CN108840915A - 毛竹PeDi19-4蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

毛竹PeDi19-4蛋白及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种毛竹PeDi19‑4蛋白及其编码基因与应用。所述的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述的毛竹PeDi19‑4蛋白的核苷酸序列如SEQID No.2所示。含有所述的编码基因序列的载体。本发明提供的PeDi19‑4基因在不同程度的干旱诱导下，均有高表达。通过农杆菌介导的花序浸染法将PeDi19‑4基因表达载体转入野生型拟南芥和拟南芥di19突变体中，结果显示转基因野生型拟南芥的抗旱性得到了明显的提高，而转基因拟南芥di19突变体植株的抗旱能力也得到了回补，说明PeDi19‑4基因能够提高转基因拟南芥的抗旱性。

Description

毛竹PeDi19-4蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种毛竹PeDi19-4蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
我国的竹类植物品种繁多、资源丰富、栽培面积较广、产量较高，因此我国被称为“竹子王国”。而毛竹(Phyllostachysedulis)作为竹类植物中的模式植物，其生长速度较快，栽培面积较广，有着重要的经济、生态和文化价值。毛竹适合生产各种竹板材，竹笋味道鲜美、营养丰富含有8种氨基酸和多种人体必需的微量元素，属于较好的非木材造纸纤维原料之一，还可加工成笋干、罐头、饮料、竹工艺品、和竹高档装饰材料、化妆品、保健品等。
Di19(Drought-induced 19)基因家族，是一类干旱诱导蛋白，属于Cys2/His2锌指蛋白转录因子中的一类，普遍存在于高等植物中，主要参与植物的干旱胁迫反应。在拟南芥中AtDi19基因，在干旱诱导下，其表达量显著升高。当对T3代植株进行干旱处理时，和野生型植物(WT)比，Di19基因的过表达植株表现出有更高的抗旱能力，而突变体植株则对干旱更敏感。AtDi19基因提高植物的抗旱性，主要是通过与上游CPK11蛋白互作，形成一个复合体；同时AtDi19基因也会引起下游逆境相关基因的表达。
毛竹的生长环境对水分、气候及土壤的要求较高，适合生长在水分充足、气候温暖及微酸性或中性壤土环境中。然而近年来，随着全球气温的不断升高及气候的不断恶化，致使植物在生长过程中会受到来自环境的各种不利条件的伤害，而在众多逆境胁迫处理中，干旱胁迫已成为首要的限制因子。在毛竹的生长发育过程中，一年内会受到两次明显的干旱影响，一是春季的出笋期，若干旱时间长，则会造成竹笋的出土缓慢，产量减少，即便出土也容易干死，导致残次竹的增多；二是秋季的笋芽分化时期，若发生干旱，则会使笋芽的分化减少，进而会大大减少当年冬季竹笋的产量和第二年的新生竹数量。尤其是幼生毛竹，对水分的要求更高。因此，培育出一批耐旱的毛竹新种质，对提高毛竹的产量，促进林产业稳定发展，增加国民的经济收入具有重要的意义。
目前已公布的Di19基因及其同源基因，多来源于模式植物或者草本植物，这些植物多为一年生植物，而在毛竹中关于Di19基因的功能还尚未报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗旱性好的毛竹PeDi19-4蛋白及其编码基因与应用。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种毛竹PeDi19-4蛋白，所述的毛竹PeDi19-4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明的一种编码所述的毛竹PeDi19-4蛋白的基因序列，所述的毛竹PeDi19-4蛋白的核苷酸序列如SEQID No.2所示。
本发明的含有权利要求2所述的编码基因序列的载体。
本发明所述的载体的构建方法，包括如下步骤：将两端包含酶切位点的毛竹PeDi19-4蛋白编码基因序列构建到pEASY T1 simple Cloning Vector载体上，转入大肠杆菌感受态细胞TransT1内，得到T1-PeDi19-4重组质粒，双酶切T1-PeDi19-4重组质粒和pCAMBIA1301a质粒，连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，提取质粒后，获得表达载体pCAMBIA1301a-PeDi19-4。
本发明含有权利要求3所述的载体的工程菌。
本发明用于克隆权利要求2所述的编码基因序列的引物对，所述的引物对包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
PeDi19-4—F:5’—GGGGTACC ATGGAGGTGGGAAGCCTT—3’；
PeDi19-4—R:5’—GCTCTAGACTATTGTGCCTCTTTGCGG—3’
本发明的一种毛竹PeDi19-4基因，其特征在于：所述的毛竹PeDi19-4基因的cDNA全长的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明所述的毛竹PeDi19-4基因在改造植物抗旱中的应用。
进一步地，通过农杆菌介导的花序浸染法将权利要求7所述的基因或所述的编码基因序列转入植物中。
有益效果：本发明首次提供了毛竹抗旱相关的PeDi19-4蛋白及其编码基因与应用。通过农杆菌介导的花序浸染法将PeDi19-4基因表达载体转入野生型拟南芥和拟南芥di19突变体中，结果显示过表达拟南芥植株的抗旱性明显增强，而转基因拟南芥di19突变体植株的抗旱能力也得到了回补，说明PeDi19-4基因能够提高转基因拟南芥的抗旱性。利用毛竹PeDi19-4基因表达载体获得的植物材料，对外界干旱环境具有一定的适应性，具有很好的应用前景。
附图说明
图1是本发明所述的PeDi19-4基因所编码的蛋白的氨基酸序列和结构域划分图；
图2是本发明实施例2毛竹叶片总RNA的电泳图。M：Trans2K DNA Marker；1：毛竹叶片总RNA；
图3本发明实施例4毛竹PeDi19-4基因的植物转基因载体pCAMBI1301a-PeDi19-4构建示意图；
图4是本发明实施例5转基因拟南芥和野生型拟南芥在干旱前后的表型图；A:转基因拟南芥和野生型拟南芥在干旱前后的表型图；B：转基因拟南芥和野生型拟南芥在干旱处理10天后的存活率；C：转基因拟南芥和野生型拟南芥在干旱处理前后的鲜重；di19：突变体拟南芥；Col：野生型拟南芥；OE-1、OE-3：转基因过表达株系；OX-4、OX-7：转基因突变体di19的株系。
具体实施方式
通过解释以下本申请的优选实施方案，本发明的其他目的和优点将变得清楚。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限值和下限值之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述的范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限值和下限值可独立地包括或排除在范围内。
实施例中所使用的试剂主要包括分子生物学实验试剂和试剂盒等，均可通过商业途径获得，具体包括：RNA提取试剂盒购自Roche生物科技有限公司；反转录试剂盒(First-Strand cDNASynthesis Kit)购自Promega公司；SYBR Green Mix购自美国ABI公司；Trizol购自上海英俊生物技术有限公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒快速小提试剂盒购自Axygen；pEASY T1 simple Cloning Vector、Taq酶、Trans T1感受态及相关的试剂盒购置北京全式金公司；限制性内切酶KpnI和XbaI及DNAmarker均购自TaKaRa(宝生物工程(大连))有限公司；测序工作均由华大基因科技股份有限公司完成。本发明实施例中所提供的方法如果没有特殊说明均为常规方法。
本发明的一种毛竹PeDi19-4蛋白，所述的毛竹PeDi19-4蛋白的氨基酸序列如SEQID No.1所示。
本发明的一种编码所述的毛竹PeDi19-4蛋白的基因序列，所述的毛竹PeDi19-4蛋白的核苷酸序列如SEQID No.2所示。
本发明的含有权利要求2所述的编码基因序列的载体。
本发明所述的载体的构建方法，包括如下步骤：将两端包含酶切位点的毛竹PeDi19-4蛋白编码基因序列构建到pEASY T1 simple Cloning Vector载体上，转入大肠杆菌感受态细胞TransT1内，得到T1-PeDi19-4重组质粒，双酶切T1-PeDi19-4重组质粒和pCAMBIA1301a质粒，连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，提取质粒后，获得表达载体pCAMBIA1301a-PeDi19-4。
本发明含有权利要求3所述的载体的工程菌。
本发明用于克隆权利要求2所述的编码基因序列的引物对，所述的引物对包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
PeDi19-4—F:5’一GGGGTACC ATGGAGGTGGGAAGCCTT—3’；
PeDi19-4—R:5’一GCTCTAGACTATTGTGCCTCTTTGCGG—3’
本发明的一种毛竹PeDi19-4基因，其特征在于：所述的毛竹PeDi19-4基因的cDNA全长的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明所述的毛竹PeDi19-4基因在改造植物抗旱中的应用。
通过农杆菌介导的花序浸染法将权利要求7所述的基因或所述的编码基因序列转入植物中。
实施例1
一个毛竹PeDi19-4基因编码的蛋白序列
使用primers软件，对毛竹PeDi19-4基因的cDNA序列全长，进行蛋白序列翻译(SEQID No.1)，并根据C2H2基因特点，毛竹PeDi19-4蛋白序列进行两个zine-finger like基序和Di19-C基序划分(图1)。
实施例2
毛竹抗旱相关基因PeDi19-4诱导表达模式分析
1.毛竹叶片totalRNA的提取
将生长在温度(白/黑)为25℃/18℃，光周期(光/暗)为18/6h的温室中月三个月大小，且长势良好的毛竹种苗，进行不同程度的干旱(15％PEG-6000、25％PEG-6000和35％PEG-6000溶液喷洒叶片)处理，在处理前取适量未处理叶片做对照，处理后不同时间段分别取样(1h、3h、6h、12h和24h)，放入试管中，立即放入液氮中快速冷冻3h后，放入一80℃超低温冰箱中备用。根据改良的Trizol法，进行总RNA的提取：
(1)将叶片转移到灭过菌的研磨内，缓慢加入液氮，迅速研磨至粉末状，将粉末装入1.5mL Dof管中；
(2)向管中加入1mL Trizol，在漩涡仪上震动20s，使其完全裂解，冰上静置10分钟；
(3)4℃，1.2×104g，离心15min；
(4)吸取800μL的上清液，打到新的2.0mL Dof管中，再加入200μL氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀；
(5)4℃，1.2×104g，离心10min；再次吸取400μL的上清液，打到新的2.0mL Dof管中，加入400μL异丙醇，使混匀充分，静置15min；
(6)4℃，1.2×104g，离心15min；弃净上清，加入1.0mL 75％的DEPC水配制的乙醇；
(7)4℃，8×103g，离心5分钟，小心地弃掉上清；再次加入1.0mL的75％乙醇，4℃，8×103g，离心5分钟，轻轻地弃掉上清，超净台上放置10min，使其干燥；
(8)再加25μL DEPC水，8×103g，离心5min，取3μL用分光光度计检测RNA的浓度。
2.电泳检测总RNA完整性
取2μL DEPC水溶解的RNA，加入1μL溴酚蓝混匀，使用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳3-5V/cm。电泳20-30分钟后，将凝胶放在凝胶成像***下观察，如果离点样孔较近的28S rRNA的主带的亮度是另一条18S rRNA的二倍且没有其它杂带(5S除外)，则表明RNA未降解(图3)。
3.去除基因组DNA处理
在微量的离心管中，依次加入下列试剂：
37℃反应20-30分钟后，加入50μL的DEPC水；加入100μL的苯酚/氯仿/异戊醇(比例25：24：1)，充分混匀，1.2×104g,离心5min，小心吸取上层(水层)至另一微量离心管中，加入10μL(1/10)的3M NaOAC，再加入250μL的冷无水乙醇，-20℃保存30-60分钟；离心回收沉淀，用70％冷乙醇清洗沉淀，真空干燥后，用适量的DEPC水溶解并检测，确认是否除去基因组DNA。
4.反转录
使用Promega反转录试剂盒First-Strand cDNA Synthesis Kit，合成第一条链cDNA，具体操作如下：在微量的离心管中，按次序分别加入下列试剂：
点动混匀后，42℃15min；95℃5min，5℃孵育5分钟；室温高速离心5s，将所有溶液集到管底，检测后置于-20℃冰箱保存样品；
5.根据毛竹PeDi19-4基因的cDNA序列全长，利用Primer3Plus软件设计荧光定量试验的引物：
F：5’-TTTGGCCTGGGCTTCACA-3’；
R：5’-GGAATAGGAACTGGCGATTTTG-3’。
用PCR对其特异性进行检测，在确保PCR特异性扩增前提下，方可使用。以毛竹TIP41基因为荧光定量试验的阳性对照，TIP41基因的引物为：
F：5’-AAAATCATTGTAGGCCATTGTCG-3’；
R：5-ACTAAATTAAGCCAGCGGGAGTG-3’。
荧光定量PCR反应体系为25μL，各组分为SYBR Green Mix 12.5μL，模板cDNA为2μL，上游引物和下游引物(10μmol/L)各0.5μL，最后补去离子水至25μL。PCR反应参数如下：95℃预变性10min；95℃15sec，60℃1min，共40个循环。反应结束后，对产物进行加热，获得产物的溶解曲线。采用2–ΔΔCT法对获得的信号和数据进行处理(图4)。
实施例3
毛竹抗旱相关基因PeDi19-4的克隆
根据毛竹基因组网站上公布的PeDi19-4基因CDS序列，设计PCR扩增该片段的引物，上游引物加KpnI的GGGGTACC酶切位点，下游引物加XbaI的GCTCTAGA酶切位点。
引物序列如下：
PeDi19-4—F:5’—GGGGTACCATGGAGGTGGGAAGCCTT—3’；
PeDi19-4—R:5’—GCTCTAGACTATTGTGCCTCTTTGCGG—3’
以毛竹叶片totalRNA反转录第1链cDNA为模板，用上游引物和下游引物进行PCR扩增，PCR反应体系如表1所示：
表1
PCR反应条件为：预变性：98℃10min；变性：98℃10s；退火：62℃5s；延伸：72℃30s，33个循环；总延伸：72℃10min。
反应结束后，吸取PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像***中检测和切胶后，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，将回收片段与pEASY T1 simple CloningVector连接，转化到全式金生物技术有限公司的大肠杆菌感受态TransT1细胞中；PCR和酶切检测筛选阳性克隆；对检测结果初步判断正确的连接片段，送去上海生工公司进行测序，测序结果如：序列表中SEQ ID NO:2的DNA序列所示，由747bp个碱基组成，将其与毛竹基因组网站上报道的序列比对，结果完全一致。
实施例4
毛竹PeDi19-4基因的植物转基因载体pCAMBI1301a-PeDi19-4构建
将将已连接到pEASY T1 simple Cloning Vector上的小片段的PeDi19-4片段与农杆菌双元载体pCAMBIA1301a用KpnI和XbaI酶进行双酶切，于37℃水浴锅中，3h，酶切20uL体系如表2所示：
表2
双酶切后，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。将上述大小片段用T4DNA连接酶连接，25℃连接2～12h，连接体系如表3所示：
表3
取5～10μL的构建好的载体pCAMBIA1301a–PeDi19-4质粒轻轻打入到100μLEHA105农杆菌感受态细胞中，冰浴5min，液氮速冻1min，37℃水浴5min后，加入200μL YEP液体培养基，28℃，220培养4～5h；1.0×104g，离心30s，弃上清，加入100μL YEP液体培养基，重新悬浮细胞，涂布于含100μg/mL Kan和50μg/mL Rif的YEP固体平板上，28℃培养约24～48h；挑取平板上长出的微黄色的单菌落，接种于含100μg/mL Kan和50μg/mL Rif的YEP液体培养液中，摇菌24～48h；待菌液浑浊，显示为橙黄色，提取质粒；分别用PCR和双酶切验证。
实施例5
将植物转基因表达载体pCAMBIA1301a–PeDi19-4转入野生型拟南芥和拟南芥di19突变体中
1.拟南芥的种植：
(1)在超净台上，用12％花王漂白水漂洗饱满的野生型拟南芥种子8min，然后以灭菌的蒸馏水反复冲洗7-8次，每次冲洗3min。
(2)用1mL移液枪吸取消毒过的种子均匀地吹打在1/2MS固体培养基上，放入4℃冰箱春化3天，然后转移到温室中培养。
(3)一周后，将平板上的拟南芥移栽到装有蛭石和黑土(3:1)的小盆中，每4棵/盆。然后保鲜膜覆盖三天。生长期间3天浇水一次，保持花盆中土壤湿润。
2.农杆菌侵染液的制备：
取50μL已构建好的过量表达载体农杆菌菌液，加入到10mLYEP液体培养中，同时加入相应的Kan和Rif，28℃，230r/min，培养两天，OD600＝08-1.0。4℃，4.5×103r/min，离心6min，弃上清。用转化buffer培养基重悬沉淀，备用。
用剪刀将已抽薹的主茎剪掉，打破顶端优势，使其分生更多的侧枝。待植株上有1/3的花蕾时，用胶头滴管吸取一配制好的菌液，滴蘸花蕾，并用剪刀剪去已有的果荚，减少种子的假阳性。避光黑暗培养三天。约5天后，用样的方法进行第二次侵染。最终收获的种子，为T0代。
实施例6
毛竹PeDi19-4基因的转基因拟南芥筛选和鉴定
1.潮霉素培养基的筛选：
将拟南芥T0种子，均匀地平铺在潮霉素的MS培养基上，如上述步骤。待4℃春化3天后，转移到温室中培养。约一周，观察萌发情况，如正常萌发，则可能为转基因阳性植株。
2.PCR分子验证
首先根据CTAB法进提取PeDi19-4转基因拟南芥DNA，
(1)在水浴锅(60℃)内溶解CTAB提取缓冲液；
(2)将叶片置于研钵内，倒入液氮，研磨至粉状。分装入2mLDof管中，每管加入1mLCTAB提取缓冲液，漩涡震荡30s，置于冰上静3-5min，使充***解；
(3)将Dof管置于水浴锅(65℃)中，保温1h，使细胞完全破碎；
(4)向Dof管中加入1mL酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，并充分混匀，1.2×104g，离心15min，取上层水相至新的Dof管中，加入等体积的氯仿异戊醇，充分混匀，再次1.2×104g，离心15分钟；
(5)再次吸400mL的上清液至新的Dof管中，加入400mL的异丙醇，混匀，于-20℃冰箱中静置半小时，1.2×104g，离心15min，去上清；
(6)加入1mL的乙醇(70％)，离心6min，弃上清；
(7)重复步骤(6)；
(8)加50μL灭过菌的纯水溶解沉淀，并进行DNA的纯度、浓度及A260/A280值的检测。
以野生型拟南芥DNA作为对照，使用载体构建的引物PeDi19-4F和PeDi19-4R，以及对转基因拟南芥的阳性植株DNA进行PCR筛选。PCR扩增程序：98℃10min；变性：98℃10s；退火：62℃5s；延伸：72℃30s，28个循环；总延伸：72℃10min。反应结束后，取PCR产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像***中检测。
3.毛竹PeDi19-4基因的转基因拟南芥的表型分析
将转基因野生型拟南芥和转基因突变体拟南芥di19纯合体种子，种植于温室中，两周后，拍照观察表型；同时进行干旱缺水处理，干旱过程中，拍照观察表型变化。并对不同株系的拟南芥干旱处理后的存活率进行统计，以及干旱处理前后的鲜重进行统计(图4)。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (9)

1.一种毛竹PeDi19-4蛋白，其特征在于：所述的毛竹PeDi19-4蛋白的氨基酸序列如SEQID No.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的毛竹PeDi19-4蛋白的基因序列，其特征在于：所述的毛竹PeDi19-4蛋白的核苷酸序列如SEQID No.2所示。
3.含有权利要求2所述的编码基因序列的载体。
4.权利要求3所述的载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：将两端包含酶切位点的毛竹PeDi19-4蛋白编码基因序列构建到pEASY T1 simple Cloning Vector载体上，转入大肠杆菌感受态细胞TransT1内，得到T1-PeDi19-4重组质粒，双酶切T1-PeDi19-4重组质粒和pCAMBIA1301a质粒，连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，提取质粒后，获得表达载体pCAMBIA1301a-PeDi19-4。
5.含有权利要求3所述的载体的工程菌。
6.用于克隆权利要求2所述的编码基因序列的引物对，其特征在于：所述的引物对包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
7.一种毛竹PeDi19-4基因，其特征在于：所述的毛竹PeDi19-4基因的cDNA全长的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
8.权利要求7所述的毛竹PeDi19-4基因在改造植物抗旱中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：通过农杆菌介导的花序浸染法将权利要求7所述的基因或权利要求2所述的编码基因序列转入植物中。
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