CN103540519B - 一种双层平板及其制备方法 - Google Patents

一种双层平板及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103540519B
CN103540519B CN201310441319.3A CN201310441319A CN103540519B CN 103540519 B CN103540519 B CN 103540519B CN 201310441319 A CN201310441319 A CN 201310441319A CN 103540519 B CN103540519 B CN 103540519B
Authority
CN
China
Prior art keywords
yeast
double
solution
candida
digboiensiszby
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201310441319.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103540519A (zh
Inventor
刘学端
梁伊丽
尹华群
恩刚姆
胡琪
马丽媛
肖云花
邱冠周
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Central South University
Original Assignee
Central South University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Central South University filed Critical Central South University
Priority to CN201310441319.3A priority Critical patent/CN103540519B/zh
Publication of CN103540519A publication Critical patent/CN103540519A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103540519B publication Critical patent/CN103540519B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/10—Petri dish
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/165—Yeast isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/72—Candida

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种双层平板及其制备方法。利用嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)，保藏编号:CCTCC NO:M2013311制作双层平板中的底层培养基，筛选自养浸矿微生物。与传统方法相比，本发明极大地提高了浸矿微生物分离筛选的效率，同时也为研究浸矿微生物遗传和代谢提供了一条可行的途径。

Description

一种双层平板及其制备方法
技术领域
本发明属于浸矿微生物筛选的产品技术领域，具体涉及一种用于浸矿微生物筛选的双层平板及其制备方法，和菌株。
背景技术
生物冶金利用微生物氧化硫化矿等矿物中的铁和硫，使结合在矿石中的有价金属释放到溶液中以利于进一步提取。浸矿微生物主要包括自养的铁氧化菌和硫氧化菌，它们利用硫化矿中的Fe2＋或者还原型的硫化物（如黄铁矿Fe2S）作为能源生长，产生硫酸促进硫化矿的浸出，因此，筛选出高效浸矿微生物是生物冶金的关键。
固体培养基通常用于浸矿微生物的分离和培养,然而浸矿微生物主要是自养菌，琼脂等凝固剂中的有机物质及其水解产物对浸矿微生物生长有抑制作用，酸性的固体培养基难以制作，所以浸矿微生物通常难以在固体平板上产生大量有特色的菌落供菌株筛选、选育及遗传特性研究。因此，高活性的浸矿微生物菌种资源缺乏，浸矿机理不明，导致生物浸出技术浸出速率慢，限制其大规模工业化应用。
为提高浸矿微生物检出率并缩短培养周期,双层平板方法发明并用于该类微生物的分离筛选。双层平板中采用底层涂布嗜酸的(Candida digboiensis sp.)等异养菌以除去培养基中的有毒有机物质,上层用于化能自养菌的筛选。双层平板中的培养基成分也不断改进，但目前该方法仍存在很大挑战。
本发明筛选了一种嗜酸酵母，利用其设计了一种新型的分离纯化极端浸矿菌的双层平板，该酵母菌除去培养基中的有毒有机物质的作用明显，成功的实现了浸矿菌的固体平板培养及纯化。
发明内容
本发明的目的是通过筛选酸性浸矿体系中的嗜酸酵母，提供一种利用该菌建立的快速筛选浸矿微生物的双层平板及其制备方法，以丰富浸矿微生物资源,成功的实现浸矿菌的固体平板培养及纯化。
一种双层平板，是在双层培养基平板的底层平板中接种有嗜酸酵母(CandidadigboiensisZBY)，所述的嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)的保藏编号为:CCTCC NO：M2013311。
所述的双层平板的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）挑选嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)单菌落置于含1wt%的葡萄糖和0.025wt%的胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）的5mL9k液体培养基中活化至菌液浓度达到109个/mL以上，取占体积比10%的活化好的培养液加入含1%葡萄糖的9K液体培养基中，得到酵母菌培养液；
2）分别配制以下三种溶液：(a)pH=2.0的2×9K液体培养基（即培养基中，每种成分的浓度均为2倍），(b)pH=2.0的250mM的硫酸亚铁溶液，其中含10mM K2S4O6；(c)pH=4.5的3wt％琼脂糖溶液；50℃时将(a)(b)(c)三种溶液按体积比4：1：5混合，制备成分离和纯化用培养基2份；
3）其中1份立即接种步骤1）得到的酵母菌培养液，接种量为培养基体积比的1%，然后倾倒在无菌培养皿中形成凝胶，另一份保温，当培养皿内的凝胶凝固，再倒入第二份无酵母的培养基，制成双层平板。
所述的酵母菌为嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)，保藏编号为:CCTCC NO：M2013311。保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2013年7月2日。
本发明筛选了一种嗜酸酵母，利用其设计了一种新型的分离纯化极端浸矿菌的双层平板，该酵母菌除去培养基中的有毒有机物质的作用明显，成功的实现了浸矿菌的固体平板培养及纯化。
附图说明
图1为酵母(Candida digboiensisZBY)显微形态；
图2为本发明利用酵母(Candida digboiensisZBY)制作的双层平板；
图3为本发明双层平板筛选的浸矿微生物菌落形态和扫描电子显微镜照片（SEM）图像；
（a）底层接种酵母，上层接种浸矿微生物的双层平板；
（b）Z1菌的SEM图像；
（c）Z2菌的SEM图像。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)的分离筛选和鉴定:
采集酸性矿坑水10mL，用含1%葡萄糖的9K液体培养基90mL富集培养，9K培养基成分为(g/L)：(NH4)2SO43.0,KCl0.1,K2HPO40.5,MgSO4·7H2O0.5,Ca(NO3)20.01,H2O1000mL，pH=2.5，培养温度35℃，转速200rpm。2天后，当菌液浓度达到109个/mL时，取10mL培养液于90mL新鲜的9K液体培养基（含1%葡萄糖）中富集培养，此过程重复四次。
酸性浸矿体系中异养微生物分离纯化采用单层平板。将pH=2.0的2×9K液体培养基和pH=4.5的3％琼脂糖溶液在121℃高温灭菌30min后按1：1混合，加入过滤灭菌的1%葡萄糖和0.025%TSB，调pH值为2.5，冷却至50℃后倒入无菌培养皿中；将上述富集的培养液稀释涂布平板，35℃中培养；挑取单菌落在同样的琼脂平板上划线分离培养。此过程重复四次，得到酵母的纯培养。
含1%葡萄糖的9K平板上生长的酵母(Candida digboiensisZBY)，菌落乳白色，菌落平整，表面与边缘平整；用普通光学显微镜观察发现分离物细胞呈卵圆形，出芽生殖，有子囊孢子形成（图1）。提取嗜酸酵母基因组DNA,扩增18S rDNA序列,结合形态特征、18S rDNA基因序列鉴定为酵母(Candida digboiensisZBY)。菌种由中国典型培养物保藏中心保藏,编号:CCTCC NO:M2013311。
实施例2利用嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)制作双层平板
挑选酵母单菌落于5mL含葡萄糖（1%）和TSB（0.025%）的9k液体培养基中活化至菌液浓度达到109个/mL时，取5mL培养液于45mL新鲜的9K液体培养基（含1%葡萄糖）中，使其具有良好的活性。
分别配制以下三种溶液用于双层平板的制作：(a)pH=2.0的2×9K培养基，121℃高温灭菌30分钟；(b)pH=2.0的250mM硫酸亚铁溶液（含K2S4O610mM），0.2μm的尼龙膜过滤；(c)pH=4.5的3％琼脂糖溶液，121℃高温灭菌30分钟。50℃时将(a)(b)(c)三种溶液按体积比4：1：5混合，制备分离和纯化用固体培养基2份，其中1份立即接种活化好的酵母（接种量1%），然后倾倒在无菌培养皿中形成薄的凝胶；另一份50℃保温，当培养皿内的凝胶凝固，再倒入第二份无酵母的培养液，待其凝固。制成双层平板(如图2所示)。
实施例3利用双层平板筛选浸矿微生物:
取10mL酸性矿坑水至90ml含有250mM硫酸亚铁的9K培养基中富集培养，选取待分离菌种的最适的pH值和温度，置于转速为200rpm/min的摇床上培养。当溶液变红，取10ml的培养液转移到90ml新鲜的上述同种培养基中继续富集培养，此过程重复四次。将富集培养液稀释，并涂布于实施例2制备的双层平板上，置于适宜的培养箱中培养。挑选菌落在琼脂平板上划线分离，适宜条件下再培养，得到纯培养。
在未接种的培养皿中，只有酵母菌菌落在底层培养基中出现。在上层接种富集物的培养皿中，出现了酵母菌和铁氧化菌的菌落（图3a所示）。根据微生物的形态特征，在上层分离和纯化出两种浸矿细菌，分别命名为Z1和Z2。在双层琼脂平板中两种菌落都在一周内出现，它们覆盖上层培养基的表面，使培养皿变红，Z1铁氧化的速度较Z2快。Z1菌在双层平板上检出的时间比单层平板提早5d,检出菌落数约800个，检出率比单层平板提高25倍,比现有双层平板提高2倍。
通过SEM（扫描电子显微镜）观察到新菌株的形态（图3所示）。Z1为杆状细菌，直径为0.40-0.70μm，长1.00-2.50μm；而Z2细胞呈弧形，直径为0.25-0.50μm，长0.80-2.15μm。光学显微镜发现，Z2运动性较Z1强。Z1和Z2的形态特征与氧化亚铁硫杆菌和钩端螺旋菌属相似。16S rDNA序列分析表明，Z1和Z2分别属于氧化亚铁硫杆菌和钩端螺旋菌属。

Claims (2)

1.一种双层平板，其特征在于，是在双层培养基平板的底层平板中接种有嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)，所述的嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)的保藏编号为:CCTCC NO：M 2013311；
所述的双层平板的制备方法，包括以下步骤：
1)挑选嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)单菌落置于含1wt％的葡萄糖和0.025wt％的胰蛋白胨大豆肉汤培养基的5mL 9k液体培养基中活化至菌液浓度达到109个/mL以上，取占体积比10％的活化好的培养液加入含1％葡萄糖的9K液体培养基中，得到酵母菌培养液；
2)分别配制以下三种溶液：(a)pH＝2.0的2×9K液体培养基，(b)pH＝2.0的250mM的硫酸亚铁溶液，其中含10mM K2S4O6；(c)pH＝4.5的3wt％琼脂糖溶液；50℃时将(a)(b)(c)三种溶液按体积比4：1：5混合，制备成分离和纯化用培养基2份；
3)其中1份立即接种步骤1)得到的酵母菌培养液，接种量为培养基体积比的1％，然后倾倒在无菌培养皿中形成凝胶，另一份保温，当培养皿内的凝胶凝固，再倒入第二份无酵母的培养基，制成双层平板。
2.一种酵母菌，其特征在于，所述的酵母菌为嗜酸酵母(CandidadigboiensisZBY)，保藏编号为:CCTCC NO：M 2013311。
CN201310441319.3A 2013-09-25 2013-09-25 一种双层平板及其制备方法 Active CN103540519B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310441319.3A CN103540519B (zh) 2013-09-25 2013-09-25 一种双层平板及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310441319.3A CN103540519B (zh) 2013-09-25 2013-09-25 一种双层平板及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103540519A CN103540519A (zh) 2014-01-29
CN103540519B true CN103540519B (zh) 2015-01-21

Family

ID=49964383

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310441319.3A Active CN103540519B (zh) 2013-09-25 2013-09-25 一种双层平板及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103540519B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107446826B (zh) * 2017-09-12 2020-05-05 佛山市海天调味食品股份有限公司 一种丝状真菌的筛选培养基及其制备方法与应用
CN113957118B (zh) * 2021-10-29 2022-11-15 播恩集团股份有限公司 一种凝结芽孢杆菌活菌数的检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1746315A (zh) * 2005-09-19 2006-03-15 南京农业大学 一种提高化能自养硫杆菌平板检出率的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1746315A (zh) * 2005-09-19 2006-03-15 南京农业大学 一种提高化能自养硫杆菌平板检出率的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Isolation and identification of a Candida digboiensis strain from an extreme acid mine drainage of the Lignite Mine,Gujarat;Patel et al;《Journal of Basic Microbiology》;20091231;第49卷;全文 *
Isolation of a novel yeast strain Candida digboiensis TERI ASN6 capable of degrading petroleum hydrocarbons in acidic conditions;Sood and Lal;《Journal of Environmental Management》;20081225;第90卷;摘要 *
提高氧化亚铁硫杆菌和氧化硫硫杆菌平板检出率的方法:双层平板法;王世梅和周立祥;《环境科学学报》;20051031;第25卷(第10期);全文 *
氧化亚铁硫杆菌的分离培养及其浸磷效果;龚文琪等;《过程工程学报》;20070630;第7卷(第3期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103540519A (zh) 2014-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102337229A (zh) 一种耐重金属细菌的分离及其在煤矸石复垦中的应用
CN106916765B (zh) 一种利用微紫青霉菌吸附废水中重金属锌的方法
CN101955904B (zh) 一种自然水环境中的溶藻菌分离方法
CN107619806B (zh) 一株吸附铅且耐受重金属的细菌及其应用
CN113122463B (zh) 巨大芽孢杆菌及该菌修复铬污染土壤的方法
CN103131650B (zh) 一株嗜酸硫杆菌属及其在黄铜矿浸出中的应用
CN102796671A (zh) 一种降解辛硫磷的淡紫拟青霉菌株及其应用
CN108102970A (zh) 一种去除镉污染土壤中酸溶态镉和可还原态镉的兼养型微生物功能菌群及其制备和应用方法
US20240060153A1 (en) Acidomyces Acidothermus and Its Application in Leaching Copper-containing Pollutants from Waste Circuit Boards
CN103540519B (zh) 一种双层平板及其制备方法
Gu et al. Degradation of inhibitory substances by heterotrophic microorganisms during bioleaching of heavy metals from anaerobically digested sewage sludge
CN103667131B (zh) 一种提高金属矿石浸取率的方法及其专用菌株
CN109516869A (zh) 复合功能微生物制剂及其制备方法和应用
CN106635854A (zh) 寡营养细菌组合及在抑制生物浸出中黄钾铁矾生成的应用
CN102618464A (zh) 一种能促进vbnc细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基及其制备方法和应用
CN102618455A (zh) 一株弗氏链霉菌及其应用
CN102162029B (zh) 氧化锰矿中有价金属的微生物氧化还原耦合浸出方法
CN111378592B (zh) 地衣芽孢杆菌及该菌处理恶臭有机废水净化水体的方法
CN116948882A (zh) 一种马德普拉塔无色杆菌及其应用
WO2017035856A1 (zh) 嗜硒微生物Wautersiella enshiensis YLX-1及其应用
CN109439586A (zh) 一种嗜酸铁氧化微生物、菌剂及其用途
CN108949583A (zh) 一株棘孢木霉菌株三炬-19及其应用
CN105670965B (zh) 一种具有铁还原能力的菌种及其应用
CN105199990B (zh) 一种自养型和异养型复合浸矿菌群fim-z4及其应用
CN105969695B (zh) 一种浸矿复合菌fim-s1及其在高品位硫化铜矿浸矿中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant