JP2024505151A - 脂質ナノ粒子球状核酸 - Google Patents
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Abstract
疾患を治療するために、DNA及びRNA治療剤を標的組織に送達し、副作用なしに持続的な利益を提供する必要がある。脂質ナノ粒子球状核酸は、ナノ粒子標的化及び組織特異性のためにDNA及びRNA配列を使用することによって、この満たされていない必要性に対処する。この脂質SNA構造は、脂質粒子(核酸を充填した)又は従来のSNA(リポソーム及びゴールドコア)の両方とは著しく異なる生体分布特性を有する。【選択図】図1
Description
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2021年1月12日に出願された米国仮特許出願第63/136,501号の優先権を米国特許法第119条(e)の下で主張する。
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2021年1月12日に出願された米国仮特許出願第63/136,501号の優先権を米国特許法第119条(e)の下で主張する。
政府の利益に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号CA208783、CA221747、及びCA199091の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号CA208783、CA221747、及びCA199091の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本開示の一部である配列表を、明細書と同時にテキストファイルとして提出する。配列表を含むテキストファイルの名称は、「2021-002_Seqlisting.txt」であり、これは、2022年1月10日に作成され、サイズは643バイトである。配列表の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の一部である配列表を、明細書と同時にテキストファイルとして提出する。配列表を含むテキストファイルの名称は、「2021-002_Seqlisting.txt」であり、これは、2022年1月10日に作成され、サイズは643バイトである。配列表の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
核酸(DNA及びRNA)は、治療及び診断の両方において多くの潜在的な用途を有するが、臨床的に関連する用量での効果的な送達は依然として課題である。これらの分子の構造は、それらの送達に制限を作り出す。これらの制限には、ヌクレアーゼによる急速な分解、不十分な生体内分布特性、標的組織内の低蓄積、及び細胞区画内の隔離が挙げられる。これらの問題に対処するために、核酸のための多くの異なるナノ粒子担体構造が探究されてきた。
脂質ナノ粒子は、オリゴヌクレオチドの細胞内送達及び細胞質認識、並びにメッセンジャーRNAの発現を促進するのに有用である。しかしながら、特定の組織を標的とするそれらの能力は、内因性脂質輸送経路に依存すると考えられる(例えば、Akinc et al.,Molecular Therapy(2010)18:1357-1364を参照されたい)。この制限に対処しようとするには、脂質構造又はステロールの広範なスクリーニングがしばしば必要である[例えば、Love et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America(2010)107:1864-1869、及びPatel et al.,Nature Communications(2020)983を参照されたい]。これらの研究は、ナノ粒子構造とそれらの分布特性との間のいくつかの関係を明らかにしたが、予測可能なナノ粒子標的化能力を有するシステムを開発する必要性が残っている。
多くの疾患は、有害な遺伝子をサイレント化し、欠損遺伝子を置き換え、患者のDNA内の変異を編集する核酸(DNA又はRNA)ベースの治療薬によって治療することができる。しかしながら、体内では、活性配列は多くの場合、標的組織及び細胞に到達しない。脂質ナノ粒子(LNP)は、核酸の最も効果的な担体のうちのいくつかである。LNP担体は、到達しやすい標的への送達に有効であるが、多くの場合、血流及び肝臓の外側の細胞集団において顕著な増強を見出すために、数千の異なる担体構造をスクリーニングする必要がある。球状核酸(SNA)構造は、既存のナノ粒子構造の表面上の短いDNA配列を使用してそれらの送達を標的とすることによって、このアプローチを促進する。半径方向に配向した外側の配列は、体内のナノ粒子の行き先及びその活性の両方を変化させる。外側のDNA配列は、遺伝子サイレンシング、遺伝子置換、又は遺伝子編集に使用される核酸を封入した関連するLNPの送達を標的とする。外側のDNA配列は、LNPが送達される「アドレス」を提供する。DNA配列の組み合わせは、多くの異なる構造を形成することができるため、この戦略は、LNP構造に標的化、刺激応答性、及び診断能力を付加するための多数の選択肢を提供する。
本明細書に記載される技術の用途には、以下が挙げられるが、これらに限定されない:
・治療用タンパク質の発現を容易にするためのRNAの送達
・治療用遺伝子サイレンシングのための低分子干渉RNA(siRNA)の送達
・ゲノム編集のための複数のDNA及びRNA鎖の送達
・診断のためのDNA及びRNAプローブの送達
・免疫系を調節するように設計されたDNA及びRNA鎖の送達
・DNA及びRNA治療薬と他の医薬品との同時送達
・封入された医薬品の標的化送達
・治療用タンパク質の発現を容易にするためのRNAの送達
・治療用遺伝子サイレンシングのための低分子干渉RNA(siRNA)の送達
・ゲノム編集のための複数のDNA及びRNA鎖の送達
・診断のためのDNA及びRNAプローブの送達
・免疫系を調節するように設計されたDNA及びRNA鎖の送達
・DNA及びRNA治療薬と他の医薬品との同時送達
・封入された医薬品の標的化送達
本明細書に記載される技術の利点には、以下が挙げられるが、これらに限定されない:
・異なるDNA、RNA配列を送達する脂質ナノ粒子(LNP)構造が存在すること
・副作用のない標的組織への送達は、この分野の中心的な課題であること
・LNPを標的とするための2つの主なアプローチ:1.)新規の脂質構造及びLNP組成物の合成、並びに2.)標的化ペプチド、抗体でLNP表面を装飾すること、があること
・脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)が、DNA及び/又はRNA配列でLNPの表面を飾ること
・LNP-SNAの表面上のDNA及びRNA配列が、機能を増強し、ナノ粒子の組織標的化を変化させること
・これが、DNA及びRNAが多くの異なる構造を形成することができ、理論的には、高い特異性で任意の標的に結合するように設計されているため、高度にモジュール化されたプラットフォームを表すこと
・DNA及びRNAが、センサーとして有用であり、脂質ナノ粒子からの治療及び診断(セラノスティック(theranostic))用構造を設計するために使用することができること
・異なるDNA、RNA配列を送達する脂質ナノ粒子(LNP)構造が存在すること
・副作用のない標的組織への送達は、この分野の中心的な課題であること
・LNPを標的とするための2つの主なアプローチ:1.)新規の脂質構造及びLNP組成物の合成、並びに2.)標的化ペプチド、抗体でLNP表面を装飾すること、があること
・脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)が、DNA及び/又はRNA配列でLNPの表面を飾ること
・LNP-SNAの表面上のDNA及びRNA配列が、機能を増強し、ナノ粒子の組織標的化を変化させること
・これが、DNA及びRNAが多くの異なる構造を形成することができ、理論的には、高い特異性で任意の標的に結合するように設計されているため、高度にモジュール化されたプラットフォームを表すこと
・DNA及びRNAが、センサーとして有用であり、脂質ナノ粒子からの治療及び診断(セラノスティック(theranostic))用構造を設計するために使用することができること
したがって、いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子コアと、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドのシェルと、を含む脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)を提供し、脂質ナノ粒子コアは、封入されたオリゴヌクレオチド、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートを含み、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの少なくとも10%は、脂質-PEGコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合する。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、又は少なくとも95%が、脂質-PEGコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの100%は、脂質-PEGコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約5~約1000個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約100~約1000個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約400個のオリゴヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、約5~約100ヌクレオチド長である。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、約10~約50ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、約25ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、同じヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも2個のオリゴヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、一本鎖、二本鎖DNAオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせから構成される。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、一本鎖、二本鎖RNAオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせから構成される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、一本鎖DNAオリゴヌクレオチド、二本鎖DNAオリゴヌクレオチド、一本鎖RNAオリゴヌクレオチド、二本鎖RNAオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせから構成される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドは、標的化オリゴヌクレオチドである。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、標的化オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドは、(GGT)nヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれ以上である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、(GGT)nヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれ以上である。いくつかの実施形態では、nは7である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドは、アプタマーである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドは、検出可能なマーカーを含む。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、阻害性オリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、遺伝子編集因子基質DNA若しくはRNA、又はそれらの組み合わせを含む。なお更なる実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA(siRNA)、アプタマー、短いヘアピンRNA(shRNA)、DNAザイム(DNAzyme)、又はアプタザイムである。いくつかの実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、CpGモチーフ含有オリゴヌクレオチド、二本鎖DNAオリゴヌクレオチド、二本鎖RNAオリゴヌクレオチド、又は一本鎖RNAオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、封入されたオリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、又はそれらの組み合わせから構成される。更なる実施形態では、封入されたオリゴヌクレオチドは、阻害性オリゴヌクレオチド、mRNA、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、遺伝子編集因子タンパク質をコードするmRNA、又はDNA若しくはRNA遺伝子編集因子基質である。いくつかの実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA(siRNA)、アプタマー、短いヘアピンRNA(shRNA)、DNAザイム(DNAzyme)、又はアプタザイムである。更なる実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、CpGモチーフ含有オリゴヌクレオチドである。更なる実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、CpGモチーフ含有オリゴヌクレオチド、二本鎖DNA(dsDNA)、二本鎖RNA、又は一本鎖RNA(ssRNA)である。様々な実施形態では、封入されたオリゴヌクレオチドは、約5~約5000ヌクレオチド長である。更なる実施形態では、封入されたオリゴヌクレオチドは、約10~約4500ヌクレオチド長である。なお更なる実施形態では、封入されたオリゴヌクレオチドは、約1500ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子コアは、複数の封入されたオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、複数の封入されたオリゴヌクレオチド中の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドは、検出可能なマーカーを含む。様々な実施形態では、複数の封入されたオリゴヌクレオチドは、阻害性オリゴヌクレオチド、mRNA、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、遺伝子編集因子タンパク質をコードするmRNA、DNA若しくはRNA遺伝子編集因子基質、又はそれらの組み合わせを含む。更なる実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA(siRNA)、アプタマー、短いヘアピンRNA(shRNA)、DNAザイム、又はアプタザイムである。更なる実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、CpGモチーフ含有オリゴヌクレオチド、二本鎖DNA(dsDNA)、二本鎖RNA、又は一本鎖RNA(ssRNA)である。いくつかの実施形態では、複数の封入されたオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドは、約10~約50ヌクレオチド長である。更なる実施形態では、複数の封入されたオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドは、約50ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、複数の封入されたオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドは、同じヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、複数の封入されたオリゴヌクレオチドは、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも2個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、ジリノレイルメチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、C12-200、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、ジリノレイルメチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)である。いくつかの実施形態では、LNP-SNAは、LNP-SNA中の総脂質の約50%であるイオン化可能な脂質のモル分率を含む。更なる実施形態では、リン脂質は、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジヘキサデカノイルホスファチジルコリン(DPPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、リン脂質は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)である。更なる実施形態では、LNP-SNAは、LNP-SNA中の総脂質の約1%~約25%であるリン脂質のモル分率を含む。いくつかの実施形態では、LNP-SNAは、LNP-SNA中の総脂質の3.5%であるか、又は約3.5%であるリン脂質のモル分率を含む。いくつかの実施形態では、ステロールは、3β-ヒドロキシコレスト-5-エン(コレステロール)、9,10-セココレスタ-5,7,10(19)-トリエン-3β-オール(ビタミンD3)、9,10-セコエルゴスタ-5,7,10(19),22-テトラエン-3β-オール(ビタミンD2)、カルシポトリオール、24-エチル-5,22-コレスタジエン-3β-オール(スチグマステロール)、22,23-ジヒドロスチグマステロール(β-シトステロール)、3,28-ジヒドロキシ-ルペオール(ベツリン)、ルペオール、ウルゾール酸、オレアノール酸、24α-メチルコレステロール(カンペステロール)、24-エチルコレスタ-5,24(28)E-ジエン-3β-オール(フコステロール)、24-メチルコレスタ-5,22-ジエン-3β-オール(ブラシカステロール)、24-メチルコレスタ-5,7,22-トリエン-3β-オール(エルゴステロール)、9,11-デヒドロエルゴステロール、ダウコステロール、又は1つ以上のアミノ酸で修飾された前述のステロールのうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、LNP-SNAは、LNP-SNA中の総脂質の約25%~約45%であるステロールのモル分率を含む。いくつかの実施形態では、LNP-SNAは、LNP-SNA中の総脂質の45%であるか、又は約45%であるステロールのモル分率を含む。更なる実施形態では、ステロールはコレステロールである。なお更なる実施形態では、LNP-SNAは、LNP-SNA中の総脂質の45%であるか、又は約45%であるコレステロールのモル分画を含む。いくつかの実施形態では、脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートは、2000ダルトン(Da)のポリエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートは、脂質-PEG-マレイミドである。更なる実施形態では、脂質-PEG-マレイミドは、2000Daのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた1,2-ジパルミトリル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPPE)、2000Daのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE)、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、LNP-SNAは、LNP-SNA中の総脂質の約1.5%~約3.5%である脂質-PEGコンジュゲートのモル分率を含む。いくつかの実施形態では、LNP-SNAは、LNP-SNA中の総脂質の1.5%であるか、又は約1.5%である脂質-PEGコンジュゲートのモル分率を含む。様々な実施形態では、イオン化可能な脂質と封入されたオリゴヌクレオチドとの間の質量比は、約20:1~約5:1である。いくつかの実施形態では、本開示のLNP-SNAは、脂質ナノ粒子コアに封入された治療剤を更に含む。更なる実施形態では、本開示のLNP-SNAは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合した治療剤を
更に含む。更なる実施形態では、治療剤は、抗体若しくは抗体断片、小分子、ペプチド、抗生物質、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、抗真菌剤、抗ウイルス剤、化学療法剤、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、本開示のLNP-SNAは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合した標的化ペプチド、標的化抗体、又はそれらの組み合わせを更に含む。
更に含む。更なる実施形態では、治療剤は、抗体若しくは抗体断片、小分子、ペプチド、抗生物質、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、抗真菌剤、抗ウイルス剤、化学療法剤、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、本開示のLNP-SNAは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合した標的化ペプチド、標的化抗体、又はそれらの組み合わせを更に含む。
いくつかの態様では、本開示は、本開示の複数の脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は治療剤を更に含む。
いくつかの態様では、本開示は、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを、本開示の脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)又は組成物とハイブリダイズさせるステップを含む、遺伝子の発現を阻害する方法を提供し、ポリヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドのシェル内の1つ以上のオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイズは、遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な程度の相補性でポリヌクレオチドの長さにわたって生じる。いくつかの実施形態では、遺伝子産物の発現はインビボで阻害される。いくつかの実施形態では、遺伝子産物の発現はインビトロで阻害される。
いくつかの態様では、本開示は、toll様受容体を有する細胞を、本開示の脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)又は組成物と接触させることを含む、Toll様受容体(TLR)の活性を上方調節するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、TLRアゴニストである1つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、toll様受容体は、toll様受容体1、toll様受容体2、toll様受容体3、toll様受容体4、toll様受容体5、toll様受容体6、toll様受容体7、toll様受容体8、toll様受容体9、toll様受容体10、toll様受容体11、toll様受容体12、toll様受容体13、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、本方法はインビトロで実施される。いくつかの実施形態では、本方法はインビボで実施される。
いくつかの態様では、本開示は、toll様受容体を有する細胞を、本開示の脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)又は組成物と接触させることを含む、Toll様受容体(TLR)の活性を下方調節するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、TLRアンタゴニストである1つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、toll様受容体は、toll様受容体1、toll様受容体2、toll様受容体3、toll様受容体4、toll様受容体5、toll様受容体6、toll様受容体7、toll様受容体8、toll様受容体9、toll様受容体10、toll様受容体11、toll様受容体12、toll様受容体13、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、本方法はインビトロで実施される。いくつかの実施形態では、本方法はインビボで実施される。
いくつかの態様では、本開示は、障害を治療する方法であって、有効量の、本開示の脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)又は組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、投与することが、障害を治療する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、がん、感染症、自己免疫疾患、又はそれらの組み合わせである。
疾患を治療するために、DNA及びRNA治療薬を標的組織に送達し、副作用なしに持続的な利益を提供する必要がある。脂質ナノ粒子球状核酸は、ナノ粒子標的化及び組織特異性のためにDNA及びRNA配列を使用することによって、この満たされていない必要性に対処する。脂質SNA構造は、脂質粒子(核酸を充填した)又は従来のSNA(リポソーム及びゴールドコア)の両方とは著しく異なる生体分布特性を有する。
本明細書で使用される場合、「標的化オリゴヌクレオチド」は、LNP-SNAを特定の組織及び/又は特定の細胞型に向けるオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化オリゴヌクレオチドはアプタマーである。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のLNP-SNAは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したアプタマーを含み、アプタマーは、特定の細胞型の表面上の1つ以上の受容体に結合するように設計されている。いくつかの実施形態では、標的化オリゴヌクレオチドは、(GGT)nヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、若しくはそれ以上であるか、又は少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、若しくはそれ以上である。更なる実施形態では、標的化オリゴヌクレオチドは、(GGT)nヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20未満である。更なる実施形態では、標的化オリゴヌクレオチドは、(GGT)nヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、nは7である。いくつかの実施形態では、標的化オリゴヌクレオチドは、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート又はオリゴヌクレオチド小分子コンジュゲートである。
本明細書で使用される場合、「免疫刺激性オリゴヌクレオチド」は、免疫応答を刺激(例えば、誘導又は増強)することができるオリゴヌクレオチドである。免疫刺激性オリゴヌクレオチドの典型的な例は、CpGモチーフ含有オリゴヌクレオチド、一本鎖RNAオリゴヌクレオチド、二本鎖RNAオリゴヌクレオチド、及び二本鎖DNAオリゴヌクレオチドである。「CpGモチーフ」は、シトシン-グアニンジヌクレオチド配列である。一本鎖RNA配列は、toll様受容体8及び9によって認識することができ、二本鎖RNA配列は、toll様受容体3によって認識することができ、二本鎖DNAは、toll様受容体3及び環状GMP-AMP合成酵素(cGAS)によって認識することができる。
「阻害性オリゴヌクレオチド」という用語は、例えば、mRNAをリボソーム内のタンパク質に翻訳することを妨げることによって、又は1つ以上の標的遺伝子若しくはmRNAに特異的に結合(ハイブリダイズ)し、それによって標的タンパク質の発現又は生物学的活性を低下させる、標的タンパク質のうちの1つ以上をコードする遺伝子又はmRNAのいずれかに十分に相補的である、タンパク質の産生又は発現を低下させるオリゴヌクレオチドを指す。阻害性オリゴヌクレオチドには、単離又は合成の短いヘアピンRNA(shRNA又はDNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスRNA又はDNA、キメラアンチセンスDNA又はRNA)、miRNA及びmiRNA模倣物、低分子干渉RNA(siRNA)、先天性免疫受容体のDNA又はRNA阻害剤、アプタマー、DNAザイム、又はアプタザイムが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明確にそうでないと示さない限り、複数の指示対象が含まれる。
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合には交換可能である。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の値又は範囲を変更するために使用される場合、一般に、記載された値又は範囲の20パーセント以内、例えば、10パーセント以内、5パーセント以内、4パーセント以内、3パーセント以内、2パーセント以内、又は1パーセント以内を意味する。
特に明記しない限り、本明細書で企図される全ての範囲は、端点及び端点間の全ての数の両方を含む。範囲に関連した「約」又は「約」の使用は、範囲の両端に適用される。したがって、「約20~30」は、少なくとも指定された端点を含む「約20~約30」をカバーすることを意図している。
脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)
脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)は、オリゴヌクレオチドで装飾された脂質ナノ粒子コアから構成される。脂質ナノ粒子コアは、封入されたオリゴヌクレオチド、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートを含む。コア及びシェル特性の組み合わせのために、構築物は、例えば、限定されないが、核酸送達に関して、従来のリポソームSNA及びゴールドSNAよりも利点を有する。オリゴヌクレオチドシェルのオリゴヌクレオチドは、様々な方向に配向され得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、半径方向外向きに配向される。オリゴヌクレオチドシェルは、脂質ナノ粒子コアの外側表面に結合した1個以上のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドシェルの球状アーキテクチャは、トランスフェクション剤とは独立したほぼ全ての細胞への侵入、ヌクレアーゼ分解に対する耐性、配列に基づく機能、標的化、及び診断を含む、従来の核酸送達方法よりも独自の利点を与える。
脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)は、オリゴヌクレオチドで装飾された脂質ナノ粒子コアから構成される。脂質ナノ粒子コアは、封入されたオリゴヌクレオチド、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートを含む。コア及びシェル特性の組み合わせのために、構築物は、例えば、限定されないが、核酸送達に関して、従来のリポソームSNA及びゴールドSNAよりも利点を有する。オリゴヌクレオチドシェルのオリゴヌクレオチドは、様々な方向に配向され得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、半径方向外向きに配向される。オリゴヌクレオチドシェルは、脂質ナノ粒子コアの外側表面に結合した1個以上のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドシェルの球状アーキテクチャは、トランスフェクション剤とは独立したほぼ全ての細胞への侵入、ヌクレアーゼ分解に対する耐性、配列に基づく機能、標的化、及び診断を含む、従来の核酸送達方法よりも独自の利点を与える。
いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子コアと、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドのシェルと、を含む脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)を提供し、脂質ナノ粒子コアは、封入されたオリゴヌクレオチド、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートを含み、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの少なくとも10%は、脂質-PEGコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合する。様々な実施形態では、LNP-SNAは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合した標的化ペプチド、標的化抗体、又はそれらの組み合わせを含む。そのような標的化ペプチドは、例えば、限定されないが、標的細胞の表面マーカーに結合する抗体Fab断片及び異なるpH環境で荷電するように設計されたペプチドである。様々な実施形態では、1つ以上の遺伝子編集オリゴヌクレオチドは、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コア中に封入される。そのような遺伝子編集オリゴヌクレオチドは、例えば、限定されないが、遺伝子編集因子タンパク質をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)、DNA若しくはRNA遺伝子編集因子基質(例えば、ガイドRNA)、又はそれらの組み合わせである。
したがって、脂質ナノ粒子コアは、封入されたオリゴヌクレオチド、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、ジリノレイルメチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、C12-200、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)、同様の脂質/リピドイド構造、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、ジリノレイルメチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジヘキサデカノイルホスファチジルコリン(DPPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、又はそれらの組み合わせである。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、リン脂質は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)である。更なる実施形態では、ステロールは、3β-ヒドロキシコレスト-5-エン(コレステロール)、9,10-セココレスタ-5,7,10(19)-トリエン-3β-オール(ビタミンD3)、9,10-セコエルゴスタ-5,7,10(19),22-テトラエン-3β-オール(ビタミンD2)、カルシポトリオール、24-エチル-5,22-コレスタジエン-3β-オール(スチグマステロール)、22,23-ジヒドロスチグマステロール(β-シトステロール)、3,28-ジヒドロキシ-ルペオール(ベツリン)、ルペオール、ウルゾール酸、オレアノール酸、24α-メチルコレステロール(カンペステロール)、24-エチルコレスタ-5,24(28)E-ジエン-3β-オール(フコステロール)、24-メチルコレスタ-5,22-ジエン-3β-オール(ブラシカステロール)、24-メチルコレスタ-5,7,22-トリエン-3β-オール(エルゴステロール)、9,11-デヒドロエルゴステロール、ダウコステロール、又は1つ以上のアミノ酸で修飾された前述のステロールのうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートは、2000ダルトン(Da)のポリエチレングリコールを含む。更なる実施形態では、脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートは、脂質-PEG-マレイミドである。なお更なる実施形態では、脂質-PEG-マレイミドは、2000Daのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた1,2-ジパルミトリル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPPE)、2000Daのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE)、又はそれらの組み合わせである。
LNP-SNAは、約1ナノメートル(nm)~約500nm、約1nm~約400nm、約1nm~約300nm、約1nm~約200nm、約1nm~約150nm、約1nm~約100nm、約1nm~約90nm、約1nm~約80nmの直径、約1nm~約70nmの直径、約1nm~約60nmの直径、約1nm~約50nmの直径、約1nm~約40nmの直径、約1nm~約30nmの直径、約1nm~約20nmの直径、約1nm~約10nm、約10nm~約150nmの直径、約10nm~約140nmの直径、約10nm~約130nmの直径、約10nm~約120nmの直径、約10nm~約110nmの直径、約10nm~約100nmの直径、約10nm~約90nmの直径、約10nm~約80nmの直径、約10nm~約70nmの直径、約10nm~約60nmの直径、約10nm~約50nmの直径、約10nm~約40nmの直径、約10nm~約30nmの直径、又は約10nm~約20nmの直径のサイズの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、LNP-SNAは、100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、若しくは10nmの直径であるか、少なくとも100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、若しくは10nmの直径であるか、又は約100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、若しくは10nm未満の直径である(又は複数のLNP-SNAが存在する場合、平均直径である)。いくつかの実施形態では、複数のLNP-SNAのサイズは、約10nm~約150nm(平均直径)、約10nm~約140nmの平均直径、約10nm~約130nmの平均直径、約10nm~約120nmの平均直径、約10nm~約110nmの平均直径、約10nm~約100nmの平均直径、約10nm~約90nmの平均直径、約10nm~約80nmの平均直径、約10nm~約70nmの平均直径、約10nm~約60nmの平均直径、約10nm~約50nmの平均直径、約10nm~約40nmの平均直径、約10nm~約30nmの平均直径、約10nm~約20nmの平均直径、約40nm~約150nmの平均直径、約40nm~約100nmの平均直径、約40nm~約90nmの平均直径、約40nm~約80nmの平均直径、約50nm~約200nmの平均直径、約50nm~約150nmの平均直径、約50nm~約100nmの平均直径、約50nm~約90nmの平均直径、又は約50nm~約80nmの平均直径である。いくつかの実施形態では、LNP-SNAの直径(又は複数のLNP-SNAの平均直径)は、約40nm~約150nm、約50~約200nm、又は約40~約100nmである。いくつかの実施形態では、方法で使用されるナノ粒子のサイズは、それらの特定の使用又は用途によって必要に応じて変化する。サイズの変動は、有利には、LNP-SNAの特定の物理的特性、例えば、本明細書に記載されるように、オリゴヌクレオチドが結合し得る表面積の量を最適化するために使用される。LNP-SNAの前述の直径は、脂質ナノ粒子コア自体の直径、又は脂質ナノ粒子コア及びそれに結合するオリゴヌクレオチドのシェルの直径に適用することができることが理解されるであろう。
オリゴヌクレオチド
本開示は、脂質ナノ粒子コアと、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルと、を含む脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)を提供する。本明細書に記載されるように、脂質ナノ粒子コアは、封入されたオリゴヌクレオチドを含む。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、オリゴヌクレオチドは、(GGT)nヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、若しくはそれ以上であるか、又は少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、若しくはそれ以上である。更なる実施形態では、標的化オリゴヌクレオチドは、(GGT)nヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20未満である。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、(GGT)nヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、nは7である。様々な実施形態では、(GGT)n配列は、オリゴヌクレオチドの5’末端又は3’末端にある。様々な実施形態では、(GGT)n配列は、ナノ粒子コアの近位又は遠位にある。様々な実施形態では、(GGT)n配列は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドの末端にあり、(GGT)n配列は、ナノ粒子コアに結合していないオリゴヌクレオチドの末端にあるか、又はその両方である。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、阻害性オリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、標的化オリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。様々な実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドには、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、それらの修飾形態、又はそれらの組み合わせが含まれる。本明細書に記載の任意の態様又は実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖である。本開示の任意の態様又は実施形態では、オリゴヌクレオチドは、検出可能なマーカーを含む。
本開示は、脂質ナノ粒子コアと、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルと、を含む脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)を提供する。本明細書に記載されるように、脂質ナノ粒子コアは、封入されたオリゴヌクレオチドを含む。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、オリゴヌクレオチドは、(GGT)nヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、若しくはそれ以上であるか、又は少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、若しくはそれ以上である。更なる実施形態では、標的化オリゴヌクレオチドは、(GGT)nヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20未満である。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、(GGT)nヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、nは7である。様々な実施形態では、(GGT)n配列は、オリゴヌクレオチドの5’末端又は3’末端にある。様々な実施形態では、(GGT)n配列は、ナノ粒子コアの近位又は遠位にある。様々な実施形態では、(GGT)n配列は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドの末端にあり、(GGT)n配列は、ナノ粒子コアに結合していないオリゴヌクレオチドの末端にあるか、又はその両方である。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、阻害性オリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、標的化オリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。様々な実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドには、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、それらの修飾形態、又はそれらの組み合わせが含まれる。本明細書に記載の任意の態様又は実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖である。本開示の任意の態様又は実施形態では、オリゴヌクレオチドは、検出可能なマーカーを含む。
本明細書に記載されるように、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間結合を有するものを含む、オリゴヌクレオチドの修飾形態もまた、本開示によって企図される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、全て又は部分的にペプチド核酸である。他の修飾ヌクレオシド間結合は、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含む。更に他の修飾オリゴヌクレオチドとしては、1つ以上のユニバーサル塩基を含むものが挙げられる。「ユニバーサル塩基」とは、著しい構造不安定化を伴わずに水素結合を形成することによって、核酸中のA、C、G、T及びUのうちのいずれか1つへの結合を置き換えることができる分子を指す。ユニバーサル塩基類似体と組み込まれたオリゴヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションにおけるプローブとして機能することができる。ユニバーサル塩基の例には、5’-ニトロインドール-2’-デオキシリボシド、3-ニトロピロール、イノシン、及びヒポキサンチンが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語又はその複数形は、本明細書で論じられ、それ以外は当技術分野で知られている変形形態と交換可能である。本明細書で使用される「核酸塩基」という用語又はその複数形は、本明細書で論じられ、それ以外は当技術分野で知られている変形形態と交換可能である。ヌクレオチド又は核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基A、G、C、T、及びUを含む。天然に存在しない核酸塩基には、例えば、限定するものではないが、キサンチン、ジアミノプリン、8-オキソ-N6-メチルアデニン、7-デアザキサンチン、7-デアザグアニン、N4,N4-エタノシトシン、N’,N’-エタノ-2,6-ジアミノプリン、5-メチルシトシン(mC)、5-(C3~C6)-アルキニル-シトシン、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、2-ヒドロキシ-5-メチル-4-トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、並びにBennerら、米国特許第5,432,272号及びにSusan M.Freier and Karl-Heinz Altmann,1997,Nucleic Acids Research,vol.25:pp 4429-4443に記載の「天然に存在しない」核酸塩基が挙げられる。「核酸塩基」という用語には、既知のプリン及びピリミジン複素環だけでなく、その複素環類似体及び互変異性体も含まれる。更に、天然に存在する及び天然に存在しない核酸塩基には、米国特許第3,687,808号(Meriganら)、Sanghviによる、Antisense Research and Application,Ed.S.T.Crooke and B.Lebleu,CRC Press,1993の15章、Englisch et al.,1991,Angewandte Chemie,International Edition,30:613-722(特に、622及び623頁を参照されたい)、並びにthe Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,J.I.Kroschwitz Ed.,John Wiley & Sons,1990,pages 858-859,Cook,Anti-Cancer Drug Design 1991,6,585-607に開示されているものが挙げられ、これらの各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。様々な態様では、オリゴヌクレオチドは、最も古典的な意味でのヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として機能する、ある特定の「ユニバーサル塩基」を含む核酸塩基のように機能し得る複素環式化合物などの化合物を含む天然に存在しないヌクレオチドのカテゴリーである1つ以上の「ヌクレオシド塩基」又は「塩基単位」も含む。ユニバーサル塩基には、3-ニトロピロール、任意選択で置換されたインドール(例えば、5-ニトロインドール)、及び任意選択で置換されたヒポキサンチンが含まれる。他の望ましいユニバーサル塩基には、当該技術分野において既知のユニバーサル塩基を含む、ピロール、ジアゾール、又はトリアゾール誘導体が挙げられる。
オリゴヌクレオチドの例には、修飾された骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含有するものが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格にリン原子を有するもの及び骨格にリン原子を有さないものが含まれる。ヌクレオシド間骨格にリン原子を有していない修飾オリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」の意味の範囲内であるとみなされる。
リン原子を含む修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホトリエステル、3’-アルキレンホスホネート、5’-アルキレンホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスネート、ホスフィネート、3’-アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及び正常な3’-5’結合を有するボラノホスフェート、これらの2’-5’結合類似体、並びに1つ以上のヌクレオチド間結合が3’-3’、5’-5’又は2’-2’結合である逆向きの極性を有するものが挙げられる。最も3’側のヌクレオチド間結合にあるただ1つの3’-3’結合を含む、すなわち、塩基がない(ヌクレオチドがない、若しくはその場所に水酸基を有する)場合があるただ1つの逆向きのヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドも企図される。塩、混合塩、及び遊離酸形態も企図される。上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第3,687,808号、同第4,469,863号、同第4,476,301号、同第5,023,243号、同第5,177,196号、同第5,188,897号、同第5,264,423号、同第5,276,019号、同第5,278,302号、同第5,286,717号、同第5,321,131号、同第5,399,676号、同第5,405,939号、同第5,453,496号、同第5,455,233号、同第5,466,677号、同第5,476,925号、同第5,519,126号、同第5,536,821号、同第5,541,306号、同第5,550,111号、同第5,563,253号、同第5,571,799号、同第5,587,361号、同第5,194,599号、同第5,565,555号、同第5,527,899号、同第5,721,218号、同第5,672,697号及び同第5,625,050号が挙げられ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキル若しくはシクロアルキルとが混合されたヌクレオシド間結合、又は1つ以上の短鎖のヘテロ原子若しくは複素環のヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合を有する骨格;シロキサン骨格;スルフィド、スルフォキシド及びスルホン骨格;ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格;メチレンホルムアセチル及びメチレンチオホルムアセチル骨格;リボアセチル骨格;アルケン含有骨格;スルファミン酸骨格;メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格;スルホン酸及びスルホンアミド骨格;アミド骨格;並びにN、O、S及びCH2構成要素部分が混在するその他の骨格がある。例えば、米国特許第5,034,506号、同第5,166,315号、同第5,185,444号、同第5,214,134号、同第5,216,141号、同第5,235,033号、同第5,264,562号、同第5,264,564号、同第5,405,938号、同第5,434,257号、同第5,466,677号、同第5,470,967号、同第5,489,677号、同第5,541,307号、同第5,561,225号、同第5,596,086号、同第5,602,240号、同第5,610,289号、同第5,602,240号、同第5,608,046号、同第5,610,289号、同第5,618,704号、同第5,623,070号、同第5,663,312号、同第5,633,360号、同第5,677,437号、同第5,792,608号、同第5,646,269号及び同第5,677,439号を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
なお更なる実施形態では、1つ以上の糖及び/又はヌクレオチド単位の1つ以上のヌクレオチド間結合の両方が「天然に存在しない」基で置き換えられている、オリゴヌクレオチド模倣物がある。オリゴヌクレオチドの塩基は、ハイブリダイゼーションのために維持される。いくつかの態様では、この実施形態は、ペプチド核酸(PNA)を企図する。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格で置き換えられる。例えば、米国特許第5,539,082号、同第5,714,331号、及び同第5,719,262号、並びにNielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
なお更なる実施形態では、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドが提供され、米国特許第5,489,677号及び同第5,602,240号に記載の-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-及び-O-N(CH3)-CH2-CH2-を含む。米国特許第5,034,506号に記載されるモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも企図される。
様々な形態では、オリゴヌクレオチド中の2つの連続するモノマー間の結合は、-CH2-、-O-、-S-、-NRH-、>C=O、>C=NRH、>C=S、-Si(R”)2-、-SO-、-S(O)2-、-P(O)2-、-PO(BH3)-、-P(O,S)-、-P(S)2-、-PO(R”)-、-PO(OCH3)-、及び-PO(NHRH)から選択される2~4個の、望ましくは3個の基/原子からなり、式中、RHは、水素及びC1~4-アルキルから選択され、R”は、C1~6-アルキル及びフェニルから選択される。そのような結合の例示的な例は、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CHOH-CH2-、-O-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-O-CH2-CH=(後続のモノマーへの結合として使用される場合R5を含む)、-CH2-CH2-O-、-NRH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NRH-、-CH2-NRH-CH2--、-O-CH2-CH2-NRH-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-NRH-CS-NRH-、-NRH-C(=NRH)-NRH-、-NRH-CO-CH2-NRH-O-CO-O-、-O-CO-CH2-O-、-O-CH2-CO-O-、-CH2-CO-NRH-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CH=N-O-、-CH2-NRH-O-、-CH2-O-N=(後続のモノマーへの結合として使用される場合R5を含む)、-CH2-O-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-O-、-CH2-NRH-CO-、-O-NRH-CH2-、-O-NRH、-O-CH2-S-、-S-CH2-O-、-CH2-CH2-S-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH=(後続のモノマーへの結合として使用される場合R5を含む)、-S-CH2-CH2-、-S-CH2-CH2--O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-S-CH2-、-CH2-SO-CH2-、-CH2-SO2-CH2-、-O-SO-O-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-NRH-、-NRH-S(O)2-CH2-;-O-S(O)2-CH2-、-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-O-P(S)2-S-、-S-P(O)2-S-、-S-P(O,S)-S-、-S-P(S)2-S-、-O-PO(R”)-O-、-O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(O CH2CH3)-O-、-O-PO(O CH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRN)-O-、-O-P(O)2-NRH H-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O、NRH)-O-、-CH2-P(O)2-O-、-O-P(O)2-CH2-、及び-O-Si(R”)2-O-であり、これらの中でとりわけ、-CH2-CO-NRH-、-CH2-NRH-O-、-S-CH2-O-、-O-P(O)2-O-O-P(-O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-NRH P(O)2-O-、-O-P(O、NRH)-O-、-O-PO(R”)-O-、-O-PO(CH3)-O-、及び-O-PO(NHRN)-O-(式中、RHは、水素及びC1~4-アルキルから選択され、 R”は、C1~6-アルキル及びフェニルから選択される)が企図される。更なる例示は、Mesmaeker et.al.,Current Opinion in Structural Biology 1995,5,343-355及びSusan M.Freier and Karl-Heinz Altmann,Nucleic Acids Research,1997,vol 25,pp 4429-4443に提供されている。
オリゴヌクレオチドの更に他の修飾形態は、米国特許出願第2004/0219565号に詳細に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
修飾オリゴヌクレオチドはまた、1つ以上の置換糖部分を含んでもよい。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、以下のうちの1つを2’位に含み:OH;F;O-、S-、若しくはN-アルキル;O-、S-、若しくはN-アルケニル;O-、S-、若しくはN-アルキニル;又はO-アルキル-O-アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は非置換のC1~C10アルキル又はC2~C10アルケニル及びアルキニルであり得る。他の実施形態には、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、及びO(CH2)nON[(CH2)nCH3]2が含まれ、式中、n及びmは、1~約10である。他のオリゴヌクレオチドは、2’位に以下のうちの1つを含む:C1~C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリル又はO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、又はRNA切断基。一態様では、修飾には、2’-メトキシエトキシ(2’-O-(2-メトキシエチル)又は2’-MOEとしても知られる、2’-O-CH2CH2OCH3)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504)、すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。他の修飾には、2’-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、2’-DMAOEとしても知られるO(CH2)2ON(CH3)2基、及び2’-ジメチルアミノエトキシエトキシ(当該技術分野において、2’-O-ジメチル-アミノ-エトキシ-エチル又は2’-DMAEOEとしても知られる)、すなわち、2’-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2が挙げられる。
更に他の修飾には、2’-メトキシ(2’-O-CH3)、2’-アミノプロポキシ(2’-OCH2CH2CH2NH2)、2’-アリル(2’-CH2-CH=CH2)、2’-O-アリル(2’-O-CH2-CH=CH2)、及び2’-フルオロ(2’-F)が挙げられる。2’修飾は、アラビノ(上)位又はリボ(下)位にあってもよい。一態様では、2’-アラビノ修飾は2’-Fである。同様の修飾はまた、オリゴヌクレオチドの他の位置、例えば、3’末端ヌクレオチド上の糖の3’位、又は2’-5’結合オリゴヌクレオチド中、及び5’末端ヌクレオチドの5’位で行ってもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有していてもよい。例えば、米国特許第4,981,957号、同第5,118,800号、同第5,319,080号、同第5,359,044号、同第5,393,878号、同第5,446,137号、同第5,466,786号、同第5,514,785号、同第5,519,134号、同第5,567,811号、同第5,576,427号、同第5,591,722号、同第5,597,909号、同第5,610,300号、同第5,627,053号、同第5,639,873号、同第5,646,265号、同第5,658,873号、同第5,670,633号、同第5,792,747号、及び同第5,700,920号を参照されたく、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、糖の修飾には、2’-ヒドロキシル基が糖環の3’又は4’炭素原子に結合し、それにより、二環式糖部分を形成する、ロックド核酸(LNA)が含まれる。特定の態様では、結合は、2’酸素原子と4’炭素原子とを架橋するメチレン(-CH2-)nであり、式中、nは1又は2である。LNA及びその調製は、WO98/39352及びWO99/14226に記載されている。
修飾ヌクレオチドは、EP1072679及びWO97/12896に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。修飾核酸塩基には、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6-メチル並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、2-プロピル並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン、及び2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニルウラシル及びシトシン、並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、シトシン及びチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル並びに他の8-置換アデニン及びグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチル並びに他の5-置換ウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン及び7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニン及び8-アザアデニン、7-デアザグアニン及び7-デアザアデニン、並びに3-デアザグアニン及び3-デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。更なる修飾塩基には、三環系のピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン)、フェノチアジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾチアジン-2(3H)-オン)、置換フェノキサジンシチジン(例えば9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン)のようなG-クランプ(G-clamp)、カルバゾールシチジン(2H-ピリミド[4,5-b]インドール-2-オン)、ピリドインドールシチジン(H-ピリド[3’,2’:4,5]ピロロ[2,3-d]ピリミジン-2-オン)が挙げられる。修飾塩基には、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環、例えば、7-デアザ-アデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジン、及び2-ピリドンで置き換えられたものも含まれ得る。追加の核酸塩基には、米国特許第3,687,808号に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley & Sons,1990に開示されているもの、Englisch et al.,1991,Angewandte Chemie,International Edition,30:613に開示されているもの、及びSanghvi,Y.S.,Chapter 15,Antisense Research and Applications,pages 289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,ed.,CRC Press,1993に開示されているものが挙げられる。これらの塩基のいくつかは、結合親和性を高めるのに有用であり、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、並びにN-2、N-6、及びO-6置換プリンを含み、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、及び5-プロピニルシトシンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6~1.2℃上昇させることが示されており、特定の態様では、2’-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。米国特許第3,687,808号、米国特許第4,845,205号、同第5,130,302号、同第5,134,066号、同第5,175,273号、同第5,367,066号、同第5,432,272号、同第5,457,187号、同第5,459,255号、同第5,484,908号、同第5,502,177号、同第5,525,711号、同第5,552,540号、同第5,587,469号、同第5,594,121号、同第5,596,091号、同第5,614,617号、同第5,645,985号、同第5,830,653号、同第5,763,588号、同第6,005,096号、同第5,750,692号及び同第5,681,941号を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
所定の配列のポリヌクレオチドを作製する方法は周知である。例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.1989)及びF.Eckstein(ed.)Oligonucleotides and Analogues,1st Ed.(Oxford University Press,New York,1991)を参照されたい。固相合成法は、ポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドの両方に適している(DNA合成の周知の方法は、RNA合成にも有用である)。ポリリボヌクレオチドは酵素的に調製することもできる。天然に存在しない核酸塩基もポリヌクレオチドに組み込むことができる。例えば、米国特許第7,223,833号、Katz,J.Am.Chem.Soc.,74:2238(1951)、Yamane,et al.,J.Am.Chem.Soc.,83:2599(1961)、Kosturko,et al.,Biochemistry,13:3949(1974)、Thomas,J.Am.Chem.Soc.,76:6032(1954)、Zhang,et al.,J.Am.Chem.Soc.,127:74-75(2005)、及びZimmermann,et al.,J.Am.Chem.Soc.,124:13684-13685(2002)を参照されたい。
様々な態様では、本開示のオリゴヌクレオチド(例えば、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチド又は封入されたオリゴヌクレオチド)、又はその修飾形態は、一般に、約10ヌクレオチド長~約100ヌクレオチド長である。より具体的には、本開示のオリゴヌクレオチドは、約5~約90ヌクレオチド長、約5~約80ヌクレオチド長、約5~約70ヌクレオチド長、約5~約60ヌクレオチド長、約5~約50ヌクレオチド長約5~約45ヌクレオチド長、約5~約40ヌクレオチド長、約5~約35ヌクレオチド長、約5~約30ヌクレオチド長、約5~約25ヌクレオチド長、約5~約20ヌクレオチド長、約5~約15ヌクレオチド長、約5~約10ヌクレオチド長、約10~約90ヌクレオチド長、約10~約80ヌクレオチド長、約10~約70ヌクレオチド長、約10~約60ヌクレオチド長、約10~約50ヌクレオチド長約10~約45ヌクレオチド長、約10~約40ヌクレオチド長、約10~約35ヌクレオチド長、約10~約30ヌクレオチド長、約10~約25ヌクレオチド長、約10~約20ヌクレオチド長、約10~約15ヌクレオチド長、約18~約28ヌクレオチド長、約15~約26ヌクレオチド長、及びオリゴヌクレオチドが所望の結果を達成できる程度に、具体的に開示されたサイズの全てのオリゴヌクレオチド中間体長である。更なる実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチド(例えば、封入されたオリゴヌクレオチド)は、約5ヌクレオチド~約5000ヌクレオチド長である。更なる実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、約5~約4000ヌクレオチド長、約5~約3500ヌクレオチド長、約5~約3000ヌクレオチド長、約5~約2500ヌクレオチド長、約5~約2000ヌクレオチド長、約5~約1500ヌクレオチド長、約5~約1000ヌクレオチド長、約5~約900ヌクレオチド長、約5~約800ヌクレオチド長、約5~約700ヌクレオチド長、約5~約600ヌクレオチド長、約5~約500ヌクレオチド長約5~約450ヌクレオチド長、約5~約400ヌクレオチド長、約5~約350ヌクレオチド長、約5~約300ヌクレオチド長、約5~約250ヌクレオチド長、約5~約200ヌクレオチド長、約5~約150ヌクレオチド長、約5~約100ヌクレオチド長、約5~約90ヌクレオチド長、約5~約80ヌクレオチド長、約5~約70ヌクレオチド長、約5~約60ヌクレオチド長、約5~約50ヌクレオチド長、約5~約40ヌクレオチド長、約5~約30ヌクレオチド長、約5~約20ヌクレオチド長、約5~約10ヌクレオチド長、及びオリゴヌクレオチドが所望の結果を達成できる程度に、具体的に開示されたサイズの全てのオリゴヌクレオチド中間体長である。したがって、様々な実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1500、1700、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、若しくはそれ以上、又は少なくともそれらのヌクレオチド長である。更なる実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、又はそれ以上未満のヌクレオチド長である。様々な実施形態では、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、全てが同じ長さ/配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含み、いくつかの実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、複数の中の少なくとも1つの他のオリゴヌクレオチドに対して異なる長さ及び/又は配列を有する1つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、脂質ナノ粒子コアは、全てが同じ長さ/配列を有するその中に封入された複数のオリゴヌクレオチドを含むが、一方いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子コアは、複数の中の少なくとも1つの他のオリゴヌクレオチドに対して異なる長さ及び/又は配列を有する1つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。例えば、限定されないが、いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子コアは、遺伝子編集のためにその中に封入された基質ガイドRNAと組み合わせた遺伝子編集エンドヌクレアーゼ(例えば、cas9)をコードするmRNAを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド(例えば、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチド及び/又は脂質ナノ粒子に封入されたオリゴヌクレオチド)は、アプタマーである。したがって、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの全ての特徴及び態様(例えば、長さ、タイプ(DNA、RNA、それらの修飾形態)、スペーサーの任意の存在)は、アプタマーにも適用される。アプタマーは、目的の様々な標的分析物に結合するように進化させることができるオリゴヌクレオチド配列である。アプタマーは、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖であってもよい。
本明細書に記載の検出可能なマーカー(例えば、フルオロフォア、放射性標識)及び治療剤(例えば、抗体)をオリゴヌクレオチドに結合させる方法は、当技術分野において既知である。
様々な態様では、本開示のLNP-SNAは、複数の標的(例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質)に結合する能力を有する。いくつかの実施形態では、LNP-SNAは、本明細書に記載の阻害性オリゴヌクレオチドである1つ以上のオリゴヌクレオチドを更に含む。そのような阻害性オリゴヌクレオチドは、様々な実施形態では、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に存在するか、脂質ナノ粒子コアに封入されているか、又はその両方である。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のLNP-SNAは、使用される条件下でハイブリダイズするために標的ポリヌクレオチドに十分に相補的な配列を有する1つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、LNP-SNAは、同一ではない2つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、すなわち、オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つは、異なる長さ及び/又は異なる配列を有するという点で、少なくとも1つの他のオリゴヌクレオチドとは異なる。例えば、特定のポリヌクレオチドが標的化されている場合、単一のLNP-SNAは、同じ標的の複数のコピーに結合する能力を有する。いくつかの実施形態では、単一のLNP-SNAは、異なる標的に結合する能力を有する。したがって、様々な態様では、単一のLNP-SNAを、2つ以上の遺伝子産物の発現を阻害する方法で使用してもよい。様々な実施形態では、したがって、オリゴヌクレオチドを使用して、標的ポリヌクレオチドの1つ以上の特異的領域であるかどうかにかかわらず、又は必要に応じて標的ポリヌクレオチドの全長にわたって、特定のポリヌクレオチドを標的にして、遺伝子発現の所望のレベルの阻害をもたらす。
いくつかの実施形態では、LNP-SNAは、本明細書に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチドである1つ以上のオリゴヌクレオチドを更に含む。そのような免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、様々な実施形態では、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に存在するか、脂質ナノ粒子コアに封入されているか、又はその両方である。したがって、本開示の様々な態様及び実施形態では、本開示のLNP-SNAは、免疫刺激活性、遺伝子発現活性の阻害、又はその両方を有する。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、CpGモチーフ含有オリゴヌクレオチドである。様々な実施形態では、CpGモチーフ含有オリゴヌクレオチドは、クラスAのCpGオリゴヌクレオチド、クラスBのCpGオリゴヌクレオチド、又はクラスCのCpGオリゴヌクレオチドである。様々な実施形態では、LNP-SNAは、阻害性オリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、標的化オリゴヌクレオチド、又はそれらの混合物を含む。
脂質ナノ粒子表面/封入密度。ナノ粒子を安定させるのに十分な表面密度、及びナノ粒子とオリゴヌクレオチドとの所望の組み合わせに対してそれを得るのに必要な条件は、経験的に決定することができる。一般に、本開示のオリゴヌクレオチドは、少なくとも約2ピコモル/cm2の表面密度で脂質ナノ粒子コアの外部に結合している。いくつかの態様では、表面密度は約15ピコモル/cm2又は少なくとも約15ピコモル/cm2である。オリゴヌクレオチドが、少なくとも2pmol/cm2、少なくとも3pmol/cm2、少なくとも4pmol/cm2、少なくとも5pmol/cm2、少なくとも6pmol/cm2、少なくとも7pmol/cm2、少なくとも8pmol/cm2、少なくとも9pmol/cm2、少なくとも10pmol/cm2、少なくとも約15pmol/cm2、少なくとも約19pmol/cm2、少なくとも約20pmol/cm2、少なくとも約25pmol/cm2、少なくとも約30pmol/cm2、少なくとも約35pmol/cm2、少なくとも約40pmol/cm2、少なくとも約45pmol/cm2、少なくとも約50pmol/cm2、少なくとも約55pmol/cm2、少なくとも約60pmol/cm2、少なくとも約65pmol/cm2、少なくとも約70pmol/cm2、少なくとも約75pmol/cm2、少なくとも約80pmol/cm2、少なくとも約85pmol/cm2、少なくとも約90pmol/cm2、少なくとも約95pmol/cm2、少なくとも約100pmol/cm2、少なくとも約125pmol/cm2、少なくとも約150pmol/cm2、少なくとも約175pmol/cm2、少なくとも約200pmol/cm2、少なくとも約250pmol/cm2、少なくとも約300pmol/cm2、少なくとも約350pmol/cm2、少なくとも約400pmol/cm2、少なくとも約450pmol/cm2、少なくとも約500pmol/cm2、少なくとも約550pmol/cm2、少なくとも約600pmol/cm2、少なくとも約650pmol/cm2、少なくとも約700pmol/cm2、少なくとも約750pmol/cm2、少なくとも約800pmol/cm2、少なくとも約850pmol/cm2、少なくとも約900pmol/cm2、少なくとも約950pmol/cm2、少なくとも約1000pmol/cm2以上の表面密度で脂質ナノ粒子コアの外部に結合する方法も提供される。あるいは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドの密度を、LNP-SNAに結合したオリゴヌクレオチドの数によって測定する。LNP-SNAに結合したオリゴヌクレオチドの表面密度に関して、本明細書に記載のLNP-SNAは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合した約1~約2,500個、又は約1~約1,000個、又は約1~約500個のオリゴヌクレオチドを含むことが企図される。様々な実施形態では、LNP-SNAは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に、約10~約500個、又は約10~約450個、又は約10~約400個、又は約10~約300個、又は約10~約200個、又は約10~約190個、又は約10~約180個、又は約10~約170個、又は約10~約160個、又は約10~約150個、又は約10~約140個、又は約10~約130個、又は約10~約120個、又は約10~約110個、又は約10~約100個、又は10~約90個、又は約10~約80個、又は約10~約70個、又は約10~約60個、又は約10~約50個、又は約10~約40個、又は約10~約30個、又は約10~約20個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、LNP-SNAは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に、約80~約500個、又は約80~約400個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、LNP-SNAは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に、少なくとも約5、10、20、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、又は1000個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、LNP-SNAは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に、少なくとも約1、2、3、4、5、10、20、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、127、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、300、400、500、600、700、800、900、又は1000個のオリゴヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる。なお更なる実施形態では、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、200、300、400、500個、又はそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、約400個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、約又は少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600個、若しくはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる。様々な実施形態では、約2~約1000個、又は約2~約500個のオリゴヌクレオチド、又は約100~約1000個のオリゴヌクレオチド、又は約50~約1000個のオリゴヌクレオチド、又は約100~約500個のオリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子コアの外側表面に結合している。更なる実施形態では、約10~約1000個、又は約10~約750個、又は約10~約500個、又は約10~約400個、又は約10~約250個、又は約10~約100個、又は約50~約1000個、又は約50~約750個、又は約50~約500個、又は約50~約250個、又は約100~約1000個、又は約100~約500個、又は約2~約90個、又は約2~約80個、又は約2~約70個、又は約2~約60個、又は約2~約50個、又は約2~約40個、又は約2~約30個、又は約2~約20個、又は約2~約10個、又は約10~約100個、又は約10~約90個、又は約10~約80個、又は約10~約70個、又は約10~約60個、又は約10~約50個、又は約10~約40個、又は約10~約30個、又は約10~約20個、又は約20~約100個、又は約20~約90個、又は約20~約80個、又は約20~約70個、又は約20~約60個、又は約20~約50個、又は約20~約40個、又は約20~約30個のオリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子コアの外側表面に結合している。なお更なる実施形態では、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、又は少なくとも10個のオリゴヌクレオチドが、脂質ナノ粒子コアの外部に結合している。脂質ナノ粒子コアに封入されたオリゴヌクレオチドの密度に関して、本明細書に記載されるLNP-SNAは、脂質ナノ粒子コアに封入された約1~約250個、約1~約220個、約1~約200個、約1~約150個、約1~約120個、約1~約100個、約1~約90個、約1~約80個、約1~約70個、約1~約60個、約1~約50個、約1~約40個、約1~約30個、約1~約20個、約1~約10個、又は約1~約5個のオリゴヌクレオチドを含むことが企図される。更なる実施形態では、本開示のLNP-SNAは、脂質ナノ粒子コアに封入された約10~約250個、約10~約220個、約10~約200個、約10~約150個、約10~約120個、約10~約100個、約10~約90個、約10~約80個、約10~約70個、約10~約60個、約10~約50個、約10~約40個、約10~約30個、又は約10~約20個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、本開示のLNP-SNAは、脂質ナノ粒子コアに封入された約又は少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、120、150、170、200、220、250個若しくはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる。更なる実施形態では、本開示のLNP-SNAは、脂質ナノ粒子コアに封入された2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、120、150、170、200、220、又は250個未満のオリゴヌクレオチドを含む。
スペーサー。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、スペーサーを介して(いくつかの実施形態では、更にリンカーを介して)脂質ナノ粒子コアに結合している。本明細書で使用される「スペーサー」は、ナノ粒子とオリゴヌクレオチドとの間の距離を増加させる、又は複数のコピーでナノ粒子に結合したときに個々のオリゴヌクレオチド間の距離を増加させる役割を果たす部分を意味する。したがって、オリゴヌクレオチドが同じ配列を有するか、又は異なる配列を有するかにかかわらず、スペーサーが、タンデムで個々のオリゴヌクレオチド間に位置することが企図される。
いくつかの態様では、スペーサーは、存在する場合、有機部分である。いくつかの態様では、スペーサーは、水溶性ポリマー、核酸、ポリペプチド、オリゴ糖、炭水化物、脂質、エチルグリコール、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されないポリマーである。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、スペーサーは、オリゴ(エチレングリコール)ベースのスペーサーである。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、1、2、3、4、5、又はそれ以上のスペーサー(例えば、スペーサー-18(ヘキサエチレングリコール))部分を含む。更なる実施形態では、スペーサーはアルカン系スペーサー(例えば、C12)である。いくつかの実施形態では、スペーサーはオリゴヌクレオチドスペーサー(例えば、T5)である。オリゴヌクレオチドスペーサーは、オリゴヌクレオチドが意図する機能を果たす(例えば、免疫応答を刺激する、又は遺伝子発現を阻害する)能力を妨げない任意の配列を有し得る。ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドスペーサーの塩基は、全てのアデニル酸、全てのチミジル酸、全てのシチジル酸、全てのグアニル酸、全てのウリジル酸、又は全ての他のいくつかの修飾塩基である。
様々な実施形態では、スペーサーの長さは、少なくとも約2ヌクレオチド、少なくとも約3ヌクレオチド、少なくとも約4ヌクレオチド、少なくとも約5ヌクレオチド、5~10ヌクレオチド、10ヌクレオチド、20ヌクレオチド、10~30ヌクレオチド、若しくは更には30ヌクレオチド超であるか、又はそれらに等しい。
脂質ナノ粒子コアへのオリゴヌクレオチドの結合。本開示による使用が企図されるオリゴヌクレオチドには、任意の手段(例えば、共有結合又は非共有結合)を通してナノ粒子コアに結合したものが含まれる。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートへの共有結合を介して、脂質ナノ粒子コアの外部に結合している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの10%又は少なくとも10%は、脂質-PEGコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%は、脂質-PEGコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%は、脂質-PEGコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。なお更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%未満は、脂質PEG-コンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドシェル内の1つ以上のオリゴヌクレオチドは、脂質アンカー基を介して脂質ナノ粒子コアの外部に結合している。脂質アンカー基は、様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドの5’又は3’末端に結合している。様々な実施形態では、脂質アンカー基は、コレステロール又はトコフェロールである。
オリゴヌクレオチドが脂質ナノ粒子コアに結合する手段に関係なく、様々な態様での結合は、5’結合、3’結合、ある種の内部結合、又はこれらの結合の任意の組み合わせを通して行われる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に共有結合している。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に非共有結合している。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、共有結合及び非共有結合の組み合わせを介してナノ粒子に結合している。
結合の方法は、当業者に既知であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国公開第2009/0209629号に記載されている。RNAをナノ粒子に結合させる方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるPCT/US2009/65822に一般的に記載されている。オリゴヌクレオチドをリポソーム粒子と会合させる方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2016/0310425号に記載されている。
LNP-SNAの合成
本明細書に記載されるように、本開示のLNP-SNAは、概して、封入されたオリゴヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子コアと、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルと、を含み、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの少なくとも10%が、脂質-PEGコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。したがって、本開示のLNP-SNAは、オリゴヌクレオチドが脂質ナノ粒子コアに封入され、オリゴヌクレオチドのシェルが脂質ナノ粒子コアの外部に結合するように合成される。LNP-SNAの合成は、本明細書(例えば、実施例1)に詳細に記載されており、概して図1に示されている。
本明細書に記載されるように、本開示のLNP-SNAは、概して、封入されたオリゴヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子コアと、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルと、を含み、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの少なくとも10%が、脂質-PEGコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。したがって、本開示のLNP-SNAは、オリゴヌクレオチドが脂質ナノ粒子コアに封入され、オリゴヌクレオチドのシェルが脂質ナノ粒子コアの外部に結合するように合成される。LNP-SNAの合成は、本明細書(例えば、実施例1)に詳細に記載されており、概して図1に示されている。
一般に、かつ一例として、脂質ナノ粒子(LNP)は、脂質及びステロールをエタノール中で希釈することによって製剤化されてもよい。封入される核酸は、低pH(例えば、pH4.0)緩衝液中に別々に溶解される。イオン化可能な脂質対封入された核酸の質量比は、所望の範囲内(例えば、20:1~5:1)に維持される。脂質ナノ粒子コアを形成するために、低pH緩衝液中の核酸を所望の体積比(例えば、3:1)でエタノール溶液と急速に混合する。このプロセスでは、低pH緩衝液は、イオン化可能な脂質を正に帯電させ、負に帯電したオリゴヌクレオチドの封入を促進する。混合後、ナノ粒子を1×PBSに対して透析して、エタノール及び残留緩衝液を除去する。最後に、LNPからLNP-SNAを形成するために、1つ以上のオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドと、コンジュゲーション部位を含む脂質-PEGコンジュゲートとの所望の比率(例えば、1:1)でLNPとを混合することによって、脂質ナノ粒子コアの外部に結合させる。
本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、脂質ナノ粒子コアの構成成分は、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、封入されたオリゴヌクレオチド、及び脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートを含む。様々な量の各構成成分を使用して、脂質ナノ粒子コアを生成することができる。いくつかの実施形態では、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアは、LNP-SNA中の総脂質の約50%であるイオン化可能な脂質のモル分率を含む。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、ジリノレイルメチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)である。いくつかの実施形態では、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアは、LNP-SNA中の総脂質の1%~25%、若しくは2%~5%、若しくは5%~20%、若しくは10%~25%、若しくは10%~20%であるか、又は約1%~約25%、若しくは約2%~約5%、若しくは約5%~約20%、若しくは約10%~約25%、若しくは約10%~約20%であるリン脂質のモル分率を含む。更なる実施形態では、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアは、LNP-SNA中の総脂質の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、若しくは25%であるか、少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、若しくは25%であるか、又は約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、若しくは25%未満である、リン脂質のモル分率を含む。いくつかの実施形態では、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアは、LNP-SNA中の総脂質の3.5%であるか、又は約3.5%であるリン脂質のモル分率を含む。様々な実施形態では、リン脂質は、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジヘキサデカノイルホスファチジルコリン(DPPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、リン脂質は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)である。いくつかの実施形態では、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態では、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアは、LNP-SNA中の総脂質の約20%~約50%、又は約25%~約45%、又は約20%~約35%、又は約20%~約30%、又は約25%~約35%であるステロールのモル分率を含む。更なる実施形態では、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアは、LNP-SNA中の総脂質の20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、若しくは50%であるか、少なくとも約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、若しくは50%であるか、又は約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、若しくは50%未満である、ステロールのモル分率を含む。いくつかの実施形態では、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアは、45%であるか、又は少なくとも約45%であるか、又は約45%未満であるステロールモル分率を含む。いくつかの実施形態では、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態では、LNP-SNAは、LNP-SNA中の総脂質の45%であるか、又は約45%であるコレステロールのモル分率を含む。いくつかの実施形態では、脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートは、2000ダルトン(Da)のポリエチレングリコールを含む。更なる実施形態では、脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートは、脂質-PEG-マレイミドである。なお更なる実施形態では、脂質-PEG-マレイミドは、2000Daのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた1,2-ジパルミトリル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPPE)、2000Daのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE)、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、LNP-SNAは、LNP-SNA中の総脂質の約1%~約5%、又は約1%~約4%、又は約1.5%~約5%、又は約1.5%~約4%、又は約1%~約3.5%、又は約1.5%~約3%、又は約1%~約2%、又は約1%~約2.5%である脂質-PEGコンジュゲートのモル分率を含む。更なる実施形態では、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアは、LNP-SNA中の総脂質の1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、若しくは5%であるか、少なくとも約1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、若しくは5%であるか、又は約1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、若しくは5%未満である、脂質-PEGコンジュゲートのモル分率を含む。いくつかの実施形態では、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアは、1.5%であるか、少なくとも約1.5%であるか、又は約1.5%未満である脂質-PEGコンジュゲートのモル分率を含む。いくつかの実施形態では、脂質-PEGコンジュゲートは、2000Daのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE)である。いくつかの実施形態では、LNP-SNA中のイオン化可能な脂質と封入されたオリゴヌクレオチドとの間の質量比は、約5:1である。更なる実施形態では、LNP-SNA中のイオン化可能な脂質と封入されたオリゴヌクレオチドとの質量比は、約20:1、15:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、又は1:1である。
遺伝子調節/療法におけるLNP-SNAの使用
本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、本明細書に開示されるLNP-SNAは、遺伝子発現を調節する能力を有することが企図される。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のLNP-SNAは、脂質ナノ粒子コアと、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルとを含み、オリゴヌクレオチドのシェルは、遺伝子調節活性(例えば、標的遺伝子発現の阻害又は標的細胞認識)を有する1つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、本明細書に記載の阻害性オリゴヌクレオチドである1つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアに封入されている。いくつかの実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアに封入され、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、阻害性オリゴヌクレオチドである1つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子産物の発現を阻害する方法を提供し、そのような方法は、標的遺伝子産物の発現が、LNP-SNAの不在下での遺伝子産物の発現と比較して、約5%若しくは少なくとも約5%、約10%若しくは少なくとも約10%、約15%若しくは少なくとも約15%、約20%若しくは少なくとも約20%、約25%若しくは少なくとも約25%、約30%若しくは少なくとも約30%、約35%若しくは少なくとも約35%、約40%若しくは少なくとも約40%、約45%若しくは少なくとも約45%、約50%若しくは少なくとも約50%、約55%若しくは少なくとも約55%、約60%若しくは少なくとも約60%、約65%若しくは少なくとも約65%、約70%若しくは少なくとも約70%、約75%若しくは少なくとも約75%、約80%若しくは少なくとも約80%、約85%若しくは少なくとも約85%、約90%若しくは少なくとも約90%、約95%若しくは少なくとも約95%、約96%若しくは少なくとも約96%、約97%若しくは少なくとも約97%、約98%若しくは少なくとも約98%、約99%若しくは少なくとも約99%、又は100%阻害される方法を含む。言い換えれば、提供される方法は、本質的に標的遺伝子産物の発現のあらゆる程度の阻害をもたらすものを包含する。
本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、本明細書に開示されるLNP-SNAは、遺伝子発現を調節する能力を有することが企図される。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のLNP-SNAは、脂質ナノ粒子コアと、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルとを含み、オリゴヌクレオチドのシェルは、遺伝子調節活性(例えば、標的遺伝子発現の阻害又は標的細胞認識)を有する1つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、本明細書に記載の阻害性オリゴヌクレオチドである1つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアに封入されている。いくつかの実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアに封入され、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、阻害性オリゴヌクレオチドである1つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子産物の発現を阻害する方法を提供し、そのような方法は、標的遺伝子産物の発現が、LNP-SNAの不在下での遺伝子産物の発現と比較して、約5%若しくは少なくとも約5%、約10%若しくは少なくとも約10%、約15%若しくは少なくとも約15%、約20%若しくは少なくとも約20%、約25%若しくは少なくとも約25%、約30%若しくは少なくとも約30%、約35%若しくは少なくとも約35%、約40%若しくは少なくとも約40%、約45%若しくは少なくとも約45%、約50%若しくは少なくとも約50%、約55%若しくは少なくとも約55%、約60%若しくは少なくとも約60%、約65%若しくは少なくとも約65%、約70%若しくは少なくとも約70%、約75%若しくは少なくとも約75%、約80%若しくは少なくとも約80%、約85%若しくは少なくとも約85%、約90%若しくは少なくとも約90%、約95%若しくは少なくとも約95%、約96%若しくは少なくとも約96%、約97%若しくは少なくとも約97%、約98%若しくは少なくとも約98%、約99%若しくは少なくとも約99%、又は100%阻害される方法を含む。言い換えれば、提供される方法は、本質的に標的遺伝子産物の発現のあらゆる程度の阻害をもたらすものを包含する。
阻害の程度は、体液試料若しくは生検試料から、又は当技術分野において周知の画像化技術により、インビボで決定される。あるいは、阻害の程度は、一般に、特定のタイプのLNP-SNA及び特定のオリゴヌクレオチドの使用から生じるインビボで予想され得る阻害の程度の予測可能な尺度として、細胞培養アッセイにおいて決定される。
したがって、遺伝子調節療法において本開示のLNP-SNAを利用する方法が提供される。この方法は、遺伝子産物をコードする標的ポリヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドの全部又は一部に相補的なLNP-SNAの1つ以上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップを含み、標的ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイズは、遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な程度の相補性で標的ポリヌクレオチドの長さにわたって生じる。遺伝子発現の阻害は、インビボ又はインビトロで生じ得る。
様々な実施形態では、本開示の方法で利用される阻害性オリゴヌクレオチドは、RNA、DNA、又はそれらの修飾形態である。様々な実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスDNA、低分子干渉RNA(siRNA)、アプタマー、短いヘアピンRNA(shRNA)、DNAザイム、又はアプタザイムである。
免疫調節におけるLNP-SNAの使用
Toll様受容体(TLR)は、センチネル細胞で発現されるタンパク質のクラスであり、自然免疫系の調節に重要な役割を果たす。哺乳類の免疫系は、感染症と戦うために2つの一般的な戦略を使用する。病原体への曝露は、免疫刺激性サイトカイン、ケモカイン、及び多反応性IgM抗体の産生によって特徴付けられる自然免疫応答を急速に引き起こす。自然免疫系は、多様な感染性微生物群によって発現される病原体関連分子パターン(PAMP)への曝露によって活性化される。PAMPの認識は、受容体のToll様ファミリーのメンバーによって媒介される。特定のオリゴヌクレオチドに応答するTLR4、TLR8、及びTLR9などのTLR受容体は、エンドソームと呼ばれる特別な細胞内区画内に存在する。TLR4、TLR8、及びTLR9受容体の調節機構は、例えば、限定されないが、DNA-タンパク質相互作用に基づいている。
Toll様受容体(TLR)は、センチネル細胞で発現されるタンパク質のクラスであり、自然免疫系の調節に重要な役割を果たす。哺乳類の免疫系は、感染症と戦うために2つの一般的な戦略を使用する。病原体への曝露は、免疫刺激性サイトカイン、ケモカイン、及び多反応性IgM抗体の産生によって特徴付けられる自然免疫応答を急速に引き起こす。自然免疫系は、多様な感染性微生物群によって発現される病原体関連分子パターン(PAMP)への曝露によって活性化される。PAMPの認識は、受容体のToll様ファミリーのメンバーによって媒介される。特定のオリゴヌクレオチドに応答するTLR4、TLR8、及びTLR9などのTLR受容体は、エンドソームと呼ばれる特別な細胞内区画内に存在する。TLR4、TLR8、及びTLR9受容体の調節機構は、例えば、限定されないが、DNA-タンパク質相互作用に基づいている。
本明細書に記載されるように、細菌DNAに見られるものと同様のCpGモチーフを含有する合成免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、TLR受容体の同様の応答を刺激する。したがって、本開示のCpGオリゴヌクレオチドは、TLRアゴニストとして機能する能力を有する。本開示によって企図される他のTLRアゴニストには、一本鎖RNA及び小分子(例えば、R848(レシキモド))が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、免疫調節オリゴヌクレオチドには、免疫不全及びがんの治療など、様々な有望な治療用途がある。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のLNP-SNAは、toll様受容体(TLR)の活性を調節する方法で使用される。
更なる実施形態では、本開示のLNP-SNAは、TLRアンタゴニストであるオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、TLRアンタゴニストは一本鎖DNA(ssDNA)である。
いくつかの実施形態では、免疫系の下方調節は、Toll様受容体の発現に関与する遺伝子のノックダウンを伴う。このアンチセンスアプローチは、任意のtoll様タンパク質の発現を阻害するための本開示のLNP-SNAの使用を伴う。
したがって、いくつかの実施形態では、toll様受容体を調節するために本明細書に記載のLNP-SNAを利用する方法が開示される。本方法は、それぞれ、TLRアゴニスト又はTLRアンタゴニストを使用して、Toll様受容体活性を上方調節又は下方調節するかのいずれかである。本方法は、toll様受容体を有する細胞を本開示のLNP-SNAと接触させ、それによってtoll様受容体の活性及び/又は発現を調節することを含む。調節されるtoll様受容体には、toll様受容体1、toll様受容体2、toll様受容体3、toll様受容体4、toll様受容体5、toll様受容体6、toll様受容体7、toll様受容体8、toll様受容体9、toll様受容体10、toll様受容体11、toll様受容体12、及び/又はtoll様受容体13のうちの1つ以上が含まれる。
障害を治療するためのLNP-SNAの使用
いくつかの実施形態では、本開示のLNP-SNAは、障害を治療するために使用される。本明細書で使用される場合、「治療する(treat)」又は「治療すること(treating)」とは、障害又はその1つ以上の症状を排除、軽減、又は改善することを意味する。したがって、いくつかの態様では、本開示は、障害を治療する方法であって、有効量の本開示のLNP-SNAを、それを必要とする対象(例えば、ヒト対象)に投与することを含み、投与することにより、障害を治療する、方法を提供する。様々な実施形態では、障害は、がん、感染症、自己免疫疾患、又はそれらの組み合わせである。LNP-SNAの「有効量」は、例えば、遺伝子編集に影響を及ぼし、遺伝子発現を阻害し、かつ/又は自然免疫応答を活性化するのに十分な量である。したがって、先天性免疫応答を活性化する方法も本明細書で企図され、かかる方法は、本開示のLNP-SNAを、対象における先天性免疫応答を活性化するのに有効な量で、それを必要とする対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のLNP-SNAは、障害を治療するために使用される。本明細書で使用される場合、「治療する(treat)」又は「治療すること(treating)」とは、障害又はその1つ以上の症状を排除、軽減、又は改善することを意味する。したがって、いくつかの態様では、本開示は、障害を治療する方法であって、有効量の本開示のLNP-SNAを、それを必要とする対象(例えば、ヒト対象)に投与することを含み、投与することにより、障害を治療する、方法を提供する。様々な実施形態では、障害は、がん、感染症、自己免疫疾患、又はそれらの組み合わせである。LNP-SNAの「有効量」は、例えば、遺伝子編集に影響を及ぼし、遺伝子発現を阻害し、かつ/又は自然免疫応答を活性化するのに十分な量である。したがって、先天性免疫応答を活性化する方法も本明細書で企図され、かかる方法は、本開示のLNP-SNAを、対象における先天性免疫応答を活性化するのに有効な量で、それを必要とする対象に投与することを含む。
本開示のLNP-SNAは、非経口投与、筋肉内注射、皮下注射、皮内投与、及び/又は経口若しくは鼻腔内などの粘膜投与などの任意の好適な経路を介して投与することができる。追加の投与経路には、静脈内、腹腔内、鼻腔内投与、膣内、直腸内、及び経口投与が挙げられるが、これらに限定されない。異なる投与経路の別々又は同時の組み合わせも、本開示によって企図される。
検出におけるLNP-SNAの使用
いくつかの実施形態では、本開示のLNP-SNAはナノフレア技術に有用である。ナノフレアは、生細胞内の標的分子レベルの蛍光検出のためのポリヌクレオチド官能化ナノ粒子との関連で以前に記載されている(米国特許出願公開第2010/0129808号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。このシステムでは、「フレア」は検出可能に標識され、いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖(又は一本鎖オリゴヌクレオチドの一部)であり、検出可能なマーカーで標識され、入ってくる標的ポリヌクレオチドによってLNP-SNAから置換又は放出される。したがって、ナノフレア技術は、本明細書に記載のLNP-SNAの関連において有用であることが企図される。
いくつかの実施形態では、本開示のLNP-SNAはナノフレア技術に有用である。ナノフレアは、生細胞内の標的分子レベルの蛍光検出のためのポリヌクレオチド官能化ナノ粒子との関連で以前に記載されている(米国特許出願公開第2010/0129808号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。このシステムでは、「フレア」は検出可能に標識され、いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖(又は一本鎖オリゴヌクレオチドの一部)であり、検出可能なマーカーで標識され、入ってくる標的ポリヌクレオチドによってLNP-SNAから置換又は放出される。したがって、ナノフレア技術は、本明細書に記載のLNP-SNAの関連において有用であることが企図される。
組成物
本開示はまた、本開示のLNP-SNA、又はその複数を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。「担体」という用語は、本明細書に記載されるSNAが対象に投与されるビヒクルを指す。本開示によるLNP-SNAと互換性のある任意の従来の媒体又は薬剤を使用することができる。担体という用語は、希釈剤、賦形剤、補助剤、及びそれらの組み合わせを包含する。
本開示はまた、本開示のLNP-SNA、又はその複数を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。「担体」という用語は、本明細書に記載されるSNAが対象に投与されるビヒクルを指す。本開示によるLNP-SNAと互換性のある任意の従来の媒体又は薬剤を使用することができる。担体という用語は、希釈剤、賦形剤、補助剤、及びそれらの組み合わせを包含する。
治療剤
本明細書で提供するLNP-SNAは、任意選択で、治療剤、又はその複数を更に含む。治療剤は、様々な実施形態では、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに単純に会合しており、かつ/又は治療剤はLNP-SNAの脂質ナノ粒子コアに会合しており、かつ/又は治療剤はLNP-SNAの脂質ナノ粒子コアに封入されている。いくつかの実施形態では、治療剤は、脂質ナノ粒子コアに結合していないオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの末端に会合している(例えば、オリゴヌクレオチドがその3’末端を介して脂質ナノ粒子コアに結合している場合、治療剤はオリゴヌクレオチドの5’末端に会合している)。あるいは、いくつかの実施形態では、治療剤は、脂質ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの末端に会合している(例えば、オリゴヌクレオチドがその3’末端を介して脂質ナノ粒子コアに結合している場合、治療剤はオリゴヌクレオチドの3’末端に会合している)。いくつかの実施形態では、治療剤は、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドと共有結合的に会合している。いくつかの実施形態では、治療剤は、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドと非共有結合的に会合している。しかしながら、本開示は、1つ以上の治療剤が、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドと共有結合及び非共有結合の両方で会合しているLNP-SNAを提供することを理解されたい。また、非共有結合的な会合には、ハイブリダイゼーション、タンパク質結合、及び/又は疎水性相互作用が含まれることも理解されるであろう。いくつかの実施形態では、治療剤は、本開示のLNP-SNAとは別個に投与される。したがって、いくつかの実施形態では、治療剤は、障害を治療するために、本開示のLNP-SNAの前、後、又は同時に投与される。
本明細書で提供するLNP-SNAは、任意選択で、治療剤、又はその複数を更に含む。治療剤は、様々な実施形態では、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに単純に会合しており、かつ/又は治療剤はLNP-SNAの脂質ナノ粒子コアに会合しており、かつ/又は治療剤はLNP-SNAの脂質ナノ粒子コアに封入されている。いくつかの実施形態では、治療剤は、脂質ナノ粒子コアに結合していないオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの末端に会合している(例えば、オリゴヌクレオチドがその3’末端を介して脂質ナノ粒子コアに結合している場合、治療剤はオリゴヌクレオチドの5’末端に会合している)。あるいは、いくつかの実施形態では、治療剤は、脂質ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの末端に会合している(例えば、オリゴヌクレオチドがその3’末端を介して脂質ナノ粒子コアに結合している場合、治療剤はオリゴヌクレオチドの3’末端に会合している)。いくつかの実施形態では、治療剤は、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドと共有結合的に会合している。いくつかの実施形態では、治療剤は、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドと非共有結合的に会合している。しかしながら、本開示は、1つ以上の治療剤が、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドと共有結合及び非共有結合の両方で会合しているLNP-SNAを提供することを理解されたい。また、非共有結合的な会合には、ハイブリダイゼーション、タンパク質結合、及び/又は疎水性相互作用が含まれることも理解されるであろう。いくつかの実施形態では、治療剤は、本開示のLNP-SNAとは別個に投与される。したがって、いくつかの実施形態では、治療剤は、障害を治療するために、本開示のLNP-SNAの前、後、又は同時に投与される。
本開示によって企図される治療剤には、タンパク質(例えば、治療用タンパク質)、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、抗体又は抗体断片、小分子、ペプチド、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、化学療法剤、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「小分子」という用語は、化学化合物若しくは薬物、又は天然若しくは合成のいずれかの任意の他の低分子量有機化合物を指す。「低分子量」とは、1500ダルトン未満、典型的には100~700ダルトンの分子量を有する化合物を意味する。
検出可能なマーカー
本開示の態様又は実施形態のいずれにおいても、オリゴヌクレオチド(例えば、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内の1つ以上のオリゴヌクレオチド、及び/又はLNP-SNAの脂質ナノ粒子コアに封入された1つ以上のオリゴヌクレオチド)は、検出可能なマーカー(例えば、フルオロフォア及び/又は放射性標識)を含む。検出可能なマーカーをオリゴヌクレオチド又はナノ粒子コアに結合させる方法は、当技術分野において既知である。
本開示の態様又は実施形態のいずれにおいても、オリゴヌクレオチド(例えば、LNP-SNAの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内の1つ以上のオリゴヌクレオチド、及び/又はLNP-SNAの脂質ナノ粒子コアに封入された1つ以上のオリゴヌクレオチド)は、検出可能なマーカー(例えば、フルオロフォア及び/又は放射性標識)を含む。検出可能なマーカーをオリゴヌクレオチド又はナノ粒子コアに結合させる方法は、当技術分野において既知である。
いくつかの実施形態では、検出可能なマーカーは、脂質ナノ粒子コアと会合される。例えば、限定されないが、本開示の脂質ナノ粒子コアは、フルオロフォアで標識され得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子コア、脂質ナノ粒子コアの外部に結合した1つ以上のオリゴヌクレオチド、及び/又は脂質ナノ粒子コア内に封入された1つ以上のオリゴヌクレオチドの両方は、フルオロフォアを含み、フルオロフォアは全て同じであり得るか、又は1つ以上のフルオロフォアが異なる場合がある。
参考文献
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12.)Akinc,A.;Zumbuehl,A.;Goldberg,M.;Leshchiner,E.S.;Busini,V.;Hossain,N.;Bacallado,S.A.;Nguyen,D.N.;Fuller,J.;Alvarez,R.;Borodovsky,A.;Borland,T.;Constien,R.;De Fougerolles,A.;Dorkin,J.R.;Narayanannair Jayaprakash,K.;Jayaraman,M.;John,M.;Koteliansky,V.;Manoharan,M.;Nechev,L.;Qin,J.;Racie,T.;Raitcheva,D.;Rajeev,K.G.;Sah,D.W.Y.;Soutschek,J.;Toudjarska,I.;Vornlocher,H.P.;Zimmermann,T.S.;Langer,R.;Anderson,D.G.A Combinatorial Library of Lipid-like Materials for Delivery of RNAi Therapeutics.Nat.Biotechnol.2008,26(5),561-569.
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17.)Lokugamage,M.P.;Sago,C.D.;Gan,Z.;Krupczak,B.R.;Dahlman,J.E.Constrained Nanoparticles Deliver SiRNA and SgRNA to T Cells In Vivo without Targeting Ligands.Adv.Mater.2019,31(41),1902251.
18.)Patel,S.;Ashwanikumar,N.;Robinson,E.;Xia,Y.;Mihai,C.;Griffith III,J.P.;Hou,S.;Esposito,A.A.;Ketova,T.;Welsher,K.;Joyal,J.L.;Almarsson,O.;Sahay,G.Naturally occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA.Nat.Comm.2020,11.
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22.)Cheng et al.,Selective organ targeting(SORT)nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing.Nature Nanotechnology 15:313-320(2020)
23.)Lokugamage et al.,Constrained nanoparticles deliver siRNA and sgRNA to T cells in vivo without targeting ligands.Advanced Materials 31(41):e1902251
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10.)Jayaraman,M.;Ansell,S.M.;Mui,B.L.;Tam,Y.K.;Chen,J.;Du,X.;Butler,D.;Eltepu,L.;Matsuda,S.;Narayanannair,J.K.;Rajeev,K.G.;Hafez,I.M.;Akinc,A.;Maier,M.A.;Tracy,M.A.;Cullis,P.R.;Madden,T.D.;Manoharan,M.;Hope,M.J.Maximizing the Potency of SiRNA Lipid Nanoparticles for Hepatic Gene Silencing in Vivo.Angew.Chemie-Int.Ed.2012,51(34),8529-8533.
11.)Love,K.T.;Mahon,K.P.;Levins,C.G.;Whitehead,K.A.;Querbes,W.;Dorkin,J.R.;Qin,J.;Cantley,W.;Qin,L.L.;Racie,T.;Frank-Kamenetsky,M.;Yip,K.N.;Alvarez,R.;Sah,D.W.Y.;De Fougerolles,A.;Fitzgerald,K.;Koteliansky,V.;Akinc,A.;Langer,R.;Anderson,D.G.Lipid-like Materials for Low-Dose,in Vivo Gene Silencing.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2010,107(5),1864-1869.
12.)Akinc,A.;Zumbuehl,A.;Goldberg,M.;Leshchiner,E.S.;Busini,V.;Hossain,N.;Bacallado,S.A.;Nguyen,D.N.;Fuller,J.;Alvarez,R.;Borodovsky,A.;Borland,T.;Constien,R.;De Fougerolles,A.;Dorkin,J.R.;Narayanannair Jayaprakash,K.;Jayaraman,M.;John,M.;Koteliansky,V.;Manoharan,M.;Nechev,L.;Qin,J.;Racie,T.;Raitcheva,D.;Rajeev,K.G.;Sah,D.W.Y.;Soutschek,J.;Toudjarska,I.;Vornlocher,H.P.;Zimmermann,T.S.;Langer,R.;Anderson,D.G.A Combinatorial Library of Lipid-like Materials for Delivery of RNAi Therapeutics.Nat.Biotechnol.2008,26(5),561-569.
13.)Sago,C.D.;Lokugamage,M.P.;Islam,F.Z.;Krupczak,B.R.;Sato,M.;Dahlman,J.E.Nanoparticles That Deliver RNA to Bone Marrow Identified by in Vivo Directed Evolution.J.Am.Chem.Soc.2018,140(49),17095-17105.
14.)Cheng,Q.;Wei,T.;Farbiak,L.;Johnson,L.T.;Dilliard,S.A.;Siegwart,D.J.Selective Organ Targeting(SORT)Nanoparticles for Tissue-Specific MRNA Delivery and CRISPR-Cas Gene Editing.Nat.Nanotechnol.2020,1-8.
15.)Chinen,A.B.;Guan,C.M.;Mirkin,C.A.Spherical Nucleic Acid Nanoparticle Conjugates Enhance G-Quadruplex Formation and Increase Serum Protein Interactions.Angew.Chemie-Int.Ed.2015,54(2),527-531.
16.)Akinc,A.;Querbes,W.;De,S.;Qin,J.;Frank-Kamenetsky,M.;Jayaprakash,K.N.;Jayaraman,M.;Rajeev,K.G.;Cantley,W.L.;Dorkin,J.R.;Butler,J.S.;Qin,L.;Racie,T.;Sprague,A.;Fava,E.;Zeigerer,A.;Hope,M.J.;Zerial,M.;Sah,D.W.;Fitzgerald,K.;Tracy,M.A.;Manoharan,M.;Koteliansky,V.;Fougerolles,A.De;Maier,M.A.Targeted Delivery of RNAi Therapeutics with Endogenous and Exogenous Ligand-Based Mechanisms.Mol.Ther.2010,18(7),1357-1364.
17.)Lokugamage,M.P.;Sago,C.D.;Gan,Z.;Krupczak,B.R.;Dahlman,J.E.Constrained Nanoparticles Deliver SiRNA and SgRNA to T Cells In Vivo without Targeting Ligands.Adv.Mater.2019,31(41),1902251.
18.)Patel,S.;Ashwanikumar,N.;Robinson,E.;Xia,Y.;Mihai,C.;Griffith III,J.P.;Hou,S.;Esposito,A.A.;Ketova,T.;Welsher,K.;Joyal,J.L.;Almarsson,O.;Sahay,G.Naturally occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA.Nat.Comm.2020,11.
19.)Wang et al.,Delivery of oligonucleotides with lipid nanoparticles.Advanced Drug Delivery Reviews 87:68-80(2015)
20.)Alfagih et al.,Nanoparticles as adjuvants and nanodelivery systems for mRNA-based vaccines.Pharmaceutics 13:45(1-27)(2021).
21.)Veiga et al.,Targeted lipid nanoparticles for RNA therapeutics and immunomodulation in leukocytes.Advanced Drug Delivery Reviews 159:364-376(2020).
22.)Cheng et al.,Selective organ targeting(SORT)nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing.Nature Nanotechnology 15:313-320(2020)
23.)Lokugamage et al.,Constrained nanoparticles deliver siRNA and sgRNA to T cells in vivo without targeting ligands.Advanced Materials 31(41):e1902251
以下の実施例は、単に本開示を例示するために与えられたものであり、その範囲を限定するために与えられたものではない。
実施例1
脂質ナノ粒子(LNP)を形成するために、構造の成分を20~80mMの総濃度でエタノールに溶解した。これらの成分は、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質-PEG-マレイミドの4つの異なるクラスに分類される。各ナノ粒子構造は、各クラスから1つの成分から構成された。各成分のモル分率は、イオン化可能な脂質、50%;リン脂質、1.4~23.5%;ステロール、25~45%;脂質-PEG-マレイミド、1.5~3.5%であった。使用したイオン化可能な脂質は、ジリノレイルメチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)であった。使用したリン脂質は、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、及び1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)であった。使用したステロールはコレステロールであった。使用した脂質-PEG-マレイミドは、2000Daのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた1,2-ジパルミトリル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPPE)及び1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE)であった。封入される核酸は、pH4.0で10mMのクエン酸ナトリウム緩衝液に溶解した。イオン化可能な脂質と使用された核酸との間で使用された質量比は、5:1であった。核酸を封入するために、核酸を、ピペット先端を使用して、3:1の体積比でエタノール中のLNP成分と混合した(図1)。混合後、LNPを、3000Daの分子量カットオフ膜中のリン酸緩衝生理食塩水に対して2時間透析した。
脂質ナノ粒子(LNP)を形成するために、構造の成分を20~80mMの総濃度でエタノールに溶解した。これらの成分は、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質-PEG-マレイミドの4つの異なるクラスに分類される。各ナノ粒子構造は、各クラスから1つの成分から構成された。各成分のモル分率は、イオン化可能な脂質、50%;リン脂質、1.4~23.5%;ステロール、25~45%;脂質-PEG-マレイミド、1.5~3.5%であった。使用したイオン化可能な脂質は、ジリノレイルメチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)であった。使用したリン脂質は、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、及び1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)であった。使用したステロールはコレステロールであった。使用した脂質-PEG-マレイミドは、2000Daのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた1,2-ジパルミトリル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPPE)及び1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE)であった。封入される核酸は、pH4.0で10mMのクエン酸ナトリウム緩衝液に溶解した。イオン化可能な脂質と使用された核酸との間で使用された質量比は、5:1であった。核酸を封入するために、核酸を、ピペット先端を使用して、3:1の体積比でエタノール中のLNP成分と混合した(図1)。混合後、LNPを、3000Daの分子量カットオフ膜中のリン酸緩衝生理食塩水に対して2時間透析した。
脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)は、透析LNPの表面上の脂質-PEG-マレイミドにスルフヒドリル末端DNA配列をコンジュゲートすることから形成された。1-O-ジメトキシトリチル-プロピル-ジスルフィド上で合成されたDNAを、pH8.3~8.5で100mMの1,4-ジチオスレイトール(DTT)を使用して、1’-スクシニル-lcaa-CPGを還元して3’スルフヒドリル基を形成した。
Sephadex G-25カラムを使用してDTTを除去した後、1当量のDNAをLNPと混合し、室温で2時間振盪して、pH7.2~7.6のリン酸緩衝生理食塩水中にLNP-SNAを形成した。LNP-SNAの直径及び構造は、ナノ粒子追跡分析及び低温電子顕微鏡を用いて確認した(図2)。
LNPとの反応後、アガロースゲル上でDNA移動度を低下させ、コンジュゲーションを確認し(図3)、細胞アッセイにおけるdsDNA及びsiRNA送達に関連して、LNP-SNA活性を評価した。cGAS-STING経路の活性化に応答するように設計されたRaw264.7細胞株では、LNP-SNAは、2’3’-cGAMP(4.75μM)及び遊離DNAと比較して、28.1nMの臨界濃度を示し、活性化を示さなかった(図4A)。ルシフェラーゼ(Luc2)を発現するU87細胞株において、siLuc2送達を、LNP-SNA媒介遺伝子サイレンシングのための概念実証として使用した。siLuc2を含有するLNP-SNAは、siGFP対照LNP-SNAと比較して、25~50nMの濃度でLuc2発現を約90%サイレント化した(図4B)。同等のLNP構造と比較して、LNP-SNAは、U87-Luc2細胞株において、50nM及び100nMの濃度で約5%多くLuc2をサイレント化する(図4C)。
C57BL/6マウスにおいて、LNP-SNAの機能及び標的化を評価した。LNP-SNA及び同等のLNPを、ルシフェラーゼmRNAを用いて製剤化した。尾静脈を介したmRNAの0.1mgkg-1注射後、6時間後に発光を評価した。LNP-SNAは、脾臓特異的なmRNA発現を示し、肝臓では検出可能な発現を示さなかった(図5)。対照的に、LNPは、肝臓において高い程度のmRNA発現、及び脾臓においてLNP-SNAと同様のレベルの発現を示し、オフターゲット肝毒性のより大きな可能性を示した。図5は、SNAの表面上のDNA配列の存在が、mRNAの発現が観察されるところで変化することを示す。同等のLNPの送達を変更することに加えて、送達は、表面DNAの配列組成を変更することによって調整することができる。図6は、表面GリッチDNA配列を有するLNP-SNAとTリッチDNA配列を有するLNP-SNAとの間で、mRNAの発現が達成される場所に有意差があることを示す。
材料及び方法
自動化された固体支持体ホスホルアミダイト合成(モデル:MM12,BioAutomation,Inc.)を使用して、DNAを合成した。配列を、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC、Agilent Technologies)によって精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI-ToF、Bruker Autoflex III)を使用して特性評価した。実験に使用されるDNA配列及び脂質ナノ粒子組成物を、以下の表1に列挙する。ホタルルシフェラーゼmRNAは、TriLink BioTechnologiesから購入した。
自動化された固体支持体ホスホルアミダイト合成(モデル:MM12,BioAutomation,Inc.)を使用して、DNAを合成した。配列を、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC、Agilent Technologies)によって精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI-ToF、Bruker Autoflex III)を使用して特性評価した。実験に使用されるDNA配列及び脂質ナノ粒子組成物を、以下の表1に列挙する。ホタルルシフェラーゼmRNAは、TriLink BioTechnologiesから購入した。
DLin-MC3-DMAは、MedChemExpressから購入した。DMPE-PEG(2000)マレイミド、DPPE-PEG(2000)マレイミド、及びDSPE-PEG(2000)マレイミドは、Nanocs,Incから購入した。コレステロール及びTriton(商標)-X-100は、Sigmaから購入した。DOPC、DSPC、18:1DAP、及びDOPEは、Avanti Polar lipidds,Inc.から購入した。Lipofectamine(商標)2000、Quant-iT(商標)PicoGreen(商標)dsDNA試薬、Quant-iT(商標)RiboGreen(商標)試薬、並びに20倍TE緩衝液は、ThermoFisherから購入した。D-ルシフェリンは、Gold BioTechnologiesから購入し、Luc mRNAは、TriLink BioTechnologiesから購入した。
LNP-SNA製剤。LNPを、エタノール希釈法を使用して製剤化した[Cheng et al.,Dendrimer-Based Lipid Nanoparticles Deliver Therapeutic FAH mRNA to Normalize Liver Function and Extend Survival in a Mouse Model of Hepatorenal Tyrosinemia Type I.Advanced Materials 30(52):e1805308(2018)]。手短に言えば、脂質及びコレステロールを100%エタノール中に溶解した。dsDNAを、5.0のイオン化可能な脂質:dsDNAの質量比で、pH4.0で10mMのクエン酸塩中に溶解した。両方の溶液を作製した後、DNAを、3:1の体積比でエタノール溶液と急速にピペット混合した。混合後、NPを、Pierce(商標)3K MWCO微小透析プレート(ThermoFisher)内で、1×PBSに対して60分間、2回透析した。続いて、1当量の凍結乾燥チオール末端のDNA配列を含有する微量遠心管にNPを添加し、700rpm、室温で一晩振盪して、マレイミド官能性PEG脂質とスルフヒドリル末端のDNAとの反応を容易にした。
LNP-SNAの特性評価。LNP-SNAサイズ及びナノ粒子濃度は、NanoSight試料アシスタントを装着したMalvern NanoSight NS300を使用して、ナノ粒子追跡分析(NTA)によって決定した。ナノ粒子を水で1:1000に希釈し、50μL/分でマイクロ流体を通過させた。サイズは、バックグラウンドを回避するために、手動で設定された検出閾値を有するNTAソフトウェアを使用して決定した。dsDNA及びRNAの封入効率は、それぞれ、修正されたQuant-iT(商標)PicoGreen(商標)及びQuant-iT(商標)RiboGreen(商標)(Invitrogen)アッセイによって決定した。簡潔に述べると、封入された核酸を用いて2つの別個の標準曲線を作製した。1つは、1×TE緩衝液中にあり、他方は、0.1%Triton(商標)-X-100を補充した1×TEに含まれた。各ナノ粒子から2つの試料を作製し、1つをTEで希釈し、1つを0.1%Triton(商標)-X-100でTEで希釈した。続いて、1×PicoGreen(商標)(dsDNA)又はRiboGreen(商標)100μLを標準品及び試料の上に添加し、各試料の蛍光をプレートリーダーを使用して測定した。遊離核酸の濃度は、TE標準曲線から決定され、総核酸の濃度は、0.1%Triton(商標)-X-100で溶解された粒子によって決定された。このことから、封入効率は、以下の式から計算された。([Triton-X]-[TE])/([Triton-X])又は([合計]-[遊離])/([合計])。
cGAS-STING経路活性化を測定するための細胞アッセイ。Raw Lucia(商標)ISG(Raw264.7)細胞株は、Invivogenから購入した。インビトロ実験のために、Zeocin(商標)、Normocin(商標)、及びQUANTI-Luc(商標)もInvivogenから購入した。全ての細胞株を、製造業者の仕様に従って培養した。細胞認証は実施されなかった。全ての細胞株をマイコプラズマ汚染について試験し、37℃で5%CO2の加湿雰囲気で増殖させた。
特定のナノ粒子製剤及び対照をOpti-MEM(Gibco)中で希釈し、96ウェルプレート中に三通りでプレーティングした。続いて、細胞を、ウェルあたり100,000個の細胞で、ナノ粒子処置物の上部にプレーティングした。24時間のインキュベーション後、20μLの培地を除去し、IRF3誘導を、メーカーのプロトコルに従って、Quanti-Luc(商標)試薬(Invivogen)を使用して定量した。生存細胞の数を、達成したIRF3誘導量に正規化するために、PrestoBlue(商標)HS細胞透過性生存試薬(Thermo Fisher)を使用した。Quanti-Luc(商標)測定のために20μLの培地を除去した後、プレート内の体積が90μLであるように追加の培地を除去した。1ウェル当たり10μLのPrestoBlue(商標)を添加し、プレートを15分間インキュベートし、その時点で、製造業者のプロトコルに従って蛍光を読み取った。次いで、IRF3誘導(発光)を生存細胞(PrestoBlue(商標)蛍光)に対してウェルごとに基づいて正規化した。
細胞アッセイでsiRNAを送達するLNP-SNA。B16-F10-Luc2及びU87-Luc2細胞株をATCCから入手し、製造元の仕様に従って培養した。siRNA媒介遺伝子サイレンシングを評価するために、cGAS-STING経路スクリーニングからの上位5つのLNP-SNA候補を、siLuc2とともに、siGFPで製剤化された対照LNP-SNAと組み合わせて製剤化した。したがって、遺伝子サイレンシングは、Luc2のサイレンシングによる発光の減少として読み出すことができる。
特定のナノ粒子製剤及びトランスフェクトされたsiRNA対照をOpti-MEM(Gibco)中で希釈し、96ウェルプレート中に三通りでプレーティングした。続いて、細胞を、ウェルあたり50,000個の細胞で、ナノ粒子処置物の上部にプレーティングした。24時間のインキュベーションの後、120μLの培地を除去し、20μLのCellTiter-Fluor(商標)試薬(Promega)を添加して、各ウェル内の生存細胞の数を測定した。37℃で30分間インキュベーションした後、製造業者のプロトコルに従って蛍光を読み取った。その後、ウェルを100uLのPBSで3回洗浄した。Luc2発光は、ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を使用して読み取った。Luc2遺伝子サイレンシングを、CellTiter-Fluor(商標)生存能に正規化された任意の単位で評価した。
動物の取り扱い。8~12週の年齢範囲の雌マウス(C57Bl/6)をJackson Laboratoryから入手し、従来の飼育施設で維持した。使用された全ての動物は、プロトコルIS00010970の下でノースウェスタン大学の動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)によって承認された方法及び手順に従って取り扱った。
ルシフェラーゼ(Luc2)mRNA発現。Cleancap(登録商標)ルシフェラーゼmRNAは、TriLink Biotechnologiesから購入した。マウスに、0.1mgkg-1のmRNA含有製剤の単回ボーラス注射を与えた。6時間後、マウスに150mgkg-1のD-ルシフェリンを腹腔内注射した。続いて、動物を安楽死処分し、主要な臓器を採取し、300μg/mLのD-ルシフェリン溶液に浸した。次いで、IVIS Spectrum機器(Perkin Elmer)を使用して個々の臓器を撮像した。
C14、C16及びC18は、脂質アルキル鎖の長さである。脂質は、以下のように命名される。DMPE-PEG-マレイミド(C14)、DPPE-PEG-マレイミド(C16)、及びDSPE-PEG-マレイミド(C18)。
「T21」とは、配列5’-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT T-3’(配列番号1)を指す。
「GGT7」とは、配列5’-GGTGGTGGTG GTGGTGGTGG T-3’(配列番号2)を指す。
「EE%」は、封入効率を指す。
実施例2
Ai14マウス実験
特定の細胞型の一般的な動物の取り扱い及び単離のためのプロトコル
動物の取り扱い。8~12週の年齢範囲の雌マウス(C57Bl/6J(#000664)及びLSL-Tomato/Ai14(#007914))をJackson Laboratoryから入手し、従来の飼育施設で維持した。使用された全ての動物は、ノースウェスタン大学の動物実験委員会によって承認された方法及び手順に従って取り扱った。
Ai14マウス実験
特定の細胞型の一般的な動物の取り扱い及び単離のためのプロトコル
動物の取り扱い。8~12週の年齢範囲の雌マウス(C57Bl/6J(#000664)及びLSL-Tomato/Ai14(#007914))をJackson Laboratoryから入手し、従来の飼育施設で維持した。使用された全ての動物は、ノースウェスタン大学の動物実験委員会によって承認された方法及び手順に従って取り扱った。
細胞の単離。臓器を採取し、37℃で30分間、5000U/mLのコラゲナーゼIの消化混合物中でインキュベートした。続いて、臓器を約3mmの厚さの小さなスライスに切り刻み、70μmのフィルターを通した。続いて、赤血球を、ACK溶解緩衝液(Thermo-Fisher)を使用して5分間溶解し、細胞をカウントし、2.5%ウシ血清アルブミンを含有するPBS中に再懸濁した。
各臓器に由来する目的の細胞型を、磁気分離を使用して単離した。EasySep(商標)キット(Stemcell(商標)Technologies)を使用して、脾臓マクロファージ及びB細胞を単離した。肝臓B細胞を、同一のEasySep(商標)キットを使用して単離した。200×gでの遠心分離によって肝細胞を単離した。
Ai14マウスについて:Ai14マウスに、Cre mRNAによって0.3mgkg-1の用量でLNP及びLNP-SNAを静脈内に注射した(図7)。図7は、Ai14マウスを使用した細胞集団レベルのゲノム編集のためのアッセイを示す。Ai14マウスは、loxPが導入された(floxed)ストップカセットの下流にtdTomを発現する(図7A)。Creリコンビナーゼの発現は、ストップカセットを除去し、tdTom発現をオンにする。これは、フローサイトメトリーを介して検出することができ、ここではバックグラウンドを上回るtdTomを発現する標的細胞集団の割合が定量化される。これは、tdTom+細胞%として表示される。
注射の2日後、動物を安楽死処分し、目的の細胞型を、上記の細胞単離プロトコルを使用して単離した。個々の細胞集団を調製したら、細胞をフローサイトメーターで実行した。PBS処置マウス上でゲートされ、各細胞型におけるゲノム編集を、検出可能なtdTomato蛍光を有する細胞パーセントの観点から定量化した(図8)。図9は、GGT配列で官能化されたLNP-SNAが、脾臓単球におけるCre mRNAによるゲノム編集を引き起こすことを示す。
DNAバーコード化実験について、
C57BL/6JマウスにおけるLNP-SNAの合成及び投与。LNP-SNA及び裸のLNPの小さなライブラリーを、以下の表2に示す組成物で作製した。各LNP又はLNP-SNAは、各粒子を識別する固有の56塩基DNAバーコードを封入した。各粒子内のバーコードの量を定量化した後、等量のバーコードを0.1mgkg-1の総用量にプールし、C57BL/6Jマウスに注射した。2日間の循環期間の後、上記のプロトコルによって目的の細胞型を磁気分離によって単離し、DNA単離及びシーケンシング(以下に記載)に進んだ。
C57BL/6JマウスにおけるLNP-SNAの合成及び投与。LNP-SNA及び裸のLNPの小さなライブラリーを、以下の表2に示す組成物で作製した。各LNP又はLNP-SNAは、各粒子を識別する固有の56塩基DNAバーコードを封入した。各粒子内のバーコードの量を定量化した後、等量のバーコードを0.1mgkg-1の総用量にプールし、C57BL/6Jマウスに注射した。2日間の循環期間の後、上記のプロトコルによって目的の細胞型を磁気分離によって単離し、DNA単離及びシーケンシング(以下に記載)に進んだ。
DNA単離、及び次世代シーケンシング。目的の細胞タイプでは、Clarity OTX(商標)カラム(Phenomenex)を使用してDNAを単離した。試料を凍結乾燥し、PCR-Cleanupキット(New England Biolabs,Inc.)を使用して洗浄した。続いて、ネステッドPCRを以前のプロトコル[Paunovska,K.;Sago,C.D.;Monaco,C.M.;Hudson,W.H.;Castro,M.G.;Rudoltz,T.G.;Kalathoor,S.;Vanover,D.A.;Santangelo,P.J.;Ahmed,R.;Bryksin,A.V.;Dahlman,J.E.A Direct Comparison of in Vitro and in Vivo Nucleic Acid Delivery Mediated by Hundreds of Nanoparticles Reveals a Weak Correlation.Nano Lett.2018,18(3),2148-2157.https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.8b00432]に従って実施した。ユニバーサルプライマーを使用してバーコード配列を増幅し、続いてアダプター配列を使用して試料をインデックス付けし、Nextera XT化学物質を添加した。Illumina NextSeq(商標)を使用して、試料を配列決定した。
NGSデータの分析。シーケンスファイルは、カスタムRスクリプトを使用して分析した。最初に、読み取りを前処理して、アダプタープライマー配列だけでなく、40塩基未満の読み取りも除外した。次に、20未満の品質スコアを含む読み取りがないように読み取りを処理した。最後に、バーコード配列の逆相補体を検索することによって、各バーコードを各試料内でカウントした。各試料中の各バーコードの読み取り回数を用いて、数値を入力に正規化した。これを使用して、各バーコードからの読み取り回数を最初に注入された回数に正規化した。続いて、送達を「正規化送達」又は試料中の読み取りの総数のパーセンテージとしての各バーコードからの正規化読み取りのパーセンテージとして定量化した。
図10は、(GGT)7外側配列及びDOPEヘルパー脂質が、主要な脾細胞型へのLNP-SNAの増強された送達を可能にしたことを示す。脾臓への送達を、DNAバーコード化技術を使用して評価した。LNP-SNAを56ヌクレオチド長のバーコードでインデックス付けし、図10の左パネルに示される戦略を使用して増幅及びインデックス付けした。LNP及びLNP-SNA構造の送達を、目的の各細胞型に由来する全バーコードリードのパーセントとして評価した。ここで、脾臓におけるLNP-SNAの濃縮は、(GGT)7外側配列を提示し、ヘルパー脂質DOPEを含有することによって達成されたことが見出された。
Claims (75)
- 脂質ナノ粒子コアと、前記脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドのシェルと、を含む脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)であって、
前記脂質ナノ粒子コアが、封入されたオリゴヌクレオチド、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートを含み、
前記オリゴヌクレオチドのシェル内の前記オリゴヌクレオチドの少なくとも10%が、前記脂質-PEGコンジュゲートを介して前記脂質ナノ粒子コアの前記外部に共有結合している、LNP-SNA。 - 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約5~約1000個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項1に記載のLNP-SNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約100~約1000個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項1又は2に記載のLNP-SNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約400個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、約5~約100ヌクレオチド長である、請求項1~4のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、約10~約50ヌクレオチド長である、請求項1~5のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、約25ヌクレオチド長である、請求項1~6のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、同じヌクレオチド配列を有する、請求項1~7のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも2個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項1~7のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、一本鎖、二本鎖DNAオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせから構成される、請求項1~9のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、一本鎖、二本鎖RNAオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせから構成される、請求項1~9のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、一本鎖DNAオリゴヌクレオチド、二本鎖DNAオリゴヌクレオチド、一本鎖RNAオリゴヌクレオチド、二本鎖RNAオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせから構成される、請求項1~9のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドが、標的化オリゴヌクレオチドである、請求項1~12のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、標的化オリゴヌクレオチドである、請求項1~13のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドが、(GGT)nヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、nが、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれ以上である、請求項1~14のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、(GGT)nヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、nが、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれ以上である、請求項1~15のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- nが7である、請求項15又は16に記載のLNP-SNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドが、アプタマーである、請求項1~17のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドが、検出可能なマーカーを含む、請求項1~18のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、阻害性オリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、遺伝子編集因子基質DNA若しくはRNA、又はそれらの組み合わせを含む、請求項1~19のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記阻害性オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA(siRNA)、アプタマー、短いヘアピンRNA(shRNA)、DNAザイム、又はアプタザイムである、請求項20に記載のLNP-SNA。
- 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、CpGモチーフ含有オリゴヌクレオチド、二本鎖DNAオリゴヌクレオチド、又は一本鎖RNAオリゴヌクレオチドである、請求項20又は21に記載のLNP-SNA。
- 前記封入されたオリゴヌクレオチドが、DNA、RNA、又はそれらの組み合わせから構成される、請求項1~22のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記封入されたオリゴヌクレオチドが、阻害性オリゴヌクレオチド、mRNA、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、遺伝子編集因子タンパク質をコードするmRNA、又はDNA若しくはRNA遺伝子編集因子基質である、請求項1~23のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記阻害性オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA(siRNA)、アプタマー、短いヘアピンRNA(shRNA)、DNAザイム、又はアプタザイムである、請求項24に記載のLNP-SNA。
- 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、CpGモチーフ含有オリゴヌクレオチドである、請求項24又は25に記載のLNP-SNA。
- 前記封入されたオリゴヌクレオチドが、約5~約5000ヌクレオチド長である、請求項1~26のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記封入されたオリゴヌクレオチドが、約10~約4500ヌクレオチド長である、請求項1~27のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記封入されたオリゴヌクレオチドが、約1500ヌクレオチド長である、請求項1~28のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記脂質ナノ粒子コアが、複数の封入されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項1~29のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記複数の封入されたオリゴヌクレオチド中の少なくとも1個のオリゴヌクレオチドが、検出可能なマーカーを含む、請求項30に記載のLNP-SNA。
- 前記複数の封入されたオリゴヌクレオチドが、阻害性オリゴヌクレオチド、mRNA、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、遺伝子編集因子タンパク質をコードするmRNA、DNA若しくはRNA遺伝子編集因子基質、又はそれらの組み合わせを含む、請求項30又は31に記載のLNP-SNA。
- 前記阻害性オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉RNA(siRNA)、アプタマー、短いヘアピンRNA(shRNA)、DNAザイム、又はアプタザイムである、請求項32に記載のLNP-SNA。
- 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、CpGモチーフ含有オリゴヌクレオチド、二本鎖DNA(dsDNA)、二本鎖RNA、又は一本鎖RNA(ssRNA)である、請求項32又は33に記載のLNP-SNA。
- 前記複数の封入されたオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドが、約10~約50ヌクレオチド長である、請求項30~32のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記複数の封入されたオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドが、約50ヌクレオチド長である、請求項30~35のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記複数の封入されたオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドが、同じヌクレオチド配列を有する、請求項30~36のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記複数の封入されたオリゴヌクレオチドが、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも2個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項30~36のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記イオン化可能な脂質が、ジリノレイルメチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、C12-200、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)、又はそれらの組み合わせである、請求項1~38のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記イオン化可能な脂質が、ジリノレイルメチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)である、請求項1~39のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記LNP-SNAが、前記LNP-SNA中の総脂質の約50%である前記イオン化可能な脂質のモル分率を含む、請求項1~40のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記リン脂質が、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジヘキサデカノイルホスファチジルコリン(DPPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、又はそれらの組み合わせである、請求項1~41のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記リン脂質が、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)である、請求項1~42のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記LNP-SNAが、前記LNP-SNA中の総脂質の約1%~約25%である前記リン脂質のモル分率を含む、請求項1~43のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記LNP-SNAが、前記LNP-SNA中の総脂質の3.5%であるか、又は約3.5%である前記リン脂質のモル分率を含む、請求項1~44のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記ステロールが、3β-ヒドロキシコレスト-5-エン(コレステロール)、9,10-セココレスタ-5,7,10(19)-トリエン-3β-オール(ビタミンD3)、9,10-セコエルゴスタ-5,7,10(19),22-テトラエン-3β-オール(ビタミンD2)、カルシポトリオール、24-エチル-5,22-コレスタジエン-3β-オール(スチグマステロール)、22,23-ジヒドロスチグマステロール(β-シトステロール)、3,28-ジヒドロキシ-ルペオール(ベツリン)、ルペオール、ウルゾール酸、オレアノール酸、24α-メチルコレステロール(カンペステロール)、24-エチルコレスタ-5,24(28)E-ジエン-3β-オール(フコステロール)、24-メチルコレスタ-5,22-ジエン-3β-オール(ブラシカステロール)、24-メチルコレスタ-5,7,22-トリエン-3β-オール(エルゴステロール)、9,11-デヒドロエルゴステロール、ダウコステロール、又は1つ以上のアミノ酸で修飾された前述のステロールのうちのいずれかである、請求項1~45のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記LNP-SNAが、前記LNP-SNA中の総脂質の約25%~約45%である前記ステロールのモル分率を含む、請求項1~46のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記LNP-SNAが、前記LNP-SNA中の総脂質の45%であるか、又は約45%である前記ステロールのモル分率を含む、請求項1~47のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記ステロールが、コレステロールである、請求項1~48のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記LNP-SNAが、前記LNP-SNA中の総脂質の45%であるか、又は約45%であるコレステロールのモル分率を含む、請求項49に記載のLNP-SNA。
- 前記脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートが、2000ダルトン(Da)のポリエチレングリコールを含む、請求項1~50のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記脂質-ポリエチレングリコール(脂質-PEG)コンジュゲートが、脂質-PEG-マレイミドである、請求項1~51のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記脂質-PEG-マレイミドが、2000Daのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた1,2-ジパルミトリル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPPE)、2000Daのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE)、又はそれらの組み合わせである、請求項52に記載のLNP-SNA。
- 前記LNP-SNAが、前記LNP-SNA中の総脂質の約1.5%~約3.5%である前記脂質-PEGコンジュゲートのモル分率を含む、請求項1~53のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記LNP-SNAが、前記LNP-SNA中の総脂質の1.5%であるか、又は約1.5%である前記脂質-PEGコンジュゲートのモル分率を含む、請求項1~54のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記イオン化可能な脂質と前記封入されたオリゴヌクレオチドとの間の質量比が、約20:1~約5:1である、請求項1~55のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記脂質ナノ粒子コアに封入された治療剤を更に含む、請求項1~56のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記脂質ナノ粒子コアの前記外部に結合した治療剤を更に含む、請求項1~57のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 前記治療剤が、抗体若しくは抗体断片、小分子、ペプチド、抗生物質、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、抗真菌剤、抗ウイルス剤、化学療法剤、又はそれらの組み合わせである、請求項57又は58に記載のLNP-SNA。
- 前記脂質ナノ粒子コアの前記外部に結合した標的化ペプチド、標的化抗体、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項1~59のいずれか一項に記載のLNP-SNA。
- 請求項1~60のいずれか一項に記載の複数の脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)を含む、組成物。
- 治療剤を更に含む、請求項61に記載の組成物。
- 遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを、請求項1~60のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)、又は請求項61若しくは62に記載の組成物とハイブリダイズさせるステップを含む、遺伝子の発現を阻害する方法であって、前記ポリヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドのシェル内の1つ以上のオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイズが、前記遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な程度の相補性で前記ポリヌクレオチドの長さにわたって生じる、方法。
- 前記遺伝子産物の発現が、インビボで阻害される、請求項63に記載の方法。
- 前記遺伝子産物の発現が、インビトロで阻害される、請求項63に記載の方法。
- toll様受容体(TLR)の活性を上方調節するための方法であって、前記toll様受容体を有する細胞を、請求項1~60のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)、又は請求項61若しくは62に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、TLRアゴニストである1つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、請求項66に記載の方法。
- 前記toll様受容体が、toll様受容体1、toll様受容体2、toll様受容体3、toll様受容体4、toll様受容体5、toll様受容体6、toll様受容体7、toll様受容体8、toll様受容体9、toll様受容体10、toll様受容体11、toll様受容体12、toll様受容体13、又はそれらの組み合わせである、請求項66又は67に記載の方法。
- toll様受容体(TLR)の活性を下方調節するための方法であって、前記toll様受容体を有する細胞を、請求項1~60のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)、又は請求項61若しくは62に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
- 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、TLRアンタゴニストである1つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、請求項69に記載の方法。
- 前記toll様受容体が、toll様受容体1、toll様受容体2、toll様受容体3、toll様受容体4、toll様受容体5、toll様受容体6、toll様受容体7、toll様受容体8、toll様受容体9、toll様受容体10、toll様受容体11、toll様受容体12、toll様受容体13、又はそれらの組み合わせである、請求項69又は70に記載の方法。
- インビトロで実施される、請求項66~71のいずれか一項に記載の方法。
- インビボで実施される、請求項66~71のいずれか一項に記載の方法。
- 障害を治療する方法であって、有効量の、請求項1~60のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子球状核酸(LNP-SNA)、又は請求項61若しくは62に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、前記投与することが、前記障害を治療する、方法。
- 前記障害が、がん、感染症、自己免疫疾患、又はそれらの組み合わせである、請求項74に記載の方法。
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