CN109055277A - 一种从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法，将酸性土壤与水混合进行振荡培养，并进行离心分离，弃去上清液，再加入无菌酸性培养液振荡培养，得到菌株混合液；取该菌株混合液作为接种菌。向所述接种菌中加入无菌酸性培养液，进行振荡培养，得到菌株培养液；取该菌株培养液作为接种菌，再以该接种菌重新执行该振荡培养，直至执行6次该振荡培养；吸取第四次、第五次和第六次该振荡培养得到的菌株培养液，并加入到固氮培养基中进行平板涂布培养和斜面培养菌，再进行菌株分离纯化，即得到纯化的嗜酸耐重金属固氮菌。本发明能够快速高效地筛选出适合酸性土壤的嗜酸耐重金属固氮菌，而且能够大幅提高菌株培养获得率和菌株的嗜酸耐重金属能力。
Description
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，尤其涉及一种从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的 方法。
背景技术
长期大量施用化肥会造成土壤酸化，而土壤酸化会促进土壤中有害重金属的溶解释 放，从而会促进作物对重金属的吸收累积，加剧重金属对人体的危害。
目前，利用生物学技术来改善酸化土壤的质量(例如：采用嗜酸耐重金属的生物菌株 改善酸化土壤的质量)是研究的热点方向。土壤微生物具有较强的恢复性，能够用于恢复 酸化土壤中微生物的多样性，改善土壤微生物群落结构，改良土壤功能，因此获得良好的 且能够适应于酸化土壤的菌株十分必要。但是，现有技术中嗜酸耐重金属菌株筛选方法的 筛选效率低、嗜酸耐重金属能力较差，难以满足酸性土壤治理需求。
发明内容
针对现有技术中的上述不足之处，本发明提供了一种从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮 菌的方法，能够快速高效地筛选出适合酸性土壤的嗜酸耐重金属固氮菌，而且能够大幅提 高菌株培养获得率和菌株的嗜酸耐重金属能力，为治理受酸化影响且重金属含量高的土壤 提供了良好的生物菌株资源。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法，包括以下步骤：
步骤A、将酸性土壤与水混合，进行振荡培养，然后进行离心分离，弃去上清液，从而得到含混合菌株的沉淀物；
步骤B、向所述含混合菌株的沉淀物中加入无菌酸性培养液，进行振荡培养，从而得 到菌株混合液；取该菌株混合液作为接种菌；
步骤C、将所述接种菌中与无菌酸性培养液混合，进行振荡培养，从而得到菌株培养 液；取该菌株培养液作为接种菌，再以该接种菌重新执行步骤C，直至执行6次步骤C的振荡培养；
步骤D、吸取第四次、第五次和第六次步骤C的振荡培养所得到的菌株培养液，并加入到固氮培养基中进行平板涂布培养，从而得到平板培养菌；
步骤E、从承载所述平板培养菌的培养皿中，选取菌落数多于50的培养皿，并在固氮 培养基中进行斜面培养，从而得到斜面培养菌；
步骤F、对所述斜面培养菌进行菌株分离，得到嗜酸耐重金属固氮菌；
步骤G、将所述嗜酸耐重金属固氮菌在固氮培养基中进行培养、纯化，从而得到纯化 的活性嗜酸耐重金属固氮菌。
优选地，所述无菌酸性培养液的成分包括：10g/L的葡萄糖、5g/L的NaCl、0.005g/L的CdCl、0.2g/L的AsCl3、0.5g/L的PbCl2、2g/L的CrCl3、2g/L的ZnSO4、2g/L的CuSO4、 1g/L的K2HPO4、0.25g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的CaCl2·2H2O、0.005g/L的 NaMoO4·2H2O、0.005g/L的FeSO4·7H2O、0.1mg/L的H3BO3、0.2mg/L的KI、0.1mg/L的 MnCl2·4H2O和0.1mg/L的CoCl2·6H2O。
优选地，所述无菌酸性培养液的pH值为3，并且在121℃灭菌30min。
优选地，所述固氮培养基的成分包括：5g/L的葡萄糖、5g/L的甘露醇、1g/L的K2HPO4、 0.25g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的CaCl2·2H2O、0.005g/L的NaMoO4·2H2O、0.005g/L的 FeSO4·7H2O、0.1mg/L的H3BO3、0.2mg/L的KI、0.1mg/L的MnCl2·4H2O、0.1mg/L的CoCl2·6H2O、0.02mg/L的CuSO4·5H2O、0.1mg/L的ZnSO4·7H2O、1g/L的海藻酸丙二醇 酯和10g/L的明胶。
优选地，所述固氮培养基的pH值为3，并且该固氮培养基在121℃灭菌30min。
优选地，在步骤A中，按照1:10的体积比将酸性土壤与无菌水混合，并在30℃恒温振 荡培养24h，然后进行离心分离，弃去上清液，从而得到含混合菌株的沉淀物。
优选地，在步骤B中，按照1:10的体积比向所述含混合菌株的沉淀物中加入无菌酸性 培养液，并在30℃恒温振荡培养2h，从而得到菌株混合液。
优选地，在步骤C中，按照1:10的体积比向所述接种菌中加入无菌酸性培养液，并在 30℃恒温振荡培养2h，从而得到菌株培养液。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明所提供的从土壤中筛选嗜酸耐重金属 固氮菌的方法根据嗜酸耐重金属菌株的生长特点，先选用特定成分和pH值的无菌酸性培养 液对从酸性土壤中提取的混合菌株进行递归式重复培养，然后采用特定成分和pH值的固氮 培养基择优进行平板涂布培养和斜面培养，再进行菌株分离纯化，从而即可快速筛选出适 合改良酸性土壤的高活性纯化嗜酸耐重金属固氮菌，不仅筛选效率大幅提高，获得菌株数 量大幅增加，而且菌株的嗜酸耐重金属能力大幅增强，为治理受酸化影响且重金属含量高 的土壤提供了良好的生物菌株资源。
具体实施方式
下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本 发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在 没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
下面对本发明所提供的从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法进行详细描述。本发 明实施例中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
一种从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法，可以包括以下步骤：
步骤A、将酸性土壤与水混合，进行振荡培养，然后进行离心分离，弃去上清液，从而得到含混合菌株的沉淀物。
步骤B、向所述含混合菌株的沉淀物中加入无菌酸性培养液，进行振荡培养，从而得 到菌株混合液。取该菌株混合液作为接种菌，并执行步骤C。
步骤C、将所述接种菌中与无菌酸性培养液混合，进行振荡培养，从而得到菌株培养 液；从该菌株培养液中吸取一部分作为接种菌，再以该接种菌重复执行步骤C，直至递归执行5次(即与步骤B中菌株混合液作为接种菌执行的一次加在一起，总共执行6次)步骤 C的振荡培养。
步骤D、分别从第四次、第五次和第六次步骤C的振荡培养所得到的菌株培养液中各 吸取一部分(例如：0.2ml)，加入到固氮培养基中进行平板涂布培养，在25℃下培养一周，从而得到平板培养菌。
步骤E、从承载所述平板培养菌的培养皿中，选取菌落数多于50的培养皿，并在固氮 培养基中进行斜面培养，在25℃下培养一周，从而得到斜面培养菌。
步骤F、对所述斜面培养菌进行菌株分离，得到嗜酸耐重金属固氮菌。
步骤G、将所述嗜酸耐重金属固氮菌在固氮培养基中进行培养，并在25℃下培养一周， 进行纯化，从而得到纯化的活性嗜酸耐重金属固氮菌。
具体地，该从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法可包括以下实施方案：
(1)所述无菌酸性培养液的成分包括：10g/L的葡萄糖、5g/L的NaCl、0.005g/L的CdCl、 0.2g/L的AsCl3、0.5g/L的PbCl2、2g/L的CrCl3、2g/L的ZnSO4、2g/L的CuSO4、1g/L的K2HPO4、0.25g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的CaCl2·2H2O、0.005g/L的NaMoO4·2H2O、 0.005g/L的FeSO4·7H2O、0.1mg/L的H3BO3、0.2mg/L的KI、0.1mg/L的MnCl2·4H2O和 0.1mg/L的CoCl2·6H2O；所述无菌酸性培养液的pH值为3，并且在121℃灭菌30min。
(2)所述固氮培养基的成分包括：5g/L的葡萄糖、5g/L的甘露醇、1g/L的K2HPO4、0.25g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的CaCl2·2H2O、0.005g/L的NaMoO4·2H2O、0.005g/L的FeSO4·7H2O、0.1mg/L的H3BO3、0.2mg/L的KI、0.1mg/L的MnCl2·4H2O、0.1mg/L的 CoCl2·6H2O、0.02mg/L的CuSO4·5H2O、0.1mg/L的ZnSO4·7H2O、1g/L的海藻酸丙二醇 酯和10g/L的明胶；所述固氮培养基的pH值为3，并且在121℃灭菌30min。
(3)在步骤A中，按照1:10的体积比将酸性土壤与无菌水混合，并在30℃恒温振荡培 养24h，然后进行离心分离，弃去上清液，从而得到含混合菌株的沉淀物。
(4)在步骤B中，按照1:10的体积比向所述含混合菌株的沉淀物中加入无菌酸性培养 液，并在30℃恒温振荡培养2h，从而得到菌株混合液。
(5)在步骤C中，按照1:10的体积比向所述接种菌中加入无菌酸性培养液，并在30℃ 恒温振荡培养2h，从而得到菌株培养液。
进一步地，本发明所提供的从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法根据嗜酸耐重金 属菌株的生长特点，先选用特定成分和pH值的无菌酸性培养液对从酸性土壤中提取的混合 菌株进行递归式重复培养，然后采用特定成分和pH值的固氮培养基择优进行平板涂布培养 和斜面培养，再进行菌株分离纯化，从而即可快速筛选出适合改良酸性土壤的高活性纯化 嗜酸耐重金属固氮菌，不仅筛选效率大幅提高，获得菌株数量大幅增加，而且菌株的嗜酸 耐重金属能力大幅增强，为治理受酸化影响且重金属含量高的土壤提供了良好的生物菌株 资源。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明所提供的从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法针对我国大面积土壤 酸化以及重金属活性高的问题，快速高效筛选出了适合于酸性土壤施用的菌株。
(2)本发明所提供的从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法通过特殊的无菌酸性 培养液和固氮培养基能够提高嗜酸耐重金属菌株的获得率，而且可显著提高菌株的嗜酸耐 重金属的能力。
(3)本发明所提供的从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法为酸化土壤的治理提 供了良好的生物菌株资源。
综上可见，本发明实施例能够快速高效地筛选出适合酸性土壤的嗜酸耐重金属固氮 菌，而且能够大幅提高菌株培养获得率和菌株的嗜酸耐重金属能力，为治理受酸化影响且 重金属含量高的土壤提供了良好的生物菌株资源。
为了更加清晰地展现出本发明所提供的技术方案及所产生的技术效果，下面以具体实 施例对本发明实施例提供的从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法进行详细描述。
实施例1
一种从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法，可以包括以下步骤：
步骤A1、取10g新鲜的酸性土壤于250m锥形瓶中，加入100mL无菌水，并在150rpm转速、30℃恒温下振荡培养24h，然后以4000rpm的转速进行离心分离，用倾析法弃去上 清液，从而得到含混合菌株的沉淀物。
步骤B1、向装有含混合菌株的沉淀物的锥形瓶中加入100mL无菌酸性培养液，并在150rpm转速、30℃恒温下振荡培养2h，从而得到菌株混合液。吸取10mL该菌株混合液作 为接种菌，并执行步骤C1。
步骤C1、将所述接种菌中加入到100mL无菌酸性培养液中，并在150rpm转速、30℃恒温下振荡培养2h，从而得到菌株培养液；吸取10mL该菌株培养液作为接种菌，再以该 接种菌重复执行步骤C1，直至执行6次步骤C1的振荡培养。
步骤D1、分别从第四次、第五次和第六次步骤C1的振荡培养所得到的菌株培养液中 各吸取0.2ml，加入到固氮培养基中进行平板涂布培养，在25℃下培养一周，从而得到平板培养菌。
步骤E1、从承载所述平板培养菌的培养皿中挑取菌落，选取菌落数多于50的培养皿， 并在固氮培养基中进行斜面培养，在25℃下培养一周，从而得到斜面培养菌。
步骤F1、对所述斜面培养菌进行菌株分离，得到嗜酸耐重金属固氮菌。
步骤G1、将所述嗜酸耐重金属固氮菌在固氮培养基中进行培养，并在25℃下培养一 周，进行纯化，从而得到纯化的活性嗜酸耐重金属固氮菌。
具体地，上述步骤B1～步骤G1中：①所述无菌酸性培养液的成分包括：10g/L的葡萄 糖、5g/L的NaCl、0.005g/L的CdCl、0.2g/L的AsCl3、0.5g/L的PbCl2、2g/L的CrCl3、2g/L的ZnSO4、2g/L的CuSO4、1g/L的K2HPO4、0.25g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的CaCl2·2H2O、0.005g/L的NaMoO4·2H2O、0.005g/L的FeSO4·7H2O、0.1mg/L的H3BO3、0.2mg/L的KI、 0.1mg/L的MnCl2·4H2O和0.1mg/L的CoCl2·6H2O；所述无菌酸性培养液的pH值为3，并且 在121℃灭菌30min。②所述固氮培养基的成分包括：5g/L的葡萄糖、5g/L的甘露醇、1g/L 的K2HPO4、0.25g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的CaCl2·2H2O、0.005g/L的NaMoO4·2H2O、0.005g/L的FeSO4·7H2O、0.1mg/L的H3BO3、0.2mg/L的KI、0.1mg/L的MnCl2·4H2O、 0.1mg/L的CoCl2·6H2O、0.02mg/L的CuSO4·5H2O、0.1mg/L的ZnSO4·7H2O、1g/L的海藻 酸丙二醇酯和10g/L的明胶；所述固氮培养基的pH值为3，并且在121℃灭菌30min。
进一步地，将上述本发明实施例1的步骤G1中得到的活性嗜酸耐重金属固氮菌接入到 液体固氮培养基(该液体固氮培养基的成分包括：5g/L的葡萄糖、5g/L的甘露醇、1g/L的 K2HPO4、0.25g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的CaCl2·2H2O、0.005g/L的NaMoO4·2H2O、0.005g/L的FeSO4·7H2O、0.1mg/L的H3BO3、0.2mg/L的KI、0.1mg/L的MnCl2·4H2O、 0.1mg/L的CoCl2·6H2O、0.02mg/L的CuSO4·5H2O和0.1mg/L的ZnSO4·7H2O；该液体固氮 培养基的pH值为3，并且在121℃灭菌30min)中进行摇瓶培养，在150rpm转速、25℃恒 温下振荡培养2～3天；然后使用细菌DNA提取试剂盒提取细菌的基因组DNA，以该DNA 为模板，对活性嗜酸耐重金属固氮菌的固氮基因的进行PCR扩增(具体方法参见“Tan J W, Thong K L,ArumugamN D,et al.Development of a PCR assay for the detection of and genes inindigenous photosynthetic bacteria.International Journal of Hydrogen Energy,2009,34(17):7538-7541”中报道的方法)；再对产物进行琼脂糖电泳，检测产物。结果 显示：筛选获得菌株具有固氮酶基因，这说明本发明实施例1中筛选得到的活性嗜酸耐重 金属固氮菌均具有固氮能力。
综上可见，本发明实施例能够快速高效地筛选出适合酸性土壤的嗜酸耐重金属固氮 菌，而且能够大幅提高菌株培养获得率和菌株的嗜酸耐重金属能力，为治理受酸化影响且 重金属含量高的土壤提供了良好的生物菌株资源。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任 何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都 应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围 为准。
Claims (8)
1.一种从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A、将酸性土壤与水混合，进行振荡培养，然后进行离心分离，弃去上清液，从而得到含混合菌株的沉淀物；
步骤B、向所述含混合菌株的沉淀物中加入无菌酸性培养液，进行振荡培养，从而得到菌株混合液；取该菌株混合液作为接种菌；
步骤C、将所述接种菌中与无菌酸性培养液混合，进行振荡培养，从而得到菌株培养液；取该菌株培养液作为接种菌，再以该接种菌重新执行步骤C，直至执行6次步骤C的振荡培养；
步骤D、吸取第四次、第五次和第六次步骤C的振荡培养所得到的菌株培养液，并加入到固氮培养基中进行平板涂布培养，从而得到平板培养菌；
步骤E、从承载所述平板培养菌的培养皿中，选取菌落数多于50的培养皿，并在固氮培养基中进行斜面培养，从而得到斜面培养菌；
步骤F、对所述斜面培养菌进行菌株分离，得到嗜酸耐重金属固氮菌；
步骤G、将所述嗜酸耐重金属固氮菌在固氮培养基中进行培养、纯化，从而得到纯化的活性嗜酸耐重金属固氮菌。
2.根据权利要求1所述从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法，其特征在于，所述无菌酸性培养液的成分包括：10g/L的葡萄糖、5g/L的NaCl、0.005g/L的CdCl、0.2g/L的AsCl3、0.5g/L的PbCl2、2g/L的CrCl3、2g/L的ZnSO4、2g/L的CuSO4、1g/L的K2HPO4、0.25g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的CaCl2·2H2O、0.005g/L的NaMoO4·2H2O、0.005g/L的FeSO4·7H2O、0.1mg/L的H3BO3、0.2mg/L的KI、0.1mg/L的MnCl2·4H2O和0.1mg/L的CoCl2·6H2O。
3.根据权利要求2所述从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法，其特征在于，所述无菌酸性培养液的pH值为3，并且在121℃灭菌30min。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法，其特征在于，所述固氮培养基的成分包括：5g/L的葡萄糖、5g/L的甘露醇、1g/L的K2HPO4、0.25g/L的MgSO4·7H2O、0.1g/L的CaCl2·2H2O、0.005g/L的NaMoO4·2H2O、0.005g/L的FeSO4·7H2O、0.1mg/L的H3BO3、0.2mg/L的KI、0.1mg/L的MnCl2·4H2O、0.1mg/L的CoCl2·6H2O、0.02mg/L的CuSO4·5H2O、0.1mg/L的ZnSO4·7H2O、1g/L的海藻酸丙二醇酯和10g/L的明胶。
5.根据权利要求4所述从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法，其特征在于，所述固氮培养基的pH值为3，并且该固氮培养基在121℃灭菌30min。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法，其特征在于，在步骤A中，按照1:10的体积比将酸性土壤与无菌水混合，并在30℃恒温振荡培养24h，然后进行离心分离，弃去上清液，从而得到含混合菌株的沉淀物。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法，其特征在于，在步骤B中，按照1:10的体积比向所述含混合菌株的沉淀物中加入无菌酸性培养液，并在30℃恒温振荡培养2h，从而得到菌株混合液。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的从土壤中筛选嗜酸耐重金属固氮菌的方法，其特征在于，在步骤C中，按照1:10的体积比向所述接种菌中加入无菌酸性培养液，并在30℃恒温振荡培养2h，从而得到菌株培养液。
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