CN108925803A - 一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法 - Google Patents
一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法 Download PDFInfo
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Classifications
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Abstract
本发明涉及生物化工领域，具体涉及一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法。本发明以冠突散囊菌为发酵菌源，通过分离获取冠突散囊菌菌种、制备第一培养基、发酵、出料、一次均质、过滤、加稳定剂和二次均质、杀菌灌装等七个步骤，通过添加红薯、山药、芹菜汁、甘蓝、洋葱、大蒜、猕猴桃汁等新鲜的果蔬汁，经发酵、均质、过滤、灭菌、灌装制备出新型的具有芳香型的、营养成分多样的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，通过此方法制备的饮品不但营养丰富，通过天然果蔬使得气味清香，并且具有清肠胃、助消化、降血脂、增强免疫力的保健功效。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工领域，具体涉及一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法。
背景技术
冠突散囊菌(Eurotium cristatum)又名冠突曲霉，属于散囊菌目发菌科散囊属的一种真菌，其闭囊壳，色泽金黄，俗称“金花”，冠突散囊菌主要存在于中国传统发酵茶茯砖茶中，土壤、冬虫夏草、中药材和木屑中也有分布。茯砖茶独特的品质和别具的风味都主要归功于冠突散囊菌。所以，在茯砖茶的发酵过程中，冠突散囊菌有着举足轻重的作用。在国家标准中，茯砖茶也是黑茶中唯一有“冠突散囊菌”这一指标的品种。在黑茶发酵的过程中，“金花”的数量和质量往往直接决定了茯砖茶的品质。茯砖茶作为一种发酵茶，含有多种益生菌，可以促进人体消化微生态平衡，有效调节人体新陈代谢，具有抗氧化、助消化、降脂减肥、降低胆固醇等保健功效。
研究显示冠突散囊菌在培养基中培养出的菌丝富含各种氨基酸，包括了所有的必需氨基酸，其产生的黄色闭束壳，能增进黑茶汤色，产生独特菌香味，对增进茯砖茶品质有良好效果，而在茯砖茶的研究中，冠突散囊菌具有良好的产酶能力，能分泌多酚氧化酶、果胶酶、纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶等胞外酶，与茶叶内含物发生微量的、复杂的生化反应的结果，生成冠突散囊菌特有的“菌花香”，菌花香积累的量越多，香味越浓郁。蛋白酶可催化蛋白质的肽键水解形成多肽和氨基酸，而氨基酸进一步发生水解、脱羧、缩合等反应，形成茶叶的香气成分；发酵过程中，冠突散囊菌产生的淀粉酶主要催化淀粉及多糖类物质的水解，生成小分子的可溶性碳水化合物，从而保证发酵液的滋味、香气的形成；果胶酶是能分解果胶物质的一大类酶，它们能降解茶叶细胞壁，生成小分子的糖类物质，同时有利于释放茶叶细胞内的可溶性糖、茶多糖等物质，能为微生物的生长提供碳源，也能改善茶叶的滋味品质。
目前随着人们对茯砖茶的研究日益成熟，尤其是茯砖茶在品质和保健功效方面的研究也引起人们的广泛关注。研究人员在以冠突散囊为优势菌的茯砖茶中检测到大量吡嗪类酱味物质。肖文军等发现茯砖茶发酵产物可以降低大鼠体内胆固醇、甘油三酯的含量，且大鼠的血常规、肝肾功能均无异常。黄群等发现茯茶发酵液可以显著提高蛋白酶和α-淀粉酶的活力，并且同时抑制脂肪酶的活性，进而有利于淀粉、蛋白质的消化吸收并抑制脂肪分解吸收，进而起到减肥功效。许爱清等发现茯砖茶发酵液可以维护肠道粘膜的完整性、保护肝肾免受损害，增强机体的免疫力。这些都得益于茯砖茶中冠突散囊菌的作用，但是冠突散囊菌在饮品的开发方面却进展缓慢，如何兼顾饮品特性和冠突散囊菌的品质，开发出营养全面并且具有特殊功效的冠突散囊菌饮品成为接下来人们关注的焦点。康乐宁等以富产冠突散囊菌的茯砖茶为原料，开发出具有降血脂、抗氧化、抗辐射功能的保健饮品，但是也仅限于以茶汁为基础原料，还添加了一些甜酸味剂制得。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种营养成分多样的冠突散囊菌保健饮品的制备方法，本发明的目的之二是提供一种不添加任何化学添加剂而具有芳香味的冠突散囊菌保健饮品的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，包括如下步骤
步骤一：获取冠突散囊菌菌种，
步骤二：制备第一培养基，
由质量体积比分别为：1％～4％的蔗糖、0.1％～0.3％的大豆蛋白、0.1％～1.2％氯化钠和余量为去离子水混合，制得第一培养基；
步骤三：发酵，
将通过步骤一获取的冠突散囊菌孢子液，按质量体积比2％～4％的接种量，接入装有由步骤二制备的第一培养基的发酵罐中，调节pH值为5.2～8.0，转速100～500rpm，按质量体积比为20％～40％溶氧，保持罐内温度为28～30℃，培养4～7天，菌丝球直径在0.5～2mm时停止发酵；
步骤四：一次均质、过滤，
将步骤三发酵好的发酵物储存在储料罐中，然后将储料罐中的发酵物经45～50MPa高压均质处理，使发酵产生的菌丝球破碎后，再过滤，除去菌体残渣不溶物，保留滤液；
步骤五：加稳定剂、二次均质，
往步骤四所得滤液中加入由蔗糖酯和羧甲基纤维素钠组成的复合稳定剂，其中蔗糖酯和羧甲基纤维素钠的质量比为1:0.5～1:1，添加量为滤液重量的0.04％～0.06％，在50～60MPa下进行第二次均质处理；
步骤六：杀菌、灌装，
将步骤五处理过的混合液，经过杀菌后进行无菌灌装，即完成制备过程。
所述的步骤一中获取冠突散囊菌菌种是用无菌拔针挑取茯砖茶块上的黄色闭囊壳，接种于第二培养基上，在恒温30℃的条件下培养，待菌落生长进入旺盛期时，用无菌接种环，挑取黄色闭囊壳进行第二培养基平板划线，经2～3次第二培养基平板划线初步纯化该菌；选取单菌落，接种于空白的第二培养基上，继续培养，该第二培养基上的单菌落即为纯冠突散囊菌；观察其菌落特征，并结合显微镜检测个体形态特征，符合冠突散囊菌的基本形态要求，用接种环挑取冠突散囊菌，接种于100mL无菌水中，振摇10-20min，制成均匀的孢子液，并进行10倍递增稀释，制成10-2～10-5稀释度的孢子悬液，得到冠突散囊菌菌种；
所述的第二培养基为PDA琼脂平板培养基。
所述的步骤二中的第一培养基中还添加有质量体积比为1-20％的果蔬汁。
所述的果蔬汁是由红薯或山药或芹菜或甘蓝或洋葱或大蒜或猕猴桃中的一种或几种制备而成的汁液。
所述的步骤二中的第一培养基中还添加重量体积比为：5％～10％红薯、12％～15％山药汁，经发酵时间4～5d而成。
所述的步骤二中的第一培养基中添加质量体积比为：2％～6％芹菜、4％～8％甘蓝汁，经发酵时间5～6d而成。
所述的步骤二中的第一培养基中添加质量体积比为：3％～9％洋葱、5％～8％大蒜汁、4％～7％猕猴桃汁，经发酵时间6～7d而成。
所述的步骤六中将步骤五处理过的混合液，采用UHT杀菌工艺，在135～140℃条件下杀菌4～6s；对杀菌后的混合液，使产品温度自然降温至40℃后无菌灌装；或将步骤六中将步骤五处理过的混合液，先灌装后再采用UHT杀菌工艺，在140℃条件下杀菌6s，即得成品。
所述的将步骤六处理过的混合液，采用UHT杀菌工艺，在135℃条件下杀菌4s，杀菌完成后，使产品温度自然降温至40℃后，经减压干燥后分装。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种以冠突散囊菌为发酵菌源，通过添加红薯、山药、芹菜汁、甘蓝、洋葱、大蒜、猕猴桃汁等新鲜的果蔬汁，经发酵、均质、过滤、灭菌、灌装制备出新型的具有芳香型的、营养成分多样的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，通过此方法制备的饮品不但营养丰富，通过天然果蔬使得气味清香，并且具有清肠胃、助消化、降血脂、增强免疫力的保健功效。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明制备方法流程示意图；
图2是本发明电子鼻传感器响应值的PCA结果；
图3是本发明电子鼻传感器响应值的LDA结果；
图4是本发明实施例2产品感官评价雷达图；
图5是本发明实施例3产品感官评价雷达图；
图6是本发明实施例4感官评价雷达图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
如图1所示的一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：获取冠突散囊菌菌种，
步骤二：制备第一培养基，
由质量体积比分别为：1％～4％的蔗糖、0.1％～0.3％的大豆蛋白、0.1％～1.2％氯化钠和去离子水制备第一培养基；
步骤三：发酵，
将通过步骤一获取的冠突散囊菌孢子液，按质量体积比2％～4％的接种量，接入装有由步骤二制备的第一培养基的发酵罐中，调节pH值为5.2～8.0，转速100～500rpm，按质量体积比20％～40％溶氧，保持罐内温度为28～30℃，培养4～7天，菌丝球直径在0.5～2mm时停止发酵；
步骤四：一次均质、过滤，
将步骤三发酵好的发酵物储存在储料罐中，然后将储料罐中的发酵物经45～50MPa高压均质处理，使发酵产生的菌丝球破碎后，再过滤，除去菌体残渣不溶物，保留滤液；
步骤五：加稳定剂、二次均质，
往步骤四所得滤液中加入由蔗糖酯和羧甲基纤维素钠组成的复合稳定剂，其中蔗糖酯和羧甲基纤维素钠的质量比为1:0.5～1:1，添加量为滤液重量的0.04％～0.06％，在50～60MPa下进行第二次均质处理；
步骤六：杀菌、灌装，
将步骤五处理过的混合液，经过杀菌后进行无菌灌装，即完成制备过程。
优选的是所述的步骤一中获取冠突散囊菌菌种是用无菌拔针挑取茯砖茶块上的黄色闭囊壳，接种于第二培养基上，在恒温30℃的条件下培养，待菌落生长进入旺盛期时，用无菌接种环，挑取黄色闭囊壳进行第二培养基平板划线，经2～3次第二培养基平板划线初步纯化该菌；选取单菌落，接种于空白的第二培养基上，继续培养，该第二培养基上的单菌落即为纯冠突散囊菌；观察其菌落特征，并结合显微镜检测个体形态特征，符合冠突散囊菌的基本形态要求，用接种环挑取冠突散囊菌，接种于100mL无菌水中，振摇10-20min，制成均匀的孢子液，并进行10倍递增稀释，制成10-2～10-5稀释度的孢子悬液，得到冠突散囊菌菌种；
优选的是所述的第二培养基为PDA琼脂平板培养基。
本发明以冠突散囊菌为发酵菌源，经发酵、均质、过滤、灭菌、灌装制备出新型的具有芳香型的、营养成分多样的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，通过此方法制备的饮品不但营养丰富，通过天然果蔬使得气味清香，并且具有清肠胃、助消化、降血脂、增强免疫力的保健功效。其中冠突散囊菌在PDA培养基上的生长较快。
实施例二：
如图1、图2、图3和图4所示的一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：获取冠突散囊菌菌种，
用无菌拔针挑取茯砖茶块上的黄色闭囊壳，接种于第二培养基上，在恒温30℃的条件下培养，待菌落生长进入旺盛期时，用无菌接种环，挑取少量黄色闭囊壳进行第二培养基平板划线，经2次第二培养基平板划线初步纯化该菌；选取单菌落，接种于空白的第二培养基上，继续培养，该第二培养基上的单菌落即为纯冠突散囊菌；观察其菌落特征，并结合显微镜检测个体形态特征，符合冠突散囊菌的基本形态要求，用接种环挑取适量冠突散囊菌，接种于100mL无菌水中，振摇10min，制成均匀的孢子液，并进行10倍递增稀释，制成10-2～10-5稀释度的孢子悬液；
步骤二：制备第一培养基，
由质量体积比为4％的蔗糖、0.2％的大豆蛋白、0.5％氯化钠和去离子水，并添5％红薯、12％山药汁，发酵时间5d制得第一培养基；
步骤三：发酵，
将通过步骤一获取的冠突散囊菌孢子液，按质量体积比2％的接种量，接入装有由步骤二制备的第一培养基的50L发酵罐中，调节pH值为7.2，转速400rpm，按质量体积比20％溶氧，保持罐内温度为30℃，培养5天，观察菌丝球直径在0.5mm，发酵液颜色红艳透明，甜香味浓郁时停止发酵；
步骤四：一次均质、过滤，
将步骤三发酵好的发酵物储存在储料罐中，然后将储料罐中的发酵物经50MPa高压均质处理，使发酵产生的菌丝球破碎后，再过滤，除去菌体残渣不溶物，保留滤液；
步骤五：步加稳定剂、二次均质，
往步骤四所得滤液中加入由蔗糖酯和羧甲基纤维素钠组成的复合稳定剂，其中蔗糖酯和羧甲基纤维素钠的质量比为1:1，添加量为滤液重量的0.05％，在60MPa下进行第二次均质处理；
步骤六：杀菌、灌装：
将步骤六处理过的混合液，采用UHT杀菌工艺，在140℃条件下杀菌4s；对杀菌后的混合液，分段冷却，使产品温度降至40℃后无菌灌装，即得成品。
在具体实施时，此方法制备的饮品不仅具有清肠胃、助消化、降血脂、增强免疫力功效，通过在第一培养基中再添加重量体积比为：5％红薯、12％山药汁，进行5d发酵制备培养基，使得制备好的饮品呈蘑菇、巧克力香味，香味物质的成分为L-芳樟醇、1-辛烯-3-醇、异戊醇、1-辛醇之中的一种或者几种，改善了制成饮品的口感。
对制备好的冠突散囊菌饮品还进行如下测试：
1、对制备好的冠突散囊菌饮品利用电子鼻技术进行香味物质分类
本实验采用法国AlphaM.O.S的FOX 3000电子鼻***(具有LY，T和P独立的传感室，18根金属氧化物传感器)，同时配有HS100自动进样器和Alpha SoftV11数据分析处理软件。检测时准确称取发酵液离心样品10mL，放入顶空瓶中，加盖密封于4℃以下低温保存待检。电子鼻分析参数如下：样品平衡30min后进行分析，以合成干燥空气为载气，流速200mL/min；顶空产生参数：时间10min，温度50℃，搅动速度250rpm；顶空注射参数：注射体积2500μL，注射速度600μL/s，注射针温度50℃，最后数据获取时间为180s，为了保证结果的准确性及重复性，每个样品重复测定。
准确称取冠突散囊菌饮品样品10ml，放入顶空瓶中，加盖密封于4℃以下低温保存待检。电子鼻分析参数如下：样品平衡30min后进行分析，以合成干燥空气为载气，流速200mL/min；顶空产生参数：时间10min，温度50℃，搅动速度250rpm；顶空注射参数：注射体积2500μL，注射速度600μL/s，注射针温度50℃，最后数据获取时间为180s，为了保证结果的准确性及重复性，每个样品重复测定。电子鼻传感器响应值的主成分分析法(PCA)与线性函数判别分析法(LDA)结果见图2和图3。
2、对制备好的冠突散囊菌饮品利用气相色谱-质谱联用技术对冠突散囊菌饮品进行香气成分测定
色谱柱：ZB-5弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.2μm)，柱温40℃(保留2min)，以5℃/min升温至270℃，运行时间：48min；汽化室温度：250℃；载气为高纯He(99.999％)；柱前压52.54kPa，载气流速1.0mL/min；不分流进样；溶剂延迟时间：1min。
气相色谱条件：电子电离(elctronic ionization，EI)源，离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6μA；倍增器电压1294V；接口温度280℃；质量范围20～450amu。
均匀取饮品上清约10g，置于50mL固相微萃取仪采样瓶中，***手动进样器，在温度120℃左右顶空萃取40min后取出，快速移出萃取头并立即***气相色谱仪进样口，热解吸3min进样。
GC-MS对本实施例中冠突散囊菌饮品中香气成分分析结果见表1(冠突散囊菌饮品中香气成分分析结果)。
本实施例中香气成分含量最多的是醇类，其中以L-芳樟醇相对含量最高，达到28.32％，说明L-芳樟醇对本实施例中的冠突散囊菌饮品体现出来的蘑菇、巧克力香味贡献最大。
3、对制备好的冠突散囊菌饮品进行感官评价
将本实施例得到的芳香型的冠突散囊菌功能性饮品分别灌装，每瓶装50ml。饮品试用人数100人，其中青年30名，中年40名，老年30名，各组男女比例均为1:1。感官评价指标如表2(冠突散囊菌饮品感官评价指标)所示。图4感官评价雷达图表明，本实施例中冠突散囊菌饮品色泽金黄、质地醇厚，无沉淀、无肉眼可见的悬浮颗粒、口感酸甜适中，香型方面，青年人群与中年、老年人群相比更能感受到浓郁的蘑菇、巧克力香。测试样品中没有苦味、酸味和涩味，说明测试样品品质良好。
表1冠突散囊菌饮品中香气成分分析结果
表2冠突散囊菌饮品感官评价指标
实施例三：
如图1、图2、图3和图5所示的一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：获取冠突散囊菌菌种，
用无菌拔针挑取茯砖茶块上的黄色闭囊壳，接种于第二培养基上，在恒温30℃的条件下培养，待菌落生长进入旺盛期时，用无菌接种环，挑取少量黄色闭囊壳进行第二培养基平板划线，经3次第二培养基平板划线初步纯化该菌；选取单菌落，接种于空白的第二培养基上，继续培养，该第二培养基上的单菌落即为纯冠突散囊菌；观察其菌落特征，并结合显微镜检测个体形态特征，符合冠突散囊菌的基本形态要求，用接种环挑取适量冠突散囊菌，接种于100mL无菌水中，振摇10min，制成均匀的孢子液，并进行10倍递增稀释，制成10-4稀释度的孢子悬液；
步骤二：制备第一培养基，
由按质量体积比为：2.5％的蔗糖、0.1％的大豆蛋白、0.6％氯化钠和去离子水，并添2％芹菜、8％甘蓝汁，发酵时间4d制得第一培养基；
步骤三：发酵，
将通过步骤一获取的冠突散囊菌孢子液，按质量体积比为2％的接种量，接入装有由步骤二制备的第一培养基的50L发酵罐中，调节pH值为7.2，转速400rpm，按质量体积比20％溶氧，保持罐内温度为30℃，培养5天，观察菌丝球直径在0.5mm，停止发酵；
步骤四：一次均质、过滤，
将步骤三发酵好的发酵物储存在储料罐中，然后将储料罐中的发酵物经45MPa高压均质处理，使发酵产生的菌丝球破碎后，再过滤，除去菌体残渣不溶物，保留滤液；
步骤五：步加稳定剂、二次均质，
往步骤五所得滤液中加入由蔗糖酯和羧甲基纤维素钠组成的复合稳定剂，其中蔗糖酯和羧甲基纤维素钠的质量比位1:1，添加量为滤液重量的0.05％，在55MPa下进行第二次均质处理；
步骤六：杀菌、灌装：
将步骤五处理过的混合液，采用UHT杀菌工艺，在140℃条件下杀菌5s；对杀菌后的混合液，分段冷却，使产品温度降至40℃后无菌灌装，完成制备过程。
在具体实施时，此方法制备的饮品不仅具有清肠胃、助消化、降血脂、增强免疫力功效，且此时饮品呈青草、果香味，香味物质的成分为3-甲基丁醛、2-甲基丁醛以及己醛中的一种或几种，有效改善了制成饮品的口感。
对制备好的冠突散囊菌饮品还进行如下测试：
1、电子鼻技术对冠突散囊菌饮品中的香味物质进行分类
本实验采用法国AlphaM.O.S的FOX 3000电子鼻***(具有LY，T和P独立的传感室，18根金属氧化物传感器)，同时配有HS100自动进样器和Alpha SoftV11数据分析处理软件。检测时准确称取发酵液离心样品10mL，放入顶空瓶中，加盖密封于4℃以下低温保存待检。电子鼻分析参数如下：样品平衡30min后进行分析，以合成干燥空气为载气，流速200mL/min；顶空产生参数：时间10min，温度50℃，搅动速度250rpm；顶空注射参数：注射体积2500μL，注射速度600μL/s，注射针温度50℃，最后数据获取时间为180s，为了保证结果的准确性及重复性，每个样品重复测定。
准确称取冠突散囊菌饮品样品10ml，放入顶空瓶中，加盖密封于4℃以下低温保存待检。电子鼻分析参数如下：样品平衡30min后进行分析，以合成干燥空气为载气，流速200mL/min；顶空产生参数：时间10min，温度50℃，搅动速度250rpm；顶空注射参数：注射体积2500μL，注射速度600μL/s，注射针温度50℃，最后数据获取时间为180s，为了保证结果的准确性及重复性，每个样品重复测定。电子鼻传感器响应值的PCA与LDA结果见图2、图3。
2、气相色谱-质谱联用技术对冠突散囊菌饮品进行香气成分测定
色谱柱：ZB-5弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.2μm)，柱温40℃(保留2min)，以5℃/min升温至270℃，运行时间：48min；汽化室温度：250℃；载气为高纯He(99.999％)；柱前压52.54kPa，载气流速1.0mL/min；不分流进样；溶剂延迟时间：1min。
气相色谱条件：电子电离(elctronic ionization，EI)源，离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6μA；倍增器电压1294V；接口温度280℃；质量范围20～450amu。
均匀取冠突散囊菌饮品约10g，置于50mL固相微萃取仪采样瓶中，***手动进样器，在温度120℃左右顶空萃取40min后取出，快速移出萃取头并立即***气相色谱仪进样口，热解吸3min进样。
GC-MS对本实施例中冠突散囊菌饮品中香气成分分析结果见表1(冠突散囊菌饮品中香气成分分析结果)。
本实施例中香气成分含量最多的是醛类，其中以三甲基-丁醛相对含量最高，为15.92％，说明三甲基-丁醛对本实施例中的冠突散囊菌饮品体现出来的青草、果香味贡献最大。
3、本实施例中冠突散囊菌功能性饮品的感官评价
将本实施例中得到的芳香型的冠突散囊菌功能性饮品分别灌装，每瓶装50ml。饮品试用人数100人，其中青年30名，中年40名，老年30名，各组男女比例均为1:1。感官评价指标如表2(冠突散囊菌饮品感官评价指标)所示。图5感官评价雷达图表明，本实施例中冠突散囊菌饮品色泽金黄、呈半透明状态，无沉淀、无肉眼可见悬浮颗粒，口感酸甜适中，青年人群更能感受到强烈的青草、果香味。测试样品中没有苦味、酸味和涩味，说明测试样品品质良好。
实施例四：
如图1、图2、图3和图6所示的一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：获取冠突散囊菌菌种，
用无菌拔针挑取茯砖茶块上的黄色闭囊壳，接种于第二培养基上，在恒温30℃的条件下培养，待菌落生长进入旺盛期时，用无菌接种环，挑取黄色闭囊壳进行第二培养基平板划线，经2～3次第二培养基平板划线初步纯化该菌；选取单菌落，接种于空白的第二培养基上，继续培养，该第二培养基上的单菌落即为纯冠突散囊菌；观察其菌落特征，并结合显微镜检测个体形态特征，符合冠突散囊菌的基本形态要求，用接种环挑取冠突散囊菌，接种于100mL无菌水中，振摇10min，制成均匀的孢子液，并进行10倍递增稀释，制成10-2～10-5稀释度的孢子悬液，得到冠突散囊菌菌种；
步骤二：制备第一培养基，
由质量体积比为：1％的蔗糖、0.3％的大豆蛋白、0.4％氯化钠和去离子水，并添3％洋葱、5％大蒜汁、7％猕猴桃汁，发酵时间7d制得培养基；
步骤三：发酵，
将通过步骤一获取的冠突散囊菌孢子液，按质量体积比2％的接种量，接入装有由步骤二制备的第一培养基的50L发酵罐中，调节pH值为7.2，转速400rpm，按质量体积比为20％溶氧，保持罐内温度为30℃，培养5天，当菌丝球直径在0.5mm，停止发酵；
步骤四：一次均质、过滤，
将步骤三发酵好的发酵物储存在储料罐中，然后将储料罐中的发酵物经50MPa高压均质处理，使发酵产生的菌丝球破碎后，再过滤，除去菌体残渣不溶物，保留滤液；
步骤五：步加稳定剂、二次均质，
往步骤四所得滤液中加入由蔗糖酯和羧甲基纤维素钠组成的复合稳定剂，其中蔗糖酯和羧甲基纤维素钠的质量比为1:1，添加量为滤液重量的0.05％，在50MPa下进行第二次均质处理；
步骤六：杀菌、灌装，
将步骤五处理过的混合液，采用UHT杀菌工艺，在140℃条件下杀菌6s；对杀菌后的混合液，使产品温度自然降温至40℃后无菌灌装，即得成品。
在具体实施时，此方法制备的饮品不仅具有清肠胃、助消化、降血脂、增强免疫力功效，通过在第一培养基中添加3％洋葱、5％大蒜汁、7％猕猴桃汁，使得制备成的饮品呈杏仁、坚果油香味，香味物质的成分为3-辛酮、二甲基丁酮、2-庚酮、2-壬酮中的一种或几种，很好的改善了制成饮品的口感。
对制备好的冠突散囊菌饮品还进行如下测试：
1、电子鼻技术对冠突散囊菌饮品中的香味物质进行分类
本实验采用法国AlphaM.O.S的FOX 3000电子鼻***(具有LY，T和P独立的传感室，18根金属氧化物传感器)，同时配有HS100自动进样器和Alpha SoftV11数据分析处理软件。检测时准确称取发酵液离心样品10mL，放入顶空瓶中，加盖密封于4℃以下低温保存待检。电子鼻分析参数如下：样品平衡30min后进行分析，以合成干燥空气为载气，流速200mL/min；顶空产生参数：时间10min，温度50℃，搅动速度250rpm；顶空注射参数：注射体积2500μL，注射速度600μL/s，注射针温度50℃，最后数据获取时间为180s，为了保证结果的准确性及重复性，每个样品重复测定。
准确称取冠突散囊菌饮品样品10ml，放入顶空瓶中，加盖密封于4℃以下低温保存待检。电子鼻分析参数如下：样品平衡30min后进行分析，以合成干燥空气为载气，流速200mL/min；顶空产生参数：时间10min，温度50℃，搅动速度250rpm；顶空注射参数：注射体积2500μL，注射速度600μL/s，注射针温度50℃，最后数据获取时间为180s，为了保证结果的准确性及重复性，每个样品重复测定。电子鼻传感器响应值的PCA与LDA结果见图2、图3
2、气相色谱-质谱联用技术对冠突散囊菌饮品进行香气成分测定
色谱柱：ZB-5弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.2μm)，柱温40℃(保留2min)，以5℃/min升温至270℃，运行时间：48min；汽化室温度：250℃；载气为高纯He(99.999％)；柱前压52.54kPa，载气流速1.0mL/min；不分流进样；溶剂延迟时间：1min。
气相色谱条件：电子电离(elctronic ionization，EI)源，离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6μA；倍增器电压1294V；接口温度280℃；质量范围20～450amu。
均匀取冠突散囊菌饮品约10g，置于50mL固相微萃取仪采样瓶中，***手动进样器，在温度120℃左右顶空萃取40min后取出，快速移出萃取头并立即***气相色谱仪进样口，热解吸3min进样。
GC-MS对本实施例中冠突散囊菌饮品中香气成分分析结果见表1(冠突散囊菌饮品中香气成分分析结果)。本实施例中香气成分含量最多的是酮类，其中以3-辛酮相对含量最高，达到14.86％，说明3-辛酮对本实施例中的冠突散囊菌饮品体现出来的杏仁、坚果油香味贡献最大。
3、本实施例中冠突散囊菌功能性饮品的感官评价
将本实施例中得到的芳香型的冠突散囊菌功能性饮品分别灌装，每瓶装50ml。饮品试用人数100人，其中青年30名，中年40名，老年30名，各组男女比例均为1:1。感官评价指标如表2所示。图6感官评价雷达图表明，本实施例中冠突散囊菌饮品色泽为黄褐色，无分层、无沉淀，香气纯正，与青年和中年人群相比，老年人对杏仁、坚果仁的香气接受度更好。测试样品中没有苦味、酸味和涩味，说明测试样品品质良好。
实施例五：
如图1所示的一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，在实施例一的基础上：所述的步骤六中将步骤五处理过的混合液，采用UHT杀菌工艺，在135～140℃条件下杀菌4～6s；对杀菌后的混合液，使产品温度自然降温至40℃后无菌灌装，即得成品，或将步骤六中将步骤五处理过的混合液，先灌装后再采用UHT杀菌工艺，在140℃条件下杀菌6s，即得成品。
优选的是所述的步骤六中将步骤五处理过的混合液，采用UHT杀菌工艺，在135℃条件下杀菌4s，杀菌完成后，使产品温度自然降温至40℃后，经减压干燥后分装。
在具体实施时，采用此UHT杀菌工艺，并且温度在135～140℃条件下杀菌4～6s，取得了较好的消毒效果，避免了消毒后的饮品在装罐时因不慎造成污染，影响产品的质量，从而大大延长了产品的保质期。灌装方式方便饮品的饮用，并且节约成本。无论消毒后装罐还是装罐后消毒，都能够取得较好的消毒效果，并且保证保质期的需要；如果杀菌完成后，使产品温度自然降至40℃后，经减压干燥后形成固体状的产品，在进行分装后，方便使用者的携带，可以根据需要随时服用，相应的保质期也会得到延长。
综上所述，本发明通过以冠突散囊菌为发酵菌源，通过分离获取冠突散囊菌菌种、制备第一培养基、发酵、出料、一次均质、过滤、加稳定剂和二次均质、杀菌灌装等七个步骤，通过添加红薯、山药、芹菜汁、甘蓝、洋葱、大蒜、猕猴桃汁等新鲜的果蔬汁，经发酵、均质、过滤、灭菌、灌装制备出新型的具有芳香型的、营养成分多样的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，通过此方法制备的饮品不但营养丰富，通过天然果蔬使得气味清香，并且具有清肠胃、助消化、降血脂、增强免疫力的保健功效。
需要说明，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。
各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，其特征在于：包括如下步骤
步骤一：获取冠突散囊菌菌种，
步骤二：制备第一培养基，
由质量体积比分别为：1％～4％的蔗糖、0.1％～0.3％的大豆蛋白、0.1％～1.2％氯化钠和余量为去离子水混合，制得第一培养基；
步骤三：发酵，
将通过步骤一获取的冠突散囊菌孢子液，按质量体积比为2％～4％的接种量，接入装有由步骤二制备的第一培养基中，调节pH值为5.2～8.0，转速100～500rpm，按质量体积比为：20％～40％溶氧，保持罐内温度为28～30℃，培养4～7天，菌丝球直径在0.5～2mm时停止发酵；
步骤四：一次均质、过滤，
将步骤三发酵好的发酵物储存在储料罐中，然后将储料罐中的发酵物经45～50MPa高压均质处理，使发酵产生的菌丝球破碎后，再过滤，除去菌体残渣不溶物，保留滤液；
步骤五：加稳定剂、二次均质，
往步骤四所得滤液中加入由蔗糖酯和羧甲基纤维素钠组成的复合稳定剂，其中蔗糖酯和羧甲基纤维素钠的质量比为1:0.5～1:1，添加量为滤液重量的0.04％～0.06％，在50～60MPa下进行第二次均质处理；
步骤六：杀菌、灌装，
将步骤五处理过的混合液，经过杀菌后进行无菌灌装，即完成制备过程。
2.如权利要求1所述的一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，其特征在于：所述的步骤一中获取冠突散囊菌菌种是用无菌拨针挑取茯砖茶块上的黄色闭囊壳，接种于第二培养基上，在恒温30℃的条件下培养，待菌落生长进入旺盛期时，用无菌接种环，挑取黄色闭囊壳进行第二培养基平板划线，经2～3次第二培养基平板划线初步纯化该菌；选取单菌落，接种于空白的第二培养基上，继续培养，该第二培养基上的单菌落即为纯冠突散囊菌；观察其菌落特征，并结合显微镜检测个体形态特征，符合冠突散囊菌的基本形态要求，用接种环挑取冠突散囊菌，接种于100mL无菌水中，振摇10-20min，制成均匀的孢子液，并进行10倍递增稀释，制成10-2～10-5稀释度的孢子悬液，得到冠突散囊菌菌种。
3.如权利要求2所述的一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，其特征在于：所述的第二培养基为PDA琼脂平板培养基。
4.如权利要求1所述的一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，其特征在于：所述的步骤二中的第一培养基中还添加有质量体积比为1-20％的果蔬汁。
5.如权利要求4所述的一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，其特征在于：所述的果蔬汁是由红薯或山药或芹菜或甘蓝或洋葱或大蒜或猕猴桃中的一种或几种制备而成的汁液。
6.如权利要求1所述的一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，其特征在于：所述的步骤二中的第一培养基中还添加重量体积比为：5％～10％红薯、12％～15％山药汁，经发酵时间4～5d而成。
7.如权利要求1所述的一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，其特征在于：所述的步骤二中的第一培养基中添加质量体积比为：2％～6％芹菜、4％～8％甘蓝汁，经发酵时间5～6d而成。
8.如权利要求1所述的一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，其特征在于：所述的步骤二中的第一培养基中添加质量体积比为：3％～9％洋葱、5％～8％大蒜汁、4％～7％猕猴桃汁，经发酵时间6～7d而成。
9.如权利要求1所述的一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，其特征在于：所述的步骤六中将步骤五处理过的混合液，采用UHT杀菌工艺，在135～140℃条件下杀菌4～6s；对杀菌后的混合液，使产品温度自然降温至40℃后无菌灌装；或将步骤六中将步骤五处理过的混合液，先灌装后再采用UHT杀菌工艺，在140℃条件下杀菌6s，即得成品。
10.如权利要求1所述的一种具有芳香型的冠突散囊菌功能性饮品的制备方法，其特征在于：所述的将步骤六处理过的混合液，采用UHT杀菌工艺，在135℃条件下杀菌4s，杀菌完成后，使产品温度自然降温至40℃后，经减压干燥后分装。
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