CN113046249A - 一株蜡蚧轮枝菌ll-01及其生防应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株蜡蚧轮枝菌LL‑01及其生防应用，属于微生物技术领域。该菌株保藏编号为：CGMCC No.21940；生长和产孢最适的温度为26℃、光周期为6L：18D、碳源为果糖、氮源为干酪素，在此培养条件下生长速度快、产孢量高，对不同虫龄南洋臀纹粉蚧和石蒜绵粉蚧的累计致死率分别可达84.09％～97.62％和89.89％～98.85％，生防潜力良好，可替代部分防控粉蚧的化学农药，减少化学农药的用量，有利于维护生态平衡。

Description

一株蜡蚧轮枝菌LL-01及其生防应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一株蜡蚧轮枝菌LL-01及其生防应用。
背景技术
南洋臀纹粉蚧Planococcus lilacinus和石蒜绵粉蚧Phenacoccus solani是2种世界性花果害虫，南洋臀纹粉蚧可危害可可、番荔枝、番石榴、羊蹄甲、变叶木和杜鹃等35个科100余种水果、林木和观赏植物，在2007年被我国列入进境植物检疫性有害生物；石蒜绵粉蚧可为害石蒜科、景天科、菊科、豆科和茄科等40科101属131种以观赏植物和经济作物，在2014年被国家质量监督检验检疫总局列为进口多肉植物重点关注的有害生物。虽然这2种检疫性粉蚧目前在国内尚未有广泛分布的报道，但本研究前期调查发现它们分别已在福建省内的番荔枝果园和多肉植物种植基地发生为害严重，世代重叠明显，若虫和成虫常群集刺吸为害果实、叶片、幼芽和嫩茎等部分，引起落花、落叶、落果和长势衰弱，同时还分泌蜜露诱发煤烟病，直接或间接影响番荔枝果实和多肉植物的品质和经济价值。由于这两种粉蚧体表覆盖大量蜡质，不易防治，目前生产上采用的防控措施还偏重于使用化学农药.
但长期使用化学农药，易造成“3R”、环境污染和生物多样性下降等负面问题，与我国绿色植保的引领导向冲突不断，需要寻找更加环保的措施协同控害。
昆虫病原真菌是自然界中昆虫种群数量得以控制的主要因素之一，其感染致死比例占昆虫自然罹病死亡总数约60％，挖掘利用昆虫病原真菌进行已是害虫绿色防控的重要措施。
目前，全世界已记载的昆虫病原真菌约1000多种，但仅金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae中的F061和FM-03等被挖掘用于防控南洋臀纹粉蚧和石蒜绵粉蚧，可供选择的菌株资源仍相对较少.
因此寻找一些高效的昆虫病原真菌菌株以减轻这它们的危害是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株蜡蚧轮枝菌LL-01及其生防应用。
本发明通过先分离纯化昆虫病原真菌，再通过形态观察和分子鉴定措施确定其分类地位，后测定其对南洋臀纹粉蚧和石蒜绵粉蚧的胞外酶活性和致病力，以丰富这2种检疫性粉蚧的生防菌资源，为利用昆虫病原真菌防控检疫性粉蚧提供支撑。
保藏信息：蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium lecanii)LL-01，于2021年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21940。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium lecanii)LL-01，保藏编号为CGMCC No.21940。
本发明还提供了含有上述蜡蚧轮枝菌LL-01的药剂。
优选的：药剂为杀虫剂，靶标害虫为南洋臀纹粉蚧和石蒜绵粉蚧
本发明还提供了一株蜡蚧轮枝菌LL-01在植物生防中的应用
优选的：植物为番荔枝和多肉植物“红心莲”。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株蜡蚧轮枝菌LL-01及其生防应用，相较于现有技术，本发明从南洋臀纹粉蚧病体上分离到1株昆虫病原真菌LL-01，经形态观察和分子鉴定确定为蜡蚧轮枝菌；其生长和产孢最适的温度为26℃、光周期为6L:18D、碳源为果糖、氮源为干酪素，此条件下培养10d菌落直径和产孢量分别可达4.66cm和3.16×108孢子/cm2；其侵染不同虫龄南洋臀纹粉蚧和石蒜绵粉蚧10d后的LC50分别为0.98×105～9.71×105孢子/mL和0.50×105～5.30×105孢子/mL，1.00×108孢子/mL处理的累计致死率分别为84.09％～97.62％和89.89％～98.85％、LT50分别为3.70～5.84d和3.48～5.14d；其蛋白酶和几丁质酶活性在第5d分别达峰值19.44U/mL和15.01U/mL，脂肪酶活性在第6d达峰值7.68U/m。综上，蜡蚧轮枝菌LL-01生长速度快、产孢量高，对这2种检疫性粉蚧的生防潜力良好，可替代部分防控粉蚧的化学农药，减少化学农药的用量，有利于维护生态平衡。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的LL-01的菌落特征(A)和显微特征(B，C)图。
图2附图为本发明提供的蜡蚧轮枝菌LL-01在不同温度(A)、光照(B)、碳源(C)和氮源(D)下培养10d后的菌落直径和产孢量示意图。
图3附图为本发明提供的蜡蚧轮枝菌LL-01侵染南洋臀纹粉蚧(A)和石蒜绵粉蚧(B)图。
图4附图为本发明提供的蜡蚧轮枝菌LL-01对南洋臀纹粉蚧和石蒜绵粉蚧侵染10d后的死亡率示意图。
图5附图为本发明提供的蜡蚧轮枝菌LL-01胞外酶活性动态图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一株蜡蚧轮枝菌LL-01及其生防应用。
实施例涉及的实验材料、数据分析方法：
供试菌株采自福建省漳州市诏安县金星乡番荔枝果园内(北纬23°76′22″、东经117°26′42″)受昆虫病原真菌感染死亡的南洋臀纹粉蚧，采用察氏培养基(NaNO33g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O 0.5g、KCl 0.5g、FeSO40.01g、蔗糖30g、琼脂粉20g和蒸馏水1000mL)平板进行分离、纯化，编号为LL-01备用。
供试南洋臀纹粉蚧和石蒜绵粉蚧分别采自福建省诏安县金星乡的番荔枝果园和龙海市九湖镇的多肉种植基地，在室温25～28℃、相对湿度50％～60％、光周期12L：12D条件下分别用番荔枝果实和多肉植物‘红心莲’饲养，取次代孵化或蜕皮1d的一龄、二龄和三龄若虫及雌成虫备用。
数据分析
在MEGA 7软件中，利用Neighbor joining法构建菌株LL-01的***发育树。在DPS7软件中，利用Tukey检验法分别对菌株LL-01在不同温度、光照、碳源和氮源下的菌落直径和产孢量进行多重比较；利用机率值分析法计算菌株LL-01对2种南洋臀纹粉蚧和石蒜绵粉蚧的致死中浓度LC50和致死中时LT50，后取实际累计死亡率达50％以上处理的计算数值作为有效结果。
实施例1
昆虫病原真菌鉴定
形态观察：挑取菌株LL-01单孢接种于察氏培养基平板中央，置于温度(25±1)℃、相对湿度(90±5)％、光周期12L：12D的GZX-250BSH-Ⅲ型光照培养箱内培养10d后，先用DSLR-A450型数码单反相机观察、拍摄菌落形态特征，并测定菌落直径；再置于E200MV型生物显微镜观察、拍摄菌丝、分生孢子梗、产孢细胞和分生孢子的形态特征，初步鉴定虫生真菌的分类地位。
结果表明：
菌株LL-01在察氏培养基平板上生长良好；菌落近圆形，初期白色，呈放射状向外扩大生长，10d后直径可达3.82～4.24cm，并在中间区域略显淡粉色，(图1-A)。菌丝细长，具分枝和分隔，宽1.99～2.37μm；分生孢子梗单生或聚集排列于菌丝上，宽1.57～1.78μm，顶端具瓶梗状产孢细胞；产孢细胞单生、簇生或轮生，大小为(8.33～10.70)μm×(1.81～2.22)μm；分生孢子单生或串生于产孢细胞顶端，椭圆形或长椭圆形，大小为(2.32～5.41)μm×(1.53～1.80)μm(图1-B，C)。据此初步鉴定菌株LL-01属轮枝菌属Lecanicillium。
分子鉴定：取纯化后的虫生真菌菌株培养10d，用无菌手术刀在培养基上刮取约0.2g的菌丝和孢子，加液氮研磨后使用真菌基因组DNA提取试剂盒提取所分离菌株的总DNA；以总DNA为模板，分别采用rDNA-ITS基因通用引物(ITS1：5’-TCCGTAG GTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)、18S rDNA基因通用引物(NS1：5’-GTAGTCATATGCTTCTCTC-3’和NS2：5’-GGCTGCTGGCACCACACTTGC-3’)和Nad1基因通用引物(nad1A：5’-ATGGCSAGTATGCAAAGAAGA-3’和nad1B：5’-GCATGTTCTGTCATAAASCCACTAAC-3’)进行PCR扩增：PCR反应体系(25μl)：Taq PCR Master Mix 12.5μL，模板DNA 2μL(100ng/μL)，10μmol/L引物各1μL，加ddH2O至总体积达25μL；对照用ddH2O代替模板DNA。PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性40s、54℃退火40s、72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min)；扩增产物用含有GelRed染料的1.5％琼脂糖凝胶进行电泳验证，再用Gel Extraction Kit凝胶回收试剂盒纯化回收，然后测定序列。
将测序所得的3段基因序列进行BLAST比对，把相关种属序列依次导入DNAMAN 6、phylosuite 1和MEGA 7软件，分别进行多基因序列的对齐、串联和建树，根据序列间同源性的高低最终判定所分离菌株的种类。
结果表明：
对菌株LL-01的总DNA进行ITS、18S和Nad1扩增，分别获得长度为560bp、979bp和528bp的序列片段，与NCBI/BLAST中的相关种属进行同源性比对，发现3段基因序列分别与登录号为EU284718、AF049155和EF51 2938的蜡蚧轮枝菌Lecanicillium lecanii序列的相似性均达99.82％、100.00％和99.80％，并在***进化树上聚为一簇。结合形态特征，最终确定菌株蜡蚧轮枝菌。
保藏信息：蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium lecanii)LL-01，于2021年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21940。
实施例2
昆虫病原真菌培养条件优化：
温度选择：挑取蜡蚧轮枝菌LL-01的单孢接种于察氏培养基平板中央，然后分别置于22、26和30℃等3个温度的培养箱中黑暗培养，每个处理3次重复；培养10d后，用十字交叉法测定菌落直径；再往每个处理培养皿中加入10mL含0.05％吐温-80的无菌水，用灭菌玻片刮下分生孢子配制成孢悬液，经3层纱布过滤后，用纽鲍尔血球计数板在E200型生物显微镜下观察、测定每个处理的产孢量。
光照选择：挑取蜡蚧轮枝菌LL-01单孢接种于察氏培养基平板中央，后分别置于6L：18D、12L：12D和18L：6D等3种光周期及温度(26±1)℃光照培养箱中培养，每个处理3次重复；培养10d后测定菌落直径和产孢量。
碳源选择：在察氏培养基的基础上，分别以蔗糖、果糖和淀粉等3种材料作为供试碳源，制成3种试验培养基，每个处理3次重复；挑取蜡蚧轮枝菌菌株LL-01的单孢接种于察氏培养基平板中央，再置于温度(26±1)℃、光周期6L：18D的光照培养箱中培养10d后，测定菌落直径和产孢量。
氮源选择：在察氏培养基和碳源选择的基础上，分别以硝酸钠、酵母膏和牛肉膏等3种材料作为供试氮源，制成3种试验培养基，每个处理3次重复；挑取蜡蚧轮枝菌LL-01的单孢接种于察氏培养基平板中央，再置于温度(26±1)℃、光周期6L：18D的光照培养箱中培养10d后，测定菌落直径和产孢量。
结果表明：
温度：
蜡蚧轮枝菌LL-01生长和产孢受温度影响较大。生长速度以26℃和30℃最快，培养10d后菌落直径分别达4.06cm和3.93cm，两者差异不显著，但均显著显著大于22℃；产孢量以26℃最高，达1.95×108孢子/cm2，显著高于其他2个处理(图2-A)。
光照：
蜡蚧轮枝菌LL-01生长和产孢受光照的影响明显不同。生长速度以18L：6D最快，培养10d后菌落直径达4.22cm，虽与12L：12D差异不显著，但显著大于6L：18D；产孢量以6L：18D最高，达2.19×108孢子/cm2，显著高于其他2个处理(图2-B)。
碳源：
蜡蚧轮枝菌LL-01在不同碳源下的生长速度和产孢量差异明显。生长速度以果糖最快，培养10d后菌落直径达4.58cm，显著大于其他2个处理；产孢量以果糖和蔗糖最高，分别达2.38×108孢子/cm2和2.24×108孢子/cm2，两者差异不显著，但显著大于淀粉(图2-C)。
氮源：
蜡蚧轮枝菌LL-01在不同氮源下的生长速度和产孢量明显不同。生长速度以干酪素和甘氨酸最快，培养10d后菌落直径分别达4.66cm和4.63cm，两者差异不显著，但均显著显著大于硝酸钠；产孢量以干酪素最高，达3.16×108孢子/cm2，显著高于其他2个处理(图2-D)。
实施例3
昆虫病原真菌生防潜力评估：
致病力测定：在培养条件优化的基础上，取培养10d的蜡蚧轮枝菌LL-01，先往培养皿中加入10mL含0.05％吐温-80的无菌水，再用灭菌玻片刮下分生孢子，后经3层纱布过滤得孢子原液，充分混匀后，计算孢子浓度；用无菌水将孢子原液稀释成1×108、1×107、1×106、1×105和1×104孢子/mL 5个处理浓度，以0.05％吐温-80无菌水为对照，每个处理3次重复。针对南洋臀纹粉蚧，取直径12cm、高10cm的塑料保鲜盒，每个保鲜盒中放1个生长90d的番荔枝果实；在每个保鲜盒的盖子上挖取直径6cm的透气孔，并用胶水将1块直径8cm的防虫网(80目)粘在透气孔上方；用毛笔分别挑取健康的南洋臀纹粉蚧各龄虫源各30头，在各浓度处理菌液中浸泡10s后挑到滤纸上，晾干2min，再分别挑到番荔枝果实上，盖上保鲜盖。针对石蒜绵粉蚧，取直径9cm的培养皿，依次铺入相同直径的花泥和滤纸各1片，花泥厚0.5cm吸水6mL，滤纸上再放1片多肉植物“红心莲”的叶片，叶柄用湿棉花包裹并紧贴滤纸；接着用软毛笔分别挑取石蒜绵粉蚧各龄虫源30头，在各浓度处理菌液中浸泡10s后挑到滤纸上，晾干2min，再分别挑到叶片上，盖上培养皿。将保鲜盒和培养皿置于温度(26±1)℃、相对湿度(90±5)％、光周期6L：18D的MGC-350HP-2型人工气候箱内，每天定时观察并挑除死亡虫体，以虫体长出菌丝确认为有效侵染，观察至所有处理中试虫的死亡数停止发生变化为止。统计2种检疫性粉蚧的死亡率，计算蜡蚧轮枝菌LL-01致死中浓度LC50和不同浓度孢悬液下的致死中时LT50。
胞外酶活性测定：
胞外酶液制作：取1×108孢子/mL的蜡蚧轮枝菌LL-01孢子液1mL分别加入到含99mL蛋白酶诱导培养基(明胶10g，K2HPO4、NaCl 0.3g和MgSO4·7H2O各0.3g，溶于1L浓度为0.02mol/L、pH＝7的磷酸盐缓冲液中)、几丁质酶诱导培养基(蛋白胨5g，K2HPO4、KCl和MgSO47·H2O各0.5g，ZnSO4·7H2O 1g，胶状几丁质10g，溶于1L蒸馏水中)或脂肪酶诱导培养基(葡萄糖2g，蛋白胨5g，MgSO4·7H2O 0.1g，K2HPO41 g，橄榄油20ml，溶于980ml蒸馏水中)的三角瓶中，置于25℃、180r/min的QYC-2102C型全温培养摇床上培养1～10d；每天分别取2mL的3种培养液用12000r/min的KDC-140HR型高速冷冻离心机离心30min，取上清液用于测定酶活性；每处理3个三角瓶，即重复3次。蛋白酶活性测定：以酪蛋白为底物；以失活的蛋白酶溶液作为空白对照，利用UV-1800PC型紫外可见分光光度计测定各组反应混合液在680nm处的吸光度值；根据L-酪氨酸标准曲线，计算各组反应混合液的蛋白酶活性，以每分钟催化分解酪蛋白生成1μmol酪氨酸的酶量为1个酶活单位。几丁质酶活性测定：以胶状几丁质为底物；以失活的几丁质酶溶液作为空白对照，测定各组反应混合液在585nm处的吸光度值，以每分钟催化分解几丁质生成1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为1个酶活单位；根据N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线，计算各组反应混合液的几丁质酶活性。脂肪酶活性：以对硝基苯棕榈酸酯为底物；失活的脂肪酶溶液作为空白对照，测定各组反应混合液在410nm处的吸光度值；根据对硝基苯酚标准曲线，计算各组反应混合液的脂肪酶活性，以每分钟催化分解脂肪成1μmol对硝基苯酚的酶量为1个酶活单位。
结果表明：
致病力：
蜡蚧轮枝菌LL-01能有效侵染南洋臀纹粉蚧和石蒜绵粉蚧(图3-A，B)，接菌10d后对2种粉蚧一龄、二龄和三龄若虫及雌成虫的LC50分别为0.98×105～9.71×105孢子/mL和0.50×105～5.30×105孢子/mL(表1)；这2种粉蚧各虫态在1×104和1×105孢子/mL处理的死亡率均未达50％，机率值分析法计算出的LT50均相对偏大，超出试虫停止死亡的时间；其他3个处理的死亡率均有明显提高，LT50均随菌液浓度的升高而缩短，特别是1×108孢子/mL处理浓度的死亡率分别为84.09％～97.62％和89.89％～98.85％(图4)，LT50分别为3.70～5.84d和3.48～5.14d(表2)。
表1侵染10d后蜡蚧轮枝菌LL-01对南洋臀纹粉蚧和石蒜绵粉蚧的LC50
Figure BDA0003069311480000091
表2侵染10d后蜡蚧轮枝菌LL-01对南洋臀纹粉蚧和石蒜绵粉蚧的LT50
Figure BDA0003069311480000092
胞外酶活性
蜡蚧轮枝菌LL-01的3种胞外酶中，蛋白酶和脂肪酶活性的变化趋势相似，蛋白酶和脂肪酶活性的变化趋势基本相似，在第5d分别达到峰值19.44U/mL和15.01U/mL；脂肪酶活性的上升和下降幅度则相对较为平稳，在第6d达到峰值7.68U/mL(图5)。
综上，菌株生长速度及产孢量等生长特性是衡量昆虫病原真菌优良与否的重要指标。本发明提供的蜡蚧轮枝菌LL-01生长和产孢最适的温度为26℃、光周期为6L：18D、碳源为果糖、氮源为干酪素，此培养条件下的菌落直径和产孢量分别可达4.66cm和3.16×108孢子/cm2。
致病力是衡量昆虫病原真菌生防潜力和应用前景的重要指标。蜡蚧轮枝菌LL-01对不同虫龄南洋臀纹粉蚧的累计致死率、LC50和LT50最终分别可达84.09％～97.62％、0.98×105～9.71×105孢子/mL和3.70～5.84d；对石蒜绵粉蚧的累计致死率、LC50和LT50最终分别可达89.89％～98.85％、0.50×105～5.30×105孢子/mL和3.48～5.14d。而蛋白酶、几丁质和脂肪酶等胞外酶活性值大小被认为是决定昆虫病原真菌致病力的主要因素之一，菌株LL-01蛋白酶和几丁质酶活性变化幅度较大，到达峰值的时间较短，推测这应该是蜡蚧轮枝菌LL-01能够有效突破2种检疫性粉蚧体壁中实现侵染致死的主要原因；而脂肪酶活性虽然到达峰值的时间稍长，但变化幅度相对较平稳，推测这可能是蜡蚧轮枝菌LL-01能够持续突破和瓦解2种检疫性粉蚧体壁的另一个重要原因。
可见，蜡蚧轮枝菌LL-01生长速度快、产孢量高，对南洋臀纹粉蚧和石蒜绵粉蚧的侵染致病活性强，可用于这2种粉蚧的生物防治，具有替代部分粉蚧化学防控药剂的潜力，研究结果丰富了2种检疫性粉蚧的生防微生物资源，也推动了蜡蚧轮枝菌等昆虫病原真菌在粉蚧生防中的应用，可减少化学农药的用量，有利于维护生态平衡。
实施例4
含有蜡蚧轮枝菌LL-01的药剂。
制备方法可采用常规工艺，剂型为杀虫剂。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.一株蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium lecanii)LL-01，其特征在于：保藏编号为CGMCCNo.21940。
2.含有权利要求1所述蜡蚧轮枝菌LL-01的药剂。
3.如权利要求2所述的药剂，其特征在于，所述药剂为杀虫剂，靶标害虫为南洋臀纹粉蚧和石蒜绵粉蚧。
4.一株蜡蚧轮枝菌LL-01在植物生防中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物为番荔枝和多肉植物“红心莲”。
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