CN112782266A - 鉴定新鲜肉制品和冻融肉制品的方法 - Google Patents

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杨敏莉
何启川
刘通
汤丽华
李银龙
贺木易
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Abstract

本发明公开了一种鉴定新鲜肉制品和冻融肉制品的方法。该方法包括：对待测肉制品进行气溶胶化处理，以便得到所述待测肉制品的气溶胶；将所述气溶胶进行离子化处理，以便得到离子化待测物；利用质谱对所述离子化待测物进行检测并利用高分辨飞行时间质谱采集质谱数据，基于所述质谱数据确定所述待测肉制品是新鲜肉制品还是冻融肉制品。该方法分析速度快、准确性高，无需参照物。

Description

鉴定新鲜肉制品和冻融肉制品的方法
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体地，涉及鉴定新鲜肉制品和冻融肉制品的方法。
背景技术
肉类人们膳食结构中主要的组成部分，肉类可以提供高质量的蛋白质和必需营养素，例如必需氨基酸，不饱和脂肪酸，矿物质和维生素。通常，肉的物理特性，化学成分，营养成分，微生物状况和感官特性会影响肉的质量。冷冻是贮藏牛肉最方便、最有效的方法之一，然而由于冷链物流技术不完善，使得新鲜肉在运输、贮藏、加工和消费过程中出现反复冻融，反复冻融会引起冻结肌肉中冰晶融化后重结晶现象的发生，致使冰晶数量减少但单个冰晶体积增大，刺破细胞膜结构，损伤细胞组织结构，加速脂肪氧化和蛋白变性,肌肉经反复冻融不仅会使营养物质流失，肌肉品质下降。当前，尽管新鲜肉的成本较高，但许多消费者还是宁愿购买新鲜肉而不是冷冻-解冻的肉。部分商家经常在产品包装、标签、宣传上混淆概念，用解冻的肉来替代新鲜肉出售是一种不公平的竞争行为，不仅损害了消费者利益，也可能会导致食品安全问题。由于新鲜肉和冻融肉在形状、外观、颜色和纹理等方面相似，所以很难用肉眼将其区分开来。到目前为止，关于区分新鲜肉和冻融肉已进行了许多研究。人们已经对各种生化技术给予了极大的关注，其中β-羟酰基辅酶A脱氢酶(HADH)方法是最广泛用于区分新鲜肉和冻融肉的一种方法。也已经报道了基于DNA技术的方法，包括实时聚合酶链反应(RT-PCR)和中性彗星试验。近年来，与化学计量学结合的光谱技术广受关注，例如，F.Huang等利用近红外光谱技术结合主成分分析和神经网络模型来鉴别冷鲜猪肉和冻融猪肉。然而，这些技术中的大多数具有明显的缺点，例如耗时，成本高以及对样品具有破坏性。大多数正确识别的前提是从相同来源获取两个样品(新鲜和冻融后的样品)并在相同条件下同时进行分析。但是，肉类真实性测试中的一个问题是，通常没有新鲜的肉样品可与被测试的肉进行比较。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种鉴定新鲜肉制品和冻融肉制品的方法，该方法无需样品制备、分析速度快、准确性高，无需参照物。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种鉴定新鲜肉制品和冻融肉制品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：对待测肉制品进行气溶胶化处理，以便得到所述待测肉制品的气溶胶；将所述气溶胶进行离子化处理，以便得到离子化待测物；利用质谱对所述离子化待测物进行检测并利用高分辨飞行时间质谱采集质谱数据，基于所述质谱数据确定所述待测肉制品是新鲜肉制品还是冻融肉制品。
根据本发明实施例的鉴定新鲜肉制品和冻融肉制品的方法，通过将待测肉制品气溶胶化，无需样品前处理即可进行检测；通过离子化处理化处理，使待测物离子化，直接进入质谱***进行检测，分析速度快、灵敏度高、准确性高，无需参照物。
另外，根据本发明上述实施例的鉴定新鲜肉制品和冻融肉制品的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，利用智能电刀(iKnife)进行所述气溶胶化处理。
根据本发明的实施例，所述智能电刀切割的单次总离子流强度不低于1×107。
根据本发明的实施例，所述智能电刀切割的流速为90-120μl/min，切割功率为10-30W，优选地，流速为110μl/min，切割功率为20W。
根据本发明的实施例，所述智能电刀切割的长度为0.5-0.7cm，深度为3-5mm，持续时间为3-5秒。
根据本发明的实施例，所述质谱的检测条件为：扫描时间：0.5秒；扫描范围为m/z50-1200；负电离模式。
根据本发明的实施例，所述质谱的检测的辅助溶剂为含有亮氨酸脑啡肽的异丙醇溶液。
根据本发明的实施例，所述亮氨酸脑啡肽的浓度为0.5ng/μl。
根据本发明的实施例，所述辅助溶剂的流速为110μl/min。
根据本发明的实施例，所述质谱数据为质谱指纹图谱数据。
根据本发明的实施例，基于主成分分析法(Principal component analysis,PCA)和线性判别分析(Linear discriminate analysis,LDA)法，对所述质谱指纹图谱数据进行统计分析，确定所述待测肉制品是新鲜肉制品还是冻融肉制品。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例内标流速优化的示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的新鲜牛肉与冻融1次、冻融2次、冻融3次、冻融4次建立的统计模型示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的新鲜牛肉与冻融1次建立的二级统计模型示意图；
图4显示了根据本发明一个实施例的未知样品实时识别结果示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种鉴定新鲜肉制品和冻融肉制品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：对待测肉制品进行气溶胶化处理，以便得到所述待测肉制品的气溶胶；将所述气溶胶进行离子化处理，以便得到离子化待测物；利用质谱对所述离子化待测物进行检测并利用高分辨飞行时间质谱采集质谱数据，基于所述质谱数据确定所述待测肉制品是新鲜肉制品还是冻融肉制品。
根据本发明实施例的鉴定新鲜肉制品和冻融肉制品的方法，通过将待测肉制品气溶胶化，无需样品前处理即可进行检测；通过离子化处理化处理，使待测物离子化，直接进入质谱***进行检测，分析速度快、灵敏度高、准确性高，无需参照物。(根据本发明实施例的鉴定新鲜肉制品和冻融肉制品的方法，
根据本发明的实施例，利用智能电刀(进行所述气溶胶化处理。例如，智能电刀可以是iKnife。由此，电刀直接切割肉制品即可直接产生气溶胶，无需样品前处理。
根据本发明的实施例，该智能电刀切割的单次总离子流强度不低于1×107。由此，数据质量充足，结果稳定，检测结果的准确性高。
根据本发明的实施例，该智能电刀切割的流速为90-120μl/min，切割功率为10-30W，优选地，流速为110μl/min，切割功率为20W。由此，上述以上述功率进行切割，切割顺畅、切口不产生焦糊现象
根据本发明的实施例，该智能电刀切割的长度为0.5-0.7cm，深度为3-5mm，持续时间为3-5秒。由此，该切割条件保证离子化效率较高。
根据本发明的实施例，该质谱的检测条件为：扫描时间：0.5秒；扫描范围为m/z50-1200；负电离模式。由此，对肉类检测的准确度高，请发明人确认并补充技术效果。
根据本发明的实施例，该质谱的检测的辅助溶剂为含有亮氨酸脑啡肽的异丙醇溶液。由此，质谱信号稳定，易于离子化，正负离子模式下都能用。
根据本发明的实施例，该亮氨酸脑啡肽的浓度为0.5ng/μl。由此，质谱易于检测到亮氨酸脑啡肽的信号。
根据本发明的实施例，该辅助溶剂的流速为110μl/min。由此，质谱峰的响应值高特征离子的峰面积更大。
根据本发明的实施例，该质谱数据为质谱指纹图谱数据。由此，基于指纹图谱数据可以准确简单肉制品是否冻融，无需对照品。
根据本发明的实施例，基于主成分分析法(Principal component analysis,PCA)和线性判别分析(Linear discriminate analysis,LDA)法，对所述质谱指纹图谱数据进行统计分析，确定所述待测肉制品是新鲜肉制品还是冻融肉制品。具体地，可以采用亮氨酸脑啡肽(m/z 554.262)作为质量数校正内标，结合总离子流图对数据结果进行归一化处理。应用Live ID对肉制品样本质谱图进行峰匹配、滤噪、中心化、质量校准，选取信噪比大于10的信号峰，然后基于主成分分析法(Principal component analysis,PCA)和线性判别分析(Linear discriminate analysis,LDA)法，对所述质谱指纹图谱数据进行统计分析，确定该待测肉制品是新鲜肉制品还是冻融肉制品。
在此，为了便于理解本发明实施例的鉴定新鲜肉制品和冻融肉制品的方法，在此提供一种鉴定新鲜肉制品和冻融肉制品的一般方法，包括：
(1)将肉样品放置于铺了一层锡箔纸的导电板上，使用iKnife电刀切肉样品表面，形成气溶胶，所述气溶胶由文丘里泵氮气驱动，经PTFE管引入质谱端口后采用正交方式与辅助溶剂混合形成喷雾，喷雾中的小微粒KanthalA1灯丝碰撞，使小微粒中的分子离子化，待测离子进入质谱仪由质量分析器检测；质谱仪扫描时间为0.5秒，扫描范围为m/z50-1200；以负电离模式采集数据，采集牛肉样品质谱原始数据。
其中，辅助溶剂为含有亮氨酸脑啡肽的异丙醇溶液，经针泵注射进样器引入端口其中，亮氨酸脑啡肽的浓度为0.5ng/μl，辅助溶剂的流速为110μl/min。
所述iKnife电刀的工作电压为15-40V，所述iKnife电刀切割牛肉表面的切割长度为0.5-0.7cm，切割深度为3-5mm，持续时间为3-5秒，每次切割的总离子流强度均高于107。
(2)根据步骤(1)对新鲜和不同冻融次数进行分析牛肉样品，每一种样品重复分析多次，例如，可以是十次，获得每次分析的质谱原始数据；冻融次数可以根据需要进行设置，例如，可以分别为冻融1次、冻融2次、冻融3次和冻融4次。
(3)将所有样品的质谱原始数据经Live ID软件进行峰匹配、滤噪、中心化、质量处理，获得所有肉样品的质谱指纹图谱数据；
(4)将获得所有肉样品的质谱指纹图谱数据导入数据统计Live ID软件，采用主成分分析(Principal component analysis,PCA)结合线性判别分析(Linear discriminateanalysis,LDA)方法，根据新鲜肉类样本和不同冻融次数肉类样本构建统计模型。
(5)选取响应最高的几个离子优化内标流速和切割功率，例如，可以选取6个离子，内标最优流速为90-120μl/min，切割功率最优为10-30W。每次切割的总离子流强度应不低于1×10-7，以保证数据质量充足，结果稳定。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。
实施例1
利用本发明实施例的鉴定新鲜肉制品和冻融肉制品的方法，对牛肉进行检测，具体如下：
1.1试剂与仪器
Synapt G2 Si飞行时间质谱仪，配有iKnife手持采样装置(美国Waters公司)；Pumpll elite针泵注射进样器(美国Harvard公司)；Milli Q超纯水处理***(美国Millipore公司)；Masslynx4.1数据采集软件、Live ID统计分析软件(美国Waters公司)。甲醇、异丙醇(色谱纯，美国Merck公司)；亮氨酸脑啡肽(美国Waters公司)，Millipore超纯水仪制备的超纯水作为实验用水。
1.2样本的采集与制备
从当地牛肉交易市场购买新鲜的牛背最长肌，于实验室进行分割，去除脂肪和***后置于聚乙烯自封袋中，随后于-20℃冰箱储存。新鲜肉不做冻融处理，将牛肉在-20℃条件下冷冻72小时，随后转移到4℃冰箱中解冻12小时为1次冻融循环，本实施例一共做了5次冻融循环。每次冻融循环精确称量3g牛肉并制备8个平行样本，使用30ml(甲醇/水，9:1)进行均质提取，均质5mins，转速8000rpm。均质后离心15mins，转速10000rpm,离心后取上清液2ml再次离心15mins，转速14000rpm。之后过0.22μm微孔滤膜保存在进样小瓶中，所有的样本均储存在-80℃冰箱中集中进样。
1.3质谱条件
使用iKnife电刀切割牛肉样品表面，切割长度为0.5-0.7cm，切割深度为3-5mm，持续时间为3-5秒，每次切割的总离子流强度应不低于1×107，生成含有大量复杂离子混合物的气溶胶，该气溶胶由文丘里泵泵氮气驱动，经PTFE管引入质谱端口后采用正交方式与辅助溶剂(含亮氨酸脑啡肽(0.5μg/ml)的异丙醇溶液)混合形成喷雾，喷雾中的小微粒与KanthalA1灯丝(1.1Ω，3V，500℃)碰撞，使小微粒中的分子离子化，随后待测离子进入质谱仪检测分析。含亮氨酸脑啡肽的异丙醇溶液为辅助溶液，经针泵进样以0.11ml/min的流速引入质谱，iKnife切割电压设置为20W，质谱仪扫描时间：1秒；扫描范围：100-1200m/z；所有数据均以负电离模式采集。
1.3数据分析
采用亮氨酸脑啡肽(m/z 554.262)作为质量数校正内标，结合总离子流图对数据结果进行归一化处理。应用Live ID对牛肉样本质谱图进行峰匹配、滤噪、中心化、质量校准，选取信噪比大于10的信号峰，采用主成分分析(PCA)结合线性判别分析(LDA)构建模型。同时将采集的数据分为新鲜组、冻融1次组、冻融2次组、冻融3次组、冻融4次组，从而对鲜样品和不同冻融次数样品进行分类。
2.结果与讨论
2.1质谱扫描参数优化
iKnife切割电压分别设置为15、20、25、30、35、40V，终选取切割顺畅、切口不产生焦糊现象的20V为优选电压。含有亮氨酸脑啡肽的异丙醇溶液流速分别设置为50、70、90、110、130μl/min,选择响应较强的m/z：279.23、281.24、681.49、699.50、726.53、863.56的峰面积进行优化，如图1所示，选取110μl/min为优选流速。
2.2 REIMS结合化学计量学建立新鲜牛肉和不同冻融次数牛肉的统计分析模型
对新鲜和冻融1次、冻融2次、冻融3次、冻融4次牛肉样品(各10块)进行检测，每一种样品重复分析十次，将采集的质谱图导入Live ID软件，选取信噪比大于10的信号峰，对新鲜样本和不同冻融次数的样本建立PCA-LDA模型。统计分析模型见图2，从图中可见，除了新鲜样本与冻融1次样本有部分重叠，但与其他冻融次数组有明显的区分。
2.3 REIMS结合化学计量学建立新鲜牛肉样本和冻融1次牛肉样本的统计分析模型
为了进一步可以明显区分新鲜样本和冻融1次样本，将采集的新鲜样本和冻融1次样本的质谱图导入Live ID软件，选取信噪比大于10的信号峰，对新鲜样本和冻融1次的样本建立PCA-LDA模型。统计分析模型见图3，如图所示，新鲜样本与冻融1次样本区分明显。
2.4模型识别验证
采用Live ID软件对新鲜样品、冻融1次、冻融2次、冻融3次、冻融4次共60个样的494个数据进行模型评价，开展五重交叉模式分析，将每组数据随机分为5组，选取其中4组建模，用剩余的1组数据进行测试，重复模拟测试5次，以确定模型的预测精度，识别正确率为97.77％，结果列于表1和表2。
表1模型识别结果
谱图数 通过数 失败数 异常数 正确性得分
494 483 11 0 97.77％
表2各个样本组之间识别结果
新鲜 冻融1次 冻融2次 冻融3次 冻融4次 异常数 总共
新鲜 93 4 0 0 0 0 97
冻融1次 2 90 0 0 0 0 92
冻融2次 0 1 102 1 0 0 104
冻融3次 2 1 0 97 0 0 100
冻融4次 0 0 0 0 101 0 101
2.5实时鉴定结果
在相同的牛羊肉交易市场获得相同品种、相同部位的新鲜牛肉样本，使用相同采集条件进行采集，同样地，将采集的质谱图导入Live ID软件，选取信噪比大于10的信号峰进行实时鉴定，结果如图4所示，新鲜样本识别率达到97.11％-99.96％，证明模型有很好的实用性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种鉴定新鲜肉制品和冻融肉制品的方法，其特征在于，包括：
对待测肉制品进行气溶胶化处理，以便得到所述待测肉制品的气溶胶；
将所述气溶胶进行离子化处理，以便得到离子化待测物；
利用质谱对所述离子化待测物进行检测并利用高分辨飞行时间质谱采集质谱数据，基于所述质谱数据确定所述待测肉制品是新鲜肉制品还是冻融肉制品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用智能电刀进行所述气溶胶化处理。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述智能电刀切割的单次总离子流强度不低于1×107。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述智能电刀切割的流速为90-120μl/min，切割功率为10-30W，优选地，流速为110μl/min，切割功率为20W。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述智能电刀切割的长度为0.5-0.7cm，深度为3-5mm，持续时间为3-5秒。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱的检测条件为：
扫描时间：0.5秒；
扫描范围为m/z50-1200；
负电离模式。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述质谱的检测的辅助溶剂为含有亮氨酸脑啡肽的异丙醇溶液，
任选地，所述亮氨酸脑啡肽的浓度为0.5ng/μl。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述辅助溶剂的流速为110μl/min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱数据为质谱指纹图谱数据。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，基于主成分分析法和线性判别分析法，对所述质谱指纹图谱数据进行统计分析，确定所述待测肉制品是新鲜肉制品还是冻融肉制品。
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