CN111812248A - 一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法 - Google Patents
一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111812248A CN111812248A CN202010716191.7A CN202010716191A CN111812248A CN 111812248 A CN111812248 A CN 111812248A CN 202010716191 A CN202010716191 A CN 202010716191A CN 111812248 A CN111812248 A CN 111812248A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mass spectrometry
- solution
- organic phase
- liquid chromatography
- phospholipids
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 title claims abstract description 98
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 52
- 229940106134 krill oil Drugs 0.000 title claims abstract description 40
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 47
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 39
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims abstract description 33
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 15
- 241000239366 Euphausiacea Species 0.000 claims abstract description 9
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 8
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 7
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000000861 blow drying Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 66
- -1 phosphatidylcholine ions Chemical class 0.000 claims description 27
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 22
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 18
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 16
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 15
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 7
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 5
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 4
- 229960001701 chloroform Drugs 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 238000002013 hydrophilic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;formic acid Chemical group CC#N.OC=O XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 claims description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 2
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 claims description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 claims 1
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 description 39
- JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N all-cis-5,8,11,14,17-icosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N 0.000 description 29
- 235000020673 eicosapentaenoic acid Nutrition 0.000 description 19
- 229960005135 eicosapentaenoic acid Drugs 0.000 description 19
- JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N eicosapentaenoic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 description 15
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 14
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 description 14
- 241000894007 species Species 0.000 description 12
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 11
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 3
- 235000020660 omega-3 fatty acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000002541 precursor ion scan Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229940012843 omega-3 fatty acid Drugs 0.000 description 2
- 239000006014 omega-3 oil Substances 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- DVSZKTAMJJTWFG-SKCDLICFSA-N (2e,4e,6e,8e,10e,12e)-docosa-2,4,6,8,10,12-hexaenoic acid Chemical compound CCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O DVSZKTAMJJTWFG-SKCDLICFSA-N 0.000 description 1
- GZJLLYHBALOKEX-UHFFFAOYSA-N 6-Ketone, O18-Me-Ussuriedine Natural products CC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O GZJLLYHBALOKEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010036618 Premenstrual syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012490 blank solution Substances 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000001360 collision-induced dissociation Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- KAUVQQXNCKESLC-UHFFFAOYSA-N docosahexaenoic acid (DHA) Natural products COC(=O)C(C)NOCC1=CC=CC=C1 KAUVQQXNCKESLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002190 fatty acyls Chemical group 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000001616 ion spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
- G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
- G01N30/724—Nebulising, aerosol formation or ionisation
- G01N30/7266—Nebulising, aerosol formation or ionisation by electric field, e.g. electrospray
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
- G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
- G01N30/8679—Target compound analysis, i.e. whereby a limited number of peaks is analysed
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Library & Information Science (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明公开了一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法,包括以下步骤：取磷虾粉碾磨均匀后加入的三氯甲烷‑甲醇混合溶液中，于室温下振荡均匀，得A提取液；再对A提取液进行超声处理，再将混合物离心后收集下层有机相和离心后的残留物，得B有机相和C残留物；再对C残留物用三氯甲烷重新提取多次，收集下层有机相，得D有机相；再将B有机相和得D有机相混合后得e1萃取液，然后将e1萃取液吹干后用乙腈定容，然后过有机滤膜，得到E待测液；最后将E待测液通过前体离子扫描模式下的亲水作用液相色谱质谱联用法进行检测。本发明能够实现对磷虾油中磷脂的非靶向筛选，并具有检测效率快、检测准确度高和分辨率高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种磷虾油的检测方法，特别是一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法。
背景技术
南极磷虾是在南冰洋南极洲水域发现的数量最丰富的生物之一，具有巨大的潜力和应用前景，而其中的磷虾油目前则常作为鱼油的替代品出现在市场上。磷虾油中富含二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，与其他生物来源的ω-3脂肪酸的不同之处在于，磷虾油在磷脂的sn-2位含有高水平的ω-3脂肪酰链，而鱼油中所含ω-3脂肪酸通常为甘油三酯或乙酯形式。由于EPA型结构磷脂和DHA型结构磷脂能够较易的结合到细胞膜并被肠道吸收，从而提到降低心血管风险，改善慢性炎症，提高大脑功能，以及治疗经前综合症等作用，因此含有上述磷脂的磷虾油被认为是一种潜在的具有重要保健价值的脂质来源，而如何准确的检测磷虾油中的EPA型结构磷脂和DHA型结构磷脂则成为了实现磷脂有效利用的先决条件。
传统对磷脂的检测方法分为鸟枪法和快速蒸发电离质谱法，但这两种方法由于不涉及色谱分离，较易受到基质效应和离子抑制的干扰，使得分析得到的结果较差。而在质谱技术的推动下，对整体脂质进行***分析的脂质组学得到了快速地发展，使得利用脂质组学实现磷脂检测的液相色谱质谱法则成为了提高磷脂检测效率及全面性的新型检测方法。但由于“组学”大数据较为复杂，导致该方法在检测过程中很容易被饱和或短链结构的磷脂所干扰，使其对可变分子量的EPA型结构磷脂和DHA型结构磷脂的非靶向筛选存在一定难度。
因此，需要一种能够对南极磷虾油中的EPA型结构磷脂和DHA型结构磷脂进行非靶向筛选的有效方法。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法。它能够实现对磷虾油中磷脂的非靶向筛选，并具有检测效率快、检测准确度高和分辨率高的特点。
本发明的技术方案：一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法，包括以下步骤：
①取每10g的磷虾粉，碾磨均匀后加入100～300mL的三氯甲烷-甲醇混合溶液中，于室温下振荡1～3分钟，得A提取液；
②对A提取液进行超声处理，使磷虾油从固体机制中释放，得b1混合物，再将b1混合物离心，收集下层有机相和离心后的残留物，得B有机相和C残留物；
③对C残留物用100～300mL的三氯甲烷重新提取多次，收集下层有机相，得D有机相；
④将B有机相和得D有机相混合后得e1萃取液，然后将e1萃取液吹干后用乙腈定容，然后过有机滤膜，得到E待测液；
⑤将E待测液通过前体离子扫描模式下的亲水作用液相色谱质谱联用法进行检测。
前述的一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法中，所述步骤②的具体步骤为：将A提取液于20kHz、130W条件下超声辅助提取10～20min，得b1混合物，然后在3～5℃下将b1混合物以8000g离心8～12min，得B有机相和C残留物。。
前述的一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法中，所述步骤④的具体步骤为：将B有机相和得D有机相混合后得e1萃取液，然后在4℃的环境温度下用氮气流将e1萃取液吹干，然后再用1mL的乙腈定容，过0.22μm有机滤膜，得到E待测液。
前述的一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法中，所述步骤⑤中的液相色谱质谱法的液相色谱条件为：液相色谱柱为Cosmosil-HILIC色谱柱；进样量为2μL，色谱柱温度保持在30℃；流动相A是向20mmol的甲酸铵和20mmol的甲酸混合溶液中加入纯水并定容至1L得到；流动相B为配甲酸浓度为20mmol的甲酸乙腈溶液。
前述的一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法中，所述步骤⑤中液相色谱质谱法的液相色谱柱洗脱方法具体为：0～10min时，流动相B由95％均匀降至70％，10～15min时，流动相B由70％均匀降至50％，15～20min时，流动相B保持在50％。
前述的一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法中，所述步骤⑤中液相色谱质谱法的质谱测定方式具体为：以2μL的进样量将E待测液注入电喷雾电离源中，以负离子的方式进行前体离子扫描，EPA型结构磷脂和DHA型结构磷脂的产物离子分别设置为m/z301和m/z327。
前述的一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法中，所述步骤⑤中液相色谱质谱法的质谱条件具体为：在负离子模式下将离子喷雾电压设置在4500V，离子源温度保持在500℃；离子源气体中的气帘气、干燥气体和雾化器气体分别设置为35psi、50psi、60psi；质谱测量范围为m/z450～950，扫描速率为每个光谱1s；然后完成数据采集、处理和分析。
前述的一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法中，所述步骤⑤中液相色谱质谱法在对E待测液中的磷脂酰胆碱离子进行检测时，质谱条件中的碰撞电压为50eV，去簇电压为100eV；液相色谱质谱法在对E待测液中的磷脂酰乙醇胺离子进行检测时，质谱条件中的碰撞电压为40eV，去簇电压为100eV；液相色谱质谱法在对E待测液中的磷酯酰肌醇离子进行检测时，质谱条件中的碰撞电压为50eV，去簇电压为70eV。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
(1)本发明通过将前体离子扫描和液相色谱质谱法联用的方式实现对磷虾油中EPA和DHA型结构磷脂的非靶向筛选，相比现有的液相色谱质谱法、鸟枪法和快速蒸发电离质谱法，能够有效提高对EPA型结构磷脂和DHA型结构磷脂的检测分子种类，使本发明能够同时检测33种EPA和DHA型磷脂分子种类；同时能够减少检测过程中基质效应和离子抑制造成的干扰，提高本发明的检测准确度和完整度；
(2)本发明通过对EPA型结构磷脂和DHA型结构磷脂的二级质谱特征进行研究，并在液相色谱质谱法中通过碰撞诱导解离进行破碎，测出EPA和DHA分别在m/z301.2和m/z327.2的质荷比时其离子强度相对突出，并在此基础上通过对EPA型结构磷脂和DHA型结构磷脂质谱方法的优化，进一步提高对各磷脂离子的分离效果，从而提高了本发明的检测准确度和分辨率；
(3)现有质谱检测方法中并没有具体的针对食源性材料中的EPA型和DHA型结构磷脂的检测工艺及参数，而本发明通过无数次实验发现，对碰撞质谱法中电压可以改变碰撞前沉积到离子中的能量程度，从而增加碎片离子的强度，提高EPA链和DHA链的解离效率，进而提高质谱法在检测时的效率和准确度；而去簇电压的变化则能够加速离子，通过其与中性分子的碰撞产生裸露的分析物离子，以消除加合的溶剂分子，并防止离子聚集在一起，从而减少离子信号的波动；在此基础上本发明针对各磷脂分子分别对碰撞电压和去簇电压进行优化，有效缓解去簇电压过低造成对离子的信号响应的影响，同时避免去簇电压过高造成的在源区域内的孔分离器区域中的离子过度碎裂，从而进一步提高对EPA和DHA型结构磷脂的检测准确度；
(4)针对本发明所用的前体离子扫描与液相色谱质谱联用的磷脂检测法，本发明还具体优化了对磷虾油待测液的提取方法，从而极大限度的降低脂质在提取过程中的氧化风险，进而提高本发明检测结果的准确度和检测效率；
所以，本发明能够实现对磷虾油中磷脂的非靶向筛选，并具有检测效率快、检测准确度高和分辨率高的特点。
附图说明
图1是对磷脂标准液中磷脂酰胆碱离子的前体离子谱图；
图2是对磷脂酰乙醇胺离子的前体离子谱图；
图3是对磷酯酰肌醇离子的前体离子谱图；
图4是对磷脂酰胆碱离子的EPA链解离效率图；
图5是对磷脂酰乙醇胺离子的EPA链解离效率图；
图6是对磷酯酰肌醇离子的EPA链解离效率图；
图7是对磷脂酰胆碱离子的DHA链解离效率图；
图8是对磷脂酰乙醇胺离子的DHA链解离效率图；
图9是对磷酯酰肌醇离子的DHA链解离效率图；
图10是EPA和DHA结合型结构磷脂在前体离子扫描模式下的总离子流色谱图；
图11是EPA型结构磷脂在前体离子扫描模式下的总离子流色谱图；
图12是DHA型结构磷脂在前体离子扫描模式下的总离子流色谱图；
图13是EPA型结构磷脂中磷脂酰胆碱离子的质谱图；
图14是EPA型结构磷脂中磷脂酰乙醇胺离子的质谱图；
图15是EPA型结构磷脂中磷酯酰肌醇离子的质谱图；
图16是DHA型结构磷脂中磷脂酰胆碱离子的质谱图；
图17是DHA型结构磷脂中磷脂酰乙醇胺离子的质谱图；
图18是DHA型结构磷脂中磷酯酰肌醇离子的质谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例。一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法，包括以下步骤：
①取每10g的磷虾粉，碾磨均匀后加入200mL的三氯甲烷-甲醇混合溶液中，该三氯甲烷-甲醇混合溶液中三氯甲烷：甲醇的体积比(v/v)为2:1，然后于室温下振荡2分钟，得A提取液；
②对A提取液进行超声处理，使磷虾油从固体机制中释放，得b1混合物，再将b1混合物离心，收集下层有机相和离心后的残留物，得B有机相和C残留物；
③对C残留物用200mL的三氯甲烷重新提取两次，收集下层有机相，得D有机相；
④将B有机相和得D有机相混合后得e1萃取液，然后将e1萃取液放置在氮吹仪下吹干后，用乙腈定容，然后过有机滤膜，得到E待测液；
⑤将E待测液通过前体离子扫描(PIS)模式下的亲水作用液相色谱质谱联用法进行检测。
所述步骤②的具体步骤为：将A提取液于20kHz、130W条件下超声辅助提取15min，得b1混合物，然后在4℃下将b1混合物以8000g离心10min，得B有机相和C残留物。
所述步骤④的具体步骤为：将B有机相和得D有机相混合后得e1萃取液，然后在4℃的环境温度下用氮气流将e1萃取液吹干，然后再用1mL的乙腈定容，过0.22μm有机滤膜，得到E待测液。
所述步骤⑤中的液相色谱质谱法的液相色谱条件为：液相色谱柱为Cosmosil-HILIC色谱柱(250×4.6mm，粒径3μm)；进样量为2μL，色谱柱温度保持在30℃；流动相A是向20mmol的甲酸铵和20mmol的甲酸混合溶液中加入纯水并定容至1L得到；流动相B为配甲酸浓度为20mmol的甲酸乙腈溶液。
所述步骤⑤中液相色谱质谱法的液相色谱柱洗脱方法具体为：0～10min时，流动相B由95％均匀降至70％，10～15min时，流动相B由70％均匀降至50％，15～20min时，流动相B保持在50％(上述％为体积％)，洗脱中的每个时间段内，余量为流动相A；洗脱完所有脂质后，用50％流动相B冲洗色谱柱，使HILIC条件调整到平衡的初始条件，冲洗后的柱子可重复使用。
所述步骤⑤中液相色谱质谱法的质谱测定方式具体为：以2μL的进样量将E待测液作为样品注入电喷雾电离源中，以负离子的方式进行前体离子扫描，EPA型结构磷脂和DHA型结构磷脂的产物离子分别设置为m/z301和m/z327。
所述步骤⑤中液相色谱质谱法的质谱条件具体为：在负离子模式下将离子喷雾电压设置在4500V，离子源温度保持在500℃；离子源气体中的气帘气、干燥气体(GS1)和雾化器气体(GS2)分别设置为35psi、50psi、60psi；质谱测量范围为m/z450～950，扫描速率为每个光谱1s；然后使用Analyst1.6软件进行仪器控制和数据采集、处理和分析。
所述步骤⑤中液相色谱质谱法在对E待测液中的磷脂酰胆碱离子(PC离子)进行检测时，质谱条件中的碰撞电压(CE)为50eV，去簇电压(DP)为100eV；液相色谱质谱法在对E待测液中的磷脂酰乙醇胺离子(PE离子)进行检测时，质谱条件中的碰撞电压为40eV，去簇电压为100eV；液相色谱质谱法在对E待测液中的磷酯酰肌醇离子(PI离子)进行检测时，质谱条件中的碰撞电压为50eV，去簇电压为70eV。
实验例1：按本发明所述的方法配置磷脂标准液并进行检测，检测时利用液相色谱质谱法中的诱导碰撞解离(CID)方法对磷脂标准液破碎后进行检测。检测结果如图1-3所示，当EPA型结构磷脂和DHA型结构磷脂的产物离子强度在m/z301.2和m/z327.2时，能够稳定的通过前体离子扫描-液相色谱质谱联用法对EPA型结构磷脂和DHA型结构磷脂进行非靶向筛选。
检测时，将质谱条件中的碰撞电压和去簇电压分别做正交试验，然后检测各磷脂中EPA链和DHA链的解离效率。试验结果如图4-9所示，当碰撞电压分别为50、40和50eV时，PC、PE、PI离子的EPA链和DHA链解离效率最佳；当去簇电压分别为100、100和70eV时，PC、PE和PI的离子的EPA链和DHA链解离效率的最佳。
前体离子扫描模式下，EPA和DHA结合型结构磷脂(PLEPA/DHA),EPA型结构磷脂(PLEPA)和DHA型结构磷脂(PLDHA)的总离子流色谱图(TIC)如图10-12所示，其中PLEPA/DHA的总离子流色谱图如图10所示，PLEPA/DHA的洗脱顺序分别为PCE/D(11min)，PEE/D(12min)，PIE/D和PSE/D(16min)，其中PCE/D的峰值强度显著高于PEE/D和PIE/D。
PLEPA的总离子流色谱图如图11所示，与PLEPA/DHA相似，表明PCE、PEE和PIE广泛存在，但PCE的信号强度仅为2.8e6cps。
PLDHA的总离子流色谱图如图12所示，色谱峰分离效果较好，PCD和PED完全分离，但PCD的信号强度(1.3e6cps)弱于PCE，而PID几乎不存在，在总离子流图中不能直接观察到。
由上述可知，本发明采用前体离子扫描与液相色谱质谱法配合检测的方式，能够有效对磷虾油中各磷脂成分进行有效检测，且具有良好的检测清晰度和准确度。
PLEPA/DHA的质谱图如图13-18所示，磷虾油中检测到的每个PLEPA/DHA分子物种的化学结构和含量如表1所示。本申请共检测到8个PCE分子物种，其中m/z824.7的离子强度最大，经鉴定为PC 16：0/20：5，此外还有一种含双EPA链的磷脂，即离子m/z870.7(PC20：5/20：5)。同时EPA结构的缩醛磷脂也得到了全面检测，例如plasPC O-16：0/20：5(m/z810.7)和plasPC O-18：0/20：5(m/z838.6)。PEE中含有5个分子种类，其中m/z762.7的最高峰鉴定为PE 18：1/20：5，同时检测到EPA型的plasPE O-16：0/20：5。PEE中含有4个分子种类，其中m/z881.7(PI 18：1/20：5)和m/z855.7(PI 16：0/20：5)的离子最丰富。
在DHA型结构磷脂中，检测到八种PCD，其中双DHA链结构磷脂分子m/z922.6(PC22：6/22：6)含量最高，还含有DHA结构的缩醛磷脂，例如m/z836.5(PC O-16：0/22：6)和m/z862.6(PC O-18：1/22：6)。PED中含有6个分子种类,m/z788.6(PE 18：1/22：6)离子最显著。PID中仅含2个分子种类，包括m/z879.8(PI 16：1/22：6)和m/z895.8(PI O-18：0/22：6)。
通过上述可知，本发明所用的前体离子扫描-液相色谱质谱联用法共能够有效鉴定33种PLEPA/DHA分子种类，还检测到大量EPA/DHA结构的缩醛磷脂，具有全面的检测范围和良好的检测清晰度。
表1磷虾油中检测到的每个PLEPA/DHA分子物种的化学结构和含量
实验例2：本实验例对空白样品和化学标准溶液的色谱图谱和保留时间进行比较，同时建立了系列浓度梯度下各磷脂类的校正曲线，用1/x的加权因子绘制峰面积与分析物浓度的关系图。结果如表2所示，对于每个磷脂标准品，校准曲线在LOQ到1000μg/mL的浓度范围内是线性的，平均相关系数为0.9978-0.9993，这表明峰面积(y)和磷脂浓度(x，μg/mL)呈良好的线性关系。采用标准添加法，分别根据3和10倍信噪比(S/N)确定被测物的方法检出限(LOD)和定量限(LOQ)，PLEPA/DHA的LOD≤4.02μg/mL，LOQ≤13.4μg/mL，结果表明本发明的检测方法具有较高的灵敏度，可用于磷虾油中PLEPA/DHA的筛选和定量。
在样品基质中添加磷脂标准品，制备成50μg/mL的加标样品，然后按照本发明的检测方法及检测条件进行精密度和回收率试验，结果表明，日内精密度的相对标准偏差≤4.71％，日间精密度的相对标准偏差≤6.24％，说明本发明检测方法检测PLEPA/DHA的结果准确、精密度高。将加标样品与以100％回收率的空白溶液制备的标准品进行比较，结果表明此方法可很好地回收EPA/DHA结构的PC，PE和PI，其回收率范围为78.9％至91.4％(RSD为2.99％-5.25％)。EPA和DHA结构的磷脂之间没有观察到显著差异。
表2前体离子扫描-液相色谱质谱联用法的线性、灵敏度、精密度和回收率的验证
实验例3：本实验例分别通过本发明的前体离子扫描-液相色谱质谱联用法与常规的液相色谱质谱法、鸟枪法和快速蒸发电离质谱法做对比试验。试验结果如表3所示，本发明的前体离子扫描-液相色谱质谱联用法可检测33种PLEPA/DHA分子种类，包括16种PCE/D，11种PEE/D和6种PIE/D。正相的液相色谱质谱法共检测到11个PCE/D，但由于体系是在正离子模式下，未发现PE和PI的磷脂种类。快速蒸发电离质谱法共检测到13种PLEPA/DHA分子，其中PCE/D或PEE/D各6种，PIE/D6种，PAE/D1种。鸟枪法共检测到15种PCE/D分子。通过上述可知，本发明所用的前体离子扫描-液相色谱质谱联用法相比其他方法，所检测到的PLEPA/DHA分子种类更多，并能够全面的检测到EPA和DHA结构的缩醛磷脂，在筛选复杂来源样品中的PLEPA/DHA方面具有较高的优越性。
Claims (8)
1.一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法，其特征在于,包括以下步骤：
①取每10g的磷虾粉，碾磨均匀后加入100～300mL的三氯甲烷-甲醇混合溶液中，于室温下振荡1～3分钟，得A提取液；
②对A提取液进行超声处理，使磷虾油从固体机制中释放，得b1混合物，再将b1混合物离心，收集下层有机相和离心后的残留物，得B有机相和C残留物；
③对C残留物用100～300mL的三氯甲烷重新提取多次，收集下层有机相，得D有机相；
④将B有机相和得D有机相混合后得e1萃取液，然后将e1萃取液吹干后用乙腈定容，然后过有机滤膜，得到E待测液；
⑤将E待测液通过前体离子扫描模式下的亲水作用液相色谱质谱联用法进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法，其特征在于，所述步骤②的具体步骤为：将A提取液于20kHz、130W条件下超声辅助提取10～20min，得b1混合物，然后在3～5℃下将b1混合物以8000g离心8～12min，得B有机相和C残留物。
3.根据权利要求1所述的一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法，其特征在于，所述步骤④的具体步骤为：将B有机相和得D有机相混合后得e1萃取液，然后在4℃的环境温度下用氮气流将e1萃取液吹干，然后再用1mL的乙腈定容，过0.22μm有机滤膜，得到E待测液。
4.根据权利要求1所述的一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法，其特征在于，所述步骤⑤中的液相色谱质谱法的液相色谱条件为：液相色谱柱为Cosmosil-HILIC色谱柱；进样量为2μL，色谱柱温度保持在30℃；流动相A是向20mmol的甲酸铵和20mmol的甲酸混合溶液中加入纯水并定容至1L得到；流动相B为配甲酸浓度为20mmol的甲酸乙腈溶液。
5.根据权利要求1所述的一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法，其特征在于，所述步骤⑤中液相色谱质谱法的液相色谱柱洗脱方法具体为：0～10min时，流动相B由95％均匀降至70％，10～15min时，流动相B由70％均匀降至50％，15～20min时，流动相B保持在50％。
6.根据权利要求1所述的一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法，其特征在于，所述步骤⑤中液相色谱质谱法的质谱测定方式具体为：以2μL的进样量将E待测液注入电喷雾电离源中，以负离子的方式进行前体离子扫描，EPA型结构磷脂和DHA型结构磷脂的产物离子分别设置为m/z301和m/z327。
7.根据权利要求1所述的一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法，其特征在于，所述步骤⑤中液相色谱质谱法的质谱条件具体为：在负离子模式下将离子喷雾电压设置在4500V，离子源温度保持在500℃；离子源气体中的气帘气、干燥气体和雾化器气体分别设置为35psi、50psi、60psi；质谱测量范围为m/z450～950，扫描速率为每个光谱1s；然后完成数据采集、处理和分析。
8.根据权利要求1所述的一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法，其特征在于，所述步骤⑤中液相色谱质谱法在对E待测液中的磷脂酰胆碱离子进行检测时，质谱条件中的碰撞电压为50eV，去簇电压为100eV；液相色谱质谱法在对E待测液中的磷脂酰乙醇胺离子进行检测时，质谱条件中的碰撞电压为40eV，去簇电压为100eV；液相色谱质谱法在对E待测液中的磷酯酰肌醇离子进行检测时，质谱条件中的碰撞电压为50eV，去簇电压为70eV。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010716191.7A CN111812248A (zh) | 2020-07-23 | 2020-07-23 | 一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010716191.7A CN111812248A (zh) | 2020-07-23 | 2020-07-23 | 一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111812248A true CN111812248A (zh) | 2020-10-23 |
Family
ID=72862380
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010716191.7A Pending CN111812248A (zh) | 2020-07-23 | 2020-07-23 | 一种有效筛选磷虾油中磷脂的分析检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111812248A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114019039A (zh) * | 2021-10-13 | 2022-02-08 | 温州医科大学附属第二医院（温州医科大学附属育英儿童医院） | 一种从血浆样本中选择性提取磷脂的方法及磷脂检测方法 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106153763A (zh) * | 2016-06-17 | 2016-11-23 | 浙江工商大学 | 刀额新对虾中磷脂的亲水色谱‑串联质谱检测方法 |
| CN106706814A (zh) * | 2017-02-13 | 2017-05-24 | 浙江工商大学 | 随机测定含epa链化合物的方法 |
| CN106831855A (zh) * | 2017-01-21 | 2017-06-13 | 浙江工商大学 | 96孔板固相萃取南极磷虾中磷脂酰胆碱的方法 |
| CN107632095A (zh) * | 2017-09-19 | 2018-01-26 | 中山大学 | 一种作物糖脂和磷脂的检测方法 |
| CN108828051A (zh) * | 2018-07-04 | 2018-11-16 | 浙江工商大学 | 快速蒸发离子化质谱的南极磷虾油的脂质实时检测方法 |
| CN108918725A (zh) * | 2018-08-31 | 2018-11-30 | 浙江工商大学 | 有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法 |
| CN109406687A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-03-01 | 清华大学 | 一种高通量检测双磷脂的方法 |
| CN109971539A (zh) * | 2019-03-18 | 2019-07-05 | 浙江工商大学 | 一种用于金枪鱼副产物的磷脂及鱼油提取方法 |
-
2020
- 2020-07-23 CN CN202010716191.7A patent/CN111812248A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106153763A (zh) * | 2016-06-17 | 2016-11-23 | 浙江工商大学 | 刀额新对虾中磷脂的亲水色谱‑串联质谱检测方法 |
| CN106831855A (zh) * | 2017-01-21 | 2017-06-13 | 浙江工商大学 | 96孔板固相萃取南极磷虾中磷脂酰胆碱的方法 |
| CN106706814A (zh) * | 2017-02-13 | 2017-05-24 | 浙江工商大学 | 随机测定含epa链化合物的方法 |
| CN107632095A (zh) * | 2017-09-19 | 2018-01-26 | 中山大学 | 一种作物糖脂和磷脂的检测方法 |
| CN108828051A (zh) * | 2018-07-04 | 2018-11-16 | 浙江工商大学 | 快速蒸发离子化质谱的南极磷虾油的脂质实时检测方法 |
| CN108918725A (zh) * | 2018-08-31 | 2018-11-30 | 浙江工商大学 | 有效鉴别不同种类中华鳖的分析检测方法 |
| CN109406687A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-03-01 | 清华大学 | 一种高通量检测双磷脂的方法 |
| CN109971539A (zh) * | 2019-03-18 | 2019-07-05 | 浙江工商大学 | 一种用于金枪鱼副产物的磷脂及鱼油提取方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 崔益玮 等: "直接进样串联质谱法快速筛查水产副产物中ω-3脂肪酸链磷脂", 《食品科学》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114019039A (zh) * | 2021-10-13 | 2022-02-08 | 温州医科大学附属第二医院（温州医科大学附属育英儿童医院） | 一种从血浆样本中选择性提取磷脂的方法及磷脂检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pilařová et al. | Recent developments in supercritical fluid chromatography–mass spectrometry: is it a viable option for analysis of complex samples? | |
| Lísa et al. | Lipidomic profiling of biological tissues using off-line two-dimensional high-performance liquid chromatography–mass spectrometry | |
| Cajka et al. | Comprehensive analysis of lipids in biological systems by liquid chromatography-mass spectrometry | |
| CN106153763B (zh) | 刀额新对虾中磷脂的亲水色谱-串联质谱检测方法 | |
| Knittelfelder et al. | A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling | |
| Brouwers | Liquid chromatographic–mass spectrometric analysis of phospholipids. Chromatography, ionization and quantification | |
| Zhao et al. | Measurement of phospholipids by hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry: the determination of choline containing compounds in foods | |
| Peterson et al. | A review of chromatographic methods for the assessment of phospholipids in biological samples | |
| Fauland et al. | A comprehensive method for lipid profiling by liquid chromatography-ion cyclotron resonance mass spectrometry | |
| Han et al. | Factors influencing the electrospray intrasource separation and selective ionization of glycerophospholipids | |
| Serna et al. | Quantitative lipidomic analysis of plasma and plasma lipoproteins using MALDI-TOF mass spectrometry | |
| Ferreiro-Vera et al. | Comparison of sample preparation approaches for phospholipids profiling in human serum by liquid chromatography–tandem mass spectrometry | |
| McLaren et al. | An ultraperformance liquid chromatography method for the normal-phase separation of lipids | |
| Fernandes et al. | Direct characterization of commercial lecithins by easy ambient sonic-spray ionization mass spectrometry | |
| Narváez-Rivas et al. | Off-line mixed-mode liquid chromatography coupled with reversed phase high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry to improve coverage in lipidomics analysis | |
| Jin et al. | Zwitterionic hydrophilic interaction solid-phase extraction and multi-dimensional mass spectrometry for shotgun lipidomic study of Hypophthalmichthys nobilis | |
| Fauland et al. | An improved SPE method for fractionation and identification of phospholipids | |
| Bang et al. | On-line two-dimensional capillary strong anion exchange/reversed phase liquid chromatography–tandem mass spectrometry for comprehensive lipid analysis | |
| US9568454B2 (en) | Methods of separating lipids | |
| CN112739441A (zh) | 用于脂质定量的***和方法 | |
| CN104267120B (zh) | 检测山药块茎内源激素的超高效液相色谱-串联质谱法 | |
| CN108828051B (zh) | 快速蒸发离子化质谱的南极磷虾油的脂质实时检测方法 | |
| Sandra et al. | Evaluation of micro-pillar array columns (µPAC) combined with high resolution mass spectrometry for lipidomics | |
| Li et al. | Simultaneous structural identification of diacylglyceryl‐N‐trimethylhomoserine (DGTS) and diacylglycerylhydroxymethyl‐N, N, N‐trimethyl‐β‐alanine (DGTA) in microalgae using dual Li+/H+ adduct ion mode by ultra‐performance liquid chromatography/quadrupole time‐of‐flight mass spectrometry | |
| Li et al. | Analysis of phospholipids in Schizochytrium sp. S31 by using UPLC-Q-TOF-MS |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201023 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |