CN101788537A - 鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法，即采用高效液相色谱法或超高效液相色谱法，在同一色谱条件下对鸡眼睛药材中所含的鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷五个成分中的至少两个成分同时进行含量测定。本发明在同一色谱条件下对鸡眼睛药材中的多个成分同时进行含量测定，使得鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法更具整体性、特征性和稳定性，而且该方法精密度高，重复性好，回收率高，可有效控制鸡眼睛药材的质量，从而确保其临床用药的有效性及安全性，为鸡眼睛药材的再开发应用奠定了基础。
Description
技术领域：
本发明涉及一种鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法，属于对中药材进行定量检测的技术领域。
背景技术：
鸡眼睛为省沽油科植物野鸦椿Euscaphis japonica(Thunb.)Dippel带花或果的枝叶，其原植物分布江南各省和云南东北部，收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版)，《四川中药志》用其果实或种子。鸡眼睛为贵州少数民族用药，性辛、甘、平，具理气止痛，消肿散结，祛风止痒的功效，现为国家食品药品监督管理局药品标准WS-10108(ZD-0108)-2002(试行)血脉通胶囊中的主要药材之一。
血脉通胶囊(WS-10108(ZD-0108)-2002)具有活血化瘀，通经活络功能，临床用于冠心病、心绞痛，心血瘀阻证，已获得国家发明专利一项(ZL02133416.1)。但是文献调研发现关于鸡眼睛药材的研究较少，基础研究薄弱，缺乏可靠的定性定量方法和可供使用的对照品，《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版)中仅对其进行了简单的薄层鉴别。因此以鸡眼睛为主药开发的制剂血脉通胶囊，其质量控制标准较为简单，特别是未对处方主药鸡眼睛进行含量测定等项目的检测，因而不能很好地确保其临床用药的有效性及安全性，需要进一步研究，提高其质量控制标准。
发明内容：
本发明的目的在于：提供一种鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法。本发明在同一色谱条件下对鸡眼睛药材中的多种成分同时进行含量测定，使得鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法更具整体性、特征性和稳定性，为有效控制鸡眼睛药材的质量以及鸡眼睛药材的再开发应用奠定了基础。
本发明所述鸡眼睛为省沽油科植物野鸦椿Euscaphis japonica(Thunb.)Dippel带花或果的枝叶。
本发明是这样实现的：鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法为：采用高效液相色谱法或超高效液相色谱法，在同一色谱条件下对鸡眼睛药材中所含的鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷五个成分中的至少两个成分同时进行含量测定。
所述含量测定方法是以鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷五种对照品中的至少两种为对照，以乙腈∶H3PO4水溶液＝6～100∶94～0为流动相梯度洗脱的高效液相色谱法或超高效液相色谱法。
具体的含量测定方法包括以下步骤：
(1)色谱条件：色谱柱为BEH C18柱；乙腈-H3PO4水溶液梯度洗脱；柱温为20℃～50℃；检测波长为220～480nm；
(2)对照品溶液的制备：分别称取鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷对照品中的至少两种，加甲醇溶解后置同一容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：取鸡眼睛药材粉末适量，精密称定，加甲醇适量，提取2～8h，浓缩后用甲醇稀释，得供试品溶液；
(4)测定方法：按照步骤(1)所述色谱条件测定，即得。
前述步骤(1)的色谱条件与***适用性试验为：
仪器：Waters ACQUITY UPLC色谱仪；
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱；
流动相：A为乙腈，B为0.1％～1％H3PO4水溶液，按A∶B＝6～100∶94～0进行梯度洗脱；
流速：0.2mL/min；
柱温：40℃；
检测波长：235～260nm；
进样量：1μL；
理论塔板数计算均在160000以上。
流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的A、B相变化为：开始时，A相6％，B相94％，稳定1min；第19min时，A相35％，B相65％；第22min时，A相100％，B相为0。即按下表1进行洗脱：
表1流动相梯度洗脱表
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 6 | 94 |
| 1 | 6 | 94 |
| 19 | 35 | 65 |
| 22 | 100 | 0 |
前述步骤(2)对照品溶液的制备为：分别称取鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷对照品中的至少两种，加甲醇溶解，得对照品储备液；分别精密量取上述对照品储备液，置同一容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制得浓度≤0.1mg/ml的溶液，即得对照品溶液。所述五种对照品均是采用常规的植化方法从鸡眼睛药材中提取分离所得。
前述步骤(3)供试品溶液的制备为：精密称定鸡眼睛药材粉末约1g，置于索氏提取器中，加甲醇提取2～8h，用少量甲醇洗涤提取器，洗液与提取液合并、浓缩并转移至量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
根据相关资料记载，鸡眼睛药材中含有的鞣花酸类成分，其母核均为鞣花酸，具有活血化瘀、阻断致癌物的致癌、抑制肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡，抑制血管生成和抗氧化等作用，且在药材中相对含量较高。因此为更好地控制鸡眼睛药材的质量，保证药物疗效，本申请人参照中国药典，选定鞣花酸类成分作为质量控制的指标成分，建立了相应的多成分含量测定方法。
为了确保本发明含量测定方法科学、合理、可行，申请人对其进行了一系列的试验研究和考察：
一、色谱条件与***适用性试验
1、仪器与试药
司世ACQUITY UPLC(美国沃特世公司，包括二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Epower 2工作站)；Agilent 1100高效液相色谱仪系列(美国安捷伦科技公司，包括四元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Chemstation工作站)；梅特勒1/10万电子天平(AE240)；超纯水(四川沃特尔科技发展有限公司)。鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷和3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷对照品，均是采用常规的植化方法从鸡眼睛药材中提取分离制备所得，经理化分析和波谱鉴定，UPLC峰面积归一化法计算，其纯度均大于98％。乙腈(色谱纯，江苏汉邦科技有限公司)，其余试剂均为分析纯。实验用鸡眼睛药材由贵州益康制药有限公司提供，由贵阳医学院龙庆德副教授鉴定为省沽油科植物鸡眼睛Euscaphis japonica(Thunb.)Dippel的干燥枝。标本存于贵州省中药民族药研究开发中心。
2、仪器及色谱柱的选择
由于超高效液相色谱(UPLC)使用1.7μm颗粒度的色谱柱填料，能够获得更高的柱效，并且在更宽的线速度范围内柱效保持恒定，因而有利于提高流动相流速，缩短分析时间，提高分析通量，这种固定相还减少了表面残余硅羟基，适合于中药复杂体系的分析。因此试验比较了高效液相色谱(HPLC)法和超高效液相色谱(UPLC)法。
通过上述两种仪器分析和两种色谱柱得到的鸡眼睛药材色谱图结果可见，采用UPLC和小颗粒填料的色谱柱，其色谱峰的分离度、峰形和灵敏度等均优于HPLC，且分析时间缩短近1/3，故优选采用UPLC测定鸡眼睛药材的含量。
3、流动相的选择
由于所测定的成分极性相差较大，流动相等度洗脱较为困难，因此试验采用梯度洗脱，鞣花酸类化合物含有酚羟基，以有机溶剂-水为流动相，色谱峰拖尾严重，故选用乙腈-0.1％～1％磷酸***，谱图中绝大部分色谱峰型对称、分离度好、分析时间短。
在上述试验的基础上对乙腈(A)-0.1％～1％磷酸(B)流动相***的梯度条件进行了优化，流动相按照下表2所述规则进行梯度洗脱。
表2梯度洗脱流动相配比变化程序表
| 时间(min) | 梯度1(A％) | 梯度2(A％) | 梯度3(A％) | 梯度4(A％) |
| 0 | 8 | 6 | 7 | 6 |
| 2 | 8 | 6 | 7 | 6 |
| 19 | 42 | 41 | 38 | 35 |
| 22 | 100 | 100 | 100 | 100 |
在4个洗脱梯度中，所得的色谱峰峰型对称、分离度良好，特别是用梯度4对所分析的化合物分离较好，故采用梯度4进行洗脱。
4、测定波长的选择
鞣花酸类成分均具有紫外吸收，试验选择紫外检测器。经UPLC-PDA测定，其中3，3′-二甲氧基鞣花酸，3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷，3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷，3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷在紫外245nm有最大吸收(见图2-图5)，鞣花酸在紫外254nm有最大吸收，但在245nm也有较大吸收(见图1)，综合考虑选择245nm为含量测定波长。
5、柱温的选择
试验考察了色谱柱温度为35℃、40℃、45℃时对鸡眼睛药材色谱分离效果的影响，色谱图整体面貌相差较小，所选定的上述柱温对色谱峰的分离影响不大。综合考虑各个局部分离度，优先选择柱温40℃。
6、优化后的色谱条件
通过对仪器、流动相、检测波长、柱温等色谱条件进行优化考察的基础上，获得了能适用于多成分含量测定的色谱条件：
仪器：Waters ACQUITY UPLC色谱仪(包括二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Epower 2工作站)；
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；
流动相：A为乙腈，B为0.1％～1％H3PO4，按表1中的规定进行梯度洗脱；
流速：0.2mL/min；
柱温：40℃；
检测波长：245nm；
进样量：1μL；
理论塔板数计算均在160000以上。
二、对照品溶液的制备：
分别称取鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸对照品20.23、8.84、4.78、13.30和6.58mg，分别置五个25mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，摇匀，得对照品储备液。分别精密量取上述对照品储备液各1mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。
三、供试品溶液的制备：
1、提取溶媒的选择
由于鞣花酸类化合物在甲醇中溶解性较好，因此选用甲醇作为提取溶剂。
2、提取方法
试验比较了回流(2h)、超声(1h)和索氏提取(2h)三种方式，结果三者UPLC图谱基本一致，但从五个被测定成分含量值可知，索氏提取优于回流提取和超声提取，故采用以甲醇为溶剂、索氏提取的方法，见表3。同时，试验还对索氏提取时间(2h、4h、6h、8h)进行了考察，结果表明，提取6h基本能将被测物质提取完全，见表4。
表3不同提取方法鸡眼睛药材含量测定结果(n＝2)
表4不同提取时间鸡眼睛药材含量测定结果(n＝2)
3、供试品溶液制备方法的确定
取鸡眼睛药材粉末约1g(过40目)，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇适量，加热回流6h，用少量甲醇洗涤容器，洗液并入提取液，浓缩并转移至10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
四、标准曲线的绘制
分别精密量取对照品溶液0.4μL、0.8μL、1.4μL、1.6μL、1.8μL，按上述优化后的色谱条件进样测定。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
鞣花酸线性关系测定回归方程为：Y＝12492919.12X-61593.24，r＝0.9998，线性范围为：0.032～0.146μg，结果见表5。
表5鞣花酸线性关系测定结果
| 进样序号 | 进样量(μg) | 峰面积 |
| 1 | 0.032 | 342125 |
| 2 | 0.064 | 733445 |
| 进样序号 | 进样量(μg) | 峰面积 |
| 3 | 0.113 | 1327608 |
| 4 | 0.129 | 1552441 |
| 5 | 0.146 | 1733016 |
3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷线性关系测定回归方程为：Y＝6754214.29X-11023.60，r＝0.9997，线性范围为：0.014～0.063μg，结果见表6。
表63，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷线性关系测定结果
| 进样序号 | 进样量(μg) | 峰面积 |
| 1 | 0.014 | 86128 |
| 2 | 0.028 | 175939 |
| 3 | 0.049 | 315024 |
| 4 | 0.056 | 369659 |
| 5 | 0.063 | 416527 |
3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷线性关系测定回归方程为：Y＝6754214.29X-11023.60，r＝0.9998，线性范围为：0.008～0.036μg，结果见表7。
表73，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷线性关系测定结果
| 进样序号 | 进样量(μg) | 峰面积 |
| 1 | 0.008 | 89386 |
| 2 | 0.016 | 184083 |
| 3 | 0.028 | 329978 |
| 4 | 0.032 | 386970 |
| 5 | 0.036 | 439538 |
3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷线性关系测定回归方程为：Y＝9068511.96X-18716.96，r＝0.9998，线性范围为：0.021～0.096μg，结果见表8。
表83，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷线性关系测定结果
| 进样序号 | 进样量(μg) | 峰面积 |
| 1 | 0.021 | 174461 |
| 2 | 0.042 | 359480 |
| 3 | 0.074 | 646305 |
| 4 | 0.085 | 758685 |
| 5 | 0.096 | 851271 |
3，3′-二甲氧基鞣花酸线性关系测定回归方程为：Y＝6953431.54X-9048.10，r＝0.9998，线性范围为：0.011～0.051μg，结果见表9。
表93，3′-二甲氧基鞣花酸线性关系测定结果
| 进样序号 | 进样量(μg) | 峰面积 |
| 1 | 0.011 | 68264 |
| 2 | 0.022 | 143105 |
| 3 | 0.039 | 259784 |
| 4 | 0.045 | 307039 |
| 5 | 0.051 | 344744 |
五、精密度试验
按本发明所述含量测定方法下的色谱条件，精密量取鸡眼睛供试品溶液1μL，连续进样5次，分别测定鞣花酸(A)、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷(B)、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷(C)、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷(D)、3，3′-二甲氧基鞣花酸(E)，记录峰面积积分并计算RSD，结果见表10。
表10精密度试验结果
由上表结果可知，本发明所述含量测定方法的精密度良好。
六、重复性试验
取同一批号鸡眼睛药材供试品6份，照本发明所述含量测定方法下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液6份，分别测定，计算鞣花酸(A)、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷(B)、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷(C)、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷(D)、3，3′-二甲氧基鞣花酸(E)的含量和RSD，结果见表11。
表11重复性试验结果
由上表结果可知，本发明所述含量测定方法的重复性良好。
七、稳定性试验
精密量取鸡眼睛同一供试品溶液1μL，分别于0、1、2、4、8h测定，结果见表12。
表12稳定性试验结果
由上表结果可知，供试品溶液中被测成分8h内稳定。
八、回收率试验
取已测定含量的鸡眼睛药材6份(过40目筛)，每份约0.5g，精密称定，分别精密加入五种对照品混合制得的混合对照品溶液1mL(五种对照品各自在混合对照品溶液中的浓度分别为：鞣花酸对照品0.226mg/mL、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷对照品0.118mg/mL、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷对照品0.121mg/mL、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷对照品0.142mg/mL、3，3′-二甲氧基鞣花酸对照品0.135mg/mL)，室温挥干，按本发明所述含量测定方法下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按本发明所述含量测定方法下的色谱条件测定，计算，结果回收率良好。
鞣花酸回收率试验结果见表13；3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷回收率试验结果见表14；3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷回收率试验结果见表15；3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷回收率试验结果见表16；3，3′-二甲氧基鞣花酸回收率试验结果见表17。
表13鞣花酸回收率试验结果
表143，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷回收率试验结果
表153，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷回收率试验结果
表163，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷回收率试验结果
表173，3′-二甲氧基鞣花酸回收率试验结果
九、样品含量测定
取不同批次的鸡眼睛药材供试品1g，精密称定，照本发明所述含量测定方法下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按本发明所述含量测定方法下的色谱条件测定鞣花酸(A)、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷(B)、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷(C)、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷(D)、3，3′-二甲氧基鞣花酸(E)的含量，计算。结果见表18。
表18不同批次鸡眼睛药材含量测定结果(n＝2)
9个批次样品中：A的平均含量为0.4726mg/g，B的平均含量为0.3314mg/g，C的平均含量为0.2519mg/g，D的平均含量为0.4334mg/g，E的平均含量为0.3636mg/g，五个被测成分总平均含量为1.853mg/g。
经综合评价，结合各***适用性参数情况，并经方法学验证，该方法精确度、重复性、回收率等指标均良好，提高了鸡眼睛药材的质量控制标准，为鸡眼睛药材的再开发应用奠定了基础。
与现有技术相比，本发明采用高效液相色谱法或超高效液相色谱法，在同一色谱条件下对鸡眼睛药材中的多种成分同时进行含量测定，使得鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法更具整体性、特征性和稳定性，而且该方法精密度高，重复性好，回收率高，测量结果准确，可有效控制鸡眼睛药材的质量，从而确保其临床用药的有效性及安全性，为鸡眼睛药材的再开发应用奠定了基础。
附图说明：
图1是鞣花酸对照品溶液的紫外光谱图。
图2是3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液的紫外光谱图。
图3是3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷对照品溶液的紫外光谱图。
图4是3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷对照品溶液的紫外光谱图。
图5是3，3′-二甲氧基鞣花酸对照品溶液的紫外光谱图。
图6是鞣花酸(1)、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷(2)、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷(3)、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷(4)、3，3′-二甲氧基鞣花酸(5)混合对照品溶液的UPLC色谱图。
图7是供试品溶液的UPLC色谱图，色谱峰分别为：鞣花酸(1)、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷(2)、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷(3)、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷(4)、3，3′-二甲氧基鞣花酸(5)。
具体实施方式：
本发明的实施例1：鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法为：
采用超高效液相色谱法，具体包括以下步骤：
(1)色谱条件与***适用性试验：
仪器：Waters ACQUITY UPLC色谱仪(包括二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Epower 2工作站)；
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；
流动相：A为乙腈，B为0.1％H3PO4，按A∶B＝6～100∶94～0进行梯度洗脱；流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的A、B相变化为：开始时，A相6％，B相94％，稳定1min；第19min时，A相35％，B相65％；第22min时，A相100％，B相为0；即按下表(表19)进行洗脱：
表19流动相梯度洗脱表
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 6 | 94 |
| 1 | 6 | 94 |
| 19 | 35 | 65 |
| 22 | 100 | 0 |
流速：0.2mL/min；
柱温：40℃；
检测波长：245nm；
进样量：1μL；
理论塔板数计算均在160000以上。
(2)对照品溶液的制备：分别称取鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸对照品20.23mg、8.84mg、4.78mg、13.30mg、6.58mg，分别置五个25mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，摇匀，得对照品储备液。分别精密量取上述对照品储备液各1mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得浓度≤0.1mg/ml的溶液，即得对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备：精密称定鸡眼睛药材粉末约1g(过40目)，置于索氏提取器中，加甲醇适量，加热回流6h，用少量甲醇洗涤提取器，洗液与提取液合并、浓缩并转移至10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
(4)测定法：按照步骤(1)所述色谱条件测定，即得。
本发明的实施例2：鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法也可以为：
采用超高效液相色谱法，具体包括以下步骤：
(1)色谱条件与***适用性试验：
仪器：Waters ACQUITY UPLC色谱仪；
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱；
流动相：A为乙腈，B为1％H3PO4，按A∶B＝6～100∶94～0进行梯度洗脱；流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的A、B相变化为：开始时，A相6％，B相94％，稳定1min；第19min时，A相35％，B相65％；第22min时，A相100％，B相为0。
流速：0.2mL/min；
柱温：35℃；
检测波长：235～250nm；
进样量：1μL；
理论塔板数计算均在160000以上。
(2)对照品溶液的制备：分别称取鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷对照品适量，加甲醇溶解，得对照品储备液；分别精密量取上述对照品储备液，置同一容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制得浓度≤0.1mg/ml的溶液，即得对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备：精密称定鸡眼睛药材粉末约1g，置于提取器中，加甲醇适量，加热回流提取8h，用少量甲醇洗涤提取器，洗液与提取液合并、浓缩并转移至量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
(4)测定法：按照步骤(1)所述色谱条件测定，即得。
本发明的实施例3：鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法也可以为：
采用超高效液相色谱法，具体包括以下步骤：
(1)色谱条件与***适用性试验：
仪器：Waters ACQUITY UPLC色谱仪；
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱；
流动相：A为乙腈，B为0.5％H3PO4，按A∶B＝6～100∶94～0进行梯度洗脱；流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的A、B相变化为：开始时，A相6％，B相94％，稳定1min；第19min时，A相35％，B相65％；第22min时，A相100％，B相为0。
流速：0.2mL/min；
柱温：45℃；
检测波长：240～260nm；
进样量：1μL；
理论塔板数计算均在160000以上。
(2)对照品溶液的制备：分别称取鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷对照品适量，加甲醇溶解，得对照品储备液；分别精密量取上述对照品储备液，置同一容量瓶中，加甲醇稀释，制得浓度≤0.1mg/ml的溶液，即得对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备：精密称定鸡眼睛药材粉末约1g，置于提取器中，加甲醇超声提取2～6h，用甲醇洗涤提取器，洗液与提取液合并、浓缩并转移至量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
(4)测定法：按照步骤(1)所述色谱条件测定，即得。
本发明的实施例4：鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法还可以为：
采用高效液相色谱法，具体包括以下步骤：
(1)色谱条件与***适用性试验：
仪器：高效液相色谱仪；
色谱柱：BEH C18柱；
流动相：A为乙腈，B为0.1％～1％H3PO4，按A∶B＝6～100∶94～0进行梯度洗脱；
流速：0.2mL/min；
柱温：35℃～45℃；
检测波长：235～260nm；
进样量：1μL；
理论塔板数计算均在160000以上。
(2)对照品溶液的制备：分别称取3，3′-二甲氧基鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷对照品适量，加甲醇溶解后置同一容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备：取鸡眼睛药材粉末适量，精密称定，加甲醇提取4～8h，浓缩后用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
(4)测定法：按照步骤(1)所述色谱条件测定，即得。
Claims (7)
1.鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法，其特征在于：采用高效液相色谱法或超高效液相色谱法，在同一色谱条件下对鸡眼睛药材中所含的鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷五个成分中的至少两个成分同时进行含量测定。
2.按照权利要求1所述鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法，其特征在于：所述含量测定方法是以鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷五种对照品中的至少两种为对照，以乙腈∶H3PO4水溶液＝6～100∶94～0为流动相梯度洗脱的高效液相色谱法或超高效液相色谱法。
3.按照权利要求1或2所述鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)色谱条件：色谱柱为BEH C18柱；乙腈-H3PO4水溶液梯度洗脱；柱温为20℃～50℃；检测波长为220～480nm；
(2)对照品溶液的制备：分别称取鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷对照品中的至少两种，加甲醇溶解后置同一容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：取鸡眼睛药材粉末适量，精密称定，加甲醇适量，提取2～8h，浓缩后用甲醇稀释，得供试品溶液；
(4)测定方法：按照步骤(1)所述色谱条件测定，即得。
4.按照权利要求3所述鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法，其特征在于：步骤(1)的色谱条件与***适用性试验为：
仪器：Waters ACQUITY UPLC色谱仪；
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱；
流动相：A为乙腈，B为0.1％～1％H3PO4水溶液，按A∶B＝6～100∶94～0进行梯度洗脱；
流速：0.2mL/min；
柱温：40℃；
检测波长：235～260nm；
进样量：1μL；
理论塔板数计算均在160000以上。
5.按照权利要求4所述鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法，其特征在于：流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的A、B相变化为：开始时，A相6％，B相94％，稳定1min；第19min时，A相35％，B相65％；第22min时，A相100％，B相为0。
6.按照权利要求3所述鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法，其特征在于：步骤(2)对照品溶液的制备为：分别称取鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-木糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-葡萄糖苷、3，3′-二甲氧基鞣花酸-4′-O-α-D-***糖苷对照品中的至少两种，加甲醇溶解，得对照品储备液；分别精密量取上述对照品储备液，置同一容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制得浓度≤0.1mg/ml的溶液，即得对照品溶液。
7.按照权利要求3所述鸡眼睛药材中鞣花酸类成分的含量测定方法，其特征在于：步骤(3)供试品溶液的制备为：精密称定鸡眼睛药材粉末约1g，置于索氏提取器中，加甲醇提取2～8h，用少量甲醇洗涤提取器，洗液与提取液合并、浓缩并转移至量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
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