 (en) | 2021-01-27 | 2022-08-04 | Curevac Ag | Method of reducing the immunostimulatory properties of in vitro transcribed rna |
CN115197935A (zh) * | 2021-04-08 | 2022-10-18 | 上海细胞治疗集团有限公司 | 纤维素色谱纯化rna的方法 |
JP2024514364A (ja) | 2021-04-12 | 2024-04-01 | ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア | 緩衝物質を含むrna組成物ならびにその製造、保存および使用のための方法 |
KR20240006575A (ko) | 2021-04-26 | 2024-01-15 | 앵스띠뛰 파스퇴르 | SARS-CoV-2에 대한 사람 중화 모노클로날 항체 및 이의 용도 |
CN117730149A (zh) * | 2021-06-14 | 2024-03-19 | 2赛文缇生物公司 | 单链rna纯化方法 |
WO2022266389A1 (en) * | 2021-06-17 | 2022-12-22 | Modernatx, Inc. | Alternative rna purification strategies |
CN115505589A (zh) * | 2021-07-27 | 2022-12-23 | 上海兆维科技发展有限公司 | 一种rna的制备方法、合成蛋白质的方法以及转录反应液 |
CA3223943A1 (en) | 2021-07-29 | 2023-02-02 | Ugur Sahin | Compositions and methods for treatment of melanoma |
WO2023030635A1 (en) | 2021-09-02 | 2023-03-09 | BioNTech SE | Potency assay for therapeutic potential of coding nucleic acid |
WO2023036960A1 (en) | 2021-09-10 | 2023-03-16 | BioNTech SE | Lipid-based rna formulations suitable for therapy |
WO2023051926A1 (en) | 2021-09-30 | 2023-04-06 | BioNTech SE | Treatment involving non-immunogenic rna for antigen vaccination and pd-1 axis binding antagonists |
WO2023067193A2 (en) | 2021-10-22 | 2023-04-27 | BioNTech SE | Compositions for administration of different doses of rna |
WO2023073228A1 (en) | 2021-10-29 | 2023-05-04 | CureVac SE | Improved circular rna for expressing therapeutic proteins |
WO2023081935A2 (en) * | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Gritstone Bio, Inc. | Self-amplifying rna compositions and methods of use thereof |
WO2023083434A1 (en) | 2021-11-09 | 2023-05-19 | BioNTech SE | Rna encoding peptidoglycan hydrolase and use thereof for treating bacterial infection |
WO2023126053A1 (en) | 2021-12-28 | 2023-07-06 | BioNTech SE | Lipid-based formulations for administration of rna |
WO2023147090A1 (en) | 2022-01-27 | 2023-08-03 | BioNTech SE | Pharmaceutical compositions for delivery of herpes simplex virus antigens and related methods |
US20230279471A1 (en) * | 2022-02-28 | 2023-09-07 | Perkinelmer Health Sciences, Inc. | Methods for separating and detecting double-stranded and single-stranded ribonucleic acid (rna) |
WO2023165681A1 (en) | 2022-03-01 | 2023-09-07 | BioNTech SE | Rna lipid nanoparticles (lnps) comprising a polyoxazoline and/or polyoxazine polymer |
KR20230142248A (ko) | 2022-04-01 | 2023-10-11 | 주식회사 엘지에너지솔루션 | 연성회로기판을 포함하는 파우치형 전지셀 |
WO2023193892A1 (en) | 2022-04-05 | 2023-10-12 | BioNTech SE | Nucleic acid compositions comprising an inorganic polyphosphate and methods for preparing, storing and using the same |
WO2023218431A1 (en) | 2022-05-13 | 2023-11-16 | BioNTech SE | Rna compositions targeting hiv |
CN114921457B (zh) * | 2022-05-16 | 2023-09-29 | 硅羿科技(上海)有限公司 | 一种提取dsRNA的方法 |
WO2023230295A1 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | BioNTech SE | Rna compositions for delivery of monkeypox antigens and related methods |
WO2024017479A1 (en) | 2022-07-21 | 2024-01-25 | BioNTech SE | Multifunctional cells transiently expressing an immune receptor and one or more cytokines, their use and methods for their production |
WO2024028325A1 (en) | 2022-08-01 | 2024-02-08 | BioNTech SE | Nucleic acid compositions comprising amphiphilic oligo ethylene glycol (oeg)-conjugated compounds and methods of using such compounds and compositions |
WO2024027910A1 (en) | 2022-08-03 | 2024-02-08 | BioNTech SE | Rna for preventing or treating tuberculosis |
WO2024028445A1 (en) | 2022-08-03 | 2024-02-08 | BioNTech SE | Rna for preventing or treating tuberculosis |
WO2024063789A1 (en) | 2022-09-23 | 2024-03-28 | BioNTech SE | Compositions for delivery of malaria antigens and related methods |
WO2024063788A1 (en) | 2022-09-23 | 2024-03-28 | BioNTech SE | Compositions for delivery of malaria antigens and related methods |
WO2024064931A1 (en) | 2022-09-23 | 2024-03-28 | BioNTech SE | Compositions for delivery of liver stage antigens and related methods |
WO2024064934A1 (en) | 2022-09-23 | 2024-03-28 | BioNTech SE | Compositions for delivery of plasmodium csp antigens and related methods |
WO2024074211A1 (en) | 2022-10-06 | 2024-04-11 | BioNTech SE | Rna compositions targeting claudin-18.2 |
WO2024074634A1 (en) | 2022-10-06 | 2024-04-11 | BioNTech SE | Rna compositions targeting claudin-18.2 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0389063A2 (en) * | 1989-03-23 | 1990-09-26 | Akzo Nobel N.V. | Process for isolating nucleic acid |
CN101086011A (zh) * | 2006-06-08 | 2007-12-12 | 河南农业大学 | 食用菌和植物双链rna病毒检测试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2936240A1 (de) * | 1979-09-07 | 1981-03-26 | Bayer Ag, 51373 Leverkusen | Verfahren zur herstellung bekannter und neuer 6-amino-6-desoxy-2,3-0-isopropyliden-(alpha)-l-sorbofuranose-derivate sowie neue zwischenprodukte des verfahrens |
US4475196A (en) | 1981-03-06 | 1984-10-02 | Zor Clair G | Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system |
US4447233A (en) | 1981-04-10 | 1984-05-08 | Parker-Hannifin Corporation | Medication infusion pump |
US4439196A (en) | 1982-03-18 | 1984-03-27 | Merck & Co., Inc. | Osmotic drug delivery system |
US4522811A (en) | 1982-07-08 | 1985-06-11 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides |
US4447224A (en) | 1982-09-20 | 1984-05-08 | Infusaid Corporation | Variable flow implantable infusion apparatus |
US4487603A (en) | 1982-11-26 | 1984-12-11 | Cordis Corporation | Implantable microinfusion pump system |
US4486194A (en) | 1983-06-08 | 1984-12-04 | James Ferrara | Therapeutic device for administering medicaments through the skin |
US4596556A (en) | 1985-03-25 | 1986-06-24 | Bioject, Inc. | Hypodermic injection apparatus |
US5374548A (en) | 1986-05-02 | 1994-12-20 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor |
MX9203291A (es) | 1985-06-26 | 1992-08-01 | Liposome Co Inc | Metodo para acoplamiento de liposomas. |
US4790824A (en) | 1987-06-19 | 1988-12-13 | Bioject, Inc. | Non-invasive hypodermic injection device |
US4941880A (en) | 1987-06-19 | 1990-07-17 | Bioject, Inc. | Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly |
US5108921A (en) | 1989-04-03 | 1992-04-28 | Purdue Research Foundation | Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules |
US5064413A (en) | 1989-11-09 | 1991-11-12 | Bioject, Inc. | Needleless hypodermic injection device |
US5312335A (en) | 1989-11-09 | 1994-05-17 | Bioject Inc. | Needleless hypodermic injection device |
US5383851A (en) | 1992-07-24 | 1995-01-24 | Bioject Inc. | Needleless hypodermic injection device |
JP5500750B2 (ja) | 2000-03-30 | 2014-05-21 | ホワイトヘッド インスチチュート フォアー バイオメディカル リサーチ | Rna干渉のrna配列特異的メディエータ |
JP3692395B2 (ja) | 2000-09-01 | 2005-09-07 | 独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構 | ベクターモノカリオンを用いた紫紋羽病菌に対するゲノムが2本鎖rnaである糸状菌に寄生するウイルスを導入する新規方法 |
EP2216415B2 (en) * | 2003-08-01 | 2017-01-04 | Life Technologies Corporation | Methods for preparing short RNA molecules |
DE102005046490A1 (de) | 2005-09-28 | 2007-03-29 | Johannes-Gutenberg-Universität Mainz | Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen |
DE102006061015A1 (de) | 2006-12-22 | 2008-06-26 | Curevac Gmbh | Verfahren zur Reinigung von RNA im präparativen Maßstab mittels HPLC |
WO2008157688A2 (en) | 2007-06-19 | 2008-12-24 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Synthesis and use of anti-reverse phosphorothioate analogs of the messenger rna cap |
KR102171849B1 (ko) | 2009-12-07 | 2020-10-30 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | 세포 리프로그래밍을 위한 정제된 변형 rna를 포함하는 rna 제제 |
HUE047947T2 (hu) * | 2011-12-30 | 2020-05-28 | Cellscript Llc | In vitro szintetizált ssRNS elõállítása és alkalmazása emlõssejtekbe történõ bevezetésre biológiai vagy biokémiai hatás indukálására |
EP3744843A1 (en) * | 2015-05-29 | 2020-12-02 | CureVac Real Estate GmbH | A method for producing and purifying rna, comprising at least one step of tangential flow filtration |
WO2017182524A1 (en) | 2016-04-22 | 2017-10-26 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Methods for providing single-stranded rna |
-
2017
- 2017-04-19 WO PCT/EP2017/059293 patent/WO2017182524A1/en active Application Filing
- 2017-04-19 KR KR1020227009308A patent/KR102565881B1/ko active IP Right Grant
- 2017-04-19 EP EP21204500.9A patent/EP4008782A1/en active Pending
- 2017-04-19 KR KR1020187030368A patent/KR102378404B1/ko active IP Right Grant
- 2017-04-19 EP EP17722695.8A patent/EP3445850B1/en active Active
- 2017-04-19 SG SG10202010471UA patent/SG10202010471UA/en unknown
- 2017-04-19 SI SI201730980T patent/SI3445850T1/sl unknown
- 2017-04-19 DK DK17722695.8T patent/DK3445850T3/da active
- 2017-04-19 JP JP2018555164A patent/JP7000343B2/ja active Active
- 2017-04-19 MD MDE20190258T patent/MD3445850T2/ro unknown
- 2017-04-19 AU AU2017251983A patent/AU2017251983B2/en active Active
- 2017-04-19 RS RS20211459A patent/RS62612B1/sr unknown
- 2017-04-19 ES ES17722695T patent/ES2900272T3/es active Active
- 2017-04-19 RU RU2021134269A patent/RU2021134269A/ru unknown
- 2017-04-19 US US16/091,389 patent/US20190153425A1/en active Pending
- 2017-04-19 SG SG11201807573VA patent/SG11201807573VA/en unknown
- 2017-04-19 MX MX2018012880A patent/MX2018012880A/es unknown
- 2017-04-19 CA CA3020481A patent/CA3020481A1/en active Pending
- 2017-04-19 HR HRP20211745TT patent/HRP20211745T1/hr unknown
- 2017-04-19 CN CN201780024328.9A patent/CN109072232B/zh active Active
- 2017-04-19 HU HUE17722695A patent/HUE059314T2/hu unknown
- 2017-04-19 RU RU2018136601A patent/RU2760790C2/ru active
- 2017-04-19 LT LTEPPCT/EP2017/059293T patent/LT3445850T/lt unknown
- 2017-04-19 PT PT177226958T patent/PT3445850T/pt unknown
- 2017-04-19 PL PL17722695T patent/PL3445850T3/pl unknown
- 2017-04-19 BR BR112018069417A patent/BR112018069417A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2017-04-19 MA MA44732A patent/MA44732B1/fr unknown
-
2018
- 2018-09-05 ZA ZA2018/05949A patent/ZA201805949B/en unknown
- 2018-10-11 IL IL262304A patent/IL262304A/en unknown
-
2019
- 2019-08-22 ZA ZA2019/05536A patent/ZA201905536B/en unknown
-
2021
- 2021-11-26 CY CY20211101032T patent/CY1124845T1/el unknown
- 2021-12-23 JP JP2021209047A patent/JP7335313B2/ja active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0389063A2 (en) * | 1989-03-23 | 1990-09-26 | Akzo Nobel N.V. | Process for isolating nucleic acid |
CN101086011A (zh) * | 2006-06-08 | 2007-12-12 | 河南农业大学 | 食用菌和植物双链rna病毒检测试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
A New Fractionation and Recovery Method of Viral Genomes Based on Nucleic Acid Composition and Structure Using Tandem Column Chromatography;Syun-ichi Urayama等;《Microbes Environ》;20150523;第30卷(第2期);摘要、第200页图1 * |
Rapid isolation of mycoviral double-stranded RNA from Botrytis cinerea and Saccharomyces cerevisiae;Antonio Castillo等;《Virology Journal》;20110125;第8卷;摘要、图1 * |
Synthesis and purification of single-stranded RNA for use in experiments with PKR and in cell-free translation systems;Tsafrira Pe"ery等;《Mehods》;19970430;第11卷(第4期);摘要、第372页右栏-373页、第376-377页 * |
Tsafrira Pe"ery等.Synthesis and purification of single-stranded RNA for use in experiments with PKR and in cell-free translation systems.《Mehods》.1997,第11卷(第4期), * |
一种简单快速的食用菌病毒dsRNA提取方法;郭灵芳等;《实验技术与管理》;20101220(第12期);全文 * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109072232B (zh) | 用于提供单链rna的方法 | |
Rosa et al. | mRNA vaccines manufacturing: Challenges and bottlenecks | |
JP2023164537A (ja) | Rna癌ワクチン | |
CN114404581A (zh) | 癌症疫苗 | |
EP3297664B1 (en) | Cancer vaccine comprising mrna encoding a m-like-protein | |
US20230133188A1 (en) | Modified mrnas for vaccine development | |
JP2018521115A5 (zh) | ||
WO2019121803A1 (en) | Click-modified mrna | |
AU2022310435A1 (en) | Rna adsorbed onto lipid nano-emulsion particles and its formulations. | |
EP3502258A1 (en) | Click-modified in vitro transcribed mrna for gene expression | |
WO2018204234A1 (en) | Multi-indication mrna cancer immunotherapy | |
Batra et al. | An insight on RNA based therapeutics and vaccines: challenges and opportunities | |
NZ786562A (en) | Methods for providing single-stranded RNA | |
EP3964576A1 (en) | Modified mrnas for vaccine development | |
Bevers | Systemic cancer vaccination: tuning mRNA-LNP towards splenic uptake | |
JP2024505151A (ja) | 脂質ナノ粒子球状核酸 | |
CN117965488A (zh) | 一种癌症mRNA疫苗 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 40000433 Country of ref document: HK |
|
TA01 | Transfer of patent application right | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20220120 Address after: Mainz, Germany Applicant after: DEBIOTECH S.A. Address before: Mainz, Germany Applicant before: BIONTECH RNA PHARMACEUTICALS GmbH |
|
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |