CN108956800A - 牡丹皮中鞣花酸含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中医中药技术领域牡丹皮中鞣花酸含量的测定方法：取牡丹皮药材，使用盐酸甲醇溶液进行提取，滤过，取续滤液；续滤液注入液相色谱仪，检测波长为253nm，以外标法或标准曲线法测定供试品溶液中鞣花酸的含量。本发明方法操作简便，步骤简单，为中药牡丹皮的进一步开发利用提供了一定的理论依据。

Description

牡丹皮中鞣花酸含量的测定方法

技术领域

本发明涉及中医中药技术领域，特别涉及一种牡丹皮中鞣花酸含量的测定方法。

背景技术

中药材牡丹皮为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，秋季采挖根部，除去细根和泥沙，剥取根皮，晒干或刮去粗皮，除去木心，晒干。味苦、辛，微寒，具有清热凉血，活血化瘀和清肝泻火之功效，用于热入营血，温毒发斑，吐血衄血，夜热早凉，无汗骨蒸，经闭痛经，跌扑伤痛，痈肿疮毒。

牡丹皮化学成分复杂，赵文军等采用HPLC-QTOFMS技术对其进行分析，共鉴定出48个化合物[药学实践杂志，2014,32(4)：261-265]，胡云飞等采用UPLC-Q-TOF-MS技术对不同产地牡丹皮药材化学成分的差异进行研究，共鉴定出37个化合物[中草药，2016,47(17)：2984-2992]，主要包括苯乙酰类(丹皮酚、丹皮酚苷、丹皮酚原苷和丹皮酚新苷等)、单萜(芍药苷、氧化芍药苷和苯甲酰芍药苷等)、酚酸(苯甲酸、没食子酸、没食子酸甲酯)、没食子酰苷类(没食子酸吡喃葡萄糖和没食子酰基葡萄糖等)、黄酮类(儿茶素等)。具有镇静、降温、解热、镇痛、解痉等中枢抑制作用、抗动脉粥样硬化、利尿、抗溃疡、抗炎、抗病毒作用、改善酒精性肝炎、抑制脂多糖诱导的炎症、保护急性肝毒性以及改善1-甲基-4苯基-1,2, 3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森疾病的作用。

阳勇等采用HPLC法对牡丹皮中的没食子酸、(+)-儿茶素、芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖和丹皮酚进行了含量测定[中药材，2013,36(3)：416-422]，谢剑琳等采用HPLC 法对牡丹皮中的没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、丹皮酚、苯甲酰芍药苷进行了含量测定[中国实验方剂学杂志，2013,19(2)：85-89]，张容华等采用UPLC 法对牡丹皮中的没食子酸、5-羟甲基糠醛、对羟基苯甲酸、氧化芍药苷、芍药苷、苯甲酸、 1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、丹皮酚等8个成分进行了含量测定[广东药科大学学报， 2017,33(3)：336-341]。

现有技术中还没有关于牡丹皮中含有鞣花酸的报道。

发明内容

经过长期研究，我们首次发现牡丹皮中含有一种多酚二内酯：2,3,7,8-tetrahydroxy benzopyrano5,4,3-cdebenzopyran-5,10dione，俗称鞣花酸。经HR-ESI-MS、2DNMR技术确定该化合物结构式如下：

本发明的目的是提供一种操作简便、准确度高、重复性好的牡丹皮中鞣花酸的含量测定方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种牡丹皮中鞣花酸含量的测定方法，包括以下步骤：

(1)取牡丹皮药材粉末，使用盐酸甲醇溶液进行提取，滤过，取续滤液；

(2)续滤液注入液相色谱仪，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相 A，以体积分数比0.1～1％的酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→12min，乙腈3％→15％；12min→25min，乙腈15％→24％；检测波长为253nm，以外标法或标准曲线法测定供试品溶液中鞣花酸的含量。

所述的测定方法，优选盐酸甲醇溶液中盐酸体积百分比大于2％，优选2％。

所述的测定方法，优选提取方法为加热回流30分钟～2小时，优选1小时。

所述的测定方法，优选牡丹皮药材粉末与盐酸甲醇溶液的质量体积比为0.1g～0.5g： 50mL，优选0.2g：50mL。

所述的测定方法，优选步骤(1)中

取供试品牡丹皮药材粉末，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入一定体积分数比的盐酸甲醇溶液，称定重量，加热回流30分钟～2小时，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。优选牡丹皮药材粉末过五号筛。

所述的测定方法，优选以鞣花酸对照品的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程y＝9619272x-19673，相关系数r＝1.0000，x为进样量，取值范围0.0043μg ～0.086μg，y为峰面积。

所述的测定方法，优选加样回收率为95.0％～105.0％。

所述的含量测定方法，优选步骤(2)中的酸溶液为冰醋酸溶液、甲酸溶液或磷酸溶液。

所述的牡丹皮药材为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮。

所述的梯度洗脱方式为梯度性地改变洗脱液的组分(成分、离子强度等)或pH，以期将层析柱上不同的组分在合理的时间内洗脱出来的方法。

有益效果：

1)本发明方法制备的牡丹皮供试品溶液稳定性好，24h测定值基本稳定；

2)加样回收率在95.0％～105.0％范围内，测定数值能够准确地反映原药材中鞣花酸的含量；

3)方法操作简便，步骤简单，为中药牡丹皮的进一步开发利用提供了一定的理论依据。

附图说明

图1为鞣花酸紫外吸收光谱图；

图2为实施例1的2.3项下鞣花酸对照品的HPLC色谱图；

图3为实施例1的2.3项下牡丹皮药材供试品溶液的HPLC色谱图；

图4为鞣花酸标准曲线(横坐标为进样量，纵坐标为峰面积。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于具体实施例。

实施例1

1.仪器与试药

仪器：Sartorius CP225D电子天平；Waters2695高效液相色谱仪。

对照品由中国食品药品检定研究院提供，批号：111959-201602，含量以89.3％计。

试剂：乙腈、甲醇为色谱纯，水为Millipore制备的纯化水，其他试剂均为分析纯。

2.色谱条件

2.1对照品溶液的制备：精密称取鞣花酸对照品12.09mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，再精密量取1ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到浓度为4.3μg/ml的对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备：取待测牡丹皮粉末(过五号筛)0.2g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入2％盐酸甲醇溶液50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用2％盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.3色谱条件

鞣花酸紫外吸收光谱图见图1。最终选择253nm作为测定波长。

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(5μm，4.6mm×250mm)；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速1.0mL/min，柱温35℃；检测波长253nm 。理论板数按鞣花酸峰计算应不低于5000。

精密吸取2.1项下对照品溶液及2.2项下供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，进行测定。结果鞣花酸峰型较好，理论板数、分离度、对称因子均符合相关要求，证明该色谱条件可行。见图2、3。

3.供试品溶液制备方法的考察

3.1提取溶剂的考察

供试品溶液的制备：分别取待测牡丹皮粉末(过五号筛)0.2g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇、75％甲醇、50％甲醇、1％盐酸甲醇溶液、2％盐酸甲醇溶液、5％盐酸甲醇溶液 50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用相应提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

分别精密吸取2.1项下对照品溶液及上述供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，进行测定，计算含量(以干燥品计算：经甲苯法测定，方法学研究用牡丹皮水分为9.39％)。结果见表1。

表1提取溶剂考察结果

由测定结果可知，以体积百分比大于2％的盐酸甲醇溶液为提取溶剂时目标成分色谱峰面积最大，含量测定结果最高，考虑到色谱柱的适用性，选择2％盐酸甲醇溶液作为提取溶剂。

3.2提取方法的考察

方法一(超声提取)：分别取待测牡丹皮粉末(过五号筛)0.2g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入2％盐酸甲醇溶液50ml，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟、45分钟、1小时，取出，再称定重量，用2％盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

方法二(加热回流)：分别取待测牡丹皮粉末(过五号筛)0.2g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入2％盐酸甲醇溶液50ml，称定重量，加热回流30分钟、1小时、2小时，放冷，再称定重量，用2％盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

分别精密吸取2.1项下对照品溶液及3.2项下供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，进行测定，计算含量。结果见表2。

表2提取方式及提取时间考察结果

提取方法	含量(mg/g)
		超声30分钟	0.74
超声45分钟	0.78
		超声1小时	0.82
加热回流30分钟	0.92
		加热回流1小时	1.14
加热回流2小时	1.14

根据表2测定结果，加热回流提取效率明显高于超声提取。加热回流1小时以上，提取结果基本无差异，故选择提取方法为加热回流1小时。

3.3取样量的考察

分别取待测牡丹皮粉末(过五号筛)0.1g、0.2g、0.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入 2％盐酸甲醇溶液50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用2％盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

分别精密吸取2.1项下对照品溶液级3.3项下供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，进行测定，计算含量。结果见表3。

表3取样量考察结果

取样量	含量(mg/g)
		0.1024g	1.16
0.2006g	1.14
		0.5021g	1.02

由上述结果可见，取样量为0.5021g时测定结果偏低，另外两种取样量测定结果没有显著性差异。为了确保取样的均匀性，确定取样量为0.2g。

3.4供试品溶液的制备

综上所述，供试品溶液的制备方法如下：取待测牡丹皮粉末(过五号筛)0.2g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入2％盐酸甲醇溶液50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用2％盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

4.线性关系的考察

取2.1项下对照品溶液，分别精密吸取各1、2、5、10、15、20μL，注入液相色谱仪，分别测定峰面积积分值。以鞣花酸对照品的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。测定结果见表4。

表4线性关系考察结果

进样体积(μL)	浓度(μg/mL)	进样量(μg)	峰面积
				1	4.3	0.0043	22105
2	4.3	0.0086	63594
				5	4.3	0.0215	187353
10	4.3	0.0430	392335
				15	4.3	0.0645	599848
20	4.3	0.0860	808958

回归方程y＝9619272x-19673，相关系数r＝1.0000。x为进样量，取值范围0.0043～

0.0860μg，y为峰面积。

试验结果表明，鞣花酸进样量在0.0043～0.0860μg之间进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系。见图4。

5.仪器精密度试验

精密吸取2.1项下对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，测其峰面积积分值。结果见表 5。

表5精密度试验结果

试验结果显示仪器精密度良好。

6.样品稳定性试验

供试品溶液的制备：取待测牡丹皮粉末(过五号筛)约0.2g，精密称定，照3.4项下方法制成供试品溶液。分别在0h，4h，8h，12h，16h，20h，24h精密吸取10μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算峰面积的相对标准偏差(RSD)，结果见表6。

表6精密度试验结果

结果表明，供试品溶液中鞣花酸在室温放置24小时内基本稳定。

7.检测限和定量限

分别配制一个较低浓度的鞣花酸对照品溶液，注入液相色谱仪，计算其峰高与基线噪音的比值 (即信噪比S/N)，当S/N＝3时，此时的进样量作为方法的检测限(LDQ)；当S/N＝10时，此时的进样量作为方法的定量限(LOQ)，鞣花酸的LDQ＝0.215ng，LOQ＝0.645ng，见表7。

表7检测限和定量限检测结果

进样浓度(μg/mL)	信噪比(S/N)	进样体积(μL)	检测限(ng)	定量限(ng)
					0.0215	3	10	0.215	/
0.0645	10	10	/	0.645

8.方法重复性考察

供试品溶液的制备：取待测牡丹皮粉末(过五号筛)约0.2g，精密称定，照3.4项下方法制成供试品溶液，平行制备6份。

分别精密吸取2.1项下的对照品溶液及上述供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，进行测定，计算含量。结果见表8。

表8重复性考察结果

6份样品测定结果RSD≤2.0％，表明含量测定方法的重复性良好。

9.加样回收率试验

供试品溶液的制备：取已测知含量的牡丹皮粉末0.1g(鞣花酸含量为1.14mg/g)，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入鞣花酸对照品稀溶液(取2.1项下的鞣花酸对照品储备液5ml，置 250ml量瓶中，用2％盐酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀)50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用2％盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。平行制备6份。

分别精密吸取2.1项下的对照品溶液及上述供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，进行测定，计算含量。结果见表9。

表9加样回收率考察结果

6份样品加样回收率平均值在95.0％～105.0％范围内，RSD≤2.0％，表明测定方法的回收率良好。

10.样品测定

按照3.4项下方法制备供试品溶液，对所收集到的10批样品进行测定，结果见表10。

表10样品含量测定结果(按照干燥品计算)

编号	产地	含量(mg/g)
			1	山东	1.14
2	山东	0.92
			3	河南	0.84
4	河南	0.94
			5	河南	1.03
6	山东	0.88
			7	河南	0.84
8	山东	0.92
			9	河南	0.94
10	山东	0.90
			11	山东	0.84

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种牡丹皮中鞣花酸含量的测定方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)取牡丹皮药材粉末，使用盐酸甲醇溶液进行提取，滤过，取续滤液；

(2)续滤液注入液相色谱仪，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积分数比0.1～1％的酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→12min，乙腈3％→15％；12min→25min，乙腈15％→24％；检测波长为253nm，以外标法或标准曲线法测定供试品溶液中鞣花酸的含量。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于盐酸甲醇溶液中盐酸体积百分比大于2%。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于提取方法为加热回流30分钟～2小时。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于牡丹皮药材粉末与盐酸甲醇溶液的质量体积比为0.1g～0.5g：50mL。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于步骤（1）中

取供试品牡丹皮药材粉末，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入一定体积分数比的盐酸甲醇溶液，称定重量，加热回流30分钟～2小时，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。

6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于以鞣花酸对照品的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程y =9619272 x-19673，相关系数r＝1.0000，x为进样量，取值范围0.0043μg～0.086μg，y为峰面积。

7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于步骤(1)中提取溶剂为体积百分比2%的盐酸甲醇溶液。

8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于步骤(1)中提取方法为加热回流1小时。

9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于加样回收率为95.0％～105.0％。

10.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于步骤(2)中的酸溶液为冰醋酸溶液、甲酸溶液或磷酸溶液。