CN108883031A - 使用凝胶珠来控制液滴分散 - Google Patents

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Abstract

描述了产生包含单一胶状颗粒的可变形凝胶珠的方法。含有颗粒的凝胶珠与不含颗粒的凝胶珠基于这些凝胶珠群的浮力密度之间的差异进行分离。含有颗粒的凝胶珠随后以高效率封装进入包含其它物体(例如细胞、其它颗粒、或试剂)的液滴。在刚性颗粒上的凝胶覆层能够防止窄通道中的堵塞，例如，液滴产生器的窄通道中的堵塞。

Description

使用凝胶珠来控制液滴分散
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月24日提交的美国临时申请号62/312,650的权益，该申请以其全文纳入本文用于所有目的。
背景技术
基于液滴的技术是一种在生物学、生物技术、计算和化学分析领域具有广阔应用前景的工具。在该技术中，使用微流体技术和装置以数kHz速率在惰性和不互容的载体流或连续相中形成液滴。一旦形成，这些液滴即可以在任意数量的下游步骤中进行组合、拆分(split)和选择。作为该技术特征的速度、小体积和离散型分区已被证明在许多领域中是可用的，例如涉及遗传物质的分析、化学化合物大型库的筛选以及细胞和酶之进化的那些领域。
该技术的一个应用涉及在皮升(picoliter)级单分散液滴内封装个体细胞。这使得能够在单细胞基础上对大细胞群进行定量实验。另一种应用可见于液滴数字PCR(Droplet Digital PCR)中，其中，将聚合酶链式反应样品稀释并分成多个不同的反应，使得每个反应含有待扩增的靶核苷酸序列的至多一个拷贝。由此，通过对其中进行成功PCR扩增的反应的数量计数，可以确定DNA分子的原始拷贝数。在如下文献中讨论了用于基于液滴的技术的其他应用和装置：Koster S，Angile FE，Duan H，Agresti JJ，Wintner A，SchmitzC，Rowat AC，Merten CA，Pisignano D，Griffiths AD和Weitz DA的《用于封装单个细胞的基于液滴的微流体装置(Drop-based microfluidic devices for encapsulation ofsingle cells)》，《芯片实验室(Lab on a Chip)》2008；8：1110，其通过引用纳入本文用于所有目的。
这些技术和应用的主要挑战之一是离散液滴之间材料分布的变化性。因为分布基本上是随机的，所以可能会形成包含比所期望的更多或更少量的材料的液滴。例如，在需要一个颗粒/液滴的应用中，所产生的液滴群的大部分可能会替代性地包含多个颗粒或完全不含颗粒。
在Edd JF、Di Carlo D、Humphry KJ、Koster S、Irimia D、Weitz DA和Toner M.的《单个细胞受控封装到单分散皮升液滴(Controlled encapsulation of single-cellsinto monodisperse picolitre droplets.)》，《芯片实验室》2008；74：61402(其通过引用纳入本文用于所有目的)中描述的所建议的溶液用于调节进入液滴产生装置的细胞流。该调节使得细胞彼此均匀间隔，并且其以与液滴形成精确匹配的频率进入液滴发生器。
在Abate AR,Chen C-H,Agresti,JJ和Weitz DA.的《使用紧密堆积排序法胜过泊松封装统计学(Beating Poisson encapsulation statistics using close-packedordering)》，《芯片实验室》2009；9：2628-2631(其通过引用纳入本文用于所有目的)中描述的替代方案使用紧密堆积的可变形颗粒。这些颗粒包含一种顺应性凝胶(compliant gel)，其结构具有足够的柔韧性以防止通道堵塞。以此方式，颗粒的体积分数可以增加到超出其它方式实际可达的水平，并且可以提高颗粒封装的最终效率。
发明内容
本文提供了用于产生凝胶涂覆颗粒群的方法。在一些实施方式中，所述方法包括：提供大量(例如至少100；200；300；500；750；1000；2500；5000；7500；10,000；15,000；20,000；30,000；50,000；75,000；100,000；250,000；500,000；1x 106个或更多个)颗粒，以及用凝胶涂覆这些颗粒以产生凝胶涂覆颗粒和不含颗粒的凝胶珠的初始混合物，其中，凝胶涂覆颗粒的密度大于凝胶珠的密度。在一些实施方式中，所述方法还包括：允许该混合物沉淀在流体中，使得大部分凝胶涂覆颗粒分散在该流体中低于大部分凝胶珠的位置。在一些实施方式中，所述方法还包括收集凝胶涂覆颗粒，其不含大部分凝胶珠，由此产生收集的凝胶涂覆颗粒群。在一些实施方式中，一些凝胶涂覆颗粒在一块凝胶中包含多个颗粒。
在一些实施方式中，所述方法的颗粒包括聚甲基丙烯酸甲酯、玻璃、聚苯乙烯、或与固相寡核苷酸合成相容的其它聚合物。在一些实施方式中，所述方法的颗粒可以具有约1μm至约60μm范围的直径。在所述方法的一些实施方式中，将寡核苷酸连接至颗粒。在一些实施方式中，所述方法的大部分的颗粒的每一个都可以连接至不同的寡核苷酸，其中，所述不同的寡核苷酸的序列可互相区分。
在一些实施方式中，所述方法的凝胶可以选自：聚丙烯酰胺、琼脂糖、琼脂、PLGA、聚乙二醇或藻酸盐。在一些实施方式中，不含颗粒的凝胶珠可以具有约10μm至约100μm范围的直径。
在一些实施方式中，所述方法的通过涂覆产生的初始混合物可以每包含一个凝胶涂覆颗粒就具有至少10、15、20个或更多个不含颗粒的凝胶珠。
在一些实施方式中，所述方法的流体可以是两种不互溶的流体的混合物。在一些实施方式中，所述两种不互溶的流体是水性流体和油。
在一些实施方式中，所述方法还包括将来自所收集的凝胶涂覆颗粒群的凝胶涂覆颗粒***液滴中。
还提供凝胶涂覆颗粒和不含颗粒的凝胶珠的混合物，其中，凝胶涂覆颗粒的密度大于凝胶珠的密度，并且所述混合物具有至少10个凝胶涂覆颗粒/不含颗粒的凝胶珠。在一些实施方式中，混合物包括至少100；200；300；500；750；1000；2500；5000；7500；10,000；15,000；20,000；30,000；50,000；75,000；100,000；250,000；500,000；1x 106个或更多个的凝胶涂覆颗粒。
在一些实施方式中，所述混合物的颗粒包括聚甲基丙烯酸甲酯、玻璃、聚苯乙烯、或与固相寡核苷酸合成相容的其它聚合物。在一些实施方式中，所述混合物的颗粒可以具有约1μm至约60μm范围的直径。在一些实施方式中，寡核苷酸连接至颗粒。在一些实施方式中，所述混合物的大部分的颗粒的每一个都可以连接至不同的寡核苷酸，其中，所述不同的寡核苷酸的序列可互相区分。
在一些实施方式中，所述混合物的凝胶可以选自：聚丙烯酰胺、琼脂糖、琼脂、PLGA、聚乙二醇或藻酸盐。在一些实施方式中，所述方法的不含颗粒的凝胶珠可以具有约10μm至约100μm范围的直径。
附图说明
图1显示出用于产生凝胶涂覆颗粒和不含颗粒的凝胶珠的混合物的颗粒封装装置的示意图。
图2显示出基于凝胶涂覆颗粒和不含颗粒的凝胶珠的浮力密度上的差异来用于分离富集的凝胶涂覆颗粒群的分离装置的示意图。
图3显示出用于生产用液滴共同封装的凝胶涂覆颗粒群的液滴产生装置的示意图。
定义
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等价的方法、装置和材料。提供以下定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。
如本文所用，术语“凝胶”是指交联材料的稀释网络，其在稳态时显示为不流动。"水凝胶"是其中凝胶的液体组分为水的凝胶。凝胶和水凝胶可以是可形变的。凝胶和水凝胶可以是sol(液态)或gel(固态)形式。在一些情况中，水凝胶是可逆的。可逆的水凝胶可以在sol(液态，本文中也称为“预凝胶”)或gel(固态)形式之间可逆转换。例如，琼脂糖水凝胶可用加热转换成sol形式并用冷却来转换成gel形式。或者，一些水凝胶组合物在转换温度以下以sol形式存在，而在转换温度以上以gel形式存在。一些情况中，sol(液态)水凝胶、或水凝胶前体可以不可逆地硬化成gel形式。例如，丙烯酰胺可以不可逆地聚合成gel形式。如本文所用，sol是指水凝胶的可溶形式或指可溶的水凝胶前体，而gel指固态水凝胶。本领域已知大量可逆和不可逆的水凝胶组合物，包括例如下列文献中所述：美国专利号4,438,258、6,534,083、8,008,476、8,329,763；美国专利申请号2002/0,009,591、2013/0,022,569、2013/0,034,592；和国际专利申请号WO/1997/030092与WO/2001/049240。
本文所用的“寡核苷酸”表示DNA、RNA、单链、双链、或更高度聚集的杂交基序或其任意化学修饰形式。寡核苷酸长度可以变化。在一些实施方式中，寡核苷酸将小于约500个核苷酸长，例如，2-500、5-300、4-100、5-50个核苷酸长。修饰包括但不限于，提供引入其它电荷、极化性、氢键、静电相互作用、与核酸配体碱基或核酸配体整体的连接点和作用点的化学基团的那些修饰。这类修饰包括但不限于，肽核酸(PNA)、磷酸二酯基团修饰(例如，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2'-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺处的修饰、4-硫尿核苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架修饰、甲基化、不常见的碱基配对组合如异碱基(isobase)、异胞苷和异胍(isoguanidine)等。核酸也可包含非天然碱基，如硝基吲哚。修饰还可包括3'和5'修饰，包括但不限于用荧光团(例如，量子点)或其他部分加帽。
术语“乳液”是指不互容的两种或更多种流体的混合物。乳液可以包括在第二相中的第一相，例如，在油相中的水相。在一些情况中，乳液包括超过两相。一些实施方式还包括多种乳液。此外，在一些示例中，乳液包括用于使得乳液稳定和/或用作覆层(例如凝胶状覆层)的颗粒，例如液滴外层(droplet skin)。
术语“液滴”是指由不互溶的流体(例如乳液的连续相或载液)包封的小体积的液体，通常具有球形形状。在一些实施方式中，乳液中的液滴的体积和/或液滴的平均体积为例如小于约1微升(即“微液滴”)(或者在约1微升至约1纳升之间或在约1微升至约1皮升之间)、小于约1纳升(或者在约1纳升至1皮升之间)，或小于约1皮升(或在约1皮升至1毫微微升(femtoliter))等。在一些实施方式中，液滴(或乳液的液滴)的直径(或平均直径)小于约1000、100、或10微米，或者为约1000微米至10微米等。液滴可以是球形或非球形的。液滴可以是简单的液滴或复合液滴，即，其中至少一个液滴包封至少一个其它液滴的液滴。
乳液的液滴可以在连续相中具有任意均匀或非均匀的分布。如果是非均匀的，则液滴的浓度可以变化，从而在连续相中提供较高液滴密度的一个或多个区域以及较低液滴密度的一个或多个区域。例如，液滴可以在连续相中下沉或浮动，可以沿着通道聚集在一个或多个分组中，可以向着流动流的中心或周边集中等。例如，在一些实施方式中，生成的液滴的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL、或约50nL。
本文公开的任意乳液可以是单分散的，即，由至少大致均匀尺寸的液滴组成；或者可以是多分散的，即由不同尺寸的液滴组成。如果是单分散的，则乳液液滴的体积变化可以例如小于平均液滴体积的约±100％、50％、20％、10％、5％、2％或1％的标准偏差。从孔口产生的液滴可以类似地是单分散或多分散的。
术语“油”是指任意液体化合物或液体化合物的混合物，其与水不互溶且其大部分分子量是碳的形式的。在一些示例中，油还具有高含量的氢、氟、硅、氧或其任意组合等。例如，在一些实施方式中，本文所公开的任意乳液是油包水(W/O)乳液(水性液滴在连续油相中)。在一些实施方式中，油是或包括至少一种硅油、矿物油、氟碳油、植物油或它们的组合。
任何其它合适的组分可以存在于任意乳液相中，例如至少一种表面活性剂、试剂、样品、其它添加剂、标记物(label)、颗粒、或它们的任意组合。乳液可以具有任意合适的组合物。在一些实施方式中，乳液以各相中主要液体化合物或液体化合物的类型为特点。在一些实施方式中，乳液中的主要液体化合物是水和油。提供了产生稳定乳液的方法。在一些实施方式中，乳液包含位于非水性连续相中的水相液滴。在一些实施方式中，形成的乳液包含位于水性连续相中的非水相液滴。在一些实施方式中，在各液滴和连续相之间产生界面外层(interfacial skin)，以将液滴转化为胶囊。在一些实施方式中，所提供的水相包含外层形成性蛋白质和至少一种表面活性剂。在一些实施方式中，乳液还包含间隔液，所述间隔液可与连续相混溶并具有不同于连续相的组成。乳液形成方法的示例性描述可见于美国专利申请号2012/0152369，其通过引用纳入本文用于所有目的。
本文中使用术语“约”和“近似”修饰数值并表示在围绕该值所限定的范围。如果"X"是值，那么"约X"或"近似等于X"通常表示0.90X至1.10X的值。任何提及约“X”处至少表示值X、0.90X、0.91X、0.92X、0.93X、0.94X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X、1.05X、1.06X、1.07X、1.08X、1.09X和1.10X。因此，“约X”也意在公开例如"0.98X"。当将“约”用于数值范围的开始时，其适用于范围的两端。因此，“约6至8.5”等于“约6至约8.5”。当“约”用于一组值的第一个值时，其用于该集合中的所有值。因此，“约7、9、或11％”等于“约7％、约8％、或约11％”。
发明详述
发明人已经发现了一种用于获得富集或均匀的凝胶涂覆颗粒群的令人惊讶的途径，其中，一种颗粒被包含于至少大部分的分离的凝胶珠中，并且几乎不存在不含颗粒的凝胶珠。例如，在一些实施方式中，所获得的凝胶珠群将不会具有颗粒的泊松分布，而是，与由凝胶珠中的颗粒的泊松分布所预测的情况相比，将会具有比例上更多的包含单个颗粒的凝胶珠，以及比例上更少的不含颗粒的凝胶珠。本文提供的方法、装置和混合物基于其浮力密度之间的差异通过分离凝胶涂覆颗粒与不含颗粒的凝胶珠来获得该群体。
因为将材料加载到液滴中的过程是完全随机的，所以分布符合泊松统计学。泊松统计学是指在固定间隔或时间和/或空间中给定数量的事件发生的概率分布，如果这些事件以与先前事件发生无关的已知平均频率发生。可以使用泊松统计学，例如，计算颗粒浓度分布，从而评估堵塞的可能性，如Wyss HM、Blair DL、Morris JF、Stone HA和Weitz DA的《微通道堵塞的机理(Mechanism for clogging of microchannels)》，《物理学综述E(Physical Review E)》2006；74:61402中所述。还可以使用泊松统计学，例如，确定液滴群中的材料分布，如Abate AR、Chen C-H、Agresti,JJ和Weitz DA的《使用紧密堆积排序法胜过泊松封装统计学(Beating Poisson encapsulation statistics using close-packedordering)》，《芯片实验室》2009；9:2628中所述。采用泊松统计学的其它示例性说明提供于WO 2010/036352，其内容通过引用纳入本文用于所有目的。
根据泊松统计学，含有例如k个颗粒的液滴的概率是λkexp(-λ)/(k！)，其中λ是每个液滴的平均颗粒数。这意味着为了使得包含多个颗粒的液滴数量最小化，必须降低平均负载密度。该策略不期望的副作用是将有大量的液滴不包含任何颗粒，降低了可使用的液滴的百分比。本文所述方法、装置和混合物通过使所需液滴与不可用液滴进行有效分离来减轻这些问题。
新发现的方法包括：提供待分配在凝胶珠或液滴中的多个颗粒的悬浮液在一些实施方式中，颗粒包括刚性固体。颗粒可以包括：例如，聚甲基丙烯酸甲酯、玻璃、聚苯乙烯、或与固相寡核苷酸合成相容的一种或多种聚合物。颗粒可以包括：例如，调孔玻璃(CPG)(可购自Glen Research公司，弗吉尼亚州斯特灵)，草酰-调孔玻璃(参见，如Alul等，核酸研究(Nucleic Acids Research)1991,19,1527)、TentaGel支持物—一种氨基聚乙二醇衍生化的支持物(参见，如Wright等，四面体通信(Tetrahedron Letters)1993,34,3373)、聚苯乙烯、Poros(一种聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物)或可逆交联的丙烯酰胺。很多其它固体支持物是市售可得的，且适用于本发明。在一些实施方式中，颗粒的直径范围为约0.1μm至约180μm、约0.1μm至约120μm、约0.1μm至约60μm、约0.1μm至约30μm、约1μm至约180μm、约1μm至约120μm、约1μm至约60μm、约1μm至约30μm、约10μm至约180μm、约10μm至约120μm、约10μm至约60μm、约10μm至约30μm、或约20μm至约40μm。
颗粒可以包括会响应磁场的材料。材料可以具有顺磁性、变磁性、铁磁性(ferromagnetic)、或铁磁体性质(ferromagnetic properties)。例如，材料可以包括金属或金属氧化物。示例性材料包括铁、镍、钴、Fe3O4、BaFe12O19、CoO、NiO、Mn2O3、Cr2O3和CoMnP。
颗粒接下来用凝胶涂覆。在一些实施方式中，该涂层用颗粒封装装置施加。该颗粒封装装置可以是例如液滴产生器。液滴产生器的许多构造可以适用于根据本发明教导用凝胶涂覆颗粒。例如，合适的液滴产生器包括对接管、具有交叉通道的钻孔管、部分或完全***其它管内的管、以及具有多个孔(apertures)的管，其中“管”是指具有任何横截面形状的细长中空结构。合适的储液库包括移液管尖部、离心柱、孔(well)(个体或板阵列)、管和注射器等。液滴产生的普遍原理和基于那些原理的液滴产生器描述于WO 2011/051555，其内容通过引用纳入本文用于所有目的。在一些实施方式中，颗粒通过颗粒表面的水凝胶接枝聚合来进行涂覆。
用于涂覆颗粒的凝胶可以包括：例如，聚丙烯酰胺、琼脂糖、琼脂、聚(乳酸-共-乙醇酸)、或聚乙二醇(PEG)。其它水凝胶包括但不限于例如下列文件中所述：美国专利号4,438,258、6,534,083、8,008,476、8,329,763；美国专利申请号2002/0,009,591、2013/0,022,569、2013/0,034,592；以及国际专利申请号WO/1997/030092和WO/2001/049240。在一些实施方式中，颗粒首先以处于水性预凝胶状态(即，sol形态)的凝胶进行涂覆。该预凝胶还未经受其大部分组成组分分子的交联或凝胶化。不包含任何颗粒的凝胶或预凝胶的液滴在本文中称为不含颗粒的凝胶珠。在一些实施方式中，这些凝胶珠的直径范围为约1μm至约300μm、约1μm至约200μm、约1μm至约100μm、约1μm至约50μm、约10μm至约300μm、约10μm至约200μm、约10μm至约100μm、约10μm至约50μm、约20μm至约300μm、约20μm至约200μm、约20μm至约100μm、或约20μm至约50μm。
可以选择凝胶珠直径(Dg)与颗粒直径(Dp)的比率，从而增强不含任何颗粒的凝胶珠与包含颗粒的凝胶珠的密度驱动的分离。在一些实施方式中，Dg/Dp的比率范围为约0.005至约3000、约0.01至约800、约0.02至约200约0.05至约60、约0.1至约20、或约0.2至约5。在一些实施方式中，Dg/Dp比率为约0.25至约5。
所述方法的涂覆步骤产生了包含凝胶珠的初始混合物，其具有由泊松统计学确定的颗粒分布。根据所述装置的特定操作条件的泊松分布，初始混合物可以包括含有0、1、2、3个或更多个颗粒的凝胶珠的分布。为了提高包含0个或1个颗粒的液滴的频率，可以减少所提供的颗粒悬浮物中的颗粒的体积分数。在一些实施方式中，所提供的颗粒悬浮物中的颗粒的体积分数范围为0至约0.5、0至约0.4、0至约0.3、0至约0.2、0至约0.1、0至约0.01、或0至小于0.01。在一些实施方式中，含有一个颗粒液滴的频率为约5％至约10％。
所提供方法的初始混合物在含有两个或更多个颗粒的凝胶珠的比例小的情况下产生。例如，在一些实施方式中，初始混合物将具有不超过5、4、3、2、或10％的具有两个或更多个颗粒的珠。此外，在一些实施方式中，对于每个凝胶涂覆颗粒，初始混合物包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个的不含颗粒的凝胶珠。
颗粒封装装置的一个实施方式如图1所示。该示意图描绘了中心入口通道101，其包括在第一流体103内的颗粒102的悬浮物。侧入口通道104包括第二流体105，第二流体105与第一流体至少部分不混溶。携载这些入口流的三个通道汇聚以形成接管(nozzle)106。在第一流体在该接管处与第二流体接触，并且合并的混合物持续流动通过出口通道107时，形成了包含液滴108的乳液。这些液滴109的一些可以包含一个颗粒。其它液滴110可以不包含颗粒。
在一些实施方式中，第一流体103是水性的。在一些实施方式中，第二流体105是油。在一些实施方式中，第二流体包含油和表面活性剂。
可以使用一个或多个泵来使流体移动通过装置。各实施方式与任何合适的泵送方法兼容，至少包括压力控制泵送、真空控制泵送、离心、重力驱动流动、正排量泵送、注射器泵送和蠕动泵送。
液滴108的平均体积可以通过使得接管106的尺寸与所需液滴直径匹配、以及选择第一流体103和第二流体105的适当流速从而以滴落方式操作该装置而变化。在一些实施方式中，这需要控制一个或多个泵的活动以调节第一流体103和第二流体105的流速。
如果固体颗粒接触尺寸上小于颗粒直径的通道开口，则会发生微流体装置的堵塞(例如本文中所述的一种)。即使在通道开口或内部的尺寸大于流动通过通道的流体中所悬浮的固体颗粒的情况下，如果颗粒的体积分数足够大，也会发生堵塞。微通道堵塞机理的数学模型可以在如下文献中找到：Wyss HM、Blair DL、Morris JF、Stone HA和Weitz DA的《堵塞微通道的机理(Mechanism for clogging of microchannels)》，《物理学综述E(Physical Review E)》2006；74:61402，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。入口通道101的堵塞频率可以通过相对于颗粒102，增加通道直径和长度来降低。在一些实施方式中，入口通道的直径为颗粒直径的约1倍至约1000倍、约1倍至约300倍、约1倍至约100倍、约1倍至约30倍、约1倍至约10倍、约1倍至约3倍、或约1倍至约2倍。在一些实施方式中，入口通道的直径为颗粒直径的约3倍。在一些实施方式中，入口通道的长度为颗粒直径的约1倍至约1000倍、约1倍至约300倍、约1倍至约100倍、约1倍至约30倍、约1倍至约10倍、约1倍至约3倍、或约1倍至约2倍。
在产生液滴108(一些含有颗粒，一些不含颗粒)之后，收集初始混合物乳液。在一些实施方式中，初始混合物中的液滴是预凝胶(不是固体gel)，并且在收集初始混合物后进行交联以形成凝胶。
在一些实施方式中，使凝胶珠(一些含有颗粒，一些不含有)的初始群体移动到水相。还可以通过稀释油中的表面活性剂或通过离心以将液滴引入水性溶液中来使得乳液中的液滴破裂。可以调整水相的密度以影响含有不同数量颗粒的液滴的相对浮力。
所提供的方法还包括：允许凝胶涂覆颗粒和不含颗粒的凝胶珠在流体中分离。分离基于液滴中所含颗粒的存在和数量。在一实施方式中，分离是在凝胶涂覆颗粒(含有一个或多个颗粒的液滴)和不含颗粒的凝胶珠(不含颗粒的液滴)之间进行。在其它实施方式中，分离是在含有两个或更多个颗粒的液滴和含有一个或不含颗粒的液滴之间进行。可以用该方法实现的其它分离是：在含有三个或更多个颗粒的液滴和含有两个或更少颗粒的液滴之间；在含有四个或更多个颗粒的液滴和含有三个或更少颗粒的液滴之间；在含有五个或更多个颗粒的液滴与含有四个或更少颗粒的液滴之间；在含有六个或更多个颗粒的液滴和含有五个或更少颗粒的液滴之间；在含有七个或更多个颗粒的液滴和含有六个或更少颗粒的液滴之间；在含有八个或更多个颗粒的液滴与含有七个或更少颗粒的液滴之间；在含有九个或更多个颗粒的液滴和含有八个或更少颗粒的液滴之间；在含有十个或更多个颗粒的液滴和含有九个或更少颗粒的液滴之间进行。
分离可以由含有不同数量颗粒的液滴之间的浮力差异引起。分离还可以由含有不同数量颗粒的液滴对例如磁场、电场或流体流的存在的不同响应引起。在一些实施方式中，基于所获得的液滴密度差，分离由含有不同数量液滴的液滴差异沉淀引起。
其中发生分离的流体可以包含单一液相或多个液相。流体可以包含水性溶液。流体可以是水性流体和油的混合物。在一些实施方式中，凝胶涂覆颗粒的密度大于不含颗粒的凝胶珠。在这些实施方式中，可以选择流体密度使得凝胶涂覆颗粒沉淀到低于不含颗粒的凝胶珠的水平。在其它实施方式中，凝胶涂覆颗粒的密度小于不含颗粒的凝胶珠。在这些实施方式中，可以选择流体密度使得凝胶涂覆颗粒沉淀到高于不含颗粒的凝胶珠的水平。基于空凝胶珠和含有颗粒的凝胶珠的密度差的沉淀可以基于重力发生，或通过机械力(例如，离心)诱导。
基于浮力差的分离可以基于如上所述沉淀发生，或者可动态地发生。在一些实施方式中，其中发生分离的流体具有大于初始混合物的液滴的密度。在该情况下，所有液滴在流体中上浮。由于所含颗粒的数量差异而具有较低密度的那些液滴将会比具有更高密度的液滴上浮得更快。在一些实施方式中，其中发生分离的流体具有小于初始混合物的液滴的密度。在该情况下，所有液滴在流体中下沉。由于所含颗粒的数量差异而具有较高密度的那些液滴将会比具有更低密度的液滴下沉得更快。
图2显示出用于分离液滴、凝胶涂覆颗粒、或不含颗粒的凝胶珠的示例性装置含有一个颗粒的液滴109具有不同于不含颗粒的液滴110的浮力密度。在一些实施方式中，含有一个颗粒的液滴109的密度小于空液滴110。在如图2所示的实施方式中，含有一个颗粒的液滴109的密度大于空液滴110。在一些实施方式中，颗粒102的密度大于或等于1.01g/cm3、1.02g/cm3、1.03g/cm3、1.04g/cm3、1.05g/cm3、1.06g/cm3、1.07g/cm3、1.08g/cm3、1.09g/cm3、1.10g/cm3、1.20g/cm3、1.30g/cm3、1.40g/cm3、或1.50g/cm3。
在通过例如离心、重力位移、泵送、或用于在流体中移动的任意其它机理从第二流体105移出后，使液滴悬浮在溶液111中。控制溶液111的密度，使得孔液滴110浮起，而含有颗粒的液滴109下沉。在液滴因此分离后，可以将含有颗粒的液滴群分离用于进一步的处理。
所提供的方法还包括：收集由此分离的凝胶涂覆颗粒，使得大部分不含颗粒的凝胶珠不被回收。以此方式，该方法产生了富集的凝胶涂覆颗粒群。在一些实施方式中，对于每个不含颗粒的凝胶珠，所收集的群体包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个或更多个凝胶涂覆颗粒。收集可以包括：例如，将含有颗粒的凝胶珠移动到另一容器中，由此物理分离具有颗粒的凝胶珠和至少大部分不含颗粒的凝胶珠。获得的所收集的混合物将高度富集含颗粒的凝胶珠。例如，在一些实施方式中，至少90％的凝胶珠包含一个颗粒，并且小于10％的凝胶珠不含颗粒。
一旦被分离，富集的凝胶涂覆颗粒群可以通过第二液滴产生器，从而以高效率将凝胶涂覆颗粒共封装到液滴中。在一些实施方式中，颗粒上的凝胶覆层减少了该第二液滴产生器中狭窄通道的堵塞。通常，随着颗粒体积分数上升，浓度波动大到足以堵住通道的可能性也会上升。因此，阻塞通常与颗粒体积分数值密切相关。通过先用可变形凝胶涂覆颗粒，本文所提供的方法、装置和组合物允许在随后的共封装中采用更高体积分数的颗粒，从而提高液滴加载的效率而不会对阻塞的可能性产生负面影响。
图3显示出用于以高效率将凝胶涂覆颗粒共封装到液滴中的液滴产生器的一个示例。在该附图所示装置中，第二中心入口通道112包括第三流体113中包含颗粒的液滴109的悬浮物。第二侧入口通道114包括第四流体115。携载这些入口流的三个通道汇聚以形成第二接管116。随着第三流体在该接管处与第四流体接触，并且合并的混合物持续流动通过第二出口通道117，形成了包含第二液滴118的乳液。
在其中液滴109是可变形凝胶涂覆颗粒的实施方式中，凝胶变形的能力允许凝胶涂覆颗粒以接近1.0的体积分数堆积，而不会堵塞第二中心入口通道112或第二接管116。这与在图1的第一液滴产生器中所用的较低颗粒体积分数形成对比。用可变形凝胶涂覆颗粒可实现的高体积分数和密集堆积使得它们能够以常规间隔排列，并且获得第二液滴118的均匀填充，使得各第二液滴包含一层第三流体113、一层可变形凝胶、和单个颗粒。
在一些实施方式中，第三流体113包括与一个颗粒一起共封装到第二液滴118中的材料。在一些实施方式中，该共封装的材料包含一个或多个细胞。在一些实施方式中，该共封装的材料包含另一颗粒类型。在一些实施方式中，该共封装的材料包含一种或多种反应底物。在一些实施方式中，该共封装的材料包含一种或多种反应混合物组分。反应混合物组分可以是：例如，DNA、RNA、寡核苷酸、核苷酸、酶、缓冲剂、盐或分子生物学反应的其它组分。在一些实施方式中，该共封装的材料包含支持细胞代谢的一种或多种营养素。在一些实施方式中，液滴中共封装的材料是单个细胞、来自单个细胞的核酸、或来自多个细胞的核酸。在一些实施方式中，共封装的材料包含核酸和/或蛋白质的混合物。
该方法还包括在产生凝胶涂覆颗粒群之后或产生共封装液滴之后的其它步骤。在一些实施方式中，该方法还包括：液滴合并。在一些实施方式中，该方法还包括：液滴拆分。在一些实施方式中，该方法还包括：液滴检测。在一些实施方式中，该方法还包括：液滴分选。在一些实施方式中，该方法还包括关于液滴几何形状、组分或其它性质的其它试验。
凝胶、预凝胶、或颗粒中的一种或多种可以包含或附着有一种或多种不同的化合物。所述化合物可以包含荧光化学物质如荧光团、抗体、酶、或寡核苷酸如DNA片段。
在一些实施方式中，寡核苷酸(例如，包括条码)共价连接至水凝胶。本领域已知用于共价连接寡核苷酸与一种或多种水凝胶基质的许多方法。仅举一例，醛衍生化琼脂糖可共价连接至合成寡核苷酸的5’-胺基团。参见例如，PCTUS2015/37525。
大部分颗粒中的每一个可以附着有不同的寡核苷酸分子。在一些实施方式中，这些不同的寡核苷酸中大部分的每一个具有不同于其它寡核苷酸序列的序列。以此方式，因为颗粒所包含的寡核苷酸的序列是确定的，个体颗粒和含有它们的液滴可以通过条码化技术来鉴定。例如参见PCT 2015/37525。寡核苷酸颗粒包括但不限于：由在所述颗粒上进行寡核苷酸固相合成所制造的颗粒(例如，含有分子和/或细胞/颗粒条码)，其可包含大量寡核苷酸。例如，在一些实施方式中，将1,000、10,000、100,000、1x 106、1x 107或更多的寡核苷酸附着于该颗粒。制备和使用非水凝胶颗粒例如条码化颗粒的其它组合物和方法包括如下文献所述的那些，例如，Macosko等人的《细胞(Cell.)》，2015年5月21日；161(5):1202-14。
如本文所用的“条码”是能够鉴定其所偶联的分子的短核苷酸序列(例如，长至少约2、4、6、8、10、12或更多个核苷酸，例如，长2至100个、4至50个核苷酸)。例如，条码可用来鉴定液滴中的分子。与其它液滴中存在的条码相比，这样的液滴特异性条码应为该液滴所独有。例如，含有来自单一细胞的靶RNA的液滴可以经受使用引物的逆转录条件，所述引物在各液滴中含有不同的液滴特异性条码序列，从而将独有“细胞条码”的拷贝引入各液滴的逆转录的核酸。由此，来自各细胞的核酸可藉由独有“细胞条码”而与其它细胞的核酸相区分。一些情况中，细胞条码是由偶联至颗粒的寡核苷酸上存在的“颗粒条码”来提供，其中所述颗粒条码为偶联至该颗粒的全部或基本全部寡核苷酸所共有(例如，在它们之间相同或基本相同)。因此，细胞和颗粒条码可以相同条码序列的多个拷贝形式存在于液滴中、附着于颗粒、或结合细胞核酸。具有相同序列的细胞或颗粒条码可鉴定为衍生自相同细胞、液滴或颗粒。该液滴特异性细胞或颗粒条码可使用各种方法产生，这些方法导致条码偶联至或纳入固体或水凝胶支持物(例如，固体珠或颗粒或水凝胶珠或颗粒)。一些情况中，使用本文所述的拆分(split)与混合(也称拆分与汇集)合成方案来产生液滴特异性细胞或颗粒条码。液滴特异性条码可以是细胞条码和/或颗粒条码。类似地，细胞条码可以是液滴特异性条码和/或颗粒条码。此外，颗粒条码可以是细胞条码和/或液滴特异性条码。
其它情况中，条码专一性辨识其偶联的分子。例如，通过使用各自含有独有“分子条码”的引物进行逆转录。同样在另一些实施例中，可以利用包含各分区所独有的“分区特异性条码”、以及各分子独有的“分子条码”的引物。条码化之后，可以合并分区，并任选地扩增，而保持虚拟分区。因此，例如，可计算包括各条码的靶核酸(例如，逆转录所得的核酸)的存在与否(例如，通过测序)，而无需维持实体分区。
条码序列的长度决定了可以对多少独特的样品进行分区。例如，1个核苷酸条码可以对不多于4个样品或分子进行分区；4个核苷酸条码可以对不多于44(即256)个样品进行分区；6个核苷酸条码可以对不多于4096个不同样品进行分区；而8个核苷酸的条码可以标引不多于65,536个不同样品。此外，条码可通过对第一和第二链合成都采用条码化引物或者通过连接来同时附着于两条链。
通常使用固有不精确的过程来合成和/或聚合(例如，扩增)条码。因此，旨在均一的条码(例如，单个分区、细胞或珠的全部条码化核酸所共有的细胞、颗粒或分区特异性条码)可以相对于范本条码序列包含不同的N-1缺失或其它突变。因此，被称作“相同或基本相同拷贝”的条码是指由于例如合成、聚合或纯化中一个或多个错误而导致条码相对范本条码序列含有不同的N-1缺失或其它突变的不同的条码。此外，在使用例如本文所述的拆分与汇集方法和/或核苷酸前体分子等同混合物的合成过程中，条码核苷酸的随机偶联可能导致低概率事件，其中条码并非绝对独特(例如，不同于群体的其它条码，或不同于不同分区、细胞或珠的条码)。但是，这类偏离理论上理想的条码的轻微偏差不会干扰本文所述的单细胞分析方法、组合物和试剂盒。因此，如本文所用，术语“独特/独有”在涉及颗粒、细胞、分区特异性或分子条码的内容中涵盖偏离理想条码序列的各种非有意的N-1缺失和突变。一些情况中，由于条码合成、聚合和/或扩增所致的不精确性质造成的问题通过对与待区分的条码序列的数量相比进行可能的条码序列的过量采样(oversampling)来克服(例如，至少约2、5、10倍或更多倍的可能的条码序列)。例如，可用具有9个条码核苷酸的细胞条码(代表262,144个可能的条码序列)来分析10,000个细胞。本领域熟知条码技术的使用，参见例如Katsuyuki Shiroguchi等人Proc Natl Acad Sci U S A.，2012年1月24日109(4):1347-52和Smith,AM等人的Nucleic Acids Research Can 11,(2010)。
所提供的方法还可包括：从凝胶涂覆颗粒去除寡核苷酸。在一些实施方式中，该处理通过共价键的酶促或化学切割完成。在一些实施方式中，去除的寡核苷酸通过凝胶扩散离开颗粒。在一些实施方式中，所述凝胶被分解。在一些实施方式中，该分解通过熔化凝胶来完成。
本文引用的所有文件(例如，专利、专利申请、书籍、期刊论文或其它公开物)通过引用全文纳入本文以用于所有目的，就好像将各篇单独的文件特定且单独地通过引用全文纳入本文用于所有目的一样。对于通过引用纳入的此类文件与本说明书中所含公开内容相矛盾的内容，均意于以本说明书为准和/或本说明书优先于任何相矛盾的材料。
可获得本发明的多种修改形式和变化形式而不背离本发明的精神和范围，这对于本领域技术人员而言是显见的。本文所述的具体实施方式仅起示例作用，且不意于构成任何方式的限制。本说明书和实施例应仅视为示例性的，本发明真正的范围和精神由所附权利要求书来说明。

Claims (18)

1.一种产生凝胶涂覆颗粒群的方法，所述方法包括：
提供多个颗粒；
用凝胶涂覆颗粒，从而产生凝胶涂覆颗粒和不含颗粒的凝胶珠的初始混合物，其中，凝胶涂覆颗粒的密度大于凝胶珠的密度；
允许初始混合物沉淀在流体中，使得大部分凝胶涂覆颗粒分散在该流体中低于大部分凝胶珠的位置；以及
收集凝胶涂覆颗粒，其不含大部分凝胶珠，由此产生收集的凝胶涂覆颗粒群。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将寡核苷酸连接至颗粒。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，大部分的颗粒的每一个都附着于不同的寡核苷酸，并且，所述不同的寡核苷酸的序列可互相区分。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述颗粒包括聚甲基丙烯酸甲酯、玻璃、聚苯乙烯、或与固相寡核苷酸合成相容的其它聚合物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝胶选自：聚丙烯酰胺、琼脂糖、琼脂、PLGA、聚乙二醇或藻酸盐。
6.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括将来自所收集的凝胶涂覆颗粒群的凝胶涂覆颗粒共封装到液滴中。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过涂覆产生的初始混合物每包含一个凝胶涂覆颗粒就具有至少10个不含颗粒的凝胶珠。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流体是两种不互溶的流体的混合物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述两种不互溶的流体是水性流体和油。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述颗粒的直径范围为约1μm至约60μm。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝胶珠的直径范围为约10μm至约100μm。
12.一种凝胶涂覆颗粒和不含颗粒的凝胶珠的混合物，其中，凝胶涂覆颗粒的密度大于凝胶珠的密度，并且所述混合物每包含一个不含颗粒的凝胶珠就具有至少10个凝胶涂覆颗粒。
13.如权利要求12所述的混合物，其特征在于，将寡核苷酸连接至颗粒。
14.如权利要求13所述的混合物，其特征在于，大部分的颗粒的每一个都附着于不同的寡核苷酸，并且，所述不同的寡核苷酸的序列可互相区分。
15.如权利要求12所述的混合物，其特征在于，所述颗粒包括聚甲基丙烯酸甲酯、玻璃、聚苯乙烯、或与固相寡核苷酸合成相容的其它聚合物。
16.如权利要求12所述的混合物，其特征在于，所述凝胶选自：聚丙烯酰胺、琼脂糖、琼脂、PLGA、聚乙二醇或藻酸盐。
17.如权利要求12所述的混合物，其特征在于，所述颗粒的直径范围为约1μm至约60μm。
18.如权利要求12所述的混合物，其特征在于，所述凝胶珠的直径范围为约10μm至约100μm。
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