CN108865895A - 蝙蝠蛾拟青霉zjb18001及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产虫草素的蝙蝠蛾拟青霉菌株及其应用，所述的蝙蝠蛾拟青霉菌株(Paecilomyces hepial)ZJB2018001是从野生型冬虫夏草中分离所得，通过对野生型的冬虫夏草进行分离、纯化、鉴定得到蝙蝠蛾拟青霉菌株。并通过对这株菌进行物理化学诱变使得虫草素含量提高约3倍。

Description

蝙蝠蛾拟青霉ZJB18001及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一株来自冬虫夏草共生菌蝙蝠蛾拟青霉虫草素高产菌株的筛选及其应用。
(二)背景技术
冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)为麦角菌科真菌冬虫夏草菌寄生在鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialus armoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是我国民间惯用的一种名贵滋补药材，其营养成分高于人参，可入药，也可食用，是上乘的佳肴，具有很高的营养价值，具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂等广泛的药理作用。在临床上对肺虚久咳，气喘，肺结核咯血，盗汗，肾虚腰膝酸痛，阳痿遗精，神经衰弱及化疗、放疗后的红细胞下降都有疗效。
冬虫夏草菌是一种子囊菌，其在蝙蝠蛾幼虫体内形成菌核到长出冬虫夏草子座和子囊，这过程属于冬虫夏草有性型阶段，此时的冬虫夏草称有性型。从冬虫夏草的子囊孢子发芽成菌丝(或产生分生孢子——发芽成菌丝)侵染蝙蝠蛾幼虫，到冬虫夏草菌丝在幼虫体内增殖、消化吸收幼虫体全部营养的过程属冬虫夏草菌种无性增殖阶段。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepial)已被证明是冬虫夏草的共生菌的一种，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。
虫草素，又称虫草菌素，即3′-脱氧腺苷，它的分子式是C10H10N5O3,为含氮配糖体的核酸衍生物，属嘌呤类生物碱。它作为冬虫夏草的一种活性成分常用于***等疾病。早在1950，Cuningham等从蛹虫草(Cordyceps militaris)的原浆液中分离到一种腺苷类活性物质，命名为cordycepin，它是由腺苷和有碳支键的脱氧戊糖组成的一种核苷酸，被称为3’-脱氧腺苷(3’-deoxyadenosine，3’-dA)，后来经过进一步的鉴定，该物质被证实是我国传统中药冬虫夏草(C.sinensis)的有效成分，其中文名称为虫草素，又称蛹虫草菌素、虫草菌素。虫草素作为第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素，具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤和增强人体免疫功能等显著作用，越来越受到人们的重视。
(三)发明内容
本发明目的是分离鉴定蝙蝠蛾拟青霉，并提高蝙蝠蛾拟青霉中虫草素的含量。通过对野生的冬虫夏草进行筛选分离，利用形态学、分子生物学以及Biolog代谢指纹图谱相结合的方法对得到的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepial)原始菌株进行鉴定。然后对获得的原始菌株进行物理化学诱变，得到虫草素含量稳定提高的菌株ZJB18001，使其在人工发酵中能够得到更加广泛的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种源自冬虫夏草的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)ZJB18001，所述蝙蝠蛾拟青霉ZJB18001保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2018年2月6号，保藏编号CCTCC NO:M 2018091，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明还提供一种所述蝙蝠蛾拟青霉ZJB18001在提高虫草素产量中的应用，所述应用是将蝙蝠蛾拟青霉ZJB18001接种至发酵培养基，在18-25℃、150rpm条件下发酵培养，将发酵液离心，获得含虫草素的菌体，将菌体干燥，提取虫草素；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖18-25g/L，蛋白胨4-8g/L，KH2PO41-3g/L，MgSO4 0.4-0.8g/L，溶剂为自来水，pH5.5-6.5。
进一步，所述发酵培养在发酵罐中进行，发酵条件为18-25℃，发酵罐压力0.05MPa，搅拌转速100-300rpm(优选150rpm)，通气比0.08-1.5vvm(优选0.5vvm)。
进一步，所述蝙蝠蛾拟青霉ZJB18001在发酵培养前先进行活化培养和种子培养，再将种子液以体积浓度2-10％(优选5％)的接种量接种至发酵培养基，所述活化培养为：将蝙蝠蛾拟青霉ZJB18001接种至PDA平板，25℃培养5天，获得活化菌体；所述种子培养为：挑取活化菌体接种于种子培养基，25℃，150rpm培养3天，获得种子液；种子培养基终浓度组成：蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，溶剂为自来水，pH自然。
进一步，所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，溶剂为自来水，pH 5.5-6.5。
从青海玉树采集的野生冬虫夏草，清洗干净并且用1％的升汞严格消毒后进行内菌核的无菌切割操作，并将内菌核置于一种斜面培养基上进行萌发，萌发物用于后续的纯培养。首先用形态学的方法对纯培养后的单菌落形态进行初步鉴定，然后利用分子生物学的方法对分离物进行分子鉴定，其18S rDNA序列如SEQ ID No.1所示，最后进一步采取Biolog代谢指纹图谱的方法鉴定其为冬虫夏草菌的共生菌蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepial)。后续利用物理化学等多种诱变方式对其孢子悬液进行诱变，得到虫草素产量提高约3倍的菌株ZJB18001。
由于冬虫夏草采集地的差异性，导致分离到的物种也具有一定的差异性，只要其与该18S rDNA序列具有95％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述改变可包括核苷酸序列中核苷酸的缺失、***或替换。
本发明的有益效果主要体现在：本发明对一种蝙蝠蛾拟青霉新型菌株的分离鉴定进行了详细研究，提供了此株蝙蝠蛾拟青霉的形态学观察结果、18S rDNA序列以及Biolog代谢指纹图谱。并且本发明利用物理、化学等诱变方式使蝙蝠蛾拟青霉菌株突变为代谢产物虫草素的产量提高了约3倍的新菌株ZJB18001，未经诱变的野生型蝙蝠蛾拟青霉虫草素产量为0.187-0.27mg/g，虫草素产量为0.562-0.811mg/g，使虫草素的生产成本降低，有利于蝙蝠蛾拟青霉的广泛推广应用。本发明利用的诱变技术对于冬虫夏草菌的诱变有重要的指导意义。
(四)附图说明
图1固体培养基上单菌落形态。
图2电镜观察下的菌丝体形态。
图3 18S rDNA序列PCR扩增argrose电泳图。
图4 18s rDNA***发育树。
图5发酵液中葡萄糖含量变化曲线。
图6发酵液中pH变化曲线。
图7发酵进程中菌体干重(g/L)变化曲线。
图8虫草素标品(A)、原始菌株(B)及突变株ZJB18001(C)的液相谱图。
图9虫草素的标准曲线。
图10虫草素标品(A，B)及样品(C，D)的液质谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
实施例1：野生冬虫夏草共生菌蝙蝠蛾拟青霉的筛选培养及鉴定
1、筛选培养
从青海玉树海拔4000-4300米的山坡上采挖45株子实体粗壮饱满、虫体粗大的冬虫夏草完整菌虫复合体，寄主昆虫为蝙蝠蛾幼虫。放入25℃培养箱中养护。用清洁刷清除子实体表面杂质，用无菌纯化水冲洗，再用0.1％的升汞进行消毒，在超净台中用无菌解剖刀剖开虫体的内菌核部分，挑取上中下三个部位的组织放在已灭菌的且含有庆大霉素(50mg/L)的马铃薯培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养，每天观察记录。分离组织在马铃薯培养基上培养3天后开始萌发，此时转接到马铃薯液体培养基中，25℃，150r/min振荡培养，观察记录。振荡培养3天后，菌丝体长满于马铃薯液体培养基中。
马铃薯(PDA)培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH值自然。首先将马铃薯去皮，切成块加水煮沸半小时，然后用三层纱布过滤，再加葡萄糖和琼脂，溶化后加水补足至1000mL，115℃灭菌30min。
马铃薯液体培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，溶剂为自来水，pH值自然。
2、冬虫夏草分离物的形态学鉴定
吸取少许步骤1菌丝体涂布于马铃薯斜面培养基上，5天后培养基表面长满白色单菌落，如图1所示。在马铃薯培养基的生长情况和单菌落形态进行观察，并且利用扫描电镜对固定载玻片上的微生物进行观察，了解微生物的形态。经鉴定，菌丝体生长缓慢，斜面大约需培养5d，菌丝体致密，不易挑取，呈雪白色***，随着培养时间的延长，菌丝体背面慢慢呈现棕黄色，表面较圆润，菌丝向外蓬松，如图1所示。电镜观察菌丝体形态显示菌丝发育良好，细长，有横隔，直径1.5～2.0μm，可以观察到形成孢子的孢子器，结果如图2所示。经形态学鉴定，初步判断出此分离物形成的菌落为蝙蝠蛾拟青霉。
3、冬虫夏草分离物的分子生物学鉴定
(1)18S rDNA引物设计
根据真菌保守区域设计一对18S rDNA引物p1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3’及p2:5’p2:CCTCCGCTTATTGATATGC-3’。引物由北京擎科公司合成。
(2)基因组提取
利用快速核酸提取仪及微生物基因组提取试剂盒(美国MP公司)提取微生物基因组DNA。
(3)18S rDNA序列扩增
以基因组DNA为模板，利用通用引物p1和p2进行PCR扩增(美国BioRad公司，PTC200扩增仪)，反应条件为：95℃预变性5min，循环参数为95℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸60s，重复35个循环后，72℃继续延伸10min，最终用0.9％的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。
(4)目的基因的连接与转化(试剂盒：pMD18-T Vector，TaKaRa code D101A)
1)连接体系：PMD18-T 1μL，Slution1 4μL，目的基因5μL。
2)连接、转化条件：
连接：16℃，16h；灭活：65℃，15min；将10μL反应体系转至感受态细胞JM109中，冰浴30min；热击：42℃，90s；冰浴：2～3min；加入800μL液体LB培养基，37℃，250rpm，1h；涂布含Amp抗性(100mg/L)LB平板；37℃培养箱培养过夜。
液体LB培养基组成：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
LB平板组成：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
(5)重组菌筛选：
1)平板挑取单菌落，标号；每个单菌落一半用于接种试管培养；另一半用于菌落PCR；
2)试管培养：5mL液体LB培养基/试管，3μL Amp(100mg/L)/5mLLB；37℃，250rpm培养过夜，离心，获得重组菌株；
3)菌落PCR：将单菌落挑至50μL无菌水中，沸水浴30min；
PCR体系为：2X Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix(10mM)1μL，上下游引物p1、p2(50mM)各1μL，煮沸后的菌液1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，加水20μL补足至50μL的总体系。
引物：
p1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3’及
p2:5’–TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。引物由上海生工公司合成。
4)电泳检测。
(6)质粒提取(试剂盒：AxyPrep质粒DNA小量试剂盒)
1)取2mL步骤(5)中2)培养过夜的培养液，12000g离心1min，弃上清；
2)加250μL Buffer S1(4℃冰箱贮存)，悬浮均匀；
3)加250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转4～6次，使菌体充***解，直至形成透亮的溶液，时间不宜超过5min；
4)加350μL Buffer S3，温和并充分地翻转混合6～8次，12000g离心10min；
5)将上清转移至制备管(置于2mL离心管(试剂盒提供))，12000g离心1min，弃滤液；
6)加500μL Bufffer W1，12000g离心1min，弃滤液；
7)加700μL Bufffer W2，12000g离心1min，弃滤液，再用700μL Bufffer W2洗涤一次，弃滤液；
8)将制备管置回离心管，12000g离心1min；
9)将制备管移入新的1.5mL离心管(试剂盒提供)，在制备管膜中央加60～80μL超纯水(65℃预热)，室温静置1min，12000g离心1min；
10)-20℃保存。
7、18S rDNA序列检测
提取质粒后用自动序列仪进行测序，利用软件Blast对18S rDNA测序结果进行同源性分析。以提取到的细胞总DNA为模板，利用设计的引物p1、p2扩增菌株的18S rDNA序列，将PCR产物进行0.9％的琼脂糖凝胶电泳，从图3可以看出经PCR扩增成功获得了一长约为0.55kb的片段，符合预期结果。
引物：
p1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3’及
p2:5’–TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。引物由上海生工公司合成。
8、18S rDNA序列的测定与分析
将经PCR扩增的片段克隆到T载体后，抽提质粒后的含有本实验获得的18S rDNA片段的重组质粒，经测序确认片段实际长度。样品的实际长度为561bp，序列如下(SEQ IDNO.1)：
SEQ ZJB18001:561bp；
Composition 129A；175C；141G；116T；0OTHER
PercentaGe:23.0％A；31.2％C；25.1％G；20.7％T；0.0％OTHER
MolecuLar WeiGht(kDa):ssDNA:172.61dsDNA:345.89
ORIGIN
获得的序列与genBank中保存的数据进行相似性分析发现，本实验所鉴定微生物与Paecilomyces hepiali同源性最高(homology,100％/560bp,based on 18S rDNA)，根据微生物分子遗传学鉴定原则，基于18S rDNA序列的同源性高于95％，鉴定菌基本属于对照菌。18S rDNA序列经过***发育树分析，其亲缘关系与Paecilomyces hepiali最近，如图4所示。因此，本实验鉴定的微生物为Paecilomyces属hepiali种。
实施例2：冬虫夏草分离物的Biolog代谢指纹图谱鉴定
利用Biolog(FF)自动鉴定***测定碳源利用情况。由于试验菌株的形态特征和培养特征类似于真菌，所以本试验使用FF鉴定微平板对试验菌株的碳源利用情况进行测定。
1、菌悬液制备：
(1)取无菌棉签在Biolog菌种鉴定***的接种液(FF-IF)中蘸湿；
(2)将棉签在实施例1菌落表面滚动，粘取孢子，注意不要带出培养基；
(3)在接种液管液面上沿内壁转动棉签，使孢子附着在内壁上，同时将孢子均匀打散；
(4)倾斜接种液管，用棉签将孢子分散于接种液中。如有小的菌团，应使之沉到管底；
(5)调整浊度：
(a)关闭电源，调整指针至“0”刻度；
(b)擦干空白接种液管外壁，置于浊度计中，接通电源，调整指针至100％T；
(c)使用浊度标准品检查浊度仪的准确性，并调整至标准浊度值；
(d)擦干菌悬液管外壁，***浊度计，读取菌悬液浊度值；
(e)通过添加孢子调整浊度值，使其在75％加孢％范围内。
2、FF微平板接种：
(1)将制备好的菌悬液倒入加样槽中，使用八道电动移液器，将其接种于微平板96孔中；
(2)使用FF鉴定微平板，接种量为100μL/孔。
3、FF微平板培养：
接种丝状真菌的FF鉴定微平板在26℃，空气中培养至24h、48h、72h、96h、168h和240h，培养环境不宜过湿。
4、FF微平板读数及结果保存：
(1)打开“MicroLog”应用程序，输入用户名和密码，点击“OK”进入主界面；
(2)先进入“Setup”界面，点击“initialize reader”，进行初始化设置，等到界面上红色的“ComNot Open”键变成绿色的“Ready”时，点击“Read”；
(3)进入“Read”界面后，选择阅读器模式—Reader，如采用人工读数，进入手动模式(Manual)；在“Data File Name”后输入数据保存名称和保存地址；点击“Read NewPlate”选择微平板类型和培养时间，在“Strain type”下拉菜单中选择丝状真菌类型；
(4)将微平板放人读数仪托架上，合上读数仪盖子，准备读数；
(5)按“Read Next”键开始读数。
(6)以PDF格式保存结果。
5、Biolog鉴定的结果分析
利用Biolog自动微生物鉴定***考察菌株对95种不同碳源的代谢情况：将原始菌株接种于真菌PDA培养基，25℃恒温培养5天，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液(FF-IF)混合，制成菌悬液，用浊度计调整至75％T/FF。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在Biolog FF微孔鉴定板的各孔中，每孔100uL。将微孔鉴定板放在14微孔培养箱中，分别在培养24h、48h、72h、96h、168h和240h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。经Biolog读数仪分析代谢指纹，菌株可较强利用26种碳源，对其他69种碳源不能利用或利用能力较弱与标准数据库对比后，发现与冬虫夏草菌无性型的相似性指数大于0.5。Biolog***给出168h鉴定结果，如表1所示。
表1.菌株ZJB18001对Biolog FF板上95种碳源的利用能力
实施例3：蝙蝠蛾拟青霉的摇瓶发酵
1、种子液的制备：将实施例1获得的原始菌株接种于PDA固体培养基上，25℃培养3天后，出现单菌落，挑取单菌落接种于种子培养基，25℃，150rpm培养3天。
种子培养基配方：蛋白胨5g，酵母粉2g，葡萄糖20g，KH2PO4 1g，MgSO40.5g，加水定容至1L，pH自然，115℃灭菌30min。
2、发酵培养
250mL规格的摇瓶装50mL发酵培养基，发酵时按照体积浓度2％的接种量接种种子液，25℃，150rpm发酵培养5天。发酵过程中，其发酵液中葡萄糖含量变化如图5，发酵液中pH变化如图6，菌体干重变化如图7。
发酵培养基配方：蛋白胨5g，葡萄糖20g，KH2PO4 1g，MgSO4 0.5g，加水定容至1L，pH自然。
实施例4：高产虫草素突变株的筛选
1、孢子悬液的制备：取于25℃PDA培养基中培养五天的原始菌株，用接种铲刮下菌体，并放置于加入了体积浓度0.05％的吐温80水溶液的三角反应瓶中，反应瓶中预先加入磁力转子，加入菌丝体后，包扎好于磁力搅拌器上高速搅拌一小时。然后用三层纱布过滤，得到的滤液即为所需的孢子悬液。以上所用的所有器具均已灭菌。
2、利用血球计数板计数：取制备好的孢子悬液于血球计数板上，放在显微镜下进行计数，取左上，左下，右上，右下和中间五个点进行计数，然后得到孢子悬液中的总孢子数，稀释控制孢子数约为106/mL。
3、Co60诱变方法：取步骤2中的孢子悬液，用0GY、200GY、400GY、600GY、800GY、1000GY和1200GY七个不同剂量的Co60对孢子进行诱变。将经Co60诱变的孢子用生理盐水稀释至105后涂板于PDA培养基，25℃培养3天，初步挑取菌落较大的单菌落，按照实施例3进行发酵，收集菌体检测虫草素产量(方法同实施例6)，直至获得高产突变株。突变次数、突变率和致死率如表2所示。
表2Co60诱变方法诱变过程
4、EMS-UV诱变方法：将步骤3筛选的高产突变菌株按照步骤1方法制备孢子悬液5mL置于直径9cm无菌平皿中，在紫外灯下25cm处振荡照射90s，取一量转于无菌试管，并立即浸入冰水中2h后，取样涂布于PDA平板中，25℃避光培养3天，收集诱变后菌体，使用EMS处理，处理方式：每1mL菌体悬液使用含5mg/mL甲基磺酸乙酯(EMS)的50mM、pH7.0的PBS缓冲液搅拌0.5h，8000rpm离心5min，收集菌体使用无菌水清洗3次，重悬后涂布在PDA固体培养基中，25℃避光培养，初步筛选颜色偏黄的菌株，挑取单菌落，按照实施例3进行发酵，收集菌体通过HPLC方法检测虫草素产量(方法同实施例6)，直至获得虫草素产量提升明显的突变株。突变次数、突变率和致死率如表3所示。
表3紫外-亚硝基胍复合诱变过程
步骤3和4为一轮突变，对于每轮诱变获得的高产菌株，重新作为初始菌株按照上述方法进行复合诱变。从500个突变体中经3轮筛选，筛选获得虫草素产量为0.562-0.811mg/g，最终获得产量最高的突变株ZJB18001，即蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepial)ZJB18001，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2018年2月6号，保藏编号CCTCC NO:M 2018091，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明包含但不仅限于上述两种诱变方式。
实施例5：蝙蝠蛾拟青霉CCTCC NO:M 2018091的深层发酵
(1)斜面培养：蝙蝠蛾拟青霉CCTCC NO:M 2018091接种于PDA固体培养基上，25℃培养3天后，出现单菌落，获得活化菌体。
(2)种子培养：挑取活化菌体单菌落接种于种子培养基，25℃，150rpm培养3天，获得种子液。种子培养基配方：蛋白胨5g，酵母粉2g，葡萄糖20g，KH2PO4 1g，MgSO4 0.5g，加自来水定容至1L，pH自然，115℃灭菌30min。
(3)发酵培养：将步骤(2)种子液以体积浓度5％的接种量接种至发酵培养基，于气升式发酵罐中，罐压0.05Mpa，搅拌转速150rpm，发酵罐通气量为0.5V/V·min；培养温度25℃，培养40天至发酵终点，放罐，获得发酵液，将发酵液离心，获得菌丝体。
实施例6：虫草素的快速提取及检测
1、准确称取实施例5获得的蝙蝠蛾拟青霉CCTCC NO:M 2018091菌丝体0.2g，加入到10mL纯甲醇中，65Hz超声提取2次，每次30min，提取后再用纯甲醇定容至10mL，置4℃冰箱备用。吸取1mL提取液，使用0.22um有机相过滤膜过滤后用于高效液相色谱检测。
2、液相条件：流动相为甲醇水，梯度洗脱，0-4min甲醇：水＝15:85，4-8min甲醇：水＝20:80，8-12min甲醇：水＝25:75，12-16min甲醇：水＝20:80，16-20min甲醇：水＝15:85。柱子为C18(4.6mm*250mm)检测波长为260nm。上述方法对虫草素进行检测，获得虫草素标品(A)、原始菌株(B)及ZJB18001(C)的液相图谱如图8所示。
3、虫草素的标准曲线的绘制：取虫草素标准品0.1g，溶于10mL甲醇，得到浓度为1g/L的标准溶液，然后取出200uL的标准溶液，用甲醇稀释5倍，在从稀释的溶液中取200uL，用纯甲醇稀释5倍，重复四次得标曲浓度为1g/L，0.2g/L，0.04g/L，0.008g/L，0.0016g/L。用液相检测的标准曲线为：y＝42967x+37.423(x为虫草素浓度mg/L，y为峰面积)，R2＝0.9972，如图9所示。
4、虫草素的液质检测：利用液相--质谱连用对样品中的虫草素进行检测，液相--质谱条件为：流动相为甲醇水，流速为0.4ml/min，梯度洗脱，0-8min甲醇：水＝15:85，8-16min甲醇：水＝20:80，16-24min甲醇：水＝25:75，24-32min甲醇：水＝20:80。柱子为C18(4.6mm*250mm)检测波长为260nm。所获得的液相色谱质谱图如图10所示。未经诱变的野生型蝙蝠蛾拟青霉虫草素产量为0.187mg/g，虫草素产量为0.562mg/g。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 蝙蝠蛾拟青霉ZJB18001及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 561
<212> DNA
<213> 蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepial)
<400> 1
tgcggaggga tcattaccga gttttcaact cccaaaccct tttgtgaaca tacctatcgt 60
tgcttcggcg gactcgcccc agcgtccggc cggccccgcg ccggccgcgg cctggatcca 120
ggcggccgcc ggagaccccc aaactctgta ttctcagtat cttctgaatc cgccgcaagg 180
caaaacaaat gaatcaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa 240
cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga 300
acgcacattg cgcccgccag cattctggcg ggcatgcctg ttcgagcgtc atttcaaccc 360
tcgacttccc tttggggaaa tcggcgttgg ggaccggccg tataccgccg gccccgaaat 420
gaagtggcgg cccgtccgcg gcgacctctg cgtagtaatc caactcgcac cggaaccccg 480
acgtggccac gccgtaaaac ccccgacttc tgaacgttga cctcggatca ggtaggaata 540
cccgctgaac ttaagcatat c 561

Claims (6)

1.一种源自冬虫夏草的蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)ZJB18001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2018年2月6号，保藏编号CCTCC NO:M 2018091，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述蝙蝠蛾拟青霉ZJB18001在提高虫草素产量中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用是将蝙蝠蛾拟青霉ZJB18001接种至发酵培养基，在18-25℃、150rpm条件下发酵培养，将发酵液离心，获得含虫草素的菌体，将菌体干燥，提取虫草素；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖18-25g/L，蛋白胨4-8g/L，KH2PO41-3g/L，MgSO4 0.4-0.8g/L，溶剂为自来水，pH 5.5-6.5。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养在发酵罐中进行，发酵条件为18-25℃，发酵罐压力0.05MPa，搅拌转速100-300rpm，通气比0.08-1.5vvm。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述蝙蝠蛾拟青霉ZJB18001在发酵培养前先进行活化培养和种子培养，再将种子液以体积浓度2-10％的接种量接种至发酵培养基，所述活化培养为：将蝙蝠蛾拟青霉ZJB18001接种至PDA平板，25℃培养5天，获得活化菌体；所述种子培养为：挑取活化菌体接种于种子培养基，25℃，150rpm培养3天，获得种子液；种子培养基终浓度组成：蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，溶剂为自来水，pH自然。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，溶剂为自来水，pH 5.5-6.5。
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