CN108949747A - 一种提取rna的试剂盒及应用方法 - Google Patents

一种提取rna的试剂盒及应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种磁珠法提取核糖核酸(RNA)的试剂盒及提取方法，所述试剂盒包括试剂：组织消化液、裂解液、蛋白酶K、DNase Ⅰ、DNase ⅠBuffer、核酸、提取磁珠、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗脱液；本发明还公开了利用所述试剂盒提取组织RNA的方法。本发明试剂盒及方法提高了RNA提取产量、纯度、及RNA完整性，同时可实现自动化提取，实现多样本同时进行平行检测，节约人力、时间成本。

Description

一种提取RNA的试剂盒及应用方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种提取生物组织样本中的核糖核酸(RNA)的试剂盒及提取方法。
背景技术
RNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息向表型转化过程中的桥梁。
RNA提取容易降解，RNA容易降解有内在因素也有外在因素，从自身结构来说RNA是单链分子，本身就很不稳定，另外，RNA分子2’位置上有游离的羟基，易形成2’，3’-环形磷酸盐中间产物，易分解。从外在因素来看，就是RNase无处不在，并且RNase本身热稳定性高、不容易失活，所以在RNA提取过程中，凡是与RNA接触到的器皿都必须是RNase-free的，例如DEPC处理失活RNase、购买RNase-free的实验耗材。
RNA提取最常用的是TRIzol法和离心柱试剂盒法，二者各有优劣，可根据研究目的进行选择。
TRIzol法优点：提取成本低，为最经典常见的RNA提取方法，缺点：操作步骤繁琐、耗时长，提取RNA纯度不高，而且所用试剂大多有毒，对操作人员身体和环境可能造成危害。
试剂法中较常见的过柱法则是结合TRIzol法，加入氯仿分层后取水相RNA过柱提取，较TRIzol法提取RNA纯度高，但是离心等步骤过于繁琐，试剂对操作人员和环境也同样有害。
磁珠法提取RNA,实验过程操作快，加样准确且可以实现自动化提取，但目前国内大多磁珠法提取依然未脱离TRIzol法，与过柱法类似，取加入氯仿分层后的水相，进行核酸吸附。
由此可见，现有技术亟待改善。
发明内容
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种磁珠法提取RNA的试剂盒及应用方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种提取RNA的试剂盒，试剂包括：
核酸提取磁珠、裂解液、蛋白酶K溶液、DNaseⅠ、DNaseⅠBuffer、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗脱液；
所述裂解液包括：终浓度为1～5mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为5～10mmol/L的柠檬酸钠、终浓度为0.5mol/L～2mol/L氯化锂、体积百分比为0.5～5％的Tween-20、体积百分比为0.10％～2％的乙酸钾、终浓度为0.05mg～1mg/ml的糖原，终浓度为10mmol/L～100mmol/L的DTT；
优选地，所述裂解液包括：终浓度为3mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为5mmol/L的柠檬酸钠、终浓度为2mol/L氯化锂、体积百分比为3～5％的Tween-20、终浓度为0.5mg/ml的糖原，终浓度为50mmol/L的DTT；
所述裂解液中LiCl能够促进磁珠对小分子RNA的吸附效果，同时，裂解液中的糖原具有显著的RNA助沉效果，两者共同作用，可以显著提高磁珠提取RNA的产量，尤其是提高了吸附小片段RNA的能力，避免了MicroRNA的损失。
所述裂解液中乙酸钾能够去除样本中多糖组分，有助于得到高纯度RNA。
进一步的，所述试剂盒还包括组织消化液。
所述组织消化液包括：终浓度为10～50mmol/L的Tris-Hcl、终浓度10～20mmol/LCaCL2，终浓度为10mmol/L～100mmol/L的DTT；
优选的，所述组织消化液包括：终浓度为20mmol/L的Tris-Hcl，终浓度为50mmol/L的DTT；
所述消化液主要作用是辅助裂解液消化组织，降低裂解液中胍盐浓度，同时消化液中CaCl2是一种蛋白酶K活性增强剂，可以促进蛋白酶K对组织的消化能力，提高RNA提取产量。
所述消化液中DTT是一种强还原剂，还原RNA酶中二硫键，抑制RNA酶，消化液中和裂解液组分，促进蛋白酶K消化组织。
进一步的，所述蛋白酶K溶液，浓度为5～10mg/ml；优选地，所述蛋白酶K溶液浓度为10mg/ml。
进一步的，所述洗涤液Ⅰ包括：终浓度0.1～0.5mol/L异硫氰酸胍、终浓度50～100mmol/L的Tris-HCl、终浓度为5～10mmol/L的EDTA、体积百分比浓度为0.5％～5％的Tween-20、终浓度为0.1～1mol/L的可溶性盐LiCl、终浓度为10mmol/L～100mmol/L的DTT；体积百分比浓度30～80％的异丙醇；
优选的，所述洗涤液Ⅰ包括：终浓度0.25mol/L异硫氰酸胍、终浓度100mmol/L的Tris-Hcl、终浓度为10mmol/L的EDTA、体积百分比浓度为3％的Tween-20、终浓度为0.5mol/L的可溶性盐LiCl、终浓度为50mmol/L的DTT；体积百分比浓度60％的异丙醇；
所述异硫氰酸胍、DTT可强烈抑制RNA酶，Tween-20作为去污剂，去除残留的蛋白及杂质，LiCl可以促进磁珠与RNA吸附，避免了清洗带来的RNA损失。经过洗涤液Ⅰ处理后，可提高核酸纯度。
进一步的，所述洗涤液Ⅱ包括：终浓度为5～20mmol/L的Tris-HCL、体积百分比浓度70～80％的乙醇；
优选地，所述洗涤液Ⅱ包括：终浓度为10mmol/L的Tris-HCL、体积百分比浓度75％的乙醇，pH8.0。
进一步的，所述DNaseⅠ浓度为1～3U/μl。
进一步的，所述为DNaseⅠBuffer包括：终浓度为5～20mmol/L Tris-HCL、终浓度为10～50mmol/L的MgCl2，终浓度为0.1～1mmol/L CaCl2。
进一步的，所述洗脱液包括：终浓度为5～20mmol/L的Tris-HCL(pH＝8.0)；优选终浓度为10mmol/L的Tris-HCL(pH＝8.0)。
一种利用上述试剂盒提取RNA的方法，包括如下步骤：
(1)将样本于离心管中加入裂解液裂解；
(2)向(1)中裂解后的混合液中加入蛋白酶K溶液；再加入异丙醇吹打混匀；
(3)向(2)所得溶液中加入提取磁珠，混合；
(4)将(3)所得混合液瞬时离心约5s，吸弃液体；
(5)向(4)离心管中加洗涤液Ⅰ进行洗涤，吸弃洗涤液体，晾干；
(6)向(5)离心管中加DNaseⅠ和DNaseⅠBuffer消化；
(7)向(6)离心管中加洗涤液Ⅰ，混合，瞬时离心约5s，吸弃液体；
(8)向(7)离心管中加入洗涤液Ⅱ进行洗涤，吸弃洗涤液体，晾干；
(9)向(8)离心管中加入洗脱液，充分震荡混匀；
(10)将(9)所得混合液瞬时离心约5s，将洗脱液转移至新的离心管中备用。
进一步的，所述RNA提取试剂盒可用于组织、培养细胞或全血等样本的RNA提取。
进一步的，一种利用上述试剂盒提取组织RNA的方法，具体包括如下步骤：
(1)切取组织样本：切取约芝麻粒大小的组织，加入无核酶离心管中；
(2)利用裂解液的高盐及强RNase抑制环境，加入200μl裂解液，吹打疏散组织，可使裂解液加速进入组织内部抑制RNase；加入400μl组织消化液；加入蛋白酶K(10mg/ml)10μl。
(3)利用裂解液及组织消化液的高盐环境，将(2)中的混合液在2000rpm，55℃，10～20min(优选20min)的条件下充***解消化样本，释放组织总核酸，之后向裂解后的混合液中加入与混合液体积相同量的异丙醇吹打混匀；
(4)使用无菌枪头将离心管中的液体全部转移至新的无核酸酶离心管，向(3)中所得混合溶液中加入10～20μl提取磁珠盖上离心管盖，将离心管置于垂直混匀仪上，室温混合10min，让磁珠与核酸充分结合；
(5)取下(4)中的离心管瞬时离心，将离心管置于磁力架上2～3min，待磁珠完全吸附，吸弃液体；
(6)从磁力架上取出(5)中离心管置于离心管板上，加入300～500μl(优选400μl)洗涤液Ⅰ，充分震荡混匀后瞬时离心，再将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附，吸弃洗涤液Ⅰ，晾干30s；
(7)取无核酶离心管加入1～3μl DNaseⅠ(优选2μl),30～50μl DNaseⅠBuffer(优选50μl)混合配制混合液加入(6)离心管中，混匀室温消化10～30min；
(8)向(7)离心管中加入300～500μl(优选400μl)洗涤液Ⅰ充分震荡混匀，室温混合5min，让磁珠与RNA充分结合；
(9)取下(8)中的离心管瞬时离心，将离心管置于磁力架上2～3min，待磁珠完全吸附，吸弃液体，
(10)从磁力架上取出(9)中离心管置于离心管板上，加入300～500μl(优选400μl)洗涤液Ⅱ，充分震荡混匀后瞬时离心，再将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附，吸弃洗涤液Ⅱ；重复一次清洗步骤；将离心管瞬时离心，置于磁力架上，吸弃残余液体，晾干30s；
(11)取下(10)中离心管，向离心管中加入50～100μl洗脱液，充分震荡混匀后将离心管放入恒温震荡混匀仪中2000rpm，10～20min(优选10min)；
(12)取出(11)中离心管瞬时离心，将离心管置于磁力架上2～3min，待磁珠完全吸附，将洗脱液转移至新的离心管中备用。
本发明有益效果：
本发明所用的裂解液为异硫氰酸胍；在提取组织RNA时可快速抑制样本内部RNase,提取RNA完整性高,避免了TRIzol试剂中的苯酚，氯仿等有毒试剂对操作人员的伤害。
在提取RNA过程中，磁珠对核酸吸附达到90％以上，大大提高RNA回收率，避免离心等繁琐操作。
本发明提供一种RNA提取的试剂盒及方法，与现有技术相比，提取RNA提取产量更高、RNA完整性更好。
同时，本发明提取采用的磁珠法可实现自动化提取，实现多样本同时进行平行检测，提高通量及效率，节约人力、时间成本。
附图说明
图1为：本发明提取对比TRIzol提取产物电泳对比图；其中图左：TRIzol提取产物；图右：本试剂盒及方法提取产物；上方条带为28S，下方条带为18S。
图2为：全自动化全血RNA提取电泳图；其中上方条带为28S，下方条带为18S。
具体实施方式
为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。
本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
实施例1本发明RNA提取试剂盒提取全血RNA的方法
取新鲜全血5份,每份200μl，使用本发明RNA提取试剂盒提取具体操作如下：
(1)将200μl样本全部加入1.5ml无核酶离心管中；
(2)向(1)离心管中加入200μl裂解液，10μl蛋白酶K(10mg/ml)，震荡混匀；
(3)将(2)中加入300μl异丙醇，15μl提取磁珠，室温混匀10min；
(4)将(3)离心管瞬时离心约5s，置于磁力架上3min，吸弃液体；
(5)向(4)离心管中加入400μl洗涤液Ⅰ，震荡混匀，瞬时离心，置于磁力架上2min，吸弃液体；
(6)按照下表配制DNaseⅠ及DNaseⅠBuffer混合液：
取50μl上述混合液加至(5)离心管中，震荡混匀，室温消化15min；
(7)向(6)离心管中加入400μl洗涤液Ⅰ，震荡混匀,室温混匀5min，置于磁力架上2min，吸弃液体；
(8)向(7)离心管中加入400μl洗涤液Ⅱ，，震荡混匀，置于磁力架上2min，吸弃液体，重复一次洗涤液Ⅱ清洗，吸弃残夜，晾干30sec。
(9)向(8)中加入100μl洗脱液，充分震荡混匀后将离心管放入恒温震荡混匀仪中2000rpm，10min；
(10)将(9)所得混合液瞬时离心，将离心管置于磁力架上2～3min，待磁珠完全吸附，将洗脱液转移至新的离心管中备用。
实施例2 TRIzol法及本发明RNA试剂盒提取组织RNA的对比效果验证
设计对比试验，比较市面上传统的TRIzol法与本发明RNA试剂盒提取组织RNA的产量、纯度、完整性、对人员及环境的危害等。
取小鼠肝脏，剪切，称重，均分为10份，各30mg；随机分为两组，每组5份。分别按照本发明磁珠法提取RNA试剂盒和传统的TRIzol法各提取5份RNA。
本发明磁珠法提取RNA试剂盒提取操作方法如下：
(1)将样本加入1.5ml无核酶离心管中，
(2)向(1)离心管中加入200μl裂解液，吹打疏散组织，加入400μl组织消化液，10μl蛋白酶K(10mg/ml)，震荡混匀。
(3)将(2)离心管置于2000rpm，55℃，20min，检查离心管内有无组织残渣，若有残余，将离心管离心，取上清转移至新的离心管的中，若无，直接进行(4)操作。
(4)向(3)中加入等体积的异丙醇，加入15μl提取磁珠，室温混匀10min。
(5)将(4)离心管瞬时离心，置于磁力架上3min，吸弃液体。
(6)向(5)离心管中加入400μl洗涤液Ⅰ，震荡混匀，瞬时离心，置于磁力架上2min，吸弃液体。
(7)按照下表配制DNaseⅠ及DNaseⅠBuffer
DNaseⅠ DNaseⅠBuffer
单个样本 3μl 50μl
5个样本 3μl X6＝18μl 50μl X6＝300μl
取50μl混合液中加至(6)离心管中，震荡混匀，室温消化15min。
(8)向(7)离心管中加入400μl洗涤液Ⅰ，震荡混匀,室温混匀5min，置于磁力架上2min，吸弃液体
(9)向(8)离心管中加入400μl洗涤液Ⅱ，震荡混匀，置于磁力架上2min，吸弃液体，重复一次洗涤液Ⅱ清洗，吸弃残夜，晾干30sec；
(10)向(9)中加入100μl洗脱液，充分震荡混匀后将离心管放入恒温震荡混匀仪中2000rpm，10min；
(11)将(10)所得混合液瞬时离心，将离心管置于磁力架上2～3min，待磁珠完全吸附，将洗脱液转移至新的离心管中备用。
选择天根TRIzol Universal Reagent(TRIzol Universal总RNA提取试剂，目录号：DP424)提取RNA效果作为对比试验。
(1)每份组织加入1ml TRIzol Universal试剂，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积一般不要超过TRIzol Universal试剂体积的10％。
(2)将匀浆样品在室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
(3)4℃12,000rpm(～13,400×g)离心10min，取上清。注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。
(4)离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
(5)每使用1ml TRIzol Universal试剂加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置3min。注意：如不能旋涡混匀，可手动快速颠倒混匀2min。
(6)4℃12,000rpm(～13,400×g)离心15min。样品会分成三层：粉色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(约500μl)转移到新的离心管中。
(7)在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min。
(8)4℃12,000rpm(～13,400×g)离心10min，去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
(9)加入1ml 75％乙醇(用RNase-free ddH2O配制)洗涤沉淀。每使用1ml TRIzolUniversal试剂至少用1ml 75％乙醇对沉淀进行洗涤。
(10)4℃10,000rpm(～9,391×g)离心5min。倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。
(11)室温放置晾干(不要晾的过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min左右即可)，根据实验需要，加入30-100μl RNase-Free ddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。
将本发明RNA试剂盒与TRIzol Universal总RNA提取试剂提取的RNA进行浓度测定、定量250ng 1％琼脂糖凝胶电泳。电泳图见图1。
汇总两种方法提取RNA产量、纯度、完整性、对人员及环境的危害汇总如下表。
编号 纯度 RNA总量(μg) 完整性 是否含有毒物质
本发明-1 2.20 13.3 +++ 无
本发明-2 2.19 14.8 +++ 无
本发明-3 2.15 15.3 +++ 无
本发明-4 2.10 15.0 +++ 无
本发明-5 2.25 13.1 +++ 无
天根-1 1.91 12.8 + 有
天根-2 1.70 11.2 + 有
天根-3 1.83 13.7 + 有
天根-4 1.75 12.7 + 有
天根-5 1.99 11.2 + 有
注：“---”代表RNA完全降解，“-”代表RNA部分降解，“+”代表RNA完整性较好、有两条带，“+++”代表RNA完整性好无降解。
由此可见，本发明提取的RNA纯度明显优于传统方法；直接产量略优于传统方法，但是本发明的提取物纯度明显高于传统方法，即传统方法产物中杂质将多于本发明提取物，可以认为本发明提取产物中有效的RNA产量是大大优于传统方法提取物的；本发明提取产物的完整性均优于传统的TRIzol法。且本发明操作简便，易于推广。
实施例3氯化锂与糖原浓度在RNA提取中效果验证
设计实验，验证裂解液中氯化锂与糖原不同浓度组合情况下，对RNA提取效果的影响。按照本发明裂解液配制组分要求及浓度范围配制裂解液：3mol异硫氰酸胍、10mmol/L的柠檬酸钠、体积百分比为2％Tween-20、体积百分比为1％的乙酸钾、终浓度为10mM DTT；糖原浓度分别设置为0mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL五个浓度梯度；氯化锂浓度分别设置为0mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L四个浓度梯度。两种组分各浓度分别组合后，共产生20个浓度组合。
按照实施例一所述方法对全血样本进行RNA提取，并测定RNA浓度，计算RNA提取产量。20个不同浓度组合提取RNA产量结果汇总如下表。
RNA样本浓度信息表：
综上所述，添加氯化锂的样本RNA产量提高5％～20％,其中当糖原浓度为0.2～0.5mg,氯化锂浓度0.5mol～1mol时RNA浓度约提高20％。
实施例4：乙酸钾对RNA纯度效果验证
按照本发明裂解液配制组分要求及浓度范围配制裂解液：终浓度为3mol的异硫氰酸胍、5mol的柠檬酸钠，体积百分比为3％的Tween-20，终浓度为0.5mol的氯化锂，0.2mg/ml的糖原、终浓度为20mM DTT；乙酸钾的体积百分比浓度分别设置为0％、0.5％、1％、2％、3％、5％六个百分比浓度梯度。
按照实施例一所述方法对全血样本进行RNA提取，并测定RNA纯度，5个不同乙酸钾百分比浓度提取RNA纯度结果汇总如下表。
纯度信息表：
上表显示，添加乙酸钾能够明显提高RNA纯度，当乙酸甲百分比浓度达到2％至5％情况时，纯度基本趋于一致，由此可得出，2％的乙酸钾即可达到较高纯度要求。
实施例5一种自动化提取全血RNA的验证
传统的TRIzol法和离心柱试剂盒法由于操作步骤中需要多次高速离心、倾倒废液步骤，不易实现自动化。本发明磁珠法提取RNA可轻松实现自动化，提高样本检测通量及效率，同时降低人工及时间成本、减少人为因素、操作简单、满足数据库建设对大批量样本提取的需要。
本发明提取RNA的试剂盒采用KingFisherTMDuo Prime自动化核酸提取工作站提取全血RNA，试剂添加方法如下：在96深孔板B行8个的深孔中，分别加入200ul新鲜全血、200μl裂解液，10μl蛋白酶K(10mg/ml)。在A行的孔中加入50μl磁珠提取液，在C行的孔中加入100μl DNaseⅠ工作液，在D行的孔中加入500μl洗涤液Ⅰ，在E、F行的孔中加入500μl洗涤液Ⅱ，在G行放入一个新的磁套，并将50μl洗脱缓冲液加入到洗脱条中。
KingFisherTMDuo Prime开始运行程序后，自动化操作如下：
(1)首先取磁套在B行混匀裂解10min；
(2)暂停加入300μl异丙醇，继续运行程序；
(3)磁棒取A行的磁珠加入B行结合10分钟吸取RNA；
(4)DNaseⅠ消化、清洗三次；
(5)在洗脱条中洗涤RNA产物。
将获得的RNA提取产物进行浓度测定，定量250ng进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图2。
根据电泳结果得知，按照自动化程序提取的RNA产量跟手工提取的产量相差不大，且完整性良好。自动化方法提取RNA方法更易于科研及临床推广应用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种提取RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下试剂：
核酸提取磁珠、裂解液、蛋白酶K溶液、DNaseⅠ、DNaseⅠBuffer、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗脱液；
所述裂解液包括：终浓度为1～5mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为5～10mmol/L的柠檬酸钠、终浓度为0.5mol/L～2mol/L氯化锂、体积百分比为0.5～5％的Tween-20、体积百分比为0.10％～2％乙酸钾、终浓度为0.05mg～1mg/ml的糖原，终浓度为10mmol/L～100mmol/L的DTT。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括组织消化液；
所述组织消化液包括：终浓度为10～50mmol/L的Tris-Hcl、终浓度10～20mmol/LCaCl2，终浓度为10mmol/L～100mmol/L的DTT。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K溶液，浓度为5～10mg/ml。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液Ⅰ包括：终浓度0.1～0.5mol/L异硫氰酸胍、终浓度50～100mmol/L的Tris-HCl、终浓度为5～10mmol/L的EDTA、体积百分比浓度为0.5％～5％的Tween-20、终浓度为0.1～1mol/L的可溶性盐LiCl、终浓度为10mmol/L～100mmol/L的DTT；体积百分比浓度30～80％的异丙醇。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液Ⅱ包括：终浓度为5～20mmol/L的Tris-HCL、体积百分比浓度70～80％的乙醇。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNaseⅠ浓度为1～3U/μl。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述为DNaseⅠBuffer包括：终浓度为5～20mmol/L的Tris-HCL、终浓度为10～50mmol/L的MgCl2，终浓度为0.1～1mmol/L的CaCl2。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包括：终浓度为5～20mmol/L的Tris-HCL(pH＝8.0)。
9.一种利用上述试剂盒提取RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将样本于离心管中加入裂解液裂解；
(2)向(1)中裂解后的混合液中加入蛋白酶K溶液；再加入异丙醇吹打混匀；
(3)向(2)所得溶液中加入核酸提取磁珠，混合；
(4)将(3)所得混合液瞬时离心，吸弃液体；
(5)向(4)离心管中加洗涤液Ⅰ进行洗涤，吸弃洗涤液体，晾干；
(6)向(5)离心管中加DNaseⅠ和DNaseⅠBuffer消化；
(7)向(6)离心管中加洗涤液Ⅰ，混合，瞬时离心，吸弃液体；
(8)向(7)离心管中加入洗涤液Ⅱ进行洗涤，吸弃洗涤液体，晾干；
(9)向(8)离心管中加入洗脱液，充分震荡混匀；
(10)将(9)所得混合液瞬时离心，将洗脱液转移至新的离心管中备用。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA提取试剂盒可用于组织、培养细胞或血液样本的RNA提取。
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