CN115820493A - 一种固氮菌富集和用纤维素培养固氮菌降解染料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固氮菌富集和用纤维素培养固氮菌降解染料的方法。固氮菌的富集和用纤维素培养固氮菌降解染料的方法包括：1、采集土样作为接种源，利用培养基进行培养；2、将步骤1中的混菌接入含培养基的培养瓶中，通入氮气，在适宜的温度条件下培养，富集固氮菌；3、将步骤2中富集好的固氮菌离心收集，重悬于无碳源的培养基中以获得高浓度菌悬液；4、将步骤3中的菌悬液接种到含纤维素和染料的培养基中，确定培养基中糖、蛋白质和染料浓度的变化以及固氮菌的纤维素酶活性。本发明为固氮混菌处理染料(如偶氮染料甲基橙)废水提出了一种全新的技术路线，具有低成本、环保等优势，在废纸纤维素利用和染料降解方面的应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及微生物的富集培养方法，具体地说，涉及一种固氮菌富集和用纤维素培养固氮菌降解染料的方法。
背景技术
据报道，2021年全国纸及纸板生产量12105万吨，较2020年增长7.50％。由于纸制品的质量规格以及废纸与其他废物混合，纸纤维回收为新纸非常困难，2021年国内废纸回收率为51.3％，废纸的利用率为54.1％。除回收利用外，其他如填埋、焚烧等废纸处理方式会释放有害物质，对环境造成二次污染，且经济效益较低。废纸再生纤维技术可以降低纤维生产成本，节省原料。但国内没有形成废纸回收产业，废纸回收质量参差不齐。多次的回收会造成纤维损耗和纤维素大分子间的结合强度的减弱。废纸厌氧消化可有效利用废纸资源，将其转化为各种有机酸、醇类和甲烷等。但因受较高碳氮比的限制需要与含氮量高的基质共消化，以提高其消化性能。固氮菌作为一种可以将氮气固定转化并利用的微生物，利用能够释放纤维素酶的固氮菌分解废纸是对抗高碳氮比的一种理想方法。
为了获得色彩鲜艳的彩色纸张，造纸工厂使用偶氮染料进行染色，会产生大量的染料废水。偶氮染料废水具有毒性，能引起DNA损伤和癌症，其排放对水生生物和人类具有危害。生物脱色是处理偶氮染料废水的环境友好技术，但高碳氮比的废水处理需要额外添加氮源。利用固氮菌处理废水，可以避免增加氮源，降低成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种固氮菌富集和用纤维素培养固氮菌降解染料的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供一种固氮菌富集和用纤维素培养固氮菌降解染料的方法方法，包括以下步骤：
(1)采集土样作为接种源，将土样悬浮于无菌水中混匀；将上述悬液取接入培养瓶中，加入培养基，使培养体系体积达到50mL，通入氮气后密封，在恒温培养箱中于30-32℃振荡培养48-72h；
(2)取步骤(1)中的培养液2.5-5mL加入新的培养瓶中，加入45-47.5mL的培养基(总体系50mL)，通入氮气后密封，在恒温培养箱中于30-32℃振荡培养；
(3)培养48-72h后，培养液离心，弃上清液，菌体重悬于新的50mL的培养基中，接入培养瓶，通入氮气后密封，于30-32℃继续振荡培养；
(4)重复步骤(3)10～15次；
(5)取2.5-5mL富集到的固氮菌培养液接入培养瓶中，培养瓶中加入45-47.5mL的培养基(总体系50mL)，通入氮气后密封，于30-32℃振荡培养20-24h；
(6)步骤(5)中的固氮菌培养液经离心，弃上清液，菌体重悬于无碳源的培养基中以获得高浓度菌悬液；上述高浓度菌悬液取5mL接入培养瓶中，加入无碳源培养基、纤维素材料和染料，最终培养瓶中培养液体积为50mL，通入氮气后密封，在恒温培养箱中30-32℃振荡培养；每天取样，测糖、蛋白质和染料浓度变化，连续1-5天；第5天测固氮菌的纤维素酶(CMC酶)和β-葡萄糖苷酶活性。
优选地，所述培养基中不含氮源。
所述培养基成分为KH2PO4 2.3g/L,K2HPO4 5.75g/L,MgSO4·7H2O 0.025g/L,CaCl2·2H2O 0.025g/L,葡萄糖10g/L,H3BO3 0.124mg/L,FeSO4·7H2O 0.1068mg/L,CoSO4·7H2O 0.0512mg/L,CuSO4·5H2O 0.0044mg/L,MnCl2·4H2O 0.00384mg/L,Na2MoO4·2H2O0.1068mg/L,ZnSO4·7H2O 0.0512mg/L。
步骤(6)中所述无碳源的培养基即将上述培养基中去除葡萄糖后的培养基。
优选地，步骤(4)能够富集出固氮细菌。
优选地，步骤(6)中高浓度菌悬液的OD600＝1.8-2.0。
本发明中，所述纤维素材料为纸，优选卫生纸；所述染料为偶氮染料，优选甲基橙。卫生纸能被固氮菌利用，同时甲基橙可以被降解。
进一步地，步骤(6)卫生纸的终含量为1.8-2g/L，甲基橙的终含量为20-25mg/L。
优选地，通入氮气10-15min后密封。
优选地，振荡培养转速为120-130rpm。
优选地，离心条件为：7000-8000rpm离心6-10min。
优选地，步骤(1)～(6)中培养温度为30℃。
本发明为固氮混菌处理染料废水(如偶氮染料甲基橙)提出了一种全新的技术路线，具有低成本、环保等优势，在废纸纤维素利用和染料降解方面的应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中富集的固氮菌群属水平多样性(A)和温度对固氮菌生长的影响(B)。
图2为本发明较佳实施例中以卫生纸为碳源培养固氮菌过程中的糖(A)、蛋白质(B)含量变化和固氮菌的CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活(C)。
图3为本发明较佳实施例中以卫生纸为碳源培养固氮菌降解甲基橙过程中甲基橙的含量变化。
具体实施方式
为了解决甲基橙染料污染和废弃卫生纸问题，本发明提供一种利用卫生纸培养固氮混菌降解甲基橙的方法。
本发明采用如下技术方案：
(1)取泥土作为接种源，将泥土悬浮于无菌水中，充分混匀；将上述悬液5mL接入血清瓶中，加入45mL培养基，通入氮气10min后用丁基橡胶塞和铝帽密封。在恒温培养箱中于30℃，120rpm培养72h。
(2)将(1)中的培养液5mL加入新的血清瓶中，加入45mL培养基，通入氮气10min后用丁基橡胶塞和铝帽密封，在恒温培养箱中于30℃，120rpm培养。培养72h后培养液用离心机在8000rpm离心10min，弃去上清液，保留菌体；将上述菌体重新悬浮于新的50mL培养基中，接入血清瓶，通入氮气10min后用丁基橡胶塞和铝帽密封，于30℃继续振荡培养。上述步骤重复10～15次。
(3)取5mL富集到的固氮菌培养液接入120mL的血清瓶中，血清瓶中加入45mL培养基，曝氮气10min后用丁基橡胶塞和铝帽封口，并在30℃，120rpm培养24h。
(4)将步骤(3)中的固氮菌培养液用离心机在8000rpm离心10min，弃去上清液，菌体重新悬浮于无碳源的培养基中以获得高浓度菌悬液。将上述高浓度菌悬液5mL接入血清瓶中，加入无碳源的培养基、卫生纸和甲基橙，最终血清瓶培养液体积为50mL，卫生纸含量2g/L，甲基橙含量为25mg/L，通入氮气10min后用丁基橡胶塞和铝帽密封。将上述血清瓶在在恒温培养箱中30℃，120rpm培养，每天取样，测糖、蛋白质和甲基橙浓度变化，连续5天；第5天测固氮菌的CMC酶和β-葡萄糖苷酶活性。
优选地，步骤(1)所述培养基成分为KH2PO4 2.3g/L,K2HPO4 5.75g/L,MgSO4·7H2O0.025g/L,CaCl2·2H2O 0.025g/L,葡萄糖10g/L,H3BO3 0.124mg/L,FeSO4·7H2O0.1068mg/L,CoSO4·7H2O 0.0512mg/L,CuSO4·5H2O 0.0044mg/L,MnCl2·4H2O 0.00384mg/L,Na2MoO4·2H2O 0.1068mg/L,ZnSO4·7H2O 0.0512mg/L.
步骤(4)中所述无碳源的培养基即将上述培养基中葡萄糖去除后的培养基。
优选地，步骤(1)中培养基不含氮。
优选地，步骤(2)能够富集出固氮细菌。
优选地，步骤(4)中高浓度固氮菌悬液浓度为OD600＝1.8-2.0。
优选地，步骤(4)中固氮菌接种量为10％(v/v)。
优选地，步骤(4)卫生纸最终含量为2g/L，甲基橙最终含量为25mg/L。
优选地，步骤(4)中卫生纸能被固氮菌能够利，同时甲基橙可以被降解。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1固氮菌群的富集
土壤样品取自安徽农业大学中西部综合楼下的草地，取0.1g土样加到5mL培养基中充分震荡混匀，将上述悬液5mL接入血清瓶中，加入45mL培养基，通入氮气10min后用丁基橡胶塞和铝帽密封。在恒温培养箱中于30℃，120rpm培养72h。
取上述培养液5mL加入新的血清瓶中，加入45mL培养基，通入氮气10min后用丁基橡胶塞和铝帽密封，在恒温培养箱中于30℃，120rpm培养。培养72h后培养液用离心机在8000rpm离心10min，弃去上清液，保留菌体；将上述菌体重新悬浮于新的50mL培养基中，接入血清瓶，通入氮气10min后用丁基橡胶塞和铝帽密封，于30℃继续振荡培养。上述步骤重复10～15次。高通量测序分析富集到的固氮菌群的多样性。
培养基组成为：KH2PO4 2.3g/L,K2HPO4 5.75g/L,MgSO4·7H2O 0.025g/L,CaCl2·2H2O 0.025g/L,葡萄糖10g/L,H3BO3 0.124mg/L,FeSO4·7H2O 0.1068mg/L,CoSO4·7H2O0.0512mg/L,CuSO4·5H2O 0.0044mg/L,MnCl2·4H2O 0.00384mg/L,Na2MoO4·2H2O0.1068mg/L,ZnSO4·7H2O 0.0512mg/L。
富集得到的固氮菌群属水平多样性如图1A所示，其主要组成为Klebsiella(80.77％)、Clostridium 12(17.16％)和Clostridium 1(1.88％)。
实施例2富集温度条件的优化
取5mL菌液加入血清瓶中，加入45mL培养基，通入氮气10min后用丁基橡胶塞和铝帽密封。恒温培养箱温度转速为120rpm，温度分别设置为25℃、30℃、35℃，在上述三种温度条件下培养48h，测定菌液OD600，确定最佳生长温度。
结果如图1B所示，30℃时固氮菌生长最佳。
实施例3利用卫生纸培养固氮混菌降解甲基橙的方法
将5mL富集到的固氮菌培养液接入120mL的血清瓶中，血清瓶中加入45mL培养基，曝氮气10min后用丁基橡胶塞和铝帽封口，并在30℃，120rpm培养24h。培养完成后离心，用0.9％氯化钠溶液冲洗并重新悬浮于无碳源的培养基(即培养基中不含葡萄糖)中，获得高浓度的固氮菌悬液。
吸取5mL高浓度固氮菌悬液接入血清瓶中，再加入卫生纸、甲基橙和无碳源的培养基，最终血清瓶培养液体积为50mL，卫生纸含量2g/L，甲基橙含量为25mg/L，曝氮气10min后用丁基橡胶塞和铝帽封口，在30℃，120rpm培养5天。
每天取样测定样品糖、蛋白质、甲基橙含量变化和第5天固氮菌的CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活，具体如下：
注射器吸取血清瓶中的样品，10000rpm离心10min后用0.45μm过滤器过滤。
(1)蒽酮-硫酸法测定糖含量变化：取1mL过滤后的样品于试管中，加入4mL蒽酮-硫酸试剂，混匀后于100℃水浴加热10min。冷却后于540nm波长测吸光度。
(2)样品蛋白质含量测定：BCA微量蛋白质浓度测定试剂盒描述方法检测蛋白质浓度。
(3)分光光度法测甲基橙浓度变化：取0.3mL样品加水稀释至3mL，在465nm波长下测定吸光度。
(4)CMC酶活性：0.5mL离心后的样品为酶液，加入1.5mL 1％的CMC-Na溶液中。以灭活的酶液为空白对照，混匀盖塞，在50℃水浴反应1小时。取出后迅速加入1.5mL DNS试剂，摇匀于沸水中反应5分钟。取出冷却至室温，加入6.5mL水，摇匀测OD540。
(5)β-葡萄糖苷酶活性：0.5ml离心后的样品为粗酶液，加入1.5mL 0.5％的水杨苷溶液。在50℃水浴1小时。取出后迅速加入1.5mL DNS试剂，摇匀于沸水中反应5分钟。取出冷却至室温，加入2.5ml水，摇匀测OD540。
经过5天固氮菌分解卫生纸分转化为糖的情况如图2A所示，培养5天后培养基中的糖含量达到6.7mg/L；培养基中的蛋白质含量如图2B所示，蛋白质含量增加到69.1mg/L；第5天固氮菌的CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活如图2C所示，CMC酶活达到0.080U/mL，β-葡萄糖苷酶活达到0.069U/mL。甲基橙的含量变化如图3所示，甲基橙的含量从48h开始快速下降，至第120h下降了99％，以上结果表明该固氮菌群可以在分解卫生纸的同时降解甲基橙。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种固氮菌富集和用纤维素培养固氮菌降解染料的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集土样作为接种源，将土样悬浮于无菌水中混匀；将上述悬液接入培养瓶中，加入培养基，培养体系的体积为50mL，通入氮气后密封，在恒温培养箱中于30-32℃振荡培养48-72h；
(2)取步骤(1)中的培养液2.5-5mL加入新的培养瓶中，加入45-47.5mL的培养基，通入氮气后密封，在恒温培养箱中于30-32℃振荡培养；
(3)培养48-72h后，培养液离心，弃上清液，菌体重悬于新的50mL的培养基中，接入培养瓶，通入氮气后密封，于30-32℃继续振荡培养；
(4)重复步骤(3)10～15次；
(5)取2.5-5mL富集到的固氮菌培养液接入培养瓶中，培养瓶中加入45-47.5mL的培养基，通入氮气后密封，于30-32℃振荡培养20-24h；
(6)步骤(5)中的固氮菌培养液经离心，弃上清液，菌体重悬于无碳源的培养基中以获得高浓度菌悬液；上述高浓度菌悬液取5mL接入培养瓶中，加入无碳源培养基、纤维素材料和染料，最终培养瓶中培养液体积为50mL，通入氮气后密封，在恒温培养箱中30-32℃振荡培养；每天取样，测糖、蛋白质和染料浓度变化，连续1-5天；第5天测固氮菌的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶活性；
优选地，所述培养基成分为KH2PO4 2.3g/L,K2HPO4 5.75g/L,MgSO4·7H2O 0.025g/L,CaCl2·2H2O 0.025g/L,葡萄糖10g/L,H3BO3 0.124mg/L,FeSO4·7H2O 0.1068mg/L,CoSO4·7H2O 0.0512mg/L,CuSO4·5H2O 0.0044mg/L,MnCl2·4H2O 0.00384mg/L,Na2MoO4·2H2O0.1068mg/L,ZnSO4·7H2O 0.0512mg/L；
步骤(6)中所述无碳源的培养基即将上述培养基中去除葡萄糖后的培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中高浓度菌悬液的OD600＝1.8-2.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素材料为卫生纸，所述染料为甲基橙。
4.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(6)卫生纸的终含量为1.8-2g/L，甲基橙的终含量为20-25mg/L。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，通入氮气10-15min后密封。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，振荡培养转速为120-130rpm。
7.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，离心条件为：7000-8000rpm离心6-10min。
8.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)～(6)中培养温度为30℃。
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