CN103459610A - 凝胶包裹的微集落筛选 - Google Patents

凝胶包裹的微集落筛选 Download PDF

Info

Publication number
CN103459610A
CN103459610A CN2012800150525A CN201280015052A CN103459610A CN 103459610 A CN103459610 A CN 103459610A CN 2012800150525 A CN2012800150525 A CN 2012800150525A CN 201280015052 A CN201280015052 A CN 201280015052A CN 103459610 A CN103459610 A CN 103459610A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
hydrogel
synthase
enzyme
hydrogel particle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2012800150525A
Other languages
English (en)
Inventor
J·阿格雷斯蒂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amyris Inc
Original Assignee
Amyris Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amyris Inc filed Critical Amyris Inc
Publication of CN103459610A publication Critical patent/CN103459610A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/007—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons containing one or more isoprene units, i.e. terpenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本文中提供了对于检测细胞中工业上有用的化合物（例如类异戊二烯、聚酮化合物和脂肪酸）的生成有用的方法和组合物，所述细胞例如经遗传修饰以生成一或多种这类化合物的微生物细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在水凝胶颗粒中包裹细胞，并检测水凝胶颗粒内的化合物。

Description

凝胶包裹的微集落筛选
1.对相关申请的交叉引用
本申请要求2011年1月28日提交且题为“凝胶包裹的微集落筛选”的美国临时专利申请No.61/437,214及2011年5月13日提交且题为“用于检测水不混溶性化合物的微生物生成的方法和组合物”的美国临时申请No.61/486,211的优先权，据此其通过提述完整并入。
2.发明领域
本文中提供的组合物和方法一般涉及微生物的工业用途。具体地，本文中提供了对于检测细胞中工业上有用的化合物（例如类异戊二烯、聚酮化合物和脂肪酸）的生成有用的方法和组合物，所述细胞例如经遗传修饰以生成一或多种这类化合物的微生物细胞。
3.发明背景
合成生物学的出现带来了在生产规模和质量上从可再生来源得到微生物生成的生物燃料、化工品和生物材料的希望。然而，工业合成生物学的商业成功将较大程度上依赖于是否能使可再生产品的生产成本比得上或比得过其各自不可再生对应物的生产成本。为此目标，株工程化和筛选努力理想地指向在生产过程中尽可能早地鉴定出期望的株（例如能够具有高产率（每克底物的化合物克数）、高产量（每升克数）和/或高生产率（每小时每升克数）。
可以工程化宿主微生物以包含生物合成基因或途径，并且可以优化经由这些途径的代谢通量以实现高产物滴度。例如，已工程化微生物以过表达部分或全部的甲羟戊酸(MEV)代谢途径以用于工业生产抗疟药物青蒿素（artemisinin）的前体。参见例如Martin等,Nat.Biotechnol.21:796-802(2003);Ro等,Nature440:940943(2006)；和美国专利No.7,172,886和7,192,751，据此其每项的内容均通过提述完整并入。
经常作为重复的过程来实施工程化改造株为期望的表型，所述重复过程牵涉数轮的工程化、分析和代谢通量的建模。在此过程中，可以测试并优化控制代谢通量的数种办法，包括但不限于掺入异源启动子以精调各途径组分的表达、合理设计优化网络和途径以及牵涉随机诱变的定向进化策略。
理想地，针对具有改进性能的株的筛选方法为：(1)足够灵敏以察觉从一种经修饰群体到另一种经修饰群体在性能中的减增改进；(2)足够特异性以区分内源分子与重组生成的异源产物（不管是包含在细胞内还是分泌到周围培养基中）；(3)足够有力以一次性筛选经修饰株的许多库；和(4)为生产对宿主的代谢影响提供信息。对于后者，可能的情况是宿主中异源基因的输入和表达将导致代谢不平衡和/或毒性代谢物的积累。在这类场景下，知晓生产是否以降低宿主的存活力为代价是有用的。此外，鉴于从一种生成群体到另一种生成群体生物质广泛趋异的可能性，特异性检测重组产物而没有来自细胞生物质的影响或输入的能力能为给定株的产率、产量和/或生产率提供更准确的描述。此外，在工业化合物由宿主细胞分泌的情况下，对筛选方法还有进一步的要求，即维持由细胞生成的化合物的量和产生此表型的根本基因型之间的物理联系的能力。
本领域中利用细胞包裹技术与流式细胞术组合的各种方法一般指向鉴定出由细胞库中的细胞所生成的大分子的存在或缺失。流式细胞术具有强大的分析功能，其能够以极快的速率（高达每秒40,000个事件）评估细胞或颗粒，从而使得此技术对于可靠并准确地定量评估细胞群体及选出特定细胞是理想的。
但是，鉴于合成生物学中从一种株到另一种株鉴定代谢通量中的细微改进的挑战，仍需要比现有技术同时更灵敏、可靠、有力和有效的筛选***和方法学。特别需要用于以维持表型和基因型之间的连锁而不损害宿主细胞在鉴定后的存活力的方式来检测和量化重组化合物的生成的方法。本发明针对这些需要并还提供相关优点。
4.发明概述
本文中提供对于检测细胞中重组生成的水不混溶性化合物有用的方法和组合物，所述细胞为例如经遗传修饰而以与未经遗传修饰的亲本微生物细胞相比更高的产率和/或提高的持久性生成一或多种水不混溶性化合物的微生物细胞。具体地，本文中提供的方法（或者称为“皮筛选”）提供用于筛选经工程化改造（例如为了生成工业上有用的水不混溶性化合物，包括但不限于类异戊二烯、聚酮化合物、脂肪酸及其衍生物）的微生物菌株的高通量、灵敏且定量的手段。本文中提供的方法还提供对生成和/或包含升高水平的这类重组生成的水不混溶性化合物的细胞（例如重组细胞）及其克隆性细胞群体的鉴定、选择及富集。
在一些实施方案中，所述方法包括在水凝胶颗粒中包裹细胞并检测水凝胶颗粒内重组生成的水不混溶性化合物。在一些实施方案中，所述细胞选自下组：酵母细胞、细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、昆虫细胞和植物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，所述酵母是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
在一些实施方案中，所述检测方法包括使水凝胶颗粒与直接结合重组生成的水不混溶性化合物的荧光染料接触，并检测水凝胶颗粒内的荧光染料。在一些实施方案中，所述荧光染料是尼罗红。在一些实施方案中，所述检测包括将水凝胶颗粒内水不混溶性化合物的量相对于水凝胶颗粒内细胞生物质的量标准化。
在一些实施方案中，水凝胶颗粒能保留水不混溶性化合物，例如由细胞生成的水不混溶性化合物。在一些实施方案中，所述水凝胶包含琼脂糖。在一些实施方案中，所述水凝胶颗粒的直径小于约1毫米。在一些实施方案中，所述水凝胶颗粒的直径小于约500微米。在一些实施方案中，所述水凝胶颗粒的直径小于约100微米。在一些实施方案中，所述水凝胶颗粒的直径小于约50微米。在一些实施方案中，所述水凝胶颗粒的直径为约50、45、40、35、30或25微米。
在本文中提供的检测方法的一些实施方案中，所述包裹包括使细胞与水性水凝胶悬液在足以形成包含细胞的水凝胶颗粒的条件下接触。在一些实施方案中，所述条件包括将包含细胞的水性水凝胶悬液与氟碳油接触。在一些实施方案中，所述氟碳油包含含氟表面活性剂。在一些实施方案中，所述与氟碳油接触包括将包含细胞的水性水凝胶悬液加载到包含氟碳油的微流体装置上，其中水凝胶悬液在微流体装置的T联结点处与氟碳油接触，其中与氟碳油接触导致形成包含细胞的非水性水凝胶颗粒。在一些实施方案中，所述检测方法进一步包括将水凝胶颗粒与氟碳油分开的步骤。
在一些实施方案中，所述检测方法进一步包括在检测步骤之前培养水凝胶颗粒内的细胞。在一些实施方案中，所述培养达12至24小时的时段。
在一些实施方案中，所述重组生成的水不混溶性化合物是萜、C5类异戊二烯、C10类异戊二烯或C15类异戊二烯。在一些实施方案中，所述重组生成的水不混溶性化合物是法呢烯（farnesene）。在一些实施方案中，所述细胞是包含编码甲羟戊酸(MEV)途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列的重组酵母细胞。在一些实施方案中，所述重组生成的水不混溶性化合物是法呢烯。在一些实施方案中，所述细胞是包含编码1-脱氧-D-木酮糖5-二磷酸(DXP)途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列的重组酵母细胞。在一些实施方案中，所述重组酵母细胞包含编码能将异戊烯焦磷酸(IPP)转化成二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的酶的异源核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重组酵母细胞进一步包含编码能修饰IPP或聚异戊二烯以形成类异戊二烯化合物的酶的异源核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述细胞是包含编码聚酮化合物生物合成途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列的重组酵母细胞。在一些实施方案中，所述重组酵母细胞包含编码聚酮化合物合酶***(PKS)的一或多种核酸。在一些实施方案中，所述PKS是模块化PKS。在一些实施方案中，所述PKS是芳香族PKS。
在一些实施方案中，所述细胞是包含编码脂肪酸生物合成途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列的重组酵母细胞。在一些实施方案中，所述重组酵母细胞包含编码乙酰-CoA合酶的核酸。在一些实施方案中，所述重组酵母细胞包含编码能将乙酰-CoA转化成丙二酰-CoA的酶的异源核苷酸序列。
在一些实施方案中，检测细胞中重组生成的水不混溶性化合物的方法包括：(a)使细胞与水性水凝胶悬液接触；(b)将包含细胞的水性水凝胶悬液加载到包含氟碳油的微流体装置上，其中所述水凝胶悬液在微流体装置的T联结点处与氟碳油接触，其中所述与氟碳油接触导致包含细胞的非水性水凝胶颗粒的形成；(c)将氟碳油与水凝胶颗粒分开，例如通过清洗；(d)培养水凝胶颗粒内的细胞；(e)使水凝胶颗粒与直接结合重组生成的水不混溶性化合物的荧光染料接触；并(f)检测水凝胶颗粒内的荧光染料。
在另一个方面，本文中提供了筛选细胞库中重组生成水不混溶性化合物的细胞的方法，包括在水凝胶颗粒中包裹库的每个细胞；检测每个水凝胶颗粒内重组生成的水不混溶性化合物，并选择生成所述重组生成的水不混溶性化合物的细胞。
在另一个方面，本文中提供了富集细胞群体中重组生成水不混溶性化合物的细胞的方法，该方法包括：(a)提供水凝胶颗粒的群体，其中所述群体包含包裹有经遗传修饰以生成水不混溶性化合物的细胞或细胞的克隆性群体的水凝胶颗粒；(b)检测出包含重组生成的水不混溶性化合物的水凝胶颗粒；(c)从步骤(b)的水凝胶颗粒回收细胞或细胞的克隆性群体；(d)重新包裹来自步骤(c)的细胞或细胞的克隆性群体；并(e)重复步骤(a)-(c)。
在另一个方面，本文中提供了在水凝胶颗粒内包裹细胞的方法，该方法包括：(a)使细胞与水性水凝胶悬液接触；并(b)将包含细胞的水性水凝胶悬液加载到包含氟碳油的微流体装置上，其中所述水凝胶悬液在微流体装置的T联结点处与氟碳油接触，其中所述与氟碳油接触导致包含细胞的非水性水凝胶颗粒的形成。
在另一个方面，本文中提供了水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其包含重组生成的水不混溶性化合物。在一些实施方案中，所述细胞选自下组：真菌细胞（例如酵母细胞）、细菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，所述酵母是酿酒酵母。
在另一个方面，本文中提供了水凝胶颗粒，其包含细胞或克隆性细胞群体且进一步包含重组生成的水不混溶性化合物。在一些实施方案中，所述细胞选自下组：真菌细胞（例如酵母细胞）、细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、昆虫细胞和植物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，所述酵母是酿酒酵母。在一些实施方案中，所述水凝胶包含琼脂糖。在一些实施方案中，所述水凝胶颗粒的直径小于约1毫米。在一些实施方案中，所述水凝胶颗粒的直径小于约500微米。在一些实施方案中，所述水凝胶颗粒的直径小于约100微米。在一些实施方案中，所述水凝胶颗粒的直径小于约50微米。在一些实施方案中，所述水凝胶颗粒的直径为约50、45、40、35、30或25微米。
5.附图简述
图1A提供用于生成异戊烯二磷酸(“IPP”)的甲羟戊酸(“MEV”)途径的示意图。
图1B提供用于生成异戊烯焦磷酸(“IPP”)和二甲基烯丙基焦磷酸(“DMAPP”)的1-脱氧-D-木酮糖5-二磷酸(“DXP”)途径的示意图。Dxs是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶；Dxr是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(也称为IspC)；IspD是4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藻糖醇合酶；IspE是4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藻糖醇合酶；IspF是2C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶；IspG是1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(IspG)；而ispH是异戊烯基/二甲基烯丙基二磷酸合酶。
图2提供将IPP和二甲基烯丙基焦磷酸(“DMAPP”)转化成牦牛儿基焦磷酸(“GPP”)、法呢基焦磷酸(“FPP”)和牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸(“GGPP”)的示意图。
图3提供可用于形成本文中描述的水凝胶颗粒的例示性微流体装置。该装置在平坦基底上制造，且包含细胞入口，该细胞入口流体连接至细胞溶液流动通道，该细胞溶液流动通道流体连接至颗粒流动通道，在其末端为颗粒收集出口。该装置进一步包含油入口，该油入口流体连接至油流动通道，该油流动通道相对于细胞溶液流动通道横向放置并与细胞溶液流动通道在T联结点处相交。
图4提供用于形成用水凝胶包裹的细胞的例示性过程的绘图。细胞在水流中从左边进入，水流由两个油流压迫经过喷管以分开颗粒。在装置的出口（即颗粒收集出口）处，颗粒进入一段管道并流入容器中。
图5提供皮筛选（picoscreen）过程的例示性实施方案。(A)将酵母细胞在熔化的琼脂糖中的悬液加载到微流体装置中。琼脂糖悬液在T联结点处与油/表面活性剂混合物相遇。流动的油将悬浮于油中的均一大小的琼脂糖液滴剪断。(B)在收集液滴后，将油从颗粒清洗掉并将颗粒重悬于生长培养基中。(C)在生长24小时后，形成40至80个细胞的微菌落。然后用荧光染料将颗粒染色，接着可以使用基于荧光的测定法来对其筛选。
图6提供尼罗红的发射光谱。(A)尼罗红的发射光谱从不生成酵母在主要为磷脂的环境中～590nm的最大值（右峰）移位到纯法呢烯中～550nm的最大值(左峰)。(B)法呢烯中相对于不生成细胞中的尼罗红比率作为波长的函数。绿色（左）和红色（右）垂直条代表用于皮筛选FACS测定法的一个实施方案的发射滤光器，其光谱选择为使比率度量分析中的绿色/红色荧光比率最大化。
图7提供对包裹在水凝胶颗粒中、并用尼罗红染色的法呢烯生成菌株的例示性FACS分析。
图8提供绘出的由皮筛选测定的法呢烯生成(x轴，“FACS”)相对于由其它测定法测定的法呢烯生成(y轴；从左至右：2L发酵罐产率、尼罗红振动板测定法和法呢烯通量测定法)的相关性。对工程化为生成各种量的法呢烯的数个菌株测定法呢烯生成。
图9提供一种PCR富集测定法。(A)3种引物设计为扩增两条带以将菌株FS2（包含2个拷贝的法呢烯合酶(FS)）与菌株FS5（包含5个拷贝的FS）区别开来。从菌株FS2和菌株FS5两者的第2整合位点产生89bp片段，而从仅存在于菌株FS5的第5FS整合位点产生304bp片段。(B)304bp条带的存在被用作指示菌落自菌株FS5衍生的明确标志。
图10提供从模式库中富集高法呢烯生成酵母菌株(FS5)。将菌株FS2（低法呢烯生成菌株）和FS5以10:1、100:1和1000:1的比率混合，并实施皮筛选以富集更高产的生成者(FS5)。(A)在第1和第2行呈现了纯菌株的FACS直方图数据。第1、2和3轮（第3-5行）包裹和分选后混合群体的直方图显示在第3轮实现了菌株FS5的实质性富集。(B)对每种混合比率定量在各轮分选之间的富集。对于分别包含开始比率10:1和100:1的库，第3轮对FS5的富集使得近100%的所得群体由自FS5衍生的菌落组成。
图11提供针对检测从经包裹的酵母细胞重组生成的柠檬烯（limonene）的皮筛选的结果。(A)进行皮筛选过程的一组柠檬烯生成菌株的G/R荧光峰。菌株Y0是不生成者，而菌株L1、L2和L3跨越一定范围的柠檬烯生成水平。左图显示不同群体的中值在荧光中增加。右图显示作为96孔振动平板滴度的函数绘出的FACS中值，并证明皮筛选值与振动平板值成比例。(B)一起共培养（实心峰）或分开培养（空心峰）的经包裹的生成细胞(L1)与不生成细胞(Y0)的荧光峰。Y0和L1的分开的荧光峰在共培养条件下保持，这指示产物仍然包裹在含有生成菌株的颗粒中，且并未渗出或渗入到含有不生成菌株的颗粒中。中值中的差异可归因于管间变化。
图12提供针对检测从经包裹的酵母细胞重组生成的广藿香醇的皮筛选的结果。(A)经包裹并进行皮筛选的不生成菌株(Y0)与两种不同的广藿香醇生成菌株(P1和P2)的G/R荧光峰。(B)由皮筛选测定的广藿香醇生成（x轴，“FACS”）相对于由气相层析(GC)测量的标准振动板滴度（y轴）绘图的相关性。
6.发明详述
6.1定义
如本文中使用的，术语“甲羟戊酸途径”或“MEV途径”在本文中用于指将乙酰-CoA转化成IPP的生物合成途径。在图1A中示意性图示MEV途径。
如本文中使用的，术语“脱氧木酮糖5-磷酸途径”或“DXP途径”在本文中用于指将甘油醛-3-磷酸和丙酮酸转化成IPP和DMAPP的途径。在图1B中示意性图示DXP途径。
如本文中使用的，术语“包裹”指如与仅存在于或附着于水凝胶颗粒表面不同，主要驻留于水凝胶颗粒内部的一或多个细胞，例如克隆性细胞群体。在一些实施方案中，水凝胶颗粒内细胞的浓度可以低至单个细胞。在此实施方案中，来自水凝胶颗粒内单个细胞的细胞***产生经包裹的克隆性细胞群体。
如本文中使用的，术语“水凝胶”指交联的聚合材料，其展现出在水或水性溶液中膨胀而无溶解，并在其结构内保留显著部分的水或水性溶液的能力。在一些实施方案中，如本文中使用的，“水凝胶颗粒”具有保留水不混溶性化合物（例如由水凝胶颗粒中包裹的细胞生成的重组生成的水不混溶性化合物）的能力。
如本文中使用的，短语“异源核苷酸序列”指可为以下情况的核苷酸序列：(a)对其宿主细胞而言是外来的(即对细胞而言是“外源的”)；(b)在宿主细胞中天然发现的（即“内源的”）但在细胞中以非天然数量存在（即高于或低于宿主细胞中天然发现的数量）；或(c)在宿主细胞中天然发现的但定位于其天然位置以外的。
如本文中使用的，术语“持续/持久”在由经遗传修饰的微生物细胞生成类异戊二烯的上下文中指相比于未经遗传修饰的亲本微生物细胞，经遗传修饰的微生物细胞在较长的时间跨度上在工业发酵中生成类异戊二烯化合物的能力。
如本文中使用的，术语“亲本”指充当引入遗传修饰的起点但不包含经遗传修饰的细胞的所有遗传修饰的细胞，该遗传修饰导致生成本文中描述的经遗传修饰的微生物细胞，例如经遗传修饰以实现细胞内提高的生成和/或提高的水不混溶性化合物（例如类异戊二烯、聚酮化合物或脂肪酸）水平。
如本文中使用的，短语“重组生成的水不混溶性化合物”和“异源水不混溶性化合物”指从经遗传修饰的细胞或微生物生成的、具有至少4个碳原子的化合物，其中所述化合物不混溶于水。所述具有至少4个碳原子的化合物可以是分支的、线性的或环状的，并任选地可以包含一或多个杂原子(例如氮、氧和硫)以及一或多个取代基或功能模块(例如-OH、-NH2、-COOH、-C(H)=O、-NO3、-NH-、-C(=O)-等)。在一些实施方案中，所述化合物是油。在其它实施方案中，所述化合物是疏水性的。本文中提供的方法和组合物的例示性重组生成的（即异源的）水不混溶性化合物包括但不限于类异戊二烯、聚酮化合物和脂肪酸。在一些实施方案中，重组生成的（即异源的）水不混溶性化合物包含长度范围为4个碳原子至40个碳原子的碳链。在一些实施方案中，重组生成的（即异源的）水不混溶性化合物包含5至30、10至25或15至20个碳原子的碳链。在一些实施方案中，重组生成的（即异源的）水不混溶性化合物包含有超过5、10、15或20个碳原子的碳链。在一些实施方案中，重组生成的（即异源的）水不混溶性化合物包含有不及40个碳原子的碳链。
如本文中使用的，短语“直接结合”指第一分子（例如荧光染料）与第二分子（例如水不混溶性化合物）之间不需要第二结合试剂（如抗体）的物理相互作用。
6.2检测细胞中重组生成的水不混溶性化合物的方法
6.2.1包裹细胞的方法
在某些实施方案中，检测细胞中重组生成的水不混溶性化合物(WIC)的方法包括将细胞包裹到水凝胶颗粒中并检测水凝胶颗粒中重组生成的水不混溶性化合物水平。水凝胶颗粒发挥反应容器或微型发酵罐的功能，其在可以针对异源水不混溶性化合物生成进行细胞筛选和/或隔离之前将在其它情况中可能离开细胞的重组生成的水不混溶性化合物圈住。在优选的实施方案中，所述方法包括将单个细胞包裹在水凝胶颗粒中，细胞在合适的细胞培养条件下在颗粒中生长并***以生成细胞的克隆性微集落。水凝胶的围笼（caging）效应允许将水凝胶颗粒染色（例如用水不混溶性化合物特异性荧光染料），及对异源水不混溶性化合物生成定量（例如通过荧光激活细胞分选(FACS)）。
在本文中提供的方法的一些实施方案中，将细胞包裹到水凝胶颗粒中的步骤包括使细胞与水性水凝胶悬液在足以将细胞包裹到水凝胶颗粒中的条件下接触。可用于包裹细胞的例示性水凝胶记载于5.2.1.1节，并在下文实施例2中提供了用于将细胞包裹到琼脂糖颗粒中的例示性方案。
在一些实施方案中，从培养物收集要筛选的细胞并用生理学缓冲液（例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)）漂洗一或多次，并在与水性水凝胶悬液接触之前重悬（例如在PBS中或在培养基中）。
在一些实施方案中，使重悬的细胞与水性水凝胶悬液以特定的体积对体积(v/v)比接触。在具体的实施方案中，细胞悬液的浓度将依赖于期望的颗粒大小、要用于包裹的水凝胶以及其中在颗粒中检测重组生成的水不混溶性化合物的方法(例如FACS)。在一些实施方案中，细胞的浓度可以作为期望颗粒大小的函数如下计算：浓度(个细胞/L)=期望的细胞数/颗粒/(4/3×Pi×r3)，其中r=期望颗粒的半径。优选地，期望的细胞数/颗粒将是1或小于1以维持微集落的克隆原性，即确保每个颗粒包裹不超过1个细胞。
在一些实施方案中，细胞悬液可以以适合期望颗粒大小和/或水凝胶类型的最终浓度的2倍浓度包含细胞。在一些实施方案中，水性水凝胶悬液可以类似地以2倍最终浓度配制，且所述接触包括以1:1比率(v/v)将溶液组合。温和地混合溶液从而不会显著地损害细胞存活力。在一些实施方案中，期望的颗粒大小的直径为约25微米，且将细胞以约7.3x107个细胞/ml的2倍浓度重悬。在其它实施方案中，期望的颗粒大小的直径为约32微米，且将细胞以约3.5x107个细胞/ml的2倍浓度重悬。在其它实施方案中，期望的颗粒大小的直径为约50微米，且将细胞以约9x106个细胞/ml的2倍浓度重悬。在其它实施方案中，期望的颗粒大小的直径为约100微米，且将细胞以约1x106个细胞/ml的2倍浓度重悬。在一些实施方案中，将细胞以约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107或超过1x107个细胞/ml的2倍浓度重悬。
在一个具体的实施方案中，将包含约3.7x107个细胞/ml的2倍浓度的细胞与包含1.5%琼脂糖的2倍水性琼脂糖溶液接触。在另一个具体的实施方案中，将包含约9x106个细胞/ml的2倍浓度的细胞与包含2%琼脂糖的2倍水性琼脂糖溶液接触。在另一个具体的实施方案中，将包含约1x106个细胞/ml的2倍浓度的细胞与包含3%琼脂糖的2倍水性琼脂糖溶液接触。
在细胞与水性水凝胶悬液接触后，可以使用本领域中已知的任何方法来形成水凝胶颗粒。在一些实施方案中，通过将液体水凝胶基质（包含细胞）分散到水不混溶性油（例如氟碳油）中来形成球形水凝胶颗粒。在一些实施方案中，为了确保生成具有期望大小的均一大小的颗粒，使用包含由水性流动通道和横向放置的油流动通道交叉形成的联结点（例如T联结点）的微流体装置来形成油包水乳液。加载液体水凝胶基质（包含细胞），即流动到一个通道中，并加载不混溶性油，即流动到相对于包含水性水凝胶溶液的通道横向放置的通道中，并在T联结点处发生接触，导致形成包含细胞的水凝胶颗粒。然后将新形成的颗粒流动通过收集通道并（例如在收集管中）收集。然后使凝胶硬化（例如通过降低溶液的温度或通过加入交联剂），并将颗粒从油转移到水性溶液（例如营养生长培养基）中。
在一些实施方案中，可以不使用微流体装置而形成可用于本文中提供的方法的水凝胶颗粒。例如，膜乳化作用能产生具有相对小的大小分布的乳液。在其中小尺寸多分散性不太重要的情况下，可以使用其它形成乳液的方法，如搅拌、匀浆或振动。其它可用的方法包括形成液体在空气中的射流，然后将射流分解成气溶胶颗粒，这通过用旋转金属丝机械切割射流、用高频变换器振动射流或通过用加压空气迫使射流通过孔将其剪切来进行。
6.2.1.1水凝胶
水凝胶是已经硬化的固体基质的聚合物，其被水膨胀但不被水溶解。在一些实施方案中，水凝胶的网目大小足够小以包裹较大的对象，如细胞和微米尺度的水不混溶性化合物液滴，但又足够大以允许小分子和离子（例如支持细胞生长和增殖或检测重组生成的水不混溶性化合物所需的）自由扩散通过基质。
在一些实施方案中，水凝胶的网目大小介于约1nm和100nm之间。在一些实施方案中，水凝胶的网目大小介于约10nm和90nm之间。在一些实施方案中，水凝胶的网目大小介于约20nm和80nm之间。在一些实施方案中，水凝胶包裹的网目大小为约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100nm。
在一些实施方案中，水凝胶颗粒的大小足够大以圈住数十个细胞的集落，但足够小以适合通过例如商业细胞分选器的流体组件。在一些实施方案中，水凝胶颗粒的直径为20-50微米。在一些实施方案中，水凝胶颗粒的直径为30-40微米。在一些实施方案中，水凝胶颗粒的直径为约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、4041、42、43、44、45、46、47、48、49或50微米。在一些实施方案中，水凝胶颗粒的直径介于约50至100微米之间。在一些实施方案中，水凝胶颗粒的直径为约50、60、70、80、90、100或超过100微米。
在一些实施方案中，单个创始细胞的完全包裹使得含有细胞克隆性群体的小集落保持圈在创始细胞的紧密临近处，并与其它创始细胞分开。如此，一种基因型的表型能平均到许多数十个细胞上，这极大地降低了测定噪音。在一个优选的实施方案中，水凝胶基质通过将水凝胶中包埋的对象屏蔽于剪切力和对流而将重组生成的水不混溶性化合物局部化。因此，小分子（如分子烃）能单独通过扩散从生成细胞缓慢迁移离去。从生成源的这一缓慢移动离去导致高浓度，其启动成核作用和微米尺度的水不混溶性化合物液滴的生长。当水不混溶性化合物液滴接近并超过凝胶的网目大小时，它们被永久围笼入基质中并保持与生成它们的细胞联合。由于将液滴从凝胶基质外会存在的剪切力屏蔽开来，因此它们不能分解成可能能扩散到颗粒外的更小的液滴。
在一些实施方案中，将细胞包裹到从任何支持细胞生长的生物聚合物形成的水凝胶中。生物聚合物是天然存在的聚合物，如蛋白质和碳水化合物。在优选的实施方案中，生物聚合物对包裹的细胞是无毒性的且是生物相容的。可用于当前方法的合适生物聚合物的例子包括但不限于，胶原(包括I、II、III、IV和V型)、变性胶原(或明胶)、重组胶原、血纤蛋白-血纤蛋白原、弹性蛋白、糖蛋白、藻酸盐、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素和糖胺聚糖(或蛋白聚糖)。在一些实施方案中，生物聚合物处于其天然存在的形式。在其它实施方案中，将生物聚合物衍生化以促进与合成聚合物交联。
在具体的实施方案中，生物聚合物选自下组：热胶凝的多糖（如琼脂糖）或热胶凝的蛋白质（如明胶）。
琼脂糖是从海草提取的天然聚合物，并在其特性（例如分子量、精确的化学组成、侧链等）中有变化。可以通过降低溶液温度而不加入任何其它组分使琼脂糖凝固。此特性对于形成颗粒特别有用，特别是在使用微流体或其它基于乳液的方法来形成本文中描述的水凝胶颗粒时。在优选的实施方案中，琼脂糖具有使得可以以没有显著损害细胞存活力的温度将活细胞混合到琼脂糖溶液中的胶凝温度。在优选的实施方案中，琼脂糖在比与细胞存活相容的温度要高的温度不胶凝。如此，如果琼脂糖的胶凝温度高于细胞存活力温度，那么琼脂糖或凝胶不应当以比在低于胶凝温度将细胞混合到琼脂糖溶液（凝胶前状态）所需要的更快地胶凝。在一些实施方案中，琼脂糖允许以范围从约18℃至60℃、24℃至50℃、30℃至40℃、或32℃至37℃的温度混合（例如经由温和机械搅拌或移液）。
在一些实施方案中，琼脂糖溶液要超过1分钟来胶凝，从而允许有足够时间将细胞混合到溶液中。在一些实施方案中，琼脂糖溶液在小于约4小时，更优选地小于1小时，且更优选地在分钟级别上(例如约1至20分钟，或约2至5分钟)胶凝。本领域技术人员会领会，如果胶凝足够缓慢且只要凝胶在保留细胞存活力的温度范围是稳定的，那么实际的胶凝点温度并非至关重要。
可用于本文中提供的方法的其它热胶凝蛋白包括但不限于弹性蛋白模拟蛋白聚合物和丝状弹性蛋白嵌段共聚物。参见例如Hurt and Gehrke,J.Phar.Sci.Vol.96No.3(March2007);McMillan等,(1999)Macromolecules32:3643-3648;Huang等,(2000)Macromolecules33:2989-2997和McMillan等,(2000)Macromolecules33:4809-4821，据此其公开内容通过提述完整并入。其它潜在可用的热胶凝多糖包括κ（卡帕）-角叉菜胶和ι（伊奥塔）-角叉菜胶。
在一些实施方案中，将细胞包裹到任何支持细胞生长的生物合成基质中。在一些实施方案中，生物合成基质是包含聚丙烯酰胺的聚合物或一或多种丙烯酰胺衍生物。如本文中使用的，“丙烯酰胺衍生物”指用N-烃基或N,N-二烃基取代的丙烯酰胺或异丁烯酰胺。适合用于包裹细胞的丙烯酰胺衍生物的例子包括但不限于N-甲基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺(NiPAAm)、N-辛基丙烯酰胺、N-环己基丙烯酰胺、N-甲基-N-乙基丙烯酰胺、N-甲基异丁烯酰胺、N-乙基异丁烯酰胺、N-异丙基异丁烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、N,N-二乙基丙烯酰胺、N,N-二甲基异丁烯酰胺、N,N-二乙基异丁烯酰胺、N,N-二环己基丙烯酰胺、N-甲基-N-环己基丙烯酰胺、N-丙烯酰吡咯烷、N-乙烯基-2-吡咯烷酮、N-异丁烯酰基吡咯烷及其组合。
在一些实施方案中，将细胞包裹到支持细胞生长的物理交联的聚合物、化学交联的聚合物、静电交联的或缠结的聚合物中。在一些实施方案中，将细胞包裹到包含物理交联的聚合物、化学交联的聚合物、静电交联的或缠结的聚合物中一或多种的水凝胶网络中。在一些实施方案中，所述一或多种共聚物应当在水性溶液中充分可溶以促进水凝胶形成。
在一个具体的实施方案中，缠结的聚合物选自下组：热胶凝的多糖（如琼脂糖）或热胶凝的蛋白质（如明胶），并且自水溶性乙烯基单体（如聚乙二醇二丙烯酸酯(“PEG-DA”)和2-羟乙基异丁烯酸酯(“HEMA”)）作为同聚物或共聚物合成物理交联的、化学交联的或静电交联的共聚物。
在一些实施方案中，水凝胶网络包含经由合成聚合物中悬挂的交联模块交联至合成聚合物的生物聚合物或其衍生化形式。如此，在此实施方案中，生物聚合物包含一或多种能够与合成聚合物的交联模块（例如伯胺或硫醇）反应的基团，或可以衍生化为含有这类基团。通过在与生物聚合物混合以形成交联的水凝胶之前向合成聚合物溶液加入细胞，能够容易地将细胞圈到最终基质中。或者，可以在交联步骤之前向含有合成的聚合物和生物聚合物两者的溶液加入细胞。对于将细胞包裹到基质中，将各种组分（细胞、合成聚合物和生物聚合物）分散于水性介质（如细胞培养基或其稀释或改良形式）。将细胞悬液温和地混合到聚合物溶液中直至细胞被基本均一地分散到溶液中，然后如上文描述的形成水凝胶。
在一些实施方案中，当要将细胞包裹到由一或多种交联聚合物（例如物理交联、化学交联、或静电交联的聚合物）构成的水凝胶中时，优选地，在一段时间内将聚合物聚合和/或交联从而使活细胞的基本部分保持存活。在一些实施方案中，将细胞交联小于约1小时，小于约50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1分钟。
6.2.1.2微流体装置
可用于形成如上文所述的水凝胶颗粒的例示性微流体装置包含具有至少一个表面的基底，在该表面上制造有多个流动通道。如本文中使用的，“通道”指在基底上或基底中的至少部分引导流体流动的特征。在一些情况下，至少部分地，可以通过单个组件（例如蚀刻基底或铸模单元）形成通道。通道可以具有任何横截面形状，例如圆形、椭圆形、三角形、不规则形、正方形或矩形（具有任何长宽比）等，并且可以是有覆盖或无覆盖的（即向包围通道的外部环境打开）。在其中将通道完全覆盖住的实施方案中，通道的至少一部分可以具有完全包封的横截面，和/或整个通道除其入口和出口以外可以沿其完整长度被完全包封。
在一些实施方案中，所述装置包含至少两个制造到表面中的流动通道，其中至少一个通道在每个通道的第一点（即在T联结点）流动连接至至少一个横向放置的通道。在一些实施方案中，所述装置包含至少两个入口，即装置中分别接受例如水性溶液中细胞或氟碳油的区域。每个入口可以包含一或多个入口通道、孔或储库、开口和其它便于例如水性溶液中的细胞或氟碳油进入基底的特征。入口一般在样品入口通道（例如细胞入口通道或油入口通道）和主通道（例如分别地细胞溶液流动通道或油流动通道）之间的联结点，从而将样品溶液（例如水性溶液中的细胞或氟碳油）引入到主通道中。在一些实施方案中，若期望的话，装置可以含有超过一个入口，例如超过一个细胞入口或超过一个油入口。在一些实施方案中，不同的样品入口通道能流通，即能与主通道在不同的入口处流体流通。例如，多个细胞入口通道能与细胞溶液流动通道流通，且多个油入口通道能与油流动通道流通。或者，不同的样品入口通道能与主通道在同一入口处流通。
在一些实施方案中，装置包含样品溶液储库或孔，或其它用于将样品在与入口通道流体流通的入口（例如细胞入口或油入口）处引入装置的装备。用于将一或多种样品加载到微流体装置的储库和孔包括但不限于注射器、药筒、管形瓶、Eppendorf管和细胞培养材料。
可用于便于水凝胶颗粒形成的微流体装置的一个实施方案显示于图3。全部装置建造在平坦基底中并且包含细胞入口，该细胞入口流体连接至细胞溶液流动通道，该细胞溶液流动通道流体连接至颗粒流动通道，在其末端连接颗粒收集出口。该装置还包含油入口，该油入口与油流动通道流体连接，该油流动通道相对于细胞溶液流动通道横向放置并与细胞溶液流动通道在T联结点处相交。油流动通道能与细胞溶液流动通道相交从而将油以垂直于流体流经细胞溶液流动通道的流动的角度引入到细胞溶液流动通道中。在一些实施方案中，油流动通道与细胞溶液流动通道在T联结点处相交，即使得油流动通道垂直（90度）于细胞溶液流动通道。在其它实施方案中，油流动通道可以任意角度与细胞溶液流动通道相交，且不需要以垂直于该流动的角度向细胞溶液流动通道引入油。在一些实施方案中，相交通道之间的角度在约60至约120度的范围内。在一些实施方案中，相交通道之间的角度为约45、60、90或120度。
在一些实施方案中，溶液（例如水性溶液中的细胞或氟碳油）经由微流体装置的流动受到压力驱动流动控制的驱动，并且能利用阀和泵来操纵溶液以一或多个方向流动和/或进入微流体装置的一或多个通道中。在一些实施方案中，可以通过调节相应的入口通道上的压力（例如使用输入到入口通道的加压注射器）来调节流动通道内的压力。通过控制油和细胞溶液源在其相应入口之间的压力差异可以调节生成的水凝胶颗粒的大小和周期性。水凝胶颗粒的大小和周期性还可取决于通道直径、流体粘度和剪切压。
图4提供对用于形成用水凝胶包裹的细胞的例示性过程的描述。细胞从左边从细胞入口以连续水性流进入，经过细胞溶液流动通道。当在T联结点处与流经油流动通道的氟碳油接触时，细胞溶液变为分散或不连续的，并形成被油包围的颗粒且引流通过颗粒流动通道。在装置的出口（即颗粒收集出口）处，颗粒进入一段管道并流入容器（如微量离心管）中。使凝胶颗粒硬化，然后与氟碳油分开，即清洗掉氟碳油并进入水性缓冲液。
在一些实施方案中，微流体装置的颗粒流动通道的横截面尺寸会影响形成的水凝胶颗粒的大小，即在水凝胶悬液与氟碳油在T联结点处接触后。在一些实施方案中，颗粒流动通道会具有例如范围在约0.1μm至约500μm、0.1μm至约200μm、0.1μm至约100μm、0.1μm至约50μm、或低于50μm的横截面尺寸。类似地，在一些实施方案中，油流动通道的横截面尺寸会影响在水凝胶悬液与氟碳油在T联结点处接触后形成的水凝胶颗粒的大小。在一些实施方案中，油流动通道会具有例如范围在约0.1μm至约500μm、0.1μm至约200μm、0.1μm至约100μm、0.1μm至约50μm、或低于50μm的横截面尺寸。
用于生成微流体装置（可用于便于形成水凝胶颗粒）的合适的基底材料一般地基于其与要形成的颗粒的性质的相容性进行选择。这类条件可以包括pH极值、温度、向其应用的氟碳油/含氟表面活性剂、向其应用的聚合物等。合适的基底材料的例子包括例如玻璃、石英和硅以及聚合物基底，例如塑料。在一些实施方案中，基底材料是刚性、半刚性或非刚性的、不透明、半透明或透明的。例如，包含光学或视觉元件以允许监测颗粒形成的装置会一般至少部分地从透明材料制造，从而允许或至少便于该监测。或者，任选地，将例如玻璃或石英的透明窗口纳入到装置中用于这类监测元件。另外，聚合材料可以具有线性或分支主链，并任选地为交联或未交联的。特别合适的聚合材料的例子包括例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚氨基甲酸酯（polyurethane）、聚氯乙烯(PVC)聚苯乙烯、聚砜、聚碳酸酯等。
可以一般地通过本领域中公知的任意数目的微制造技术实施将微型规模的元件（例如流动通道）制造到基底的表面中。例如，任选地在制造例如玻璃、石英或硅基底中采用光版印刷（photolithographic）技术，其使用半导体制造工业中公知的方法如光版印刷蚀刻、等离子体蚀刻或湿化学蚀刻。或者，任选地采用微机械加工方法如激光钻孔、微研磨等。类似地，对于聚合物基底，也可以使用公知的制造技术。这些技术包括注射铸模或压印铸模方法（其中任选地使用例如滚动压印以生成大片的微型规模基底）或聚合物微铸造技术（其中在微机器加工的模中聚合基底）。
通常，所述装置会包含另外的覆盖有通道的基底的平面元件，其包封并流体密封各个流动通道以形成管道。附着此平面覆盖元件由多种手段实现，包括例如热键合、粘合剂，或者在某些基底例如玻璃或半刚性和非刚性的聚合物基底的情况下两组分之间的天然粘合。另外，可以提供具有用于引入水凝胶颗粒形成所需的各种流体元件的入口和/或储库的平面覆盖元件。
对聚合物基底的表面修饰可以采用多种不同的形式。例如，为了防止材料（例如细胞和/或水凝胶颗粒）粘附到通道侧面，通道（和盖玻片，若使用的话）可以具有使粘附最小化的涂料。可以用任何抗润湿剂或封闭剂来包被微流体装置的通道表面用于分散相。还可以用任何蛋白质来包被通道以防止粘附生物学/化学样品。可以通过本领域中已知的任何手段来包被通道。例如，可以用由PPG Industries,Inc.在商标Aquapel下销售并披露于美国专利No.5,523,162的类型的疏水涂层包被通道（例如对塑料和经包被的塑料基底表面的全氟烃基烃基硅烷（perfluoroalkylalkylsilane）表面处理连同使用硅石引物层）。通过将通道表面氟化，连续相优先使通道湿润并允许液滴稳定生成并经由装置移动。通道壁的低表面张力由此使通道阻塞微粒的积累最小化。通过将通道表面氟化，连续相优先使通道湿润并允许材料（例如细胞和/或水凝胶颗粒）稳定生成并经由装置移动。通道壁的低表面张力由此使通道阻塞微粒的积累最小化。
在一个实施方案中，在基底上制备带电荷的表面牵涉将要修饰的表面（例如流动通道）暴露于合适的溶剂，该溶剂部分溶解或软化聚合物基底的表面。对合适溶剂的选择一般会依赖于用于基底的聚合材料。例如，氯化烃溶剂即三氯乙烷（TCE）、二氯乙烷等，尤其可用作与PMMA和聚碳酸酯聚合物一起使用的溶剂。然后，使去污剂与部分溶解的表面接触。去污剂分子的疏水部分会与部分溶解的聚合物联合。可以使用很多种去污剂，例如SDS（十二烷基硫酸钠）、DTAB（十二烷基三甲基溴化铵）、或CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）。然后，当聚合物表面随着去污剂包埋于表面中而硬化时，将溶剂从表面洗掉（例如使用水），从而将带电荷的头部基团呈现于流体界面。
在备选的方面，可以通过等离子体辐射修饰聚合材料（如聚二甲基硅氧烷）。具体地，对PDMS的等离子体辐射氧化甲基基团，释放碳并将羟基基团留在其位置上，从而有效地在聚合材料表面上创造玻璃样表面，该表面具有其相关的羟基官能团。
所述聚合物基底可以是刚性、半刚性、非刚性的或刚性和非刚性元件的组合。在一个实施方案中，基底由至少一种较软的柔性基底元件和至少一种较硬的更刚性的基底元件构成，其中一种包含制造到其表面中的通道和室。当将两种基底匹配时，软元件的纳入允许形成对通道和室的有效流体密封，从而避免了与将更刚性的塑料组件粘合或熔化在一起有关的需要和问题。
6.2.1.3氟碳油
氟碳油连续相很适合作为用于形成如本文中提供的水凝胶颗粒的连续相。含氟油既疏水又疏脂，如此，其对于水相的组分具有低溶解度。另外，与烃或硅油相反，含氟油不使PDMS材料（它是一种便于构建微流体通道的材料）膨胀。
在一些实施方案中，氟碳油与水相不混溶。在一些实施方案中，氟碳油在水凝胶颗粒形成以及随后硬化/聚合时使其稳定。在一些实施方案中，氟碳油维持对水凝胶颗粒的化学和生物学惰性，并且不会对颗粒中细胞的存活力有不利影响。在一些实施方案中，油溶液不膨胀、溶解或降解用于构建微流体装置的材料。优选地，油的物理特性（例如粘度）应适合流动以及包裹过程的操作条件。
用于本文中提供的方法的例示性氟碳油包括氢氟醚（hydrofluoroether），其为经由醚键与烃化学偶联的氟化烃基链（即Novec Engineered Fluids或HFE系列油）。可用的HFE系列油包括但不限于HFE-7500、HFE-7100、HFE-7200和HFE-7600。在一个具体的实施方案中，氟碳油是3M Novec HFE-7500，按重量计为1%。HFE系列油可以用作单独的油或油混合物的组分来优化乳液特性和性能。其它可用的氟碳油包括全氟烷基胺（即Fluorinert Electronic Liquid（FC油）），其为基于全氟化烃基胺结构的全氟化油。可用的FC油包括Fluorinert FC-3283和Fluorinert FC-40。FC油也可以用作单独的油或油混合物的组分来优化乳液特性和性能。
在一些实施方案中，所述氟碳油包含含氟表面活性剂。可以加入连续相流体的表面活性剂包括但不限于表面活性剂如基于山梨聚糖的羧酸酯（例如“Span”表面活性剂，Fluka Chemika），包括山梨聚糖单月桂酸酯（Span20）、山梨聚糖单棕榈酸酯（Span40）、山梨聚糖单硬脂酸酯（Span60）和山梨聚糖单油酸酯（Span80），以及全氟化的聚醚（例如DuPont Krytox157FSL、FSM和/或ESH）。可以使用的非离子型表面活性剂的其它非限制性例子包括聚氧乙烯化烷基酚（例如壬基酚、p-十二烷基酚和二壬基酚）、聚氧乙烯化直链醇、聚氧乙烯化聚氧丙二醇、聚氧乙烯化硫醇、长链羧酸酯（例如天然脂肪酸的甘油酯和聚甘油酯、丙二醇、山梨糖醇、聚氧乙烯化山梨糖醇酯、聚氧乙二醇酯等）和烷醇胺（例如二乙醇胺-脂肪酸缩合物和异丙醇胺-脂肪酸缩合物）。在一个具体的实施方案中，所述含氟表面活性剂是Krytox157FSH的羧酸铵盐。
可以如下合成另一种例示性含氟表面活性剂，可将其加入连续相流体（例如氟碳油）中：
6.2.2检测方法
6.2.2.1细胞培养
在水凝胶颗粒形成后，将凝胶颗粒悬液与氟碳油分开，转移至生长培养基并在合适的条件下生长，例如在包含碳源的培养基中在适于异源水不混溶性化合物生成的条件下。在一些实施方案中，所述条件包含在30℃振动温育箱中在管中生长细胞以允许细胞***并生成异源水不混溶性化合物。产物保持在琼脂糖颗粒中，并因此保持与产生该产物的细胞联合。
用于培养微生物细胞的合适的条件和合适的培养基是本领域中公知的。在一些实施方案中，碳源是单糖（简单的糖）、二糖、多糖、不可发酵碳源或它们的一或多种组合。合适的单糖的非限制性例子包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖及其组合。合适的二糖的非限制性例子包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖及其组合。合适的多糖的非限制性例子包括淀粉、糖原、纤维素、壳多糖及其组合。合适的不可发酵碳源的非限制性例子包括乙酸盐/酯和甘油。在一些实施方案中，用一或多种另外的试剂补充合适的培养基，所述试剂如例如诱导物（例如当一或多个编码基因产物的核苷酸序列处于可诱导启动子的控制下时）、阻遏物（例如当一或多个编码基因产物的核苷酸序列处于可抑制启动子的控制下时）或选择剂（例如选择包含遗传修饰的微生物细胞的抗生素）。
在一些实施方案中，在适合异源水不混溶性化合物生成的条件下培养包含细胞的水凝胶颗粒达至少12小时的时段。在一些实施方案中，在适合异源水不混溶性化合物生成的条件下培养包含细胞的水凝胶颗粒达12至14小时的时段。在一些实施方案中，在适合异源水不混溶性化合物生成的条件下培养包含细胞的水凝胶颗粒达至少24小时的时段。在一些实施方案中，在适合异源水不混溶性化合物生成的条件下培养包含细胞的水凝胶颗粒达约12、24、36、48、60、72或超过72小时的时段。
6.2.2.2检测
能够使用本领域中已知的任何标准细胞检测技术来检测包裹在水凝胶颗粒中的重组生成的水不混溶性化合物（即从包裹于其中的细胞或细胞的克隆性群体生成的），所述检测技术如流式细胞术、细胞分选、荧光激活细胞分选（FACS）、磁激活细胞分选（MACS）、通过使用光学或共聚焦显微术检查颗粒和/或包裹于其中的细胞，和/或分离经包裹的细胞。
在具体的实施方案中，可以使用荧光激活细胞分选器（FACS）来分选包含生成水不混溶性化合物的细胞的颗粒。荧光激活细胞分选（FACS）是公知的一种基于颗粒的荧光特性来分开颗粒（包括细胞）的方法（Kamarch,1987,Methods Enzymol,151:150-165）。对各颗粒中荧光模块的激光激发产生小电荷，从而允许将正电和负电颗粒从混合物电磁分开。在一个实施方案中，用结合（例如直接结合）由包裹在颗粒内的细胞生成的异源水不混溶性化合物的亲脂性荧光染料将颗粒染色。将颗粒处理通过细胞分选器，从而允许基于颗粒结合使用的荧光标记物的能力来将其分开。在一些实施方案中，可以使用前向散射或侧向散射来区分有细胞占据和未有细胞占据的水凝胶颗粒。然后可以进一步将被占据的颗粒设门以检测具有期望的荧光概况的细胞子群。可以将经FACS分选的颗粒直接存放到96孔或384孔板的各个孔中以便于包裹于其中的细胞的分开、分离和克隆。
在本文中提供的检测、筛选和/或富集的方法的一些实施方案中，所述方法包括使水凝胶颗粒与直接结合重组生成的水不混溶性化合物的荧光染料接触，并检测水凝胶颗粒中的荧光染料。在一些实施方案中，所述荧光染料是溶剂化显色染料。荧光溶剂化显色染料是根据包围分子的溶剂的极性而改变颜色的染料，且被用作例如对生物分子（尤其是脂质分子）动力学的高灵敏度实时观察中的探针。它的变色机制是经由直接结合实现的，并且不需要与特定的化学品种类接触。这类荧光溶剂化显色染料包括NBD、Dansyl、DASPMI、Prodan、Dapoxyl、4-DMAP、4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺（naphthalimide）衍生物、Reichardt’s染料和尼罗红。
在一些实施方案中，所述荧光溶剂化显色染料是尼罗红。尼罗红是脂溶性荧光染料，其经常用于通过荧光显微术和流式细胞荧光测定术来检测胞内脂质小滴，例如用于评估动物细胞和微生物（包括哺乳动物细胞、细菌、酵母和微藻类）的脂质含量。尼罗红具有数个独特的特性使其对于高通量检测本文中描述的重组生成的水不混溶性化合物是理想的。例如，尼罗红在疏水环境中为高度荧光的，在亲水环境中猝灭，而且和其它溶剂化显色染料类似，其激发和发射光谱随其环境的性质在光谱位置、形状和强度中变化。尼罗红的溶剂化显色特性允许部分区分结合磷脂和极性脂质的尼罗红与结合中性脂质的尼罗红。在极性脂质（如磷脂细胞膜）中，尼罗红具有最大为～590nm的荧光发射。相比之下，在存在中性脂质（例如烃产物（例如法呢烯））的情况下，光谱蓝移且最大发射为550nm。如此，在本文中描述的方法的某些实施方案中，在检测期间使用在光谱的绿色（525+/-20nm）和红色（670+/-20nm）区域的滤光器，从而使理想的生成细胞（例如纯法呢烯）和完全不生成细胞之间绿色对红色荧光的比率最大化。可以在绿色和红色光谱二者中捕获荧光数据，而且可以使用绿色对红色荧光的比率来测定微集落中水不混溶性化合物的量，相对于微集落中细胞生物质的量标准化。如此，本文中提供的方法有利地利用溶剂化显色染料（如尼罗红）以同时测定：(a)由包裹的微集落生成的水不混溶性化合物的量；和(b)包裹的微集落中的细胞生物质。通过避免分开测定细胞生物质（例如通过用细胞壁和核特异性染剂复染色或测量微集落的光学密度）的需要，能够实现比其它筛选方法更高的通量和效率。
可以有利地使用微集落的绿色对红色荧光的比率（G/R）来测定包裹的细胞集落中的相对产物:生物质比率，并相应地对群体分级。例如，经皮筛选的集落可以分级为具有：(a)相对高的G/R比率，其可能指示相对慢生长/高生成的群体；或(b)相对低的G/R比率，其可能指示相对快生长/低生成的群体、相对快生长/高生成的群体或相对慢生长/低生成的株。微集落的G/R比率还能与其单独的绿色荧光值(G)组合使用以进一步表征群体，该绿色荧光值指示由群体生成的化合物的量。例如，经皮筛选的具有低G/R比率但高G值的集落可能指示相对快生长/高生成的群体，而经皮筛选的具有低G/R比率但低G值的集落可能指示相对慢生长/低生成的群体或快生长/低生成的群体。
如此，在本文中提供的检测、筛选和/或富集方法的一些实施方案中，所述方法包括将水凝胶颗粒中水不混溶性化合物的量相对于水凝胶颗粒中细胞生物质的量标准化。在一些实施方案中，所述标准化包括测定：(a)水凝胶颗粒中水不混溶性化合物的荧光水平，和(b)水凝胶颗粒中细胞生物质的荧光水平；并确定(a)中测定的荧光对(b)中测定的荧光的比率。在一些实施方案中，荧光染料是尼罗红，且所述标准化包括测定对应于水凝胶颗粒中水不混溶性化合物水平的绿色光谱（例如525+/-20nm）中的荧光水平，以及测定对应于水凝胶颗粒中细胞生物质水平的红色光谱（670+/-20nm）中的荧光水平，并确定绿色对红色荧光的比率（G/R）。在一些实施方案中，所述方法还包括选出具有高G/R比率的水凝胶颗粒。在一些实施方案中，所述方法还包括选出具有高水平绿色荧光的水凝胶颗粒。在一些实施方案中，所述方法还包括选出具有高G/R比率和高水平绿色荧光的水凝胶颗粒。
6.2.2.3选择用于检测的光谱条件
可以在数个实施方案中实施对适用于选择性检测结合从多个经包裹细胞生成的WIC的荧光染料的光谱条件的测定。在一个实施方案中，对于(1)由多个细胞重组生成的WIC；(2)直接结合WIC的荧光染料；和(3)宿主细胞的任意组合，可以通过包括以下步骤的方法来确定光谱条件，即鉴定能特异性检测出结合WIC的染料的激发波长。在一些实施方案中，所述方法包括鉴定能特异性检测结合WIC的染料的发射波长的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括鉴定能特异性检测结合WIC的染料的激发和发射波长配对的步骤。在优选的实施方案中，所述方法包括鉴定对于检测结合WIC的荧光染料具有足够选择性，从而不检出来自宿主细胞生物质的荧光的激发和发射波长配对。
在一些实施方案中，测定对于检测结合WIC的荧光染料为选择性的光谱条件的方法包括测定相容的激发波长。在一个实施方案中，相容的激发波长由以下测定：
(a)使荧光染料与第一种多个细胞群体和第二种多个细胞群体接触，其中所述第一种和第二种多个的细胞与要筛选的生成WIC的细胞属于相同的细胞类型，其中每类多个包含具有细胞密度为x的细胞群体和具有细胞密度为5x的细胞群体，其中第一种多个的每个细胞群体包含WIC，而第二种多个的细胞群体不包含WIC；
(b)分别测定第一种多个和第二种多个的激发光谱，并
(c)选择激发波长，其中：
(i)具有相同细胞密度的来自第一种多个的细胞群体和来自第二种多个的细胞群体在荧光中的差异为至少80%；和
(ii)来自第二种多个的具有细胞密度x和细胞密度5x的细胞群体之间在荧光中的差异不超过250%。
在一些实施方案中，测定足以选择性检测出结合WIC的荧光染料的光谱条件的方法包括测定相容的发射波长。在一个实施方案中，相容的发射波长由以下测定：
(a)使荧光染料与第一种多个细胞群体和第二种多个细胞群体接触，其中所述第一种和第二种多个的细胞与要筛选的生成WIC的细胞属于相同的细胞类型，其中每种多个包含具有细胞密度为x的细胞群体和具有细胞密度为5x的细胞群体，其中第一种多个的每个细胞群体包含WIC，而第二种多个的细胞群体不包含WIC；
(b)分别测定第一种和第二种多个的发射光谱，并
(c)选择发射波长，其中：
(i)具有相同细胞密度的来自第一种多个的细胞群体和来自第二种多个的细胞群体在荧光中的差异为至少80%；和
(ii)来自第二种多个的具有细胞密度x和具有细胞密度5x的细胞群体之间在荧光中的差异不超过250%。
在具体的实施方案中，测定足以选择性检测出结合WIC的荧光染料的光谱条件的方法包括选择激发和发射波长两者，即相容的发射和激发波长配对，其中(i)具有相同光学密度的来自第一种多个的细胞群体和来自第二种多个的细胞群体在荧光中的差异为至少80%；且(ii)来自第二种多个的具有OD5和OD25的细胞群体之间在荧光中的差异不超过250%。
在所述方法包括测定对第一种和第二种多个细胞的激发光谱时，发射波长保持为恒定，并例如从250nm至500nm或其波长子集获得激发光谱。在一些实施方案中，将发射波长保持恒定于刚好在所获得的激发光谱的激发波长范围以外。在具体的实施方案中，将发射波长保持恒定于550nm。类似地，当所述方法包括测定用于第一种和第二种多个细胞的发射光谱时，将激发波长保持恒定，并例如从260nm至720nm或其波长子集获得发射光谱。在具体的实施方案中，将激发波长保持恒定于290nm。可以在本文中描述的方法中使用本领域中已知的能够获得荧光光谱的任何荧光计。
优选地，可用于上述方法的第一种和第二种多个细胞群体包含在对测定法不产生可感知的背景荧光量的液体培养基中。例如，可以在通常用于细胞培养或基于细胞的测定法的水性溶液（例如生物学缓冲液例如磷酸盐缓冲盐水或任何能支持细胞生长的培养基）中将细胞加入微量滴定板孔。
在一些实施方案中，细胞群体的细胞密度x是该细胞群体在600nm处的光密度（OD600）。例如，当具有细胞密度x的第一细胞群体OD600为1时，具有细胞密度5x的细胞群体OD600为5。在一些实施方案中，第一种和第二种多个细胞各自包含至少两个细胞密度递增的细胞群体，例如为x和5x（例如OD600为1和5）、x和10x（例如OD600为1和10）或x和20x（例如OD600为1和20）的细胞群体。在一些实施方案中，第一种和第二种多个包含具有更低或更高光密度的群体。例如，第一种和第二种多个还可以包含OD为1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、35、40、45或高于50的细胞群体。在一些实施方案中，第一种和第二种多个包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或超过12个具有递增细胞密度的细胞群体（自其获得荧光光谱），其中所述多个包含OD600为5和OD600为25的群体。在具体的实施方案中，第一种和第二种多个包含OD600为5、10、15、20和25的细胞群体。在其它实施方案中，第一种和第二种多个细胞包含OD600为1和10、1和15、5和20、10和20或10和25的群体。优选地，细胞密度x和细胞密度5x在给定细胞类型的600nm处分光光度法检测的动态范围内。
对于寻求其选择性光谱条件的水不混溶性化合物（WIC），为了测定光谱条件，可以将WIC（作为例如纯化的化合物）加入包含第一种多个的细胞的水性介质中。或者，第一种多个的细胞可以是经修饰以生成WIC的重组细胞。在利用生成WIC的重组细胞的一些实施方案中，之前确立由细胞生成的WIC的量，例如作为产率（每克底物（例如蔗糖）的化合物克数）、产量水平（每升克数）和/或生产率水平（每小时每升克数）。在一些实施方案中，当第一种多个包含生成WIC的重组细胞时，在测定特异于WIC的光谱条件之前将细胞培养达足以生成WIC的一段时间。
在一些实施方案中，第一种多个的每个细胞群体均以相等的量包含WIC。在其它实施方案中，第一种多个的细胞群体以不同的量包含WIC。优选地，WIC的量不超过可用于在所述接触期间结合WIC的荧光染料的量。在一些实施方案中，第一种多个的每个细胞群体以至少0.1g/L的量包含WIC。在其它实施方案中，第一种多个的每个细胞群体以0.1g/L至10g/l的量包含WIC。在一些实施方案中，第一种多个的每个群体以约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0或高于15.0g/L的量包含WIC。在具体的实施方案中，将WIC（作为纯化的WIC）（例如在对测定法不产生可感知量的背景荧光的溶剂中）加入第一种多个的每个群体。在具体的实施方案中，以至少2g/L的浓度将WIC外源加入第一种多个的每个细胞群体。
优选地，第一种和第二种多个的细胞属于相同的细胞类型，从而使可由荧光染料结合的内源细胞靶物的数量或质量中的任何差异最小化。优选地，第二种多个的细胞不包含WIC，例如外源加入或重组生成的WIC。然而，在WIC可以作为内源分子存在于第二种多个的细胞中的情况下，WIC也会作为内源分子存在于第一种多个的细胞中。
在一些实施方案中，在针对特异性检测WIC所选出的激发和/或发射波长处，具有相同细胞密度的来自第一种多个（包含WIC）的细胞群体和来自第二种多个（不包含WIC）的细胞群体之间的荧光差异为至少80%。在一些实施方案中，这些细胞群体之间的荧光差异会是至少约85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500或高于500%。
在一些实施方案中，在针对特异性检测WIC所选出的激发和/或发射波长处，来自第二种多个的具有细胞密度x和细胞密度5x的细胞群体之间的荧光差异不超过250%。在一些实施方案中，此差异不超过约240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、20或10%。
本文中还提供用于测定光谱条件的方法，所述光谱条件对于检测来自细胞的自身荧光是选择性的，没有来自尼罗红荧光（例如结合WIC的尼罗红）的荧光的影响。自身荧光可以用作细胞生物质的代理者，如此，一旦已测定对自身荧光选择性的光谱条件，就能使用两个选择性的激发/发射波长对获得给定的生成WIC的细胞群体的WIC:细胞生物质比率。
在一些实施方案中，测定对细胞自身荧光选择性的光谱条件的方法包括：
(a)使荧光染料与第一种多个细胞群体和第二种多个细胞群体接触，其中所述第一种和第二种多个的细胞属于相同的细胞类型，其中每种多个包含具有细胞密度为x的细胞群体和具有细胞密度为5x的细胞群体，其中第一种多个的每个细胞群体包含WIC，而第二种多个的细胞群体不包含WIC；
(b)分别测定第一种多个和第二种多个的激发光谱，并
(c)选择激发波长，其中：
(i)具有相同细胞密度的来自第一种多个的细胞群体和来自第二种多个的细胞群体在荧光中的差异不超过80%；和
(ii)来自第二种多个的具有细胞密度x和具有细胞密度5x的细胞群体之间在荧光中的差异为至少250%。
在一些实施方案中，测定对细胞自身荧光选择性的光谱条件的方法包括：
(a)使荧光染料与第一种多个细胞群体和第二种多个细胞群体接触，其中所述第一种和第二种多个的细胞属于相同的细胞类型，其中每种多个包含具有细胞密度为x的细胞群体和具有细胞密度为5x的细胞群体，其中第一种多个的每个细胞群体包含WIC，而第二种多个的细胞群体不包含WIC；
(b)分别测定第一种多个和第二种多个的发射光谱，并
(c)选择发射波长，其中：
(i)具有相同细胞密度的来自第一种多个的细胞群体和来自第二种多个的细胞群体在荧光中的差异不超过80%；和
(ii)来自第二种多个的具有细胞密度x和具有细胞密度5x的细胞群体之间在荧光中的差异为至少250%。
在具体的实施方案中，测定对细胞自身荧光选择性的光谱条件的方法包括选择激发和发射波长两者，即相容的发射和激发波长配对，其中(i)具有相同光密度的来自第一种多个的细胞群体和来自第二种多个的细胞群体在荧光中的差异不超过80%；且(ii)来自第二种多个的具有细胞密度x和细胞密度5x的细胞群体之间在荧光中的差异为至少250%。
在一些实施方案中，在针对特异性检测细胞自身荧光所选出的激发和/或发射波长处，具有相同密度的来自第一种多个的细胞群体（包含WIC）和来自第二种多个的细胞群体（不包含WIC）之间的荧光差异不超过80%。在一些实施方案中，在这些细胞群体之间的荧光差异不会超过75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15或10%。
在一些实施方案中，在针对特异性检测细胞自身荧光所选出的激发和/或发射波长处，来自第二种多个的具有细胞密度x和细胞密度5x的细胞群体之间的荧光差异为至少250%。在一些实施方案中，该差异为至少260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500或高于500%。
6.2.3筛选和富集方法
在另一个方面，本文中提供筛选细胞库中重组生成水不混溶性化合物的细胞的方法，其包括将库中的每个细胞包裹到水凝胶颗粒中；检测每个水凝胶颗粒中的重组生成的水不混溶性化合物，并选出生成所述重组生成的水不混溶性化合物的细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括将细胞从所选出的水凝胶颗粒分离并重复所述包裹、检测和选择步骤，从而在连续的选择轮中富集生成水不混溶性化合物的细胞或细胞的克隆性群体。
在一些实施方案中，本文中提供的方法和组合物可用于检测微生物细胞中工业上有用的化合物的生成，所述微生物细胞经遗传修饰从而以相比于未经遗传修饰的亲本微生物细胞以更高的产率、产量、生产率和/或增加的持久性生成一或多种这类化合物，所述未经遗传修饰的亲本微生物细胞例如天然不生成水不混溶性化合物量的初始亲本细胞，或生成天然量的水不混溶性化合物但无异源量的初始亲本细胞。在其它实施方案中，所述方法可用于鉴定经遗传修饰从而以相比于未经遗传修饰的亲本微生物细胞以更高的产率、产量、生产率和/或增加的持久性生成一或多种这类化合物的微生物细胞。例如，所述方法可用于从都已经遗传修饰以生成水不混溶性化合物的细胞群体鉴定出高生成细胞。在一些实施方案中，群体中的所有细胞均以相同的方式经过遗传修饰。在其它实施方案中，所述细胞群体包含已经过不同的策略进行遗传修饰以增加水不混溶性化合物生成的细胞。例如，要筛选的细胞群体可以包含经修饰以包含化合物代谢途径的一或多种组分的不同拷贝数或不同调节模式（例如不同启动子使用）的细胞。本文中提供的方法尤其可用于从以下细胞群体鉴定出高产生成者，该细胞群体已以相同的方式进行遗传修饰以生成水不混溶性化合物，然后进行诱变。在一些这类实施方案中，使用所述筛选方法来鉴定携带增加水不混溶性化合物的产率、产量或生产率的一或多种突变的细胞（相对于不携带一或多种突变的细胞）。可以使用本领域已知的任何用于生成诱变细胞群体的方法，如使用物理化学诱变原，包括但不限于UV辐射、γ辐射、x射线、限制酶诱导的诱变、诱变或致畸化学品、DNA修复诱变原、DNA修复抑制剂、易错DNA复制蛋白、N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）、甲磺酸乙酯（EMS）和ICR191；或使用***性诱变原，包括但不限于一或多个多克隆位点、一或多个转录终止位点、一或多个转录调节序列、一或多个翻译信号序列、一或多个开放阅读框（ORF）、一或多个序列突变ORF、一或多个终止密码子、一或多个突变或消除终止密码子的序列、一或多个mRNA去稳定元件、一或多个发夹序列、一或多个突变或消除发夹的序列、一或多个报告基因、一或多个剪接受体序列、一或多个剪接供体序列、一或多个内部核糖体进入位点（IRES）、一或多个转座子序列、一或多个位点特异性重组位点序列、一或多个限制性酶序列、一或多个编码融合配偶蛋白或肽的核苷酸序列、一或多个选择标志或选择模块、一或多个可用于在宿主细胞中扩增所述载体的细菌序列、一或多个3’基因陷阱（trap）、一或多个5’基因陷阱、一或多个编码定位信号的核苷酸序列、一或多个复制起点、一或多个蛋白酶切割位点、一或多个由基因或基因的一部分编码的期望蛋白质或肽、和一或多个编码一或多种5’或3’多核苷酸尾部的序列。
在一些实施方案中，所述方法提供群体中对于生成水不混溶性化合物的细胞（例如相对于群体中其它细胞以更高水平生成的细胞）在每轮包裹、检测和选择中至少2倍、3倍、4倍、5倍或超过5倍的富集。在一些实施方案中，所述方法提供细胞或细胞群体中第一群体中1:10、1:100或1:1000比率至经富集的群体中超过1:2、或介于1:2和1:1之间的富集。在一些实施方案中，所述富集发生在1轮、2轮或3轮的包裹、检测和选择上。在一些实施方案中，所述富集发生在3轮、4轮或5轮的包裹、检测和选择内。
在一些实施方案中，所述筛选方法足以鉴定出重组生成一或多种水不混溶性化合物（表达为WIC对细胞生物质的比率）的细胞或细胞的克隆性群体。在一些实施方案中，所述细胞生物质通过包括检测所述多个细胞在光谱条件下的自身荧光的方法测定，其中不检测来自结合WIC的荧光染料的荧光。在一些实施方案中，可以利用如本文中描述的选择性光谱条件，基于WIC和生物质分别的分开但特异性测量的相对荧光单位（RFU）计算WIC:生物质比率。在一些实施方案中，所述筛选方法足以鉴定出以以下WIC:生物质比率重组生成一或多种水不混溶性化合物的细胞或细胞的克隆性群体：约100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95或1:100。在一些实施方案中，所述筛选方法足以鉴定出以超过100:1或低于1:100的WIC:生物质比率重组生成一或多种水不混溶性化合物的细胞或细胞的克隆性群体。
在一些实施方案中，所述筛选方法足以鉴定出以超过每升发酵培养基约10克的量重组生成一或多种水不混溶性化合物的细胞或细胞的克隆性群体。在一些实施方案中，所述重组生成的水不混溶性化合物以从每升细胞培养基约10至约50克、超过约15克、超过约20克、超过约25克、或超过约30克的量生成。
在一些实施方案中，所述筛选方法足以鉴定出以超过每克干细胞重约50毫克的量重组生成一或多种水不混溶性化合物的细胞或细胞的克隆性群体。在一些实施方案中，所述重组生成的水不混溶性化合物以每克干细胞重约50至约1500毫克、超过约100毫克、超过约150毫克、超过约200毫克、超过约250毫克、超过约500毫克、超过约750毫克、或超过约1000毫克的量生成。
在一些实施方案中，所述筛选方法足以鉴定出以在每单位体积的细胞培养物基础上，高于未经本文所述遗传修饰的微生物细胞生成的水不混溶性化合物的量至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1,000倍或更高的量生成一或多种水不混溶性化合物的细胞或细胞的克隆性群体。在一些实施方案中，所述筛选方法足以鉴定出以在每单位体积的细胞培养物基础上，高于亦经本文所述遗传修饰的微生物细胞生成的水不混溶性化合物的量至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1,000倍或更高的量生成一或多种水不混溶性化合物的细胞或细胞的克隆性群体。
在一些实施方案中，所述筛选方法足以鉴定出以在每单位干细胞重基础上，比未经依照本文中提供的方法遗传修饰的微生物细胞生成的水不混溶性化合物的量高至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1,000倍或更高的量重组生成一或多种水不混溶性化合物的细胞或细胞的克隆性群体。在一些实施方案中，所述筛选方法足以鉴定出以在每单位干细胞重基础上，比亦经依照本文中提供的方法遗传修饰的微生物细胞生成的水不混溶性化合物的量高至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1,000倍或更高的量重组生成一或多种水不混溶性化合物的细胞或细胞的克隆性群体。
在一些实施方案中，所述筛选方法足以鉴定出以在每单位时间每单位体积的细胞培养物基础上，比未经依照本文中提供的方法遗传修饰的微生物细胞生成的水不混溶性化合物的量高至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1,000倍或更高的量重组生成一或多种水不混溶性化合物的细胞或细胞的克隆性群体。在一些实施方案中，所述筛选方法足以鉴定出以在每单位时间每单位体积的细胞培养物基础上，比亦经依照本文中提供的方法遗传修饰的微生物细胞生成的水不混溶性化合物的量高至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1,000倍或更高的量重组生成一或多种水不混溶性化合物的细胞或细胞的克隆性群体。
在一些实施方案中，所述筛选方法足以鉴定出以在每单位时间每单位干细胞重的基础上，比未经依照本文中提供的方法遗传修饰的微生物细胞生成的水不混溶性化合物的量高至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1,000倍或更高的量重组生成一或多种水不混溶性化合物的细胞或细胞的克隆性群体。在一些实施方案中，所述筛选方法足以鉴定出以在每单位时间每单位干细胞重的基础上，比亦经依照本文中提供的方法遗传修饰的微生物细胞生成的水不混溶性化合物的量高至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1,000倍或更高的量重组生成一或多种水不混溶性化合物的细胞或细胞的克隆性群体。
6.2.4用水凝胶包裹的细胞组合物
在另一个方面，本文中提供包含一或多种重组生成的水不混溶性化合物的用水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体。在另一个方面，本文中提供包含细胞或克隆性细胞群体，并且还包含一或多种重组生成的水不混溶性化合物的水凝胶颗粒。可用于本文中提供的方法和组合物的细胞包括任何能够天然或重组生成水不混溶性化合物（例如类异戊二烯、聚酮化合物、脂肪酸等）的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是原核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，所述细胞是大肠杆菌（Escherichiacoli）细胞。在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、COS-7细胞、小鼠成纤维细胞、小鼠胚胎癌细胞或小鼠胚胎干细胞。在一些实施方案中，所述细胞是昆虫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是S2细胞、Schneider细胞、S12细胞、5B1-4细胞、Tn5细胞或Sf9细胞。在一些实施方案中，所述细胞是单细胞真核生物细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是丝状细菌细胞。在一些实施方案中，所述丝状细菌细胞是放线菌（actinomycete）纲的。在具体的实施方案中，所述丝状细菌细胞是链霉菌属（Streptomyces）的，例如产二素链霉菌（Streptomycesambofaciens）、除虫链霉菌（Streptomyces avermitilis）、远青链霉菌（Streptomyces azureus）、肉桂链霉菌（Streptomyces cinnamonensis）、天蓝链霉菌（Streptomyces coelicolor）、古腊科链霉菌（Streptomyces curacoi）、Streptomyces erythraeus、弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）、加利利链霉菌（Streptomyces galilaeus）、淡青链霉菌（Streptomyces glaucescens）、吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）、变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）、微小链霉菌（Streptomyces parvulus）、波塞链霉菌（Streptomyces peucetius）、龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）、玫瑰暗黄链霉菌（Streptomycesroseofulvus）、耐热链霉菌（Streptomyces thermotolerans）、紫红链霉菌（Streptomyces violaceoruber）。
在另一个实施方案中，所述细胞是真菌细胞。在一个更具体的实施方案中，所述细胞是酵母细胞。可用于本文中提供的方法和组合物的酵母包括已保藏在微生物保藏处（例如IFO、ATCC等）且属于以下属的酵母：针芽孢酵母（Aciculoconidium）、神食酵母（Ambrosiozyma）、节囊酵母（Arthroascus）、Arxiozyma、Ashbya、Babjevia、Bensingtonia、Botryoascus、Botryozyma、酒香酵母（Brettanomyces）、布勒弹孢酵母（Bullera）、Bulleromyces、假丝酵母（Candida）、固囊酵母（Citeromyces）、棒孢酵母（Clavispora）、隐球酵母（Cryptococcus）、Cystofilobasidium、德巴利酵母（Debaryomyces）、德克酵母（Dekkara）、Dipodascopsis、Dipodascus、爱尼拉酵母（Eeniella）、拟内孢霉（Endomycopsella）、Eremascus、Eremothecium、Erythrobasidium、Fellomyces、线黑粉菌（Filobasidium）、Galactomyces、地霉（Geotrichum）、小季酵母（Guilliermondella）、有孢汉逊酵母（Hanseniaspora）、Hansenula、Hasegawaea、Holtermannia、连锁酵母（Hormoascus）、Hyphopichia、伊萨酵母（Issatchenkia）、克勒克酵母（Kloeckera）、Kloeckeraspora、克鲁维酵母（Kluyveromyces）、Kondoa、Kuraishia、Kurtzmanomyces、白色冬孢酵母（Leucosporidium）、油脂酵母（Lipomyces）、类德酵母（Lodderomyces）、Malassezia、酶奇酵母（Metschnikowia）、Mrakia、Myxozyma、纳逊酵母（Nadsonia）、Nakazawaea、针孢酵母（Nematospora）、Ogataea、卵孢酵母（Oosporidium）、管囊酵母（Pachysolen）、厚壁孢酵母（Phachytichospora）、范菲亚酵母（Phaffia）、毕赤酵母（Pichia）、红色冬孢酵母（Rhodosporidium）、红酵母（Rhodotorula）、酵母（Saccharomyces）、类酵母（Saccharomycodes）、复膜孢子酵母（Saccharomycopsis）、Saitoella、Sakaguchia、Saturnospora、裂芽酵母（Schizoblastosporion）、裂殖酵母（Schizosaccharomyces）、许旺氏酵母（Schwanniomyces）、锁合掷孢酵母（Sporidiobolus）、掷孢酵母（Sporobolomyces）、孢皮肥厚酵母（Sporopachydermia）、冠囊酵母（Stephanoascus）、梗孢酵母（Sterigmatomyces）、拟梗孢酵母（Sterigmatosporidium）、Symbiotaphrina、合轴酵母（Sympodiomyces）、Sympodiomycopsis、有孢圆酵母（Torulaspora）、Trichosporiella、丝孢酵母（Trichosporon）、三角酵母（Trigonopsis）、Tsuchiyaea、Udeniomyces、Waltomyces、威克酵母（Wickerhamia）、拟威克酵母（Wickerhamiella）、拟威尔酵母（Williopsis）、Yamadazyma、耶罗威亚酵母（Yarrowia）、接合酵母（Zygoascus）、Zygosaccharomyces、Zygowilliopsis和Zygozyma等。
在具体的实施方案中，可用于本文中提供的方法和组合物的酵母包括酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、Dekkera bruxellensis、乳酸克鲁维氏酵母（Kluyveromyces lactis）（以前称为Saccharomyces lactis）、Kluveromycesmarxianus、Arxula adeninivorans、或多形汉森酵母（Hansenula polymorpha）（现称为Pichia angusta）。在一些实施方案中，微生物是假丝酵母属，如解脂假丝酵母（Candida lipolytica）、Candida guilliermondii、Candida krusei、Candida pseudotropicalis、或产朊假丝酵母（Candida utilis）的菌株。
在一个具体的实施方案中，所述细胞是酿酒酵母细胞。在一些实施方案中，酿酒酵母细胞的菌株选自下组：面包酵母（Baker’s yeast）、CBS7959、CBS7960、CBS7961、CBS7962、CBS7963、CBS7964、IZ-1904、TA、BG-1、CR-1、SA-1、M-26、Y-904、PE-2、PE-5、VR-1、BR-1、BR-2、ME-2、VR-2、MA-3、MA-4、CAT-1、CB-1、NR-1、BT-1、和AL-1。在一些实施方案中，酿酒酵母的菌株选自下组：PE-2、CAT-1、VR-1、BG-1、CR-1、和SA-1。在一个具体的实施方案中，酿酒酵母菌株是PE-2。在另一个具体的实施方案中，酿酒酵母的菌株是CAT-1。在另一个具体的实施方案中，酿酒酵母的菌株是BG-1。
在一些实施方案中，所述细胞是单倍体微生物细胞。在其它实施方案中，所述细胞是二倍体微生物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是杂合的。在其它实施方案中，所述细胞除其交配型等位基因以外是纯合的（即如果细胞会形成孢子，那么所得四个单倍体微生物细胞除其交配型等位基因以外将是遗传相同的，所述交配型等位基因在两个单倍体细胞中将为交配型a而在另外两个单倍体细胞中将为交配型α）。
在一些实施方案中，所述细胞是适用于工业发酵（例如生物乙醇发酵）的细胞。在具体的实施方案中，将细胞条件化为在工业发酵环境公认的应激条件高溶剂浓度、高温、扩大的底物利用、营养限制、应有渗透压（osmoticstress due）、酸度、亚硫酸盐和细菌污染、或其组合下生存。
下文提供例示性的生成水不混溶性化合物的细胞，例如重组生成类异戊二烯、聚酮化合物和脂肪酸的细胞，以及用于生成这类细胞的方法。
6.2.4.1生成类异戊二烯的重组细胞
在一个方面，本文中提供检测（例如经遗传修饰以重组生成一或多种类异戊二烯化合物的）细胞或细胞的克隆性群体中类异戊二烯生成的方法。类异戊二烯自异戊烯焦磷酸（IPP）衍生，而异戊烯焦磷酸可由甲羟戊酸依赖性（“MEV”）途径或1-脱氧-D-木酮糖5-二磷酸（“DXP”）途径的酶生物合成。在图1A中描述了MEV途径的示意图，在图1B中描述了DXP途径的示意图。
6.2.4.1.1MEV途径
在本文中提供的检测类异戊二烯生成细胞的方法的一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码MEV途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列，其导致一或多种类异戊二烯化合物的生成相比于未经遗传修饰的亲本细胞增加。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码能将两分子乙酰辅酶A缩合以形成乙酰基乙酰-CoA的酶（例如乙酰-CoA硫解酶）的异源核苷酸序列。编码这类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（NC_000913REGION:2324131.2325315；大肠杆菌）、（D49362；脱氮副球菌（Paracoccusdenitrificans）），和（L20428；酿酒酵母）。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码能将乙酰基乙酰-CoA与另一分子的乙酰-CoA缩合以形成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA（HMG-CoA）的酶（例如HMG-CoA合酶）的异源核苷酸序列。编码这类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（NC_001145.互补物19061.20536；酿酒酵母），（X96617；酿酒酵母），（X83882；拟南芥（Arabidopsis thaliana）），（AB037907；Kitasatospora griseola），（BT007302；人），和（NC_002758，基因座标签SAV2546，GeneID1122571；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus））。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码能将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶（例如HMG-CoA还原酶）的异源核苷酸序列。编码这类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（NM_206548；黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）），（NC_002758，基因座标签SAV2545，GeneID1122570；金黄色葡萄球菌），（NM_204485；原鸡（Gallus gallus）），（AB015627；链霉菌KO3988），（AF542543；Nicotiana attenuata），（AB037907；Kitasatospora griseola），（AX128213，提供编码截短HMGR的序列；酿酒酵母），和（NC_001145:互补物115734.118898；酿酒酵母）。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码能将甲羟戊酸转化成甲羟戊酸5-磷酸的酶（例如甲羟戊酸激酶）的异源核苷酸序列。编码这类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（L77688；拟南芥）和（X55875；酿酒酵母）。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码能将甲羟戊酸5-磷酸转化成甲羟戊酸5-焦磷酸的酶（例如磷酸甲羟戊酸激酶）的异源核苷酸序列。编码这类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（AF429385；巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）），（NM_006556；人）和（NC_001145.互补物712315.713670；酿酒酵母）。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码能将甲羟戊酸5-焦磷酸转化成IPP的酶（例如甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶）的异源核苷酸序列。编码这类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（X97557；酿酒酵母），（AF290095；屎肠球菌（Enterococcus faecium））和（U49260；人）。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码MEV途径的超过一种酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码MEV途径的2种酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码能将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶以及能将甲羟戊酸转化成甲羟戊酸5-磷酸的酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码MEV途径的3种酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码MEV途径的4种酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码MEV途径的5种酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码MEV途径的6种酶的一或多段异源核苷酸序列。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞还包含编码能将经由MEV途径生成的IPP转化成其异构体二甲基烯丙基焦磷酸（“DMAPP”）的酶的异源核苷酸序列。可以经由各种另外酶的作用缩合并修饰DMAPP以形成简单和更复杂的类异戊二烯（图2）。
6.2.4.1.2DXP途径
在本文中提供的检测类异戊二烯生成细胞的方法的一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列，其导致一或多种类异戊二烯化合物的生成相比于未经遗传修饰的亲本细胞增加。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码能将两分子乙酰辅酶A缩合以形成乙酰基乙酰-CoA的酶（例如乙酰-CoA硫解酶）的异源核苷酸序列。编码这类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（NC_000913REGION:2324131.2325315；大肠杆菌），（D49362；脱氮副球菌），和（L20428；酿酒酵母）。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码能将丙酮酸与D-甘油醛3-磷酸缩合以制备1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的酶（例如1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶）的异源核苷酸序列。编码这类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（AF035440；大肠杆菌），（NC_002947，基因座标签PP0527；恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440），（CP000026，基因座标签SPA2301；Salmonella enterica Paratyphi，参见ATCC9150），（NC_007493，基因座标签RSP_0254；类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）2.4.1），（NC_005296，基因座标签RPA0952；沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonaspalustris）CGA009），（NC_004556，基因座标签PD1293；Xylella fastidiosaTemecula1）和（NC_003076，基因座标签AT5G11380；拟南芥）。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码能将1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸转化成2C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸的酶（例如1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶）的异源核苷酸序列。核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（AB013300；大肠杆菌），（AF148852；拟南芥），（NC_002947，基因座标签PP1597；恶臭假单胞菌KT2440），（AL939124，基因座标签SCO5694；天蓝链霉菌A3(2)），（NC_007493，基因座标签RSP_2709；类球红细菌2.4.1），和（NC_007492，基因座标签Pfl_1107；萤光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）PfO-1）。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码能将2C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸转化成4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藻糖醇的酶（例如4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藻糖醇合酶）的异源核苷酸序列。核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（AF230736；大肠杆菌），（NC_007493，基因座标签RSP_2835；类球红细菌2.4.1），（NC_003071，基因座标签AT2G02500；拟南芥），和（NC_002947，基因座标签PP1614；恶臭假单胞菌KT2440）。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码能将4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藻糖醇转化成4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸的酶（例如4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藻糖醇激酶）的异源核苷酸序列。核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（AF216300；大肠杆菌）和（NC_007493，基因座标签RSP_1779；类球红细菌2.4.1）。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码能将4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸转化成2C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸的酶2C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶的异源核苷酸序列。核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（AF230738；大肠杆菌）,（NC_007493，基因座标签RSP_6071；类球红细菌2.4.1），和（NC_002947，基因座标签PP1618；恶臭假单胞菌KT2440）。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码能将2C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸转化成1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸的酶（例如1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶）的异源核苷酸序列。核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（AY033515；大肠杆菌），（NC_002947，基因座标签PP0853；恶臭假单胞菌KT2440）和（NC_007493，基因座标签RSP_2982；类球红细菌2.4.1）。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码能将1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸转化成IPP或其异构体DMAPP的酶（例如异戊基/二甲基烯丙基二磷酸合酶）的异源核苷酸序列。核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（AY062212；大肠杆菌）和（NC_002947，基因座标签PP0606；恶臭假单胞菌KT2440）。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的超过一种酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的2种酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的3种酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的4种酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的5种酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的6种酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的5种酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的7种酶的一或多段异源核苷酸序列。
在一些实施方案中，将宿主细胞自身的代谢过程与那些牵涉IPP生成的过程之间的“串扰（cross talk）”（或干扰）最小化或完全消除。例如当宿主微生物仅依赖于DXP途径来合成IPP时将串扰最小化或完全消除，并引入MEV途径以提供额外的IPP。不会使这类宿主生物体配备为改变MEV途径酶的表达或加工与MEV途径有关的中间物。仅依赖于或支配性依赖于DXP途径的生物包括例如大肠杆菌。
在一些实施方案中，宿主细胞经由MEV途径，单独地或与DXP途径组合地生成IPP。在其它实施方案中，使宿主的DXP途径功能性失能从而宿主细胞仅经由异源引入的MEV途径生成IPP。可以通过使使一或多种DXP途径酶的基因表达失能或功能失活使DXP途径功能性失能。
在一些实施方案中，由细胞生成的类异戊二烯是C5类异戊二烯。这些化合物自一个异戊二烯单元衍生，并还称为半萜。半萜的例示性例子是异戊二烯。在其它实施方案中，类异戊二烯是C10类异戊二烯。这些化合物自两个异戊二烯单元衍生，并还称为单萜。单萜的例示性例子是柠檬烯、香茅醇（citranellol）、牦牛儿醇、薄荷醇、紫苏醇（perillyl alcohol）、里那醇、崔柏酮（thujone）和香叶烯。在其它实施方案中，类异戊二烯是C15类异戊二烯。这些化合物自三个异戊二烯单元衍生，并还称为倍半萜。倍半萜的例示性例子是蜚蠊酮（periplanone）B、银杏内酯（gingkolide）B、紫穗槐双烯、青蒿素、青蒿素酸、瓦伦烯、诺卡酮、epi-cedrol、epi-aristolochene、法尼醇、棉酚（gossypol）、sanonin、蜚蠊酮、毛喉素（forskolin）、和广藿香醇（其也称为百秋李醇（patchouli alcohol））。在其它实施方案中，类异戊二烯是C20类异戊二烯。这些化合物自四个异戊二烯单元衍生，并还称为二萜。二萜的例示性例子为蓖麻烯（casbene）、eleutherobin、帕利他赛（paclitaxel）、prostratin、伪蕨素（pseudopterosin）和紫杉二烯（taxadiene）。仍在其它实施例中，类异戊二烯是C20+类异戊二烯。这些化合物自超过四个异戊二烯单元衍生，并包括：三萜（自6个异戊二烯单元衍生的C30类异戊二烯化合物）如arbrusideE、鸦胆丁（bruceantin）、睾酮、孕酮、可的松（cortisone）、洋地黄毒苷和鲨烯；四萜（自8个异戊二烯单元衍生的C40类异戊二烯化合物）如β-胡萝卜素；和多萜（自超过8个异戊二烯单元衍生的C40+类异戊二烯化合物）如聚异戊二烯。在一些实施方案中，类异戊二烯选自下组：松香双烯、紫穗槐双烯、蒈烯、α-法呢烯、β-法呢烯、法尼醇、牦牛儿醇、牦牛儿基牦牛儿醇、异戊二烯、里那醇、柠檬烯、香叶烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β-蒎烯、香桧烯（sabinene）、γ-萜品烯、萜品油烯和瓦伦烯。类异戊二烯化合物还包括但不限于类胡萝卜素（如番茄红素、α-和β-胡萝卜素、α-和β-隐黄质（cryptoxanthin）、胭脂树橙（bixin）、玉米黄质（zeaxanthin）、变胞藻黄素（astaxanthin）和叶黄素（lutein））、类固醇化合物，以及由经其它化学基团修饰的类异戊二烯构成的化合物，如混合萜-生物碱、和辅酶Q-10。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞还包含编码能将经由MEV途径生成的IPP转化成DMAPP的酶（例如IPP异构酶）的异源核苷酸序列。编码这类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（NC_000913,3031087.3031635；大肠杆菌）和（AF082326；雨生红球藻（Haematococcuspluvialis））。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞还包含编码能缩合IPP和/或DMAPP分子以形成含有超过5个碳的聚异戊二烯化合物的聚异戊二烯合酶的异源核苷酸序列。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码能将1分子IPP与1分子DMAPP缩合以形成1分子牦牛儿基焦磷酸（“GPP”）的酶（例如GPP合酶）的异源核苷酸序列。编码这类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（AF513111；Abies grandis），（AF513112；Abies grandis），（AF513113；Abiesgrandis），（AY534686；金鱼草（Antirrhinum majus）），（AY534687；金鱼草），（Y17376；拟南芥），（AE016877，基因座AP11092；Bacillus cereus；ATCC14579），（AJ243739；Citrus sinensis），（AY534745；Clarkia breweri），（AY953508；Ips pini），（DQ286930；Lycopersicon esculentum），（AF182828；胡椒薄荷（Mentha x piperita）），（AF182827；胡椒薄荷），（MPI249453；胡椒薄荷），（PZE431697，基因座CAD24425；Paracoccus zeaxanthinifaciens），（AY866498；Picrorhiza kurrooa），（AY351862；Vitis vinifera），和（AF203881，基因座AAF12843；Zymomonas mobilis）。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞包含编码能将2分子IPP与1分子DMAPP缩合，或向1分子GPP加入1分子IPP以形成1分子法呢基焦磷酸（“FPP”）的酶（例如FPP合酶）的异源核苷酸序列。编码这类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（ATU80605；拟南芥），（ATHFPS2R；拟南芥），（AAU36376；Artemisia annua），（AF461050；Bos taurus），（D00694；大肠杆菌K-12），（AE009951，基因座AAL95523；Fusobacterium nucleatumsubsp.nucleatum ATCC25586），（GFFPPSGEN；Gibberella fujikuroi），（CP000009，基因座AAW60034；Gluconobacter oxydans621H），（AF019892；Helianthus annuus），（HUMFAPS；人），（KLPFPSQCR；Kluyveromyces lactis），（LAU15777；Lupinus albus），（LAU20771；Lupinus albus），（AF309508；Mus musculus），（NCFPPSGEN；Neurospora crassa），（PAFPS1；Partheniumargentatum），（PAFPS2；Parthenium argentatum），（RATFAPS；Rattusnorvegicus），（YSCFPP；酿酒酵母），（D89104；粟酒裂殖酵母），（CP000003，基因座AAT87386；Streptococcus pyogenes），（CP000017，基因座AAZ51849；Streptococcus pyogenes），（NC_008022，基因座YP_598856；Streptococcuspyogenes MGAS10270），（NC_008023，基因座YP_600845；Streptococcuspyogenes MGAS2096），（NC_008024，基因座YP_602832；Streptococcuspyogenes MGAS10750），（MZEFPS；玉蜀黍（Zea mays）），（AE000657，基因座AAC06913;Aquifex aeolicus VF5），（NM_202836；拟南芥），（D84432，基因座BAA12575；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）），（U12678，基因座AAC28894；Bradyrhizobium japonicum USDA110），（BACFDPS；Geobacillusstearothermophilus），（NC_002940，基因座NP_873754；Haemophilus ducreyi35000HP），（L42023，基因座AAC23087；Haemophilus influenzae Rd KW20），（J05262；人），（YP_395294；Lactobacillus sakei subsp.sakei23K），（NC_005823，基因座YP_000273；Leptospira interrogans serovar Copenhagenistr.Fiocruz L1-130），（AB003187；Micrococcus luteus），（NC_002946，基因座YP_208768；Neisseria gonorrhoeae FA1090），（U00090，基因座AAB91752；Rhizobium sp.NGR234），（J05091；酿酒酵母），（CP000031，基因座AAV93568；Silicibacter pomeroyi DSS-3），（AE008481，基因座AAK99890；Streptococcuspneumoniae R6），和（NC_004556，基因座NP779706；Xylella fastidiosaTemecula1）。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞还包含编码能组合IPP和DMAPP或IPP和FPP以形成牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸（“GGPP”）的酶的异源核苷酸序列。编码这类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（ATHGERPYRS；拟南芥），（BT005328；拟南芥），（NM_119845；拟南芥），（NZ_AAJM01000380，基因座ZP_00743052；Bacillus thuringiensis serovarisraelensis，ATCC35646sq1563），（CRGGPPS；Catharanthus roseus），（NZ_AABF02000074，基因座ZP_00144509；Fusobacterium nucleatum subsp.vincentii，ATCC49256），（GFGGPPSGN；Gibberella fujikuroi），（AY371321；Ginkgo biloba），（AB055496；巴西橡胶树），（AB017971；人），（MCI276129；Mucor circinelloides f.lusitanicus），（AB016044；Mus musculus），（AABX01000298，基因座NCU01427；Neurospora crassa），（NCU20940；Neurospora crassa），（NZ_AAKL01000008，基因座ZP_00943566；Ralstoniasolanacearum UW551），（AB118238；Rattus norvegicus），（SCU31632；酿酒酵母），（AB016095；Synechococcus elongates），（SAGGPS；Sinapis alba），（SSOGDS；Sulfolobus acidocaldarius），（NC_007759，基因座YP_461832；Syntrophus aciditrophicus SB），（NC_006840，基因座YP_204095；Vibriofischeri ES114），（NM_112315；拟南芥），（ERWCRTE；Pantoea agglomerans），（D90087，基因座BAA14124；Pantoea ananatis），（X52291，基因座CAA36538；Rhodobacter capsulatus），（AF195122，基因座AAF24294；类球红细菌）和（NC_004350，基因座NP_721015；Streptococcus mutans UA159）。
在一些实施方案中，类异戊二烯生成细胞还包含编码能修饰聚异戊二烯以形成半萜、单萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜、聚萜、类固醇化合物、类胡萝卜素或经修饰的类异戊二烯化合物的酶的异源核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码蒈烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（AF461460,REGION43.1926；挪威云杉（Piceaabies））和（AF527416,REGION:78.1871；Salvia stenophylla）。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码牦牛儿醇合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（AJ457070；Cinnamomum tenuipilum）,（AY362553；Ocimum basilicum），（DQ234300；Perilla frutescens菌株1864）,（DQ234299；Perilla citriodora菌株1861），（DQ234298；Perilla citriodora菌株4935）和（DQ088667；Perilla citriodora）。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码里那醇合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（AF497485；拟南芥），（AC002294，基因座AAB71482；拟南芥），（AY059757；拟南芥），（NM_104793；拟南芥），（AF154124；Artemisia annua），（AF067603；Clarkia breweri），（AF067602；Clarkia concinna），（AF067601；Clarkia breweri），（U58314；Clarkia breweri），（AY840091；Lycopersicon esculentum），（DQ263741；Lavandula angustifolia），（AY083653；Mentha citrate），（AY693647；Ocimum basilicum），（XM_463918；Oryza sativa），（AP004078，基因座BAD07605；Oryza sativa），（XM_463918，基因座XP_463918；Oryza sativa），（AY917193；Perilla citriodora），（AF271259；Perilla frutescens），（AY473623；挪威云杉），（DQ195274；Piceasitchensis），和（AF444798；Perilla frutescens var.crispa cultivar No.79）。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码柠檬烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(+)-柠檬烯合酶（AF514287,REGION:47.1867；Citrus limon）和（AY055214,REGION:48.1889；Agastache rugosa）以及(-)-柠檬烯合酶（DQ195275,REGION:1.1905；Picea sitchensis）,（AF006193,REGION:73.1986；Abies grandis），和（MHC4SLSP,REGION:29.1828；Mentha spicata）。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码香叶烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（U87908；Abies grandis），（AY195609；金鱼草），（AY195608；金鱼草），（NM_127982；拟南芥TPS10），（NM_113485；拟南芥ATTPS-CIN），（NM_113483；拟南芥ATTPS-CIN），（AF271259；Perillafrutescens），（AY473626；挪威云杉），（AF369919；挪威云杉），和（AJ304839；Quercus ilex）。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码罗勒烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（AY195607；金鱼草），（AY195609；金鱼草），（AY195608；金鱼草），（AK221024；拟南芥），（NM_113485；拟南芥ATTPS-CIN），（NM_113483；拟南芥ATTPS-CIN），（NM_117775；拟南芥ATTPS03），（NM_001036574；拟南芥ATTPS03），（NM_127982；拟南芥TPS10），（AB110642；Citrus unshiu CitMTSL4），和（AY575970；Lotuscorniculatus var.japonicus）。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码α-蒎烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(+)α-蒎烯合酶（AF543530，REGION:1.1887；Pinus taeda），(-)α-蒎烯合酶（AF543527，REGION:32.1921；Pinus taeda），和(+)/(-)α-蒎烯合酶（AGU87909，REGION:6111892；Abies grandis）。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码β-蒎烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：(-)β-蒎烯合酶（AF276072，REGION:1.1749；Artemisia annua）和（AF514288，REGION:26.1834；Citrus limon）。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码香桧烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：AF051901，REGION:26.1798，来自Salviaofficinalis。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码γ-萜品烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（AF514286，REGION:30.1832，来自Citruslimon）和（AB110640，REGION1.1803，来自Citrus unshiu）。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码萜品油烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（AY693650，来自Oscimum basilicum）和（AY906866，REGION:10.1887，来自Pseudotsuga menziesii）。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码紫穗槐双烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子为美国专利公开No.2004/0005678的SEQ ID NO.37。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码α-法呢烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于来自Pyrus communis cultivar d′Anjou的DQ309034（梨；基因名AFS1）和来自Malus domestica的AY182241（苹果；基因AFS1）。Pechouus等,Planta219(1):84-94（2004）。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码β-法呢烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于来自胡椒薄荷的GenBank登录号AF024615（薄荷；基因Tspa11），和来自Artemisia annua的AY835398。Picaud等,Phytochemistry66（9）:961-967（2005）。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码法尼醇合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于来自玉蜀黍的GenBank登录号AF529266和来自酿酒酵母的YDR481C（基因Pho8）。Song,L.,Applied Biochemistry andBiotechnology128:149-158（2006）。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码橙花叔醇合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于来自玉蜀黍的AF529266（玉米；基因tps1）。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码广藿香醇合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于来自Pogostemon cablin的AY508730REGION:1.1659。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码诺卡酮合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于来自Citrus sinensis的AF441124REGION:1.1647和来自Perilla frutescens的AY917195REGION:1.1653。
在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码松香双烯合酶。合适的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（U50768；Abies grandis）和（AY473621；挪威云杉）。
6.2.4.2生成聚酮化合物的重组细胞
在另一个方面，本文中提供检测（例如经遗传修饰以重组生成一或多种聚酮化合物的）细胞或细胞的克隆性群体中聚酮化合物生成的方法。聚酮化合物合成由聚酮化合物合酶（PKS）介导，其是与脂肪酸合酶（FAS）有关的多功能酶。PKS经由酰基硫代酸酯（通常为乙酰、丙酰、丙二酰或甲基丙二酰）之间的重复（脱羧性）Claisen缩合催化聚酮化合物的生物合成。在每次缩合后，PKS通过整个、部分或不催化还原性循环，将结构变异引入聚酮化合物产物中，所述还原性循环包含生长的聚酮化合物链的β-酮基团上的酮还原、脱水和烯酰还原。
在本文中提供的检测聚酮化合物生成细胞的方法的一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞包含编码PKS***，即能催化聚酮化合物合成的一或多种PKS的一或多段异源核苷酸序列，从而相比于未经遗传修饰的亲本细胞导致一或多种聚酮化合物的生成提高。
有两类主要的聚酮化合物合酶（PKS）：分别为芳香族PKS和模块化PKS，其不同在于使用催化位点的方式。对于芳香族PKS，最小***（即催化生成聚酮化合物所需的最小组分）包含酮合酶/酰基转移酶（KS/AT）催化区、链长度因子（CLF）催化区和酰基载体蛋白（ACP）活性。对于模块化PKS***，最小***包含KS催化区、AT催化区和ACP活性，倘若合成中的中间物以底物提供的话。当需要从头聚酮化合物合成时，最小模块化PKS***还包含加载酰基转移酶，其包含另外的AT和ACP区。
如此，在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞包含编码包含KS催化区的酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞包含编码包含AT催化区的酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞包含编码包含AT催化区的酶的超过一段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞包含编码包含CLF催化区的酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞包含编码包含ACP活性的酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞包含编码包含ACP活性的酶的超过一段异源核苷酸序列。
在一个具体的实施方案中，聚酮化合物生成细胞包含最小芳香族PKS***，例如分别编码包含KS催化区的酶、包含AT催化区的酶、包含CLF催化区的酶和包含ACP活性的酶的异源核苷酸序列。在一个具体的实施方案中，聚酮化合物生成细胞包含最小模块化PKS***，例如分别编码包含KS催化区的酶、包含AT催化区的酶、和包含ACP活性的酶的异源核苷酸序列。在又一个具体的实施方案中，聚酮化合物生成细胞包含用于从头聚酮化合物合成的模块化芳香族PKS***，例如分别编码包含KS催化区的酶、包含AT催化区的一或多种酶、和包含ACP活性的一或多种酶的异源核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含最小PKS***（例如如上文描述的最小芳香族PKS***或最小模块化PKS***）的聚酮化合物生成细胞还包含有助于生成终产物聚酮化合物的另外的催化活性。在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞包含编码包含环化酶（CYC）催化区的酶的一或多段异源核苷酸序列，该酶促进新生聚酮化合物主链的环化。在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞包含编码包含酮还原酶（KR）催化区的酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞包含编码包含芳香酶（ARO）催化区的酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞包含编码包含烯酰还原酶（ER）催化区的酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞包含编码包含硫酯酶（TE）催化区的酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞还包含编码包含全ACP合酶活性的酶的一或多段异源核苷酸序列，该酶导致ACP的泛酰巯基乙胺化（pantetheinylation）。
在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞还包含赋予合成后聚酮化合物修饰活性的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞还包含编码包含糖基化酶活性的酶的一或多段异源核苷酸序列，该酶导致对聚酮化合物的合成后修饰，例如在期望具有抗生素活性的聚酮化合物的情况下。在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞还包含编码包含羟化酶活性的酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞还包含编码包含环氧酶活性的酶的一或多段异源核苷酸序列。在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞还包含编码包含甲基化酶活性的酶的一或多段异源核苷酸序列。
在一些实施方案中，聚酮化合物生成细胞包含异源核苷酸序列，其例如编码能够生成选自但不限于以下聚酮化合物的PKS酶和聚酮化合物修饰酶的序列：除虫菌素(Avermectin)(参见例如美国专利No.5,252,474；美国专利No.4,703,009；EP公开No.118,367；MacNeil等,1993,“IndustrialMicroorganisms:Basic and Applied Molecular Genetics”；Baltz,Hegeman,&Skatrud,eds.(ASM),pp.245-256,“A Comparison of the Genes Encoding thePolyketide Synthases for Avermectin,Erythromycin,and Nemadectin”；MacNeil等,1992,Gene115:119-125；以及Ikeda和Omura,1997,Chem.Res.97:2599-2609)；杀假丝菌素(Candicidin)(FR008)(参见例如Hu等,1994,Mol.Microbiol.14:163-172)；碳霉素(Carbomycin)、居拉霉素(Curamycin)(参见例如Bergh等,Biotechnol Appl Biochem.1992Feb;15(1):80-9)；道诺霉素(Daunorubicin)(参见例如J Bacteriol.1994Oct;176(20):6270-80)；Epothilone(参见例如PCT公开No.99/66028；和PCT公开No.00/031247)；红霉素(Erythromycin)(参见例如PCT公开No.93/13663；美国专利No.6,004,787;美国专利No.5,824,513；Donadio等,1991,Science252:675-9；和Cortes等,Nov.8,1990,Nature348:176-8)；FK-506(参见例如Motamedi等,1998；Eur.J Biochem.256:528-534；和Motamedi等,1997,Eur.J Biochem.244:74-80)；FK-520(参见例如PCT公开No.00/020601；和Nielsen等,1991,Biochem.30:5789-96)；灰霉素(Griseusin)(参见例如Yu等,J Bacteriol.1994May;176(9):2627-34)；洛伐他汀(Lovastatin)(参见例如美国专利No.5,744,350)；Frenolycin(参见例如Khosla等,Bacteriol.1993Apr;175(8):2197-204；和Bibb等,Gene1994May3;142(1):31-9)；榴菌素(Granaticin)(参见例如Sherman等,EMBO J.1989Sep;8(9):2717-25；和Bechtold等,Mol Gen Genet.1995Sep20;248(5):610-20)；曼得尔霉素(Medermycin)(参见例如Ichinose等,Microbiology2003Jul;149(Pt7):1633-45)；莫能菌素(Monensin)(参见例如Arrowsmith等,Mol Gen Genet.1992Aug;234(2):254-64)；无活菌素(Nonactin)(参见例如FEMS Microbiol Lett.2000Feb1;183(1):171-5)；七尾霉素(Nanaomycin)(参见例如Kitao等,JAntibiot(Tokyo).1980Jul;33(7):711-6)；Nemadectin(参见例如MacNeil等,1993,见上)；尼达霉素(Niddamycin)(参见例如PCT公开No.98/51695；和Kakavas等,1997,J.Bacteriol.179:7515-7522)；竹桃霉素(Oleandomycin)(参见例如Swan等,1994,Mol.Gen.Genet.242:358-362；PCT公开No.00/026349；Olano等,1998,Mol.Gen.Genet.259(3):299-308；和PCT专利申请公开No.WO99/05283)；土霉素(Oxytetracycline)(参见例如Kim等,Gene.1994Apr8;141(1):141-2)；苦霉素(Picromycin)(参见例如PCT公开No.99/61599；PCT公开No.00/00620；Xue等,1998,Chemistry&Biology5(11):661-667；Xue等,October1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:12111-12116)；Platenolide(参见例如EP公开No.791,656；和美国专利No.5,945,320)；雷帕霉素(Rapamycin)(参见例如Schwecke等,August1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7839-7843；和Aparicio等,1996,Gene169:9-16)；利福霉素(Rifamycin)(参见例如PCT公开No.WO98/07868；和August等,Feb.13,1998,Chemistry&Biology,5(2):69-79)；Sorangium(参见例如美国专利No.6,090,601)；Soraphen(参见例如美国专利No.5,716,849；Schupp等,1995,J.Bacteriology177:3673-3679)；Spinocyn(参见例如PCT公开No.99/46387)；螺旋霉素(Spiramycin)(参见例如美国专利No.5,098,837)；特曲霉素(Tetracenomycin)(参见例如Summers等,JBacteriol.1992Mar;174(6):1810-20；和Shen等,J Bacteriol.1992Jun;174(11):3818-21)；四环素(参见例如J Am Chem Soc.2009Dec9;131(48):17677-89)；泰洛星(Tylosin)(参见例如美国专利No.5,876,991;美国专利No.5,672,497;美国专利No.5,149,638；EP公开No.791,655；EP公开No.238,323；Kuhstoss等,1996,Gene183:231-6；以及Merson-Davies和Cundliffe,1994,Mol.Microbiol.13:349-355)；和6-甲基水杨酸(参见例如Richardson等,Metab Eng.1999Apr;1(2):180-7；和Shao等,Biochem Biophys Res Commun.2006Jun23;345(1):133-9)。
6.2.4.3生成脂肪酸的重组细胞
在另一个方面，本文中提供检测（例如经遗传修饰以重组生成一或多种脂肪酸的）细胞或细胞的克隆性群体中脂肪酸生成的方法。脂肪酸合成由脂肪酸合酶（FAS）介导，该酶催化酰基链的引发和延长。酰基载体蛋白（ACP）连同FAS途径的酶控制所生成的脂肪酸的长度、饱和程度和分支。脂肪酸生物合成途径涉及前体乙酰-CoA和丙二酰-CoA。此途径中的步骤由脂肪酸生物合成（fab）和乙酰-CoA羧化酶（ace）基因的酶催化。
在本文中提供的检测脂肪酸生成细胞的方法的一些实施方案中，脂肪酸生成细胞包含编码乙酰-CoA合酶和/或丙二酰-CoA合酶的一或多段异源核苷酸序列，其导致相比于未经遗传修饰的亲本细胞一或多种脂肪酸的生成提高。
例如，为了提高乙酰-CoA生成，可以在细胞中表达一或多种以下基因：pdh、panK、aceEF（编码丙酮酸和2-酮戊二酸脱氢酶组合物的EIp脱氢酶组分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶组分）、fabH、fabD、fabG、acpP和fabF。编码这类酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：pdh（BAB34380,AAC73227,AAC73226）、panK（也称为coaA,AAC76952）、aceEF（AAC73227,AAC73226）、fabH（AAC74175）、fabD（AAC74176）、fabG（AAC74177）、acpP（AAC74178）、fabF（AAC74179）。
在一些实施方案中，能够通过减弱或敲除编码涉及脂肪酸降解的蛋白质的基因来实现细胞中脂肪酸水平升高。例如，能够使用本领域中已知的技术在工程化宿主细胞中减弱或敲除fadE、gpsA、idhA、pflb、adhE、pta、poxB、ackA、和/或ackB的表达水平。编码这类蛋白质的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：fadE（AAC73325）、gspA（AAC76632）、IdhA（AAC74462）、pflb（AAC73989）、adhE（AAC74323）、pta（AAC75357）、poxB（AAC73958）、ackA（AAC75356），和ackB（BAB81430）。所得宿主细胞在合适的环境中生长时会具有提高的乙酰-CoA生成水平。
在一些实施方案中，脂肪酸生成细胞包含编码能将乙酰-CoA转化成丙二酰-CoA的酶（例如多亚基AccABCD蛋白）的异源核苷酸序列。编码AccABCD的合适核苷酸序列的例示性例子包括但不限于登录号AAC73296,EC6.4.1.2。
在一些实施方案中，脂肪酸生成细胞包含编码脂肪酶的异源核苷酸序列。编码脂肪酶的合适核苷酸序列的例示性例子包括但不限于登录号CAA89087和CAA98876。
在一些实施方案中，能通过抑制PlsB来实现细胞中脂肪酸水平升高，这能导致长链酰基-ACP的水平升高，这会抑制脂肪酸生物合成途径的早期步骤（例如accABCD、fabH和fabl）。能使用本领域中已知的技术减弱或敲除工程化宿主细胞中PlsB的表达水平。编码PlsB的合适核苷酸序列的例示性例子包括但不限于登录号AAC77011。在具体的实施方案中，可以使用plsB D31IE突变来提高细胞中可用的酰基-CoA的量。
在一些实施方案中，能通过过表达sfa基因来实现单不饱和脂肪酸的生成提高，这会导致fabA受抑制。编码sfa的合适核苷酸序列的例示性例子包括但不限于登录号AAN79592。
在一些实施方案中，能通过调控控制脂肪酸底物的链长度的酶（例如硫酯酶）的表达来实现升高的脂肪酸水平。在一些实施方案中，脂肪酸生成细胞已修饰为过表达tes或fat基因。合适的tes核苷酸序列的例示性例子包括但不限于登录号：（tesA:AAC73596，来自大肠杆菌，能够生成C18:1脂肪酸）和（tesB:AAC73555，来自大肠杆菌）。合适的fat核苷酸序列的例示性例子包括但不限于：（fatB:Q41635和AAA34215，来自Umbellularia california，能够生成C12:0脂肪酸）、（fatB2:Q39513和AAC49269，来自Cuphea hookeriana，能够生成C8:0–C10:0脂肪酸）、（fatB3:AAC49269和AAC72881，来自Cuphea hookeriana，能够生成C14:0–C16:0脂肪酸）、（fatB:Q39473和AAC49151，来自Cinnamonumcamphorum，能够生成C14:0脂肪酸）、（fatB[M141T]:CAA85388，来自m拟南芥，能够生成C16:1脂肪酸）、（fatA:NP189147和NP193041，来自拟南芥，能够生成C18:1脂肪酸）、（fatA:CAC39106，来自Bradvrhiizobium japonicum，能够优先生成C18:1脂肪酸）、（fatA:AAC72883，来自Cuphea hookeriana，能够生成C18:1脂肪酸）、和（来自Helianthus annus的fatA1，AAL79361）。
在一些实施方案中，使用本领域中已知的技术能通过减弱硫酯酶C18的表达或活性来实现细胞中C10脂肪酸的水平升高。合适的编码硫酯酶C18的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于登录号AAC73596和P0ADA1。在其它实施方案中，使用本领域中已知的技术能通过提高硫酯酶C10的表达或活性来实现细胞中C10脂肪酸的水平升高。合适的编码硫酯酶C10的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于登录号Q39513。
在一些实施方案中，使用本领域中已知的技术能通过减弱生成非C14脂肪酸的内源硫酯酶的表达或活性来实现细胞中C14脂肪酸的水平升高。在其它实施方案中，使用本领域中已知的技术能通过提高使用底物C14-ACP的硫酯酶的表达或活性来实现细胞中C14脂肪酸的水平升高。合适的编码这类硫酯酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于登录号Q39473。
在一些实施方案中，使用本领域中已知的技术能通过减弱生成非C12脂肪酸的内源硫酯酶的表达或活性来实现细胞中C12脂肪酸的水平升高。在其它实施方案中，使用本领域中已知的技术能通过提高使用底物C12-ACP的硫酯酶的表达或活性来实现细胞中C12脂肪酸的水平升高。合适的编码这类硫酯酶的核苷酸序列的例示性例子包括但不限于登录号Q41635。
6.2.4.4别的遗传修饰
在本文中提供的方法和组合物的一些实施方案中，工程化为生成一或多种水不混溶性化合物的经遗传修饰的细胞还包含赋予细胞工业发酵背景中的有用特性的一或多种遗传修饰。
在一些实施方案中，所述细胞还包含编码增加絮凝的一或多种蛋白质的一或多段异源核苷酸序列。絮凝是微生物细胞的无性、可逆且钙依赖性的聚集以形成快速沉积到液体生长底物底部的含有大量细胞的絮状物。絮凝在酵母的工业发酵（例如用于生产生物乙醇、酒、啤酒和其它产品）中具有重要意义，因为它极大地简化在工业发酵中将悬浮的酵母细胞与自其生成的发酵产物分开。可以通过离心或过滤来实现分开，但通过这些方法分开是费时且昂贵的。或者，可以通过微生物细胞的天然沉降来实现澄清。尽管单独的微生物细胞倾向于随时间沉降，但自然沉降在工业工艺中仅在细胞聚集（即絮凝）时才成为可行选项。最近的研究显示，可以密切控制并精调酵母细胞的絮凝行为以满足特定的工业需要（参见例如Governder等,Appl EnvironMicrobiol.74(19):6041-52(2008)，据此其内容通过提述完整并入）。酵母细胞的絮凝行为取决于特定的絮凝蛋白质的功能，包括但不限于FLO1、FLO5、FLO8、FLO9、FLO10和FLO11基因的产物。如此，在一些实施方案中，本文中描述的工程化为生成一或多种水不混溶性化合物的经遗传修饰的细胞包含编码选自下组的一或多种絮凝蛋白质的一或多段异源核苷酸序列：Flo1p、Flo5p、Flo8p、Flo9p、Flo10p和Flo11p。
在一些实施方案中，所述细胞是孢子形成受损的和/或内源交配受损的。孢子形成和/或内源交配受损的经遗传修饰的微生物细胞具有降低的以下风险：(1)在自然界散播；和(2)经遗传修饰的微生物细胞和其自然散播能力未受损的野生型微生物之间的遗传材料的交换。在酵母中，二倍体微生物细胞形成孢子以及单倍体微生物细胞交配的能力取决于特定基因产物的功能。在酵母的这些之中是孢子形成基因（如IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2和SPO21基因）的产物及信息素应答基因（如STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STE11基因）的产物。
在一些实施方案中，所述细胞是单倍体酵母细胞，其中功能性破坏以下一或多种信息素应答基因：STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STE11。在一些实施方案中，所述细胞是单倍体酵母细胞，其中功能性破坏以下一或多种孢子形成基因：IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2和SPO21。在一些实施方案中，所述细胞是单倍体酵母细胞，其中功能性破坏以下一或多种信息素应答基因：STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STE11，并功能性破坏以下一或多种孢子形成基因：IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2和SPO21。在一些实施方案中，所述细胞是单倍体酵母细胞，其中将IME1基因和STE5基因功能性破坏。在一些实施方案中，所述细胞是单倍体酵母细胞，其中将IME1基因和STE5基因功能性破坏，并且包含编码能将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶的异源核苷酸序列。在一些实施方案中，所述细胞是单倍体酵母细胞，其中将IME1基因和STE5基因功能性破坏，并且包含编码能将甲羟戊酸转化成甲羟戊酸5-磷酸的酶的异源核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述细胞是二倍体酵母细胞，其中将以下一或多种信息素应答基因的两个拷贝均功能性破坏：STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STE11。在一些实施方案中，所述细胞是二倍体酵母细胞，其中将以下一或多种孢子形成基因的两个拷贝均功能性破坏：IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2和SPO21。在一些实施方案中，所述细胞是二倍体酵母细胞，其中将以下一或多种信息素应答基因的两个拷贝均功能性破坏：STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STE11，并且将以下一或多种孢子形成基因的两个拷贝均功能性破坏：IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2和SPO21。在一些实施方案中，所述细胞是二倍体酵母细胞，其中将IME1基因的两个拷贝和STE5基因的两个拷贝均功能性破坏。在一些实施方案中，所述细胞是二倍体酵母细胞，其中将IME1基因的两个拷贝和STE5基因的两个拷贝均功能性破坏，并且其包含编码能将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶的异源核苷酸序列。在一些实施方案中，所述细胞是双倍体酵母细胞，其中将IME1基因的两个拷贝和STE5基因的两个拷贝均功能性破坏，并且包含编码能将甲羟戊酸转化成甲羟戊酸5-磷酸的酶的异源核苷酸序列。
可用于引入编码絮凝蛋白质的外源序列，以及可用于功能性破坏一或多种絮凝基因和/或信息素应答基因的方法和组合物记载于美国专利申请公开No.2010/0304490和美国专利申请公开No.2010/0311065，据此其公开内容通过提述完整并入。
在一些实施方案中，所述细胞包含一或多种生物合成基因中的功能性破坏，其中作为破坏的结果，所述细胞是营养缺陷型的。在某些实施方案中，所述细胞不包含赋予对抗生素化合物的抗性的异源核苷酸序列。在其它实施方案中，所述细胞包含一或多种选择标志基因。在一些实施方案中，所述选择标志是抗生素抗性标志。抗生素抗性标志的例示性例子包括但不限于BLA、NAT1、PAT、AUR1-C、PDR4、SMR1、CAT、小鼠dhfr、HPH、DSDA、KANR，和SH BLE基因产物。来自大肠杆菌的BLA基因产物赋予对β-内酰胺抗生素（例如窄谱头孢菌素、头霉素、和碳青霉烯类（ertapenem）、头孢孟多（cefamandole）和头孢哌酮（cefoperazone））以及对除替莫西林（temocillin）以外的所有抗革兰氏阴性细菌青霉素的抗性；来自S.noursei的NAT1基因产物赋予对诺尔丝菌素的抗性；来自S.viridochromogenes Tu94的PAT基因产物赋予对双丙氨磷（bialophos）的抗性；来自酿酒酵母的AUR1-C基因产物赋予对Auerobasidin A（AbA）的抗性；PDR4基因产物赋予对蓝菌素（cerulenin）的抗性；SMR1基因产物赋予对嘧磺隆（sulfometuron）甲基的抗性；来自Tn9转座子的CAT基因产物赋予对氯霉素的抗性；小鼠dhfr基因产物赋予对甲氨蝶呤的抗性；Klebsiella pneumonia的HPH基因产物赋予对潮霉素B的抗性；大肠杆菌的DSDA基因产物允许细胞在以D-丝氨酸作为唯一氮源的平板上生长；Tn903转座子的KANR基因赋予对G418的抗性；来自Streptoalloteichushindustanus的SH BLE基因产物赋予对Zeocin（博来霉素）的抗性。在一些实施方案中，例如在细胞已经过遗传修饰以实现提高的水不混溶性化合物生成之后从宿主细胞基因组切除抗生素抗性标志。可用于从经遗传修饰宿主细胞的基因组精确切除核苷酸序列（例如编码这类抗生素抗性标志的序列）的方法和组合物，记载于2010年12月23日提交的美国专利申请No.12/978,061，其公开内容通过提述完整并入本文中。
在一些实施方案中，选择标志在经遗传修饰的微生物细胞中挽救营养缺陷型（例如营养性营养缺陷型）。在这类实施方案中，亲本微生物细胞包含在氨基酸或核苷酸生物合成途径中起作用的一或多种基因产物（如例如酵母中的HIS3、LEU2、LYS1、LYS2、MET15、TRP1、ADE2和URA3基因产物）中的功能性破坏，其使得亲本微生物细胞不能在未补充一或多种营养物的培养基中生长（营养缺陷型表型）。然后，可以通过用编码受破坏基因产物的功能性拷贝的表达载体或染色体整合转化亲本微生物细胞来挽救该营养缺陷型表型，并可以基于亲本微生物细胞的营养缺陷型表型的丧失来选择生成的经遗传修饰的微生物细胞。利用URA3、TRP1和LYS2基因作为选择标志具有突出的优点，因为正和负选择两者都是可能的。正选择由URA3、TRP1和LYS2突变的营养缺陷型补足实施，而负选择基于防止原养型菌株生长但分别允许URA3、TRP1和LYS2突变体生长的特定抑制剂，即分别为5-氟-乳清酸（FOA）、5-氟邻氨基苯甲酸和α-氨基己二酸（αAA）。
在其它实施方案中，选择标志挽救可通过已知的选择方法鉴定的其它非致命性缺陷或表型。
用于使用表达载体或染色体整合构建体遗传修饰微生物，从而例如如上文所述的导致宿主细胞中一或多种水不混溶性化合物生成升高，或赋予这类细胞有用特性的方法是本领域中公知的。参见例如，Sherman,F.,等,MethodsYeast Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1978);Guthrie,C.,等(Eds.)Guide To Yeast Genetics and Molecular Biology Vol.194,Academic Press,San Diego(1991);Sambrook等,2001,Molecular Cloning--A LaboratoryManual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY;和Ausubel等,eds.,Current Edition,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,NY.；其公开内容通过提述并入本文中。另外，可以通过缺失、突变和/或基因重排来实现对基因表达的抑制，例如其导致细胞中一或多种水不混溶性化合物的生成增加。还可以凭借使用反义RNA、siRNA、miRNA、核酶、三链DNA、和转录和/或翻译抑制剂实施。另外，可以采用转座子来破坏基因表达，例如通过将其***到启动子和编码区之间，或两个临近基因之间以使这一或两个基因失活。
在一些实施方案中，通过使用表达特定蛋白质（例如如上文描述的牵涉生物合成途径的蛋白质）的表达载体来实现细胞中水不混溶性化合物的生成增加。一般地，表达载体是包含可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的复制信号和表达控制序列（例如启动子和终止子）的重组多核苷酸分子。可用于表达编码多肽的核苷酸序列的表达载体包括病毒载体（例如逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒）、质粒载体和粘粒。适合于在酵母细胞中使用的表达载体的例示性例子包括但不限于CEN/ARS和2μ质粒。适合于在酵母细胞中使用的启动子的例示性例子包括但不限于K.lactis的TEF1基因的启动子、酿酒酵母的PGK1基因的启动子、酿酒酵母的TDH3基因的启动子、可抑制启动子例如酿酒酵母的CTR3基因的启动子、和可诱导启动子例如酿酒酵母的半乳糖可诱导启动子（例如GAL1、GAL7和GAL10基因的启动子）。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法无限制地将表达载体和染色体整合构建体引入微生物细胞中。参见例如，Hinnen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1292-3(1978);Cregg等,Mol.Cell.Biol.5:3376-3385(1985);美国专利No.5,272,065;Goeddel等,eds,1990,Methods in Enzymology,vol.185,Academic Press,Inc.,CA;Krieger,1990,Gene Transfer and Expression--ALaboratory Manual,Stockton Press,NY;Sambrook等,1989,Molecular Cloning--A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY;和Ausubel等,eds.,Current Edition,Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience,NY。例示性的技术包括但不限于原生质球（spheroplasting）、电穿孔、PEG1000介导的转化和醋酸锂或氯化锂介导的转化。
7.实施例
7.1实施例1：生成水不混溶性化合物的经遗传修饰的细胞的产生
此实施例描述了用于产生工程化为生成类异戊二烯法呢烯的经遗传修饰的单倍体酿酒酵母细胞的例示性方法。
阶段I整合构建体包含作为整合序列的编码选择标志（hygA，其赋予对潮霉素B的抗性）；酿酒酵母MEV途径的两种酶（编码截短型HMG-CoA还原酶的截短型HMG1编码序列和编码HMG-CoA合酶的ERG13编码序列）和酿酒酵母的另一种酶（编码乙酰基乙酰-CoA硫解酶的ERG10编码序列）的核苷酸序列，其在半乳糖诱导型启动子（酿酒酵母基因GAL1和GAL10的启动子）的控制下；侧翼为由酿酒酵母GAL80基因座的上游和下游核苷酸序列组成的同源序列。当引入酿酒酵母宿主细胞中时，阶段I整合构建体能通过同源重组整合到酿酒酵母宿主细胞基因组的GAL80基因座中，并通过用其整合序列替换GAL80编码序列来功能性破坏GAL80基因座。将阶段I整合构建体克隆到TOPO Zero Blunt II克隆载体（Invitrogen,Carlsbad,CA）中，得到质粒TOPO-阶段I整合构建体。将此构建体在生长于含50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上的TOP10细胞中扩增。
阶段II整合构建体包含作为整合序列的编码选择标志（natA，其赋予对诺尔丝菌素的抗性）和酿酒酵母MEV途径的数种酶（编码甲羟戊酸激酶的ERG12编码序列及编码磷酸甲羟戊酸激酶的ERG8编码序列）的核苷酸序列，其在半乳糖诱导型启动子（酿酒酵母基因GAL1和GAL10的启动子）的控制下；以及在GAL4oc启动子（包含除去MIG1结合位点的突变由此使启动子对葡萄糖抑制不那么敏感的GAL4启动子）控制下的酿酒酵母GAL4基因的编码序列；侧翼为由酿酒酵母LEU2基因座的上游和下游核苷酸序列组成的同源序列。当引入酿酒酵母宿主细胞中时，阶段II整合构建体能通过同源重组整合到酿酒酵母宿主细胞基因组的LEU2基因座中，并通过用其整合序列替换LEU2编码序列来功能性破坏LEU2基因座。将阶段II整合构建体克隆到TOPOZero Blunt II克隆载体中，得到质粒TOPO-阶段II整合构建体。将此构建体在生长于含50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上的TOP10细胞（Invitrogen,Carlsbad,CA）中增殖。
阶段III整合构建体包含作为整合序列的编码选择标志（kanA，其赋予对G418的抗性）；酿酒酵母MEV途径的酶（编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的ERG19编码序列及酿酒酵母中牵涉将MEV途径的产物IPP转化成FPP的两种酶（编码法呢基焦磷酸合酶的ERG20编码序列和编码异戊烯焦磷酸脱羧酶的IDI1编码序列）的核苷酸序列，其在半乳糖诱导型启动子（酿酒酵母基因GAL1、GAL10和GAL7的启动子）的控制下；以及酿酒酵母CTR3基因的启动子；侧翼为酿酒酵母ERG9基因座的上游和编码核苷酸序列。当引入酿酒酵母宿主细胞中时，阶段III整合构建体能通过同源重组整合到酿酒酵母宿主细胞基因组的ERG9基因座上游，用CTR3启动子替换天然ERG9启动子，这样使得ERG9（鲨烯合酶）表达能通过铜来调控。将阶段III整合构建体克隆到TOPO Zero Blunt II克隆载体中，得到质粒TOPO-阶段III整合构建体。将此构建体在生长于含50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上的TOP10细胞中增殖。
阶段I标志循环构建体包含编码选择标志（URA3，其赋予在缺少尿嘧啶的培养基上生长的能力）；和A.annua的一种酶（编码法呢烯合酶的FS编码序列）的核苷酸序列，其在酿酒酵母GAL7基因的启动子的调节控制下；侧翼为酿酒酵母GAL80基因座的上游核苷酸序列和酿酒酵母HMG1基因的编码序列。当引入酿酒酵母宿主细胞中时，阶段I标志循环构建体能通过同源重组整合到已整合的阶段I整合序列中，从而用URA3替换选择标志hphA。
阶段II标志循环构建体包含编码选择标志（URA3，其赋予在缺少尿嘧啶的培养基上生长的能力）和A.annua的一种酶（编码法呢烯合酶的FS编码序列）的核苷酸序列，其在酿酒酵母GAL7基因的启动子的调节控制下；侧翼为酿酒酵母LEU2基因座的上游核苷酸序列和酿酒酵母ERG12基因的编码序列。当引入酿酒酵母宿主细胞中时，阶段II标志循环构建体能通过同源重组整合到已整合的阶段II整合序列中，从而用URA3替换选择标志natA。
阶段III标志循环构建体包含编码选择标志（URA3，其赋予在缺少尿嘧啶的培养基上生长的能力）和A.annua的一种酶（编码法呢烯合酶的FS编码序列）的核苷酸序列，其在酿酒酵母GAL7基因的启动子的调节控制下；侧翼为酿酒酵母ERG9基因座的上游核苷酸序列和酿酒酵母ERG19基因的编码序列。当引入酿酒酵母宿主细胞中时，阶段III标志循环构建体能通过同源重组整合到已整合的阶段III整合序列中，从而用URA3替换选择标志kanA。
表达质粒pAM404编码β-法呢烯合酶。核苷酸序列***物是使用Artemisia annua的β-法呢烯合酶基因针对酿酒酵母中的表达进行了密码子优化的编码序列（GenBank登录号AY835398）作为模板合成生成的。
通过将活性干PE-2酵母（1994年分离；来自Santelisa Vale,
Figure BDA0000386971150000581
,Brazil的礼物）重悬于5mL含有100ug/mL羧苄青霉素和50ug/mL卡那霉素的YPD培养基中生成起始宿主菌株Y1198。将培养物在30℃在旋转摇动器上以200rpm过夜温育。然后，将10uL的培养物等分试样铺板到YPD板，并允许干燥。将细胞连续划线接种以产生单菌落，并在30℃温育2天。挑取12个单菌落，铺缀到新的YPD平板，并允许在30℃过夜生长。通过依照制造商说明书使用Bio-Rad CHEF基因组DNA Plug试剂盒（Bio-Rad,Hercules,CA），在Bio-Rad CHEF DR II***（Bio-Rad,Hercules,CA）上分析菌落的染色体大小来验证其菌株身份。挑取一个菌落，并作为Y1198菌株储藏。
通过使菌株单倍体以允许遗传工程化从菌株Y1198生成菌株Y1661、Y1662、Y1663、和Y1664。在滚筒鼓（roller drum）中的玻璃管中，在5mL YPD培养基中于30℃过夜生长菌株Y1198。测量OD600，并将细胞在5mL含有2%醋酸钾的YP培养基稀释成OD600为0.2。在滚筒鼓中的玻璃管中于30℃过夜生长培养物。再次测量OD600，并通过以5,000xg离心2分钟来收集4OD600*mL细胞。将细胞团粒用无菌水清洗1次，然后重悬于3mL含有0.02%棉子糖的2%醋酸钾中。将细胞在滚筒鼓中的玻璃管中于30℃生长3天。孢子形成由显微术确认。将33μL的培养物等分试样转移至1.5mL微量离心管并以14,000rpm离心2分钟。将细胞团粒重悬于含有2μL10mg/mL Zymolyase100T（MP Biomedicals,Solon,OH）的50μL无菌水中，并将细胞在30℃水浴中温育10分钟。将管转移至冰，并加入150μL冰冷的水。将此混合物的10μL等分试样加入12mL YPD板，并在Singer MSM300解剖显微镜（Singer,Somerset,UK）上剖析四分体。将YPD板在30℃温育3天，然后将孢子铺缀到新鲜的YPD板上并在30℃过夜生长。通过菌落PCR分析来自8个4孢子四分体的每个孢子的交配型。挑取具有2个MATa和2个MATα孢子的单个4孢子四分体，并作为菌株Y1661（MATa）、Y1662（MATa）、Y1663（MATα）和Y1664（MATα）储藏。
对于酵母细胞转化，用起始宿主菌株的单菌落接种25ml酵母提取物-蛋白胨-右旋糖（YPD）培养基。将培养物在30℃在旋转摇动器上以200rpm过夜生长。测量培养物的OD600，然后使用培养物来接种50ml YPD培养基至OD600为0.15。将新接种的培养物在30℃在旋转摇动器上以200rpm生长至OD600为0.7至0.9，在此点处用1μg DNA转化细胞。允许细胞在YPD培养基中恢复4小时，之后将细胞铺板到含选择剂的琼脂上以鉴定宿主细胞转化体。
通过用质粒TOPO-阶段I整合构建体（已使用PmeI限制性内切核酸酶消化完全）转化菌株Y1664产生宿主菌株Y1515。在含有300ug/mL潮霉素B的YPD培养基上选择宿主细胞转化体，并通过PCR扩增验证包含在GAL80基因座处整合的阶段I整合序列的阳性转化体。
通过用质粒TOPO-阶段II整合构建体（已使用PmeI限制性内切核酸酶消化完全）转化菌株Y1515产生宿主菌株Y1762。在含有100ug/mL诺尔丝菌素的YPD培养基上选择宿主细胞转化体，并通过PCR扩增验证包含在LEU2基因座处整合的阶段II整合序列的阳性转化体。
通过用表达质粒pAM404和质粒TOPO-阶段III整合构建体（已使用PmeI限制性内切核酸酶消化完全）以两步骤转化菌株Y1762产生宿主菌株Y1770。在缺少甲硫氨酸和亮氨酸的完全合成培养基（CSM）上选择具有pAM404的宿主细胞转化体。在缺少甲硫氨酸和亮氨酸且含有200ug/mL G418（
Figure BDA0000386971150000591
）的CSM上选择具有pAM404和阶段III整合构建体的宿主细胞转化体，并通过PCR扩增验证包含在ERG9基因座处整合的阶段III整合序列的阳性转化体。
通过用URA3敲除构建体（SEQ ID NO:154）转化菌株Y1770产生宿主菌株Y1793。URA3敲除构建体包含URA3基因座的上游和下游序列（从酿酒酵母菌株CEN.PK2基因组DNA产生）。在含有5-FOA的YPD培养基上选择宿主细胞转化体。
通过用阶段I标志循环构建体转化菌株Y1793来产生宿主菌株YAAA。在缺少甲硫氨酸和尿嘧啶的CSM上选择宿主细胞转化体。通过将细胞在YPD培养基中于30℃在旋转摇动器上以200rpm过夜生长，然后将细胞铺板到含有5-FOA的琼脂上来切除URA3标志。标志的切除由菌落PCR确认。
通过用阶段II标志循环构建体转化菌株YAAA来产生宿主菌株YBBB。在缺少甲硫氨酸和尿嘧啶的CSM上选择宿主细胞转化体。通过将细胞在YPD培养基中于30℃在旋转摇动器上以200rpm过夜生长，然后将细胞铺板到含有5-FOA的琼脂上来切除URA3标志。标志的切除由菌落PCR确认。
通过用阶段III标志循环构建体转化菌株YBBB来产生宿主菌株Y1912。在缺少甲硫氨酸和尿嘧啶的CSM上选择宿主细胞转化体。通过将细胞在YPD培养基中于30℃在旋转摇动器上以200rpm过夜生长，然后将细胞铺板到含有5-FOA的琼脂上来切除URA3标志。标志的切除由菌落PCR确认。
7.2实施例2：细胞的包裹
此实施例描述了用于将细胞包裹到水凝胶中并针对一或多种水不混溶性化合物的重组生成筛选经包裹细胞的例示性方法。
7.2.1制造微流体***
由弹性体聚合物聚(二甲基硅氧烷)（PDMS）构成，并且包含至少两个在T联结点处互连的通道的微流体装置，是使用蚀刻晶片基底（例如通过光版印刷制备）作为模具制造的。
简言之，通过用丙酮和异丙醇漂洗晶片来制备晶片基底。通过旋转涂料将光致抗蚀剂例如SU8-3000光致抗蚀剂（Microchem,Newton,MA）应用于晶片。然后，穿过设计为允许以选择的模式（例如包含两个通道在T联结点互连的模式）使光致抗蚀剂曝光的掩膜，用UV光选择性照射此光致抗蚀剂涂层。在UV曝光后，通过在65℃烘焙1分钟，接着在95℃烘焙4分钟来处理晶片。通过伴随80rmp振动将晶片浸没在二醇单甲基醚醋酸（PGMEA）溶液中4-5分钟，接着用异丙醇漂洗3次使光致抗蚀剂显影。然后，将晶片在200℃烘焙5-30分钟，接着允许降至室温。
使蚀刻晶片与PDMS（
Figure BDA0000386971150000601
,Dow Corning,Midland,MI）接触以形成微流体装置。简言之，将70克
Figure BDA0000386971150000603
弹性体基材与7克
Figure BDA0000386971150000602
交联剂在容器中混合。将34克混合后的组合物倾倒在蚀刻晶片上，然后置于真空干燥器中约5分钟（或直到晶片表面上没有明显的泡沫），接着在65℃烘焙60-90分钟。
从晶片除去聚合的PDMS，并进行等离子体处理（0.3mbar达20秒）。将用于包封微流体装置的玻璃载玻片也进行等离子体处理（0.3mbar达20秒）。在等离子体处理后，将玻璃载玻片以等离子体暴露面朝下置于PDMS上，并用温和加压除去气泡。然后，将密封的微流体装置在65℃烘焙10分钟。接着，对装置的通道用水防护剂进行处理，所述水防护剂例如基于硅烷/硅氧烷的防护剂如AquapelTM（Pittsburgh Glass Works LLC,Pittsburgh,PA）。在图4和图5A中提供了如本文中描述制备的例示性微流体装置的二维图，其包含在T联结点处互连的两个通道。
7.2.2制备用于包裹的细胞
将包含要针对异源水不混溶性化合物生成进行筛选的细胞的500ul液体细胞培养基或数个来自平板的菌落加入1ml PBS-MBF（1x PBS，具有：10mM甘露糖、0.5%BSA、0.001%Pluronic F-127），涡动约10秒并以5000g离心30秒。除去上清液，加入1ml PBS-MBF，并将细胞涡动10秒，然后以5000g离心1分钟。除去上清液，并将细胞重悬于1ml PBS-F。
通过将细胞悬液加载到黑色10μM Par-tec滤器并简单离心（～500rcf）对悬液进行过滤。用简单涡动使样品重悬，然后在PBS中以1:9稀释。测定OD600，并将细胞在PBS-F（1x PBS，具有：10mM甘露糖、0.5%BSA、0.001%PluronicF-127）中稀释至在正确OD600处的1ml培养物，即对于给定液滴大小所需的2倍最终细胞浓度。
制备琼脂糖溶液用于包裹细胞。简言之，将0.5g LMP琼脂糖（例如
Figure BDA0000386971150000611
,EM Science,Gibbstown,NJ）重悬于100ml瓶中的25ml水中，并以10秒时间间隔微波加热直至完全熔化并溶解。允许琼脂糖降温至～30-35℃，然后以1:1与也已加热至30-35℃的细胞悬液混合。
7.2.3将细胞包裹到水凝胶颗粒中
将如上述制备的细胞悬液加入26口径针的注射器中，并在针尖上装备12英寸的PE/2管。将细胞经由针尖向管中逐出（例如经由自动化手段）。将管插到细胞溶液流动通道的进入处。将12英寸的1/32”OD PEEK管在流动通道的相反端***，以充当油/水凝胶乳液的出口。
给自动化油分散器配备注射器和管，并且注射器以5,000至10,000μl/h的流速灌注油。将管插到微流体装置上的油流动通道的进入处，并将油流速设为850至1,000μl/h。时不时打开油流以弄湿管和装置之间的联结点处。
水流（包含琼脂糖中的细胞）经由细胞溶液流动通道开始，接着很快是经由油流动通道的油流。从PEEK管中将包含水凝胶颗粒的乳液收集到2ml收集管中，储存在冰上。
在水凝胶颗粒已在冰上凝固5分钟后，用移液管将较低的油层除去。将500ul20%PFO（HFE-7500中20%V/V全氟辛醇）加入颗粒并涡动悬液，然后以6000g离心30秒。除去剩余的油并加入5ml期望的生长培养基+0.001%F127，接着彻底涡动悬液。再加入5ml生长培养基，并将悬液以6000g离心1分钟。倒掉上清液，然后在将团粒简单涡动，之后转移至1.5ml Eppendorf管。加入500μl生长培养基并简单涡动悬液，然后以6000g离心1分钟。除去上清液，记录水凝胶颗粒的大概重量，并加入2倍颗粒重量的生长培养基。将颗粒重悬并转移至14ml Falcon管中。然后将溶液在34℃在合适的细胞培养条件下振动24小时以允许细胞增殖和异源水不混溶性化合物生成。
7.3实施例3：颗粒分析和分选
此实施例描述了用于分析和分选包含生成水不混溶性化合物的细胞的水凝胶颗粒的例示性方法。
将70μm BD细胞过滤器放置在50ml锥形管上。将包含经包裹细胞的培养物用5ml移液管应用于滤膜中心。将颗粒用PBS的两次1ml等分试样从膜上洗下，以100g离心30秒，重悬于1ml PBS中并再次以100g离心30秒。然后，将过滤后的培养物以等分试样加入10μm Partec滤器并以100g离心90秒。向每个滤器的滤饼加入1ml PBS，并通过上下吹打将饼重悬。再向悬液加入1ml PBS，并以100g离心90秒。
制备尼罗红染色溶液（2ml/样品），根据需要，通过将200μl尼罗红储液（EtOH中100μg/ml）加入每10ml PBS（最终2μg/ml）进行。
将1ml染色溶液加至每个滤器的滤饼并通过上下吹打重悬。再加入1ml染色溶液，并以120g离心90秒。通过加入1ml空白PBS、上下吹打以重悬并将颗粒转移至FACS管而将颗粒从滤器移出。用第2次1ml PBS清洗膜并转移至同一管。
然后通过荧光激活细胞分选（FACS）基于荧光强度来分选颗粒，该荧光强度对应于异源水不混溶性化合物的生成水平，相对于颗粒中包含的细胞生物质标准化过。此分析利用尼罗红的溶剂化显色特性。在极性脂质，如磷脂细胞膜中，尼罗红具有最大为～590nm的荧光发射。相比之下，当存在中性脂质时，光谱蓝移，发射最大为550nm。如此，使用在光谱的绿色（515+/-20nm）和红色（670+/-20nm）区中的滤光片，从而使理想的生成者（纯法呢烯）和完全的非生成者之间的绿色对红色荧光的比率最大化（见图6）。
在FACSAria II（Becton Dickinson,San Jose,CA）上分析经包裹的样品。从4个参数收集峰高、面积和宽度：从固态488nm激光器的前向和侧向散射（分别为FSC和SSC）、来自515nm通带滤器的绿色荧光和来自670nm通带滤器的红色荧光。首先设门将经包裹的菌落从任何残片、剩余未包裹的细胞和空颗粒分开，其使用SSC面积作为FSC面积参数的函数的绘图（见图7A）。
为了测定颗粒中生成的产物的量，实施第一项分析，其中估计由颗粒中不同细胞数所导致的噪音。尼罗红的荧光在中性脂质如烃产物（例如法呢烯）中相对于其在极性脂质如磷脂膜中的荧光蓝移。通过使用来自绿色（产物）对红色（细胞生物质）荧光的比率，消除从细胞数变化中产生的大部分噪音。根据菌株，此标准化将变异系数从80-100%降至8-12%（分别见例如图7C和7D）。因此，用于选择分选出的群体的第二幅图具有绿色对红色荧光的比率（G/R）；选出具有高绿色（G）和高G/R信号两者的群体（见例如图7B中的框示群体）。
以每秒500-1000个事件收集事件，从而为设门收集10,000个事件。根据预期的突变体表型变化、筛选轮数和群体大小，高G+G/R菌落的“分选门”含有总菌落的0.5%至20%。将分选的群体直接铺到营养琼脂培养皿上；细胞从颗粒中长出并在琼脂上形成菌落，对其进行回收以用于进一步处理，例如随后的一轮包裹、分选和培养。可以实施包含2-6轮的包裹、分选和生长循环的筛选来富集生成大量水不混溶性化合物的细胞群体。在最后一轮分选后，可以选出各个菌落用于在传统的大批培养筛选方法中评估以对高水平生成进行确证。
7.4实施例4：鉴定并选择生成法呢烯的细胞
此实施例证明对工程化为生成低至高水平法呢烯的重组酵母菌株中异源水不混溶性化合物进行检测的灵敏度和保真度。将依照实施例1中描述的方法产生且代表广泛范围的法呢烯生成的一系列酵母菌株依照分别在实施例2和3中描述的方法包裹并分选。将尼罗红用作检测剂。将通过皮筛选方法检测到的法呢烯水平与通过标准测量方法（包括2升发酵罐产率、尼罗红96孔振动板和法呢烯通量）检出的水平进行比较。
如下实施尼罗红96孔振动板测定法。对于每种菌株，从琼脂板挑取单菌落到含有360μl Bird Seed培养基（BSM）、2%蔗糖、0.25N+crb（预培养基）的1.1ml96孔板中。用可透气的膜密封物密封预培养板，并将培养物在33.5℃、80%湿度，伴随1000rpm振动温育96小时。将14.4μl预培养基转移至包含在1.1ml96孔生产板中的360μl（1:25稀释）BSM4%蔗糖中。用可透气的膜密封物密封生产板，并将培养物在33.5℃、80%湿度，伴随1000rmp振动温育48小时。在温育后，将98μl生产培养物与2μL尼罗红溶液（最终尼罗红浓度为2μg/ml）在96孔黑色聚苯乙烯平底测定板中混合。在将板加载到分光光度计上之前，将其混合30秒，并以290nm的激发和550nm的发射获得法呢烯特异性读数。还以350nm的激发和450nm的发射获得细胞生物质特异性读数，并测定法呢烯对生物质比率。
如下实施法呢烯通量测定法。对于每种菌株，从琼脂板挑取单菌落到含有360μl BSM、2%蔗糖（预培养基）的1.1ml96孔板中。用可透气的膜密封物密封预培养板，并将培养物在33.5℃、80%湿度，伴随1000rpm振动温育65-72小时。将30μl预培养基转移至包含在1.1ml96孔生产板中的360μl BSM4%蔗糖中。用可透气的膜密封物密封生产板，并将培养物在33.5℃、80%湿度，伴随1000rpm振动温育48小时。在测定法呢烯滴度之前，对每份培养物进行OD600测量。将200μL每份培养物转移至2.2mL板，并加入400μL/孔甲醇。将板密封并振动30-40分钟。移去密封物并加入600μL/孔n-庚烷（含有0.001%反式-石竹烯），将板密封，然后振动90分钟。接着将板以2500g离心5分钟。对于每份样品，将来自2.2mL板的200μl/孔的顶部庚烷层转移至1.1mL板的孔中，并加入200μL/孔n-庚烷（含有0.001%反式-石竹烯）。将板密封，振动2分钟，然后以2500g离心2分钟。在Agilent7890气相层析***（AgilentTechnologies,Inc.,Palo Alto,CA）上用火焰离子化检测（FID）分析庚烷萃取物。通过将生成的峰面积与庚烷中经过纯化的生物学衍生的反式β-法呢烯（Amyris Inc.,Emeryville,CA）的定量校正曲线比较来计算法呢烯滴度。
如下测定2L发酵罐产率。对于每种菌株，将含有50mL无菌BSM2%蔗糖（用琥珀酸盐缓冲）的250mL不带挡板的摇瓶用1.0mL融化的工作种子储液接种。将接种物瓶以200rpm2”摆度（throw）、在34℃生长约24小时至OD600为约3.5。将含有800mL无菌培养基的Fernbach摇瓶用50mL接种物接种。允许种子瓶以200rpm2”摆度、在34℃生长约24小时至OD600为约3.5且乙醇>2g/L。将全部的接种后体积用于2L发酵。通过将2倍分批基材（batch base）与DI水组合并高压灭菌来制备发酵罐分批培养基。将无菌痕量金属和维生素作为无菌后添加物添加，并在接种前在目标工艺条件平衡培养基。在接种后还向发酵罐加入Tergitol L-81防沫剂（0.1mL/L终体积）。使用28%的氢氧化铵来控制pH。糖补料是750g/L蔗糖。发酵在生产期间以33.5℃、pH5、叶轮搅动、OUR80-150进行6天。测量细胞密度并通过上文所述气相层析来测定法呢烯滴度。
图8为工程化为生成不同水平法呢烯的7种菌株中每一种提供通过皮筛选测定的法呢烯产率（相对于生物质标准化并以任意单位表述）（y轴），其分别相对于由2L发酵罐产率（x轴，左图）、尼罗红振动板测定法（x轴，中图）和法呢烯通量分析（x轴，右图）进行的产率测量绘出。在生成值的较宽范围内相关性较好（R2>90%）。这些相关证实了皮筛选测定法能在生成各种量的法呢烯的菌株群体之中区分法呢烯生成。
7.5实施例5：富集高法呢烯生成群体
此实施例证明本文中提供的包裹和检测（“皮筛选”）方法在重复实施时，能从低生成者背景中有效富集出高生成细胞。
为了证明皮筛选方法学从较低生成者的背景中富集出高生成者的能力，开发数字式菌落PCR测定法以明确区分分选之前和之后在单个群体中共培养的不同包裹的菌株，及测定一种菌株对另一种的相对丰度。将差异之处在于其基因组中整合的法呢烯合酶（FS）基因数的一对菌株用作模式***。基因组中FS拷贝数越多，其导致菌株生成的法呢烯的量也越高。第一种菌株FS2具有2个FS的整合拷贝，而第二种菌株FS5具有5个整合的拷贝。FS5被独立地证实以优于FS2～30%的产率生成法呢烯。
设计3种能用于在单个PCR反应中明确区分FS2和FS5菌株的引物。第一引物靶向TCYC1终止子序列，其是两种菌株通用的并充当前向引物。第二引物充当反向引物，其靶向在包含第二拷贝FS的整合序列中发现的区域，并且也是两种菌株通用的；从此基因座扩增产生89bp扩增子。第三引物也充当反向引物，其靶向在包含第5拷贝FS的整合序列中发现的区域，这是菌株FS5独特的且不存在于菌株FS2中；从此基因座扩增产生304bp扩增子。当在每种菌株上用3种引物的混合物实施PCR时，菌株FS2产生1条带（仅89bp），而菌株FS5产生两条带（89bp和304bp）（见图9）。304bp条带的存在被用作指示菌落自菌株FS5衍生的明确标志。
将菌株FS2和FS5以分别为10:1、100:1、和1000:1的FS2:FS5比率混合成单一的分开库，并在这类模式库的每一种上实施皮筛选。在每一种库上实施3轮包裹和分选。在各轮之间，将分选出的颗粒直接铺板于大培养盘上生长，从每轮选出96个菌落并使用前述3种引物进行菌落PCR以确定每个菌落的身份。从这些PCR数据，确定在每轮包裹和分选后自菌株FS5衍生的菌落所代表的铺板群体的百分数。
图10中提供的结果证明在3轮包裹和分选上菌株FS5的成功富集。图10A提供纯菌株的FACS直方图数据，在第1和第2行中呈现。在1、2和3轮包裹和分选（第3-5行）后100:1混合群体的直方图显示，到第3轮实现菌株FS5的基本富集。图10B提供10:1、100:1和1000:1库每个的各轮分选之间的富集的定量结果，其自cPCR数据得到。在这些研究中，对于具有分别为10:1和100:1的起始FS2:FS5比率的库，对FS5的富集近乎是完全的，从而到第3轮时所得群体近100%由FS5衍生的菌落组成。甚至当FS5在起始群体中为稀有时（～10%），也观察到每轮约5倍的富集。这些结果证明能够通过皮筛选有效实现对较低生成细胞的群体中稀有的、高生成细胞群体的近乎完全的富集。7.6实施例6：鉴定并选出生成其它水不混溶性化合物的细胞
此实施例证明皮筛选对于检测、分选和选择重组生成其它水不混溶性化合物的细胞的有效性。
7.6.1柠檬烯生成细胞
除了倍半萜法呢烯的重组生成之外，能通过皮筛选检测出细胞中的其它类异戊二烯，包括单萜。单萜一般包含两个异戊二烯单元并具有为C10H16的分子式。单萜柠檬烯在椒薄荷和柑橘属水果的皮中天然发现，并由以下结构代表：
柠檬烯通过柠檬烯合酶从牦牛儿基焦磷酸（GPP）制得。依照实施例1中描述的方法生成产生各种量的柠檬烯的一系列酵母菌株，例外之处是菌株被工程化为表达编码柠檬烯合酶而非法呢烯合酶的基因。
依照实施例2和3中分别描述的方法包裹并分选柠檬烯生成菌株。将尼罗红用作检测剂。将通过皮筛选方法检测到的柠檬烯水平与通过如下实施的96孔振动板测定法检出的水平进行比较。对于每种菌株，从琼脂板挑取单一菌落到含有360μl Bird Seed培养基（BSM）、2%蔗糖0.25N+crb（预培养基）的1.1ml96孔板中。用可透气的膜密封物密封预培养板，并将培养物在30℃、80%湿度，伴随1000rpm振动温育72小时。将6μl预培养基转移至包含在1.1ml96孔生产板中的75μl BSM4%半乳糖和75μl异丙基肉豆蔻酸酯中。使用Velocity11plate locTM（Agilent Technologies），用不可渗透的铝箔热密封物密封生产板，并将培养物在30℃、80%湿度，伴随1000rpm振动温育72小时。温育后，将平板在-20℃速冻2小时以降低单萜产物的蒸气压。在此阶段，快速移去板密封物并使用Phoenix液体操作器（Art Robbins Instruments）以15mm分散高度和3mm/s的泵速向冷冻的培养液直接加入300ul含有十六烷内部标准品的乙酸乙酯。将板立即用不可渗透的铝密封物再次密封，并以90rpm的转速在微量滴定板搅动器上于RT振动2小时。在振动2小时后，将板以2000rpm离心2分钟并使用GC-FID（具有火焰离子化检测的气相层析）直接测定。对单萜生成的GC-FID分析进行定量，其通过将2ul乙酸乙酯以1:50的分流比注射到甲基硅酮固定相柱上。烤箱参数在2.5分钟的过程内从25℃升高至250℃，接着是快速降温用于下一次样品注射。在每次运行之前注射柠檬烯和香叶烯标准品以量化样品峰下精确的ppm积分面积。随后将这些值转化成绝对滴度以测定图11中显示的值。
图11A为3种工程化为生成不同水平柠檬烯的菌株（L1、L2和L3）和初始非生成菌株（Y0）中每一种提供：（左图）对应于每种菌株生成的柠檬烯水平的G/R荧光峰；和（右图）通过皮筛选测定的柠檬烯产率（相对于生物质标准化并以任意单位表述）（y轴），其相对于由摇瓶发酵罐产率进行的产率测定（x轴）绘出。在柠檬烯生成值的较宽范围内能看到相关性。图11B提供经包裹的生成细胞（L1）和非生成细胞（Y0）在一起共培养（实心峰）或分开培养（空心峰）时的荧光峰。Y0和L1的分开的荧光峰在共培养条件下保持，这指示产物仍然包裹在含有生成菌株的颗粒中，且并未渗出或渗入到含有非生成菌株的颗粒中。中值差异可归因于管间变化。
这些结果证明皮筛选测定法能用于鉴定及区分生成各种水平的柠檬烯的宿主菌株。
7.6.2广藿香醇生成细胞
广藿香醇，一种结构如下的倍半萜
Figure BDA0000386971150000671
也称为百秋李醇（patchouli alcohol），是Pogostemon patchouli的精油的组分。广藿香醇由广藿香醇合酶从FPP制得。依照实施例1中描述的方法生成产生各种量的广藿香醇的一系列酵母菌株，例外之处是菌株被工程化为表达广藿香醇合酶而非法呢烯合酶。依照实施例2和3中分别描述的方法包裹并分选广藿香醇生成菌株。将尼罗红用作检测剂。将通过皮筛选方法检测到的广藿香醇水平与如下通过96孔振动板产率检出的水平进行比较。对于每种菌株，在每孔含有360μl Bird Seed培养基（BSM）及2%蔗糖（预培养）的96孔板的分开孔中温育单菌落。在30℃以999rpm搅动温育2天后，将每孔6.4uL接种到含有150uL新鲜BSM及4%半乳糖和3.33%矿物油以及Brij-56乳剂的新96孔板中（生产培养）。在30℃以999rpm搅动再温育4天后，取出样品并通过气相层析（GC）分析来分析广藿香醇生成。对于GC分析，用甲醇-丁氧基乙醇-庚烷（100uL:50uL:400uL v/v）萃取样品，并允许细胞材料通过重力沉降。将庚烷萃取物的等分试样进一步稀释到庚烷中，然后使用脉冲分流注射注射到甲基硅酮固定相上。
图12提供检测从经包裹的酵母细胞重组生成的广藿香醇的皮筛选结果。包裹非生成菌株（Y0）和两种不同的广藿香醇生成菌株（P1和P2），并进行皮筛选。图12A提供对应于每菌株生成的广藿香醇水平的G/R荧光峰。图12B提供通过皮筛选测定的柠檬烯产率（相对于生物质标准化并以任意单位表述）（y轴），其相对于由96孔振动板产率进行的产率测定（x轴）绘出。这些结果显示FACS值与通过GC测量的标准振动板滴度成比例。
这些结果证明皮筛选测定法能用于鉴定和区分生成不同水平的广藿香醇的宿主菌株。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过提述并入本文，如同每一项出版物或专利申请特定地并分别地指示为通过提述并入的。尽管已通过例示和实施例在一定程度上详细描述了前述发明以澄清理解，但对于本领域普通技术人员而言将容易明显的是根据本发明的教导，可以对其进行某些变化和修改而不偏离所附权利要求的精神或范围。

Claims (123)

1.一种检测细胞中重组生成的水不混溶性化合物的方法，所述方法包括：
(a)在水凝胶颗粒中包裹细胞；并
(b)检测水凝胶颗粒内重组生成的水不混溶性化合物。
2.权利要求1的方法，其中所述检测包括使水凝胶颗粒与直接结合重组生成的水不混溶性化合物的荧光染料接触，并检测水凝胶颗粒内的荧光染料。
3.权利要求2的方法，其中所述荧光染料是溶剂化显色染料。
4.权利要求2的方法，其中所述荧光染料是尼罗红。
5.权利要求1的方法，其中所述检测包括将水凝胶颗粒内水不混溶性化合物的量相对于水凝胶颗粒内细胞生物质的量标准化。
6.权利要求1的方法，其中所述细胞选自下组：酵母细胞、细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、昆虫细胞和植物细胞。
7.权利要求5的方法，其中所述细胞是酵母细胞。
8.权利要求1的方法，其中所述重组生成的水不混溶性化合物选自下组：类异戊二烯（isoprenoid）、聚酮化合物和脂肪酸。
9.权利要求1的方法，其中所述水凝胶颗粒能够保留水不混溶性化合物。
10.权利要求1的方法，其中所述水凝胶包含琼脂糖。
11.权利要求1的方法，其中所述水凝胶颗粒的直径小于约1毫米。
12.权利要求1的方法，其中所述水凝胶颗粒的直径小于约100微米。
13.权利要求1的方法，其中所述水凝胶颗粒的直径小于约50微米。
14.权利要求1的方法，其中所述水凝胶颗粒的直径为约50、45、40、35、30或25微米。
15.权利要求1的方法，其中所述包裹包括使细胞与水性水凝胶悬液在足以形成包含细胞的水凝胶颗粒的条件下接触。
16.权利要求15的方法，其中所述条件包括使包含细胞的水性水凝胶悬液与包含含氟表面活性剂的氟碳油接触。
17.权利要求16的方法，其中所述与氟碳油接触包括将包含细胞的水性水凝胶悬液加载到包含氟碳油的微流体装置上，其中所述水凝胶悬液在微流体装置的T联结点处与氟碳油接触，其中所述与氟碳油接触导致包含细胞的非水性水凝胶颗粒的形成。
18.权利要求17的方法，其进一步包括将水凝胶颗粒与氟碳油分开的步骤。
19.权利要求1的方法，其进一步包括在所述检测之前培养水凝胶颗粒内的细胞的步骤。
20.权利要求19的方法，其中所述培养达12至24小时的时段。
21.权利要求1的方法，其中所述重组生成的水不混溶性化合物是萜、C5类异戊二烯、C10类异戊二烯或C15类异戊二烯。
22.权利要求21的方法，其中所述重组生成的水不混溶性化合物是法呢烯（farnesene）。
23.权利要求22的方法，其中所述细胞是包含编码甲羟戊酸(MEV)途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列的重组酵母细胞。
24.权利要求23的方法，其中所述重组酵母细胞包含编码法呢烯合酶的核酸。
25.权利要求23的方法，其中所述重组酵母细胞包含编码能将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶的异源核苷酸序列。
26.权利要求23的方法，其中所述重组酵母细胞包含编码能将甲羟戊酸转化成甲羟戊酸5-磷酸的酶的异源核苷酸序列。
27.权利要求23的方法，其中所述一或多段异源核苷酸序列编码甲羟戊酸途径的超过一种酶。
28.权利要求23的方法，其进一步包括编码能将异戊烯焦磷酸(IPP)转化成二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的酶的异源核苷酸序列。
29.权利要求28的方法，其进一步包括编码能修饰IPP或聚异戊二烯（polyprenyl）以形成类异戊二烯化合物的酶的异源核苷酸序列。
30.权利要求29的方法，其中所述酶选自下组：蒈烯（carene）合酶、牦牛儿醇（geraniol）合酶、里那醇（linalool）合酶、柠檬烯（limonene）合酶、香叶烯（myrcene）合酶、罗勒烯（ocimene）合酶、α-蒎烯（pinene）合酶、β-蒎烯合酶、γ-萜品烯（terpinene）合酶、萜品油烯（terpinolene）合酶、紫穗槐双烯（amorphadiene）合酶、α-法呢烯合酶、β-法呢烯合酶、法尼醇（farnesol）合酶、橙花叔醇（nerolidol）合酶、广藿香醇（patchouliol）合酶、诺卡酮（nootkatone）合酶和松香双烯（abietadiene）合酶。
31.权利要求29的方法，其中所述类异戊二烯是C5-C20类异戊二烯。
32.权利要求31的方法，其中所述类异戊二烯选自下组：松香双烯、紫穗槐双烯、蒈烯、α-法呢烯、β-法呢烯、法尼醇、牦牛儿醇、牦牛儿基牦牛儿醇（geranylgeranitol）、异戊二烯（isoprene）、里那醇、柠檬烯、香叶烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β-蒎烯、香桧烯（sabinene）、γ-萜品烯、萜品油烯和瓦伦烯（valencene）。
33.权利要求22的方法，其中所述细胞是包含编码甲羟戊酸(MEV)途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列的重组酵母细胞。
34.权利要求22的方法，其中所述细胞是包含编码聚酮化合物生物合成途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列的重组酵母细胞。
35.权利要求34的方法，其中所述重组酵母细胞包含编码聚酮化合物合酶***(PKS)的一或多种核酸。
36.权利要求35的方法，其中所述PKS是模块化PKS。
37.权利要求35的方法，其中所述PKS是芳香族PKS。
38.权利要求35的方法，其中所述重组酵母细胞包含编码包含酮合酶/酰基转移酶(KS/AT)催化区的酶的核酸。
39.权利要求35的方法，其中所述重组酵母细胞包含编码包含链长度因子(CLF)催化区的酶的核酸。
40.权利要求35的方法，其中所述重组酵母细胞包含编码包含酰基载体蛋白(ACP)活性的酶的核酸。
41.权利要求35的方法，其中所述重组酵母细胞进一步包含编码包含环化酶(CYC)催化区、酮还原酶(KR)催化区、芳香酶(ARO)催化区、烯酰还原酶(ER)催化区、硫酯酶(TE)催化区或全ACP合酶活性的酶的核酸。
42.权利要求22的方法，其中所述细胞是包含编码脂肪酸生物合成途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列的重组酵母细胞。
43.权利要求42的方法，其中所述重组酵母细胞包含编码乙酰-CoA合酶的核酸。
44.权利要求42的方法，其中所述重组酵母细胞包含编码能将乙酰-CoA转化成丙二酰-CoA的酶的异源核苷酸序列。
45.权利要求42的方法，其中所述重组酵母细胞包含编码丙二酰-CoA合酶的核酸。
46.权利要求42的方法，其中所述重组酵母细胞包含异源pdh、panK、aceEF、fabH、fabD、fabG、acpP或fabF核苷酸序列。
47.一种检测细胞中重组生成的水不混溶性化合物的方法，所述方法包括：
(a)使细胞与水性水凝胶悬液接触；
(b)将包含细胞的水性水凝胶悬液加载到包含氟碳油的微流体装置上，其中所述水凝胶悬液在微流体装置的T联结点处与氟碳油接触，其中所述与氟碳油接触导致包含细胞的非水性水凝胶颗粒的形成；
(c)将水凝胶颗粒与氟碳油分开；
(d)培养水凝胶颗粒内的细胞；
(e)使水凝胶颗粒与直接结合重组生成的水不混溶性化合物的荧光染料接触；并
(f)检测水凝胶颗粒内的荧光染料。
48.一种对细胞库筛选重组生成水不混溶性化合物的细胞的方法，所述方法包括：
(a)在水凝胶颗粒中包裹库的每个细胞；
(b)检测每个水凝胶颗粒内重组生成的水不混溶性化合物；并
(c)选择生成重组生成的水不混溶性化合物的细胞。
49.一种对细胞群体富集重组生成水不混溶性化合物的细胞的方法，所述方法包括：
(a)提供水凝胶颗粒的群体，其中所述群体包含包裹有经遗传修饰以生成水不混溶性化合物的细胞或细胞的克隆性群体的水凝胶颗粒；
(b)检测出包含重组生成的水不混溶性化合物的水凝胶颗粒；
(c)从步骤(b)的水凝胶颗粒回收细胞或细胞的克隆性群体；
(d)重新包裹来自步骤(c)的细胞或细胞的克隆性群体；并
(e)重复步骤(a)–(c)。
50.一种在水凝胶颗粒中包裹细胞的方法，所述方法包括：
(a)使细胞与水性水凝胶悬液接触；并
(b)将包含细胞的水性水凝胶悬液加载到包含氟碳油的微流体装置上，其中所述水凝胶悬液在微流体装置的T联结点处与氟碳油接触，其中所述与氟碳油接触导致包含细胞的非水性水凝胶颗粒的形成。
51.一种水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其包含重组生成的水不混溶性化合物。
52.权利要求51的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其与荧光溶剂化显色染料接触。
53.权利要求51的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其与尼罗红接触。
54.权利要求51的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述细胞选自下组：酵母细胞、细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、昆虫细胞和植物细胞。
55.权利要求51的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述细胞是酵母细胞。
56.权利要求51的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述重组生成的水不混溶性化合物选自下组：类异戊二烯、聚酮化合物和脂肪酸。
57.权利要求56的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述重组生成的水不混溶性化合物是萜、C5类异戊二烯、C10类异戊二烯或C15类异戊二烯。
58.权利要求56的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述重组生成的水不混溶性化合物是法呢烯。
59.权利要求55的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述细胞是包含编码甲羟戊酸(MEV)途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列的重组酵母细胞。
60.权利要求59的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述重组酵母细胞包含编码法呢烯合酶的核酸。
61.权利要求59的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述重组酵母细胞包含编码能将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶的异源核苷酸序列。
62.权利要求59的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述重组酵母细胞包含编码能将甲羟戊酸转化成甲羟戊酸5-磷酸的酶的异源核苷酸序列。
63.权利要求59的用水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述一或多段异源核苷酸序列编码甲羟戊酸途径的超过一种酶。
64.权利要求59的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其进一步包含编码能将异戊烯焦磷酸(IPP)转化成二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的酶的异源核苷酸序列。
65.权利要求59的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其进一步包含编码能修饰IPP或聚异戊二烯以形成类异戊二烯化合物的酶的异源核苷酸序列。
66.权利要求65的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述酶选自下组：蒈烯合酶、牦牛儿醇合酶、里那醇合酶、柠檬烯合酶、香叶烯合酶、罗勒烯合酶、α-蒎烯合酶、β-蒎烯合酶、γ-萜品烯合酶、萜品油烯合酶、紫穗槐双烯合酶、α-法呢烯合酶、β-法呢烯合酶、法尼醇合酶、橙花叔醇合酶、广藿香醇合酶、诺卡酮合酶和松香双烯合酶。
67.权利要求65的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述类异戊二烯是C5-C20类异戊二烯。
68.权利要求67的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述类异戊二烯选自下组：松香双烯、紫穗槐双烯、蒈烯、α-法呢烯、β-法呢烯、法尼醇、牦牛儿醇、牦牛儿基牦牛儿醇、异戊二烯、里那醇、柠檬烯、香叶烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β-蒎烯、香桧烯、γ-萜品烯、萜品油烯和瓦伦烯。
69.权利要求59的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述细胞是包含编码甲羟戊酸(MEV)途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列的重组酵母细胞。
70.权利要求55的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述细胞是包含编码聚酮化合物生物合成途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列的重组酵母细胞。
71.权利要求70的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述重组酵母细胞包含编码聚酮化合物合酶***(PKS)的一或多种核酸。
72.权利要求71的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述PKS是模块化PKS。
73.权利要求71的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述PKS是芳香族PKS。
74.权利要求71的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述重组酵母细胞包含编码包含酮合酶/酰基转移酶(KS/AT)催化区的酶的核酸。
75.权利要求71的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述重组酵母细胞包含编码包含链长度因子(CLF)催化区的酶的核酸。
76.权利要求71的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述重组酵母细胞包含编码包含酰基载体蛋白(ACP)活性的酶的核酸。
77.权利要求71的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述重组酵母细胞进一步包含编码包含环化酶(CYC)催化区、酮还原酶(KR)催化区、芳香酶(ARO)催化区、烯酰还原酶(ER)催化区、硫酯酶(TE)催化区或全ACP合酶活性的酶的核酸。
78.权利要求55的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述细胞是包含编码脂肪酸生物合成途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列的重组酵母细胞。
79.权利要求78的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述重组酵母细胞包含编码乙酰-CoA合酶的核酸。
80.权利要求78的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述重组酵母细胞包含编码能将乙酰-CoA转化成丙二酰-CoA的酶的异源核苷酸序列。
81.权利要求78的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述重组酵母细胞包含编码丙二酰-CoA合酶的核酸。
82.权利要求78的水凝胶包裹的细胞或克隆性细胞群体，其中所述重组酵母细胞包含异源pdh、panK、aceEF、fabH、fabD、fabG、acpP或fabF核苷酸序列。
83.一种水凝胶颗粒，其包含细胞或克隆性细胞群体，且进一步包含重组生成的水不混溶性化合物。
84.权利要求83的水凝胶颗粒，其与荧光溶剂化显色染料接触。
85.权利要求83的水凝胶颗粒，其与尼罗红接触。
86.权利要求83的水凝胶颗粒，其中所述细胞选自下组：酵母细胞、细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、昆虫细胞和植物细胞。
87.权利要求84的水凝胶颗粒，其中所述细胞是酵母细胞。
88.权利要求83的水凝胶颗粒，其中所述重组生成的水不混溶性化合物选自下组：类异戊二烯、聚酮化合物和脂肪酸。
89.权利要求88的水凝胶颗粒，其中所述类异戊二烯是萜、C5类异戊二烯、C10类异戊二烯或C15类异戊二烯。
90.权利要求88的水凝胶颗粒，其中所述类异戊二烯是法呢烯。
91.权利要求83的水凝胶颗粒，其中所述重组酵母细胞包含编码法呢烯合酶的核酸。
92.权利要求83的水凝胶颗粒，其中所述水凝胶颗粒能够保留水不混溶性化合物。
93.权利要求92的水凝胶颗粒，其中所述水不混溶性化合物选自下组：类异戊二烯、聚酮化合物和脂肪酸。
94.权利要求92的水凝胶颗粒，其中所述水不混溶性化合物是法呢烯。
95.权利要求83的水凝胶颗粒，其中所述水凝胶包含琼脂糖。
96.权利要求83的水凝胶颗粒，其中所述水凝胶颗粒的直径小于约1毫米。
97.权利要求83的水凝胶颗粒，其中所述水凝胶颗粒的直径小于约500微米。
98.权利要求83的水凝胶颗粒，其中所述水凝胶颗粒的直径小于约100微米。
99.权利要求83的水凝胶颗粒，其中所述水凝胶颗粒的直径小于约50微米。
100.权利要求87的水凝胶颗粒，其中所述细胞是包含编码甲羟戊酸(MEV)途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列的重组酵母细胞。
101.权利要求100的水凝胶颗粒，其中所述重组酵母细胞包含编码法呢烯合酶的核酸。
102.权利要求100的水凝胶颗粒，其中所述重组酵母细胞包含编码能将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶的异源核苷酸序列。
103.权利要求100的水凝胶颗粒，其中所述重组酵母细胞包含编码能将甲羟戊酸转化成甲羟戊酸5-磷酸的酶的异源核苷酸序列。
104.权利要求100的水凝胶颗粒，其中所述一或多段异源核苷酸序列编码甲羟戊酸途径的超过一种酶。
105.权利要求100的水凝胶颗粒，其进一步包含编码能将异戊烯焦磷酸(IPP)转化成二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的酶的异源核苷酸序列。
106.权利要求100的水凝胶颗粒，其进一步包含编码能修饰IPP或聚异戊二烯以形成类异戊二烯化合物的酶的异源核苷酸序列。
107.权利要求106的水凝胶颗粒，其中所述酶选自下组：蒈烯合酶、牦牛儿醇合酶、里那醇合酶、柠檬烯合酶、香叶烯合酶、罗勒烯合酶、α-蒎烯合酶、β-蒎烯合酶、γ-萜品烯合酶、萜品油烯合酶、紫穗槐双烯合酶、α-法呢烯合酶、β-法呢烯合酶、法尼醇合酶、橙花叔醇合酶、广藿香醇合酶、诺卡酮合酶和松香双烯合酶。
108.权利要求106的水凝胶颗粒，其中所述类异戊二烯是C5-C20类异戊二烯。
109.权利要求108的水凝胶颗粒，其中所述类异戊二烯选自下组：松香双烯、紫穗槐双烯、蒈烯、α-法呢烯、β-法呢烯、法尼醇、牦牛儿醇、牦牛儿基牦牛儿醇、异戊二烯、里那醇、柠檬烯、香叶烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β-蒎烯、香桧烯、γ-萜品烯、萜品油烯和瓦伦烯。
110.权利要求100的水凝胶颗粒，其中所述细胞是包含编码甲羟戊酸(MEV)途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列的重组酵母细胞。
111.权利要求87的水凝胶颗粒，其中所述细胞是包含编码聚酮化合物生物合成途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列的重组酵母细胞。
112.权利要求111的水凝胶颗粒，其中所述重组酵母细胞包含编码聚酮化合物合酶***(PKS)的一或多种核酸。
113.权利要求112的水凝胶颗粒，其中所述PKS是模块化PKS。
114.权利要求112的水凝胶颗粒，其中所述PKS是芳香族PKS。
115.权利要求112的水凝胶颗粒，其中所述重组酵母细胞包含编码包含酮合酶/酰基转移酶(KS/AT)催化区的酶的核酸。
116.权利要求112的水凝胶颗粒，其中所述重组酵母细胞包含编码包含链长度因子(CLF)催化区的酶的核酸。
117.权利要求112的水凝胶颗粒，其中所述重组酵母细胞包含编码包含酰基载体蛋白(ACP)活性的酶的核酸。
118.权利要求112的水凝胶颗粒，其中所述重组酵母细胞进一步包含编码包含环化酶(CYC)催化区、酮还原酶(KR)催化区、芳香酶(ARO)催化区、烯酰还原酶(ER)催化区、硫酯酶(TE)催化区或全ACP合酶活性的酶的核酸。
119.权利要求87的水凝胶颗粒，其中所述细胞是包含编码脂肪酸生物合成途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列的重组酵母细胞。
120.权利要求119的水凝胶颗粒，其中所述重组酵母细胞包含编码乙酰-CoA合酶的核酸。
121.权利要求119的水凝胶颗粒，其中所述重组酵母细胞包含编码能将乙酰-CoA转化成丙二酰-CoA的酶的异源核苷酸序列。
122.权利要求119的水凝胶颗粒，其中所述重组酵母细胞包含编码丙二酰-CoA合酶的核酸。
123.权利要求119的水凝胶颗粒，其中所述重组酵母细胞包含异源pdh、panK、aceEF、fabH、fabD、fabG、acpP或fabF核苷酸序列。
CN2012800150525A 2011-01-28 2012-01-27 凝胶包裹的微集落筛选 Pending CN103459610A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161437214P 2011-01-28 2011-01-28
US61/437,214 2011-01-28
US201161486211P 2011-05-13 2011-05-13
US61/486,211 2011-05-13
PCT/US2012/023024 WO2012103516A1 (en) 2011-01-28 2012-01-27 Gel-encapsulated microcolony screening

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103459610A true CN103459610A (zh) 2013-12-18

Family

ID=45722697

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012800150525A Pending CN103459610A (zh) 2011-01-28 2012-01-27 凝胶包裹的微集落筛选

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20120196770A1 (zh)
EP (1) EP2668284B1 (zh)
JP (1) JP2014508516A (zh)
KR (1) KR20140012072A (zh)
CN (1) CN103459610A (zh)
AU (1) AU2012211052A1 (zh)
BR (1) BR112013017884A2 (zh)
CA (1) CA2824420A1 (zh)
DK (1) DK2668284T3 (zh)
HK (1) HK1186498A1 (zh)
MX (1) MX2013008062A (zh)
SG (1) SG192107A1 (zh)
WO (1) WO2012103516A1 (zh)
ZA (1) ZA201304895B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105907601A (zh) * 2016-05-12 2016-08-31 大连理工大学 一种基于固态双凝胶的微生物三维群落结构分析芯片及应用
CN107980096A (zh) * 2015-05-19 2018-05-01 博瑞创新公司 低密度不混溶化合物在用于检测样本中分析物的装置中的用途
CN108883031A (zh) * 2016-03-24 2018-11-23 生物辐射实验室股份有限公司 使用凝胶珠来控制液滴分散
CN111650898A (zh) * 2020-05-13 2020-09-11 大唐七台河发电有限责任公司 具备高容错性能的集散控制***及方法
US11154863B2 (en) 2018-10-08 2021-10-26 Bioelectronica Corporation Systems and methods for optically processing samples

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150177115A1 (en) 2012-04-06 2015-06-25 Slingshot Biosciences Hydrogel particles with tunable optical properties
KR101663556B1 (ko) * 2014-06-13 2016-10-07 한국생명공학연구원 세포를 함유하는 오일 내 하이드로겔 에멀젼, 세포외 구획화 방법 및 신규효소 초고속 스크리닝법
US10538732B2 (en) 2014-10-31 2020-01-21 National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology Cell isolation method and cell trapping filter
DE102015106870B3 (de) * 2014-11-10 2016-02-25 Leibniz-Institut für Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie e. V. Hans-Knöll-Institut System zur Inkubation von mikrofluidischen Tropfen und Verfahren zur Bereitstellung von homogenen Inkubationsbedingungen in einer Tropfeninkubationseinheit
KR102436976B1 (ko) 2015-02-09 2022-08-25 슬링샷 바이오사이언시즈 인코포레이티드 튜닝가능한 광 특성을 갖는 하이드로겔 입자 및 이를 사용하기 위한 방법
US11046828B2 (en) * 2015-04-21 2021-06-29 Trustees Of Tufts College Fabrication of macroporous monodisperse hydrogel microspheres
WO2018017845A1 (en) * 2016-07-21 2018-01-25 Massachusetts Intitute Of Technology Materials and devices containing hydrogel-encapsulated cells
EP3421131A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-02 Blink AG A sample cartridge for incubating and/or analyzing a dispersion of particles, cells or droplets
KR102187682B1 (ko) * 2018-06-08 2020-12-07 한국과학기술원 타입 iii 폴리케타이드 합성 효소 기반 신규 말로닐-코에이 바이오센서 및 그 용도
US11313782B2 (en) 2020-01-24 2022-04-26 Slingshot Biosciences, Inc. Compositions and methods for cell-like calibration particles
KR20230029612A (ko) 2020-05-04 2023-03-03 슬링샷 바이오사이언시즈 인코포레이티드 다중 검정을 위한 수동 광학 바코딩용 조성물 및 방법
BR112023020542A2 (pt) * 2021-04-05 2023-12-05 Ab Mauri Cepa de levedura saccharomyces, derivada de uma cepa de levedura saccharomyces, métodos de produção da derivada de uma cepa de levedura saccharomyces, da levedura mutante, da levedura evoluída e de um produto de fermentação a partir de um substrato, leveduras mutante, evoluída, geneticamente modificada e recombinante de uma cepa de levedura, processos para a produção de etanóis a partir de um substrato e de uma biomassa, e, composição
CN112941007B (zh) * 2021-04-19 2022-06-17 广西大学 一种香蕉枯萎病菌的单孢分离方法
KR20230106910A (ko) * 2022-01-07 2023-07-14 인하대학교 산학협력단 비색형 바이오센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 항생제 감수성 검사방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998041869A1 (en) * 1997-03-18 1998-09-24 Chromaxome Corporation Methods for screening compounds using encapsulated cells
CN101080497A (zh) * 2003-12-16 2007-11-28 金伯利-克拉克环球有限公司 微生物检测与定量
CN101762572A (zh) * 2010-01-28 2010-06-30 北京交通大学 用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶及其制备方法

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4703009A (en) 1983-03-08 1987-10-27 Merck & Co., Inc. RDNA cloning vector pVE1, deletion and hybrid mutants and recombinant derivatives thereof products and processes
DE3477936D1 (en) 1983-03-08 1989-06-01 Merck & Co Inc Recombinant dna cloning vector pve1, deletion and hybrid mutants, and recombinant derivatives thereof, products and processes
US5272065A (en) 1983-10-20 1993-12-21 Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
SE8405105L (sv) * 1984-05-24 1985-11-25 Damon Biotech Inc Sett for screening av celler
US4801529A (en) * 1985-06-18 1989-01-31 Brandeis University Methods for isolating mutant microoganisms using microcapsules coated with indicator material
US5672497A (en) 1986-03-21 1997-09-30 Eli Lilly And Company Method for increasing the antibiotic-producing ability of antibiotic-producing microorganisms
IL81892A (en) 1986-03-21 1995-10-31 Lilly Co Eli Recombinant AND molecule containing a sequence encoding O-methyltransfer macrocin
US5098837A (en) 1988-06-07 1992-03-24 Eli Lilly And Company Macrolide biosynthetic genes for use in streptomyces and other organisms
US5149638A (en) 1988-09-29 1992-09-22 Eli Lilly And Company Tylosin biosynthetic genes tylA, tylB and tylI
US5252474A (en) 1989-03-31 1993-10-12 Merck & Co., Inc. Cloning genes from Streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use
US5523162A (en) 1990-04-03 1996-06-04 Ppg Industries, Inc. Water repellent surface treatment for plastic and coated plastic substrates
WO1993013663A1 (en) 1992-01-17 1993-07-22 Abbott Laboratories Method of directing biosynthesis of specific polyketides
US6060234A (en) 1991-01-17 2000-05-09 Abbott Laboratories Polyketide derivatives and recombinant methods for making same
US5824513A (en) 1991-01-17 1998-10-20 Abbott Laboratories Recombinant DNA method for producing erythromycin analogs
US5658767A (en) * 1991-01-24 1997-08-19 Martek Corporation Arachidonic acid and methods for the production and use thereof
EP0726940A4 (en) 1993-11-02 2001-05-23 Merck & Co Inc DNA ENCODING A TRIOL-POLYCETIDE-SYNTHASE
US5716849A (en) 1994-06-08 1998-02-10 Novartis Finance Corporation Genes for the biosynthesis of soraphen
DE4426396A1 (de) * 1994-07-26 1996-02-01 Ulrich Prof Dr Zimmermann Verfahren zur Herstellung konzentrierter Lösungen von mikroverkapselten Zellen oder von suspendierten Wirkstoffen in mikroverkapselter Form
CA2197524A1 (en) 1996-02-22 1997-08-22 Bradley Stuart Dehoff Polyketide synthase genes
CA2197160C (en) 1996-02-22 2007-05-01 Stanley Gene Burgett Platenolide synthase gene
AU4119597A (en) 1996-08-20 1998-03-06 Novartis Ag Rifamycin biosynthesis gene cluster
EP1032679A2 (fr) 1997-07-25 2000-09-06 Hoechst Marion Roussel Genes de biosynthese et de transfert des 6-desoxyhexoses chez saccharopolyspora erythraea et chez streptomyces antibioticus et leur utilisation
US6090601A (en) 1998-01-23 2000-07-18 Kosan Bioscience Sorangium polyketide synthase
US6143526A (en) 1998-03-09 2000-11-07 Baltz; Richard H. Biosynthetic genes for spinosyn insecticide production
EP1082439A2 (en) 1998-05-28 2001-03-14 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant narbonolide polyketide synthase
NZ508326A (en) 1998-06-18 2003-10-31 Novartis Ag A polyketide synthase and non ribosomal peptide synthase genes, isolated from a myxobacterium, necessary for synthesis of epothiones A and B
US6265202B1 (en) 1998-06-26 2001-07-24 Regents Of The University Of Minnesota DNA encoding methymycin and pikromycin
US6485703B1 (en) * 1998-07-31 2002-11-26 The Texas A&M University System Compositions and methods for analyte detection
NZ510819A (en) 1998-10-02 2004-03-26 Kosan Biosciences Inc Polyketide synthase enzymes and recombinant DNA constructs therefor
AU758421B2 (en) 1998-10-29 2003-03-20 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant oleandolide polyketide synthase
JP4662635B2 (ja) 1998-11-20 2011-03-30 コーサン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド エポチロンおよびエポチロン誘導体を生成するための組換え方法および材料
JP4257958B2 (ja) * 1999-01-07 2009-04-30 味の素株式会社 微生物の単離方法
US7172886B2 (en) 2001-12-06 2007-02-06 The Regents Of The University Of California Biosynthesis of isopentenyl pyrophosphate
US7192751B2 (en) 2001-12-06 2007-03-20 The Regents Of The University Of California Biosynthesis of amorpha-4,11-diene
WO2005072334A2 (en) * 2004-01-23 2005-08-11 Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Photoresponsive hydrogels
EP2371967B1 (en) * 2005-03-18 2015-06-03 DSM IP Assets B.V. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
US8435787B2 (en) * 2005-05-10 2013-05-07 Rutgers, The State University Of New Jersey Alginate polyelectrolyte encapsulation of embryonic stem cells
US7399323B2 (en) * 2006-10-10 2008-07-15 Amyris Biotechnologies, Inc. Fuel compositions comprising farnesane and farnesane derivatives and method of making and using same
US20080102276A1 (en) * 2006-10-27 2008-05-01 Ali Khademhosseini Controlled Release of a Curing Agent for the Generation of Microstructures
WO2009015390A2 (en) * 2007-07-26 2009-01-29 University Of Chicago Co-incuating confined microbial communities
CA3044405C (en) * 2007-09-20 2021-10-19 Amyris, Inc. Production of isoprenoids
AU2009245975A1 (en) * 2008-05-16 2009-11-19 The Governors Of The University Of Alberta High throughput methods of identifying neutral lipid synthases
EP2438157A1 (en) 2009-06-01 2012-04-11 Amyris, Inc. Genetically modified microbes producing isoprenoids
MX2011012765A (es) 2009-06-01 2012-02-01 Amyris Inc Metodo para generar un microbio geneticamente modificado.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998041869A1 (en) * 1997-03-18 1998-09-24 Chromaxome Corporation Methods for screening compounds using encapsulated cells
CN101080497A (zh) * 2003-12-16 2007-11-28 金伯利-克拉克环球有限公司 微生物检测与定量
CN101762572A (zh) * 2010-01-28 2010-06-30 北京交通大学 用于pH值传感的比率荧光纳米水凝胶及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHANG- HYOUNG CHOI等: "Encapsulation of cell into monodispersed hydrogels on microfluidic device", 《PROC. OF SPIE》 *
RHUTESH K. SHAH等: "Designer emulsions using microfluidics", 《MATERIALS TODAY》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107980096A (zh) * 2015-05-19 2018-05-01 博瑞创新公司 低密度不混溶化合物在用于检测样本中分析物的装置中的用途
CN108883031A (zh) * 2016-03-24 2018-11-23 生物辐射实验室股份有限公司 使用凝胶珠来控制液滴分散
CN105907601A (zh) * 2016-05-12 2016-08-31 大连理工大学 一种基于固态双凝胶的微生物三维群落结构分析芯片及应用
US11154863B2 (en) 2018-10-08 2021-10-26 Bioelectronica Corporation Systems and methods for optically processing samples
CN111650898A (zh) * 2020-05-13 2020-09-11 大唐七台河发电有限责任公司 具备高容错性能的集散控制***及方法
CN111650898B (zh) * 2020-05-13 2023-10-20 大唐七台河发电有限责任公司 具备高容错性能的集散控制***及方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2014508516A (ja) 2014-04-10
AU2012211052A1 (en) 2013-09-05
WO2012103516A1 (en) 2012-08-02
KR20140012072A (ko) 2014-01-29
DK2668284T3 (en) 2014-12-15
MX2013008062A (es) 2013-08-09
CA2824420A1 (en) 2012-08-02
EP2668284B1 (en) 2014-10-15
EP2668284A1 (en) 2013-12-04
HK1186498A1 (zh) 2014-03-14
US20120196770A1 (en) 2012-08-02
BR112013017884A2 (pt) 2019-09-24
SG192107A1 (en) 2013-08-30
ZA201304895B (en) 2014-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103459610A (zh) 凝胶包裹的微集落筛选
US11230716B2 (en) Methods for stabilizing production of acetyl-coenzyme A derived compounds
US20210155939A1 (en) Methods for stabilizing production of acetyl-coenzyme a derived compounds
JP5989098B2 (ja) アセチル−補酵素ａ誘導化合物の産生
CN103518136A (zh) 用于检测水不混溶性化合物的微生物生成的方法和组合物
JP2021529512A (ja) 微生物バイオマスから不水溶性イソプレノイド化合物を回収するための方法
AU2012256195A1 (en) Methods and compositions for detecting microbial production of water-immiscible compounds

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C05 Deemed withdrawal (patent law before 1993)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20131218