CN108794771A - 双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶及其制备与应用 - Google Patents

双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶及其制备与应用，其中制备方法包括以下步骤：(1)将纤维素溶液、丝素蛋白溶液、环氧氯丙烷混合均匀，搅拌条件下使之交联得到交联溶液；(2)将交联溶液离心脱气泡后倒入模具中，反应固化后得到低密度化学交联纤维素/丝素蛋白水凝胶；(3)将得到的纤维素/丝素蛋白水凝胶放置于二氧化碳培养箱中进行气氛物理交联；(4)用流水冲洗，即可得到双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶。本发明通过调节纤维素与丝素蛋白的比例，可获得具有不同力学强度和亲疏水性的水凝胶。实验结果表明，这类双网络交联高强度水凝胶具有良好的细胞相容性和血液相容性，在组织工程领域具有较大的应用潜力。

Description

双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶及其制备与应用
技术领域
本发明属于高分子化学与物理领域和组织工程的交叉领域，更具体地，涉及一种双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
随着生命科学的发展，先进生物材料如水凝胶、复合海绵、纳米微球等不断问世，为解决临床问题提供了新的方案。水凝胶是指一类由物理或化学交联方式形成的具有三维网络结构的聚合物体系(Adv.Mater.,2017,29,1700321)。目前，用于制备水凝胶的原料主要包括纤维素、壳聚糖、胶原等天然高分子和聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙内酯等合成高分子(Biomacromolecules.,2018,4,1356-1364；Adv.Funct.Mater.,2017,27,1606497)。天然高分子水凝胶因其具有较高的含水量和保水能力，以及特定的微观结构和原料的生物活性(Biomaterials.,2017,122,34-37)，在皮肤组织工程、骨组织工程以及药物释放载体等医药领域展现出广阔的应用前景。在实际应用中，水凝胶应当具有与人体组织相匹配的力学强度。然而，水凝胶普遍具有质软、易破碎等缺点(ACS.Nano.,2017,11,2554-2560)，提升水凝胶的力学性能受到了研发人员的密切关注。
纤维素是世界上分布最广泛的天然高分子材料，具有储量丰富、可自然降解、无细胞毒性以及加工性能好等优点。专利号200810197646.8的发明专利制备了一种环氧氯丙烷交联的纤维素水凝胶，其交联剂的过量使用导致水凝胶交联密度过大，其压缩强度仅数十KPa。专利号CN 107417934A公布了一种高强、高韧纤维素水凝胶，它是先采用少量环氧氯丙烷反应得到低化学交联密度的纤维素水凝胶，然后在酸性水溶液中浸泡进行快速物理交联。实验结果表明，所获得的水凝胶压缩强度达到了MPa级，缺点是纤维素水凝胶生物活性差，力学性能不易调控，且酸性试剂的使用可能加重环境污染。
丝素蛋白是天然蚕丝纤维的主要成分之一，具有良好的水溶性、细胞相容性、血液相容性和低免疫原性(Acta.Biomaterialia.,2016,31,1-16)。丝素蛋白的多肽链中含有多种化学活性基团和细胞活性因子，如细胞黏附因子RGD等，因而具有一定的生物活性。研究结果表明，丝素蛋白的降解产物有利于皮肤、牙周和肝脏组织再生(Prog.Polym.Sci.,2014,39,251-267)同时目前，丝素蛋白已经在生物反应器、组织工程器官和药物缓释载体等领域取得了良好的应用效果。
目前还未见到有关制备纤维素与丝素蛋白高强度水凝胶的报道。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶及其制备与应用，该方法以纤维素和丝素蛋白为主要原料，溶解于氢氧化钠/尿素溶液中，经共混，低密度化学交联，CO2气氛交联和冲水等工艺制备成双网络交联高强度水凝胶。
本发明选用纤维素和丝素蛋白为主要原料，不仅有效地解决了纯高强度纤维素水凝胶生物活性不好的难题，而且实现了力学强度的简便调控。通过改变丝素蛋白的含量可以调整高强度水凝胶的力学强度，进而满足人体不同组织器官对水凝胶力学强度的需求。本发明采用CO2气氛交联的方法对低密度化学交联的水凝胶进行二级物理交联，与现有技术如浸泡乙醇或酸性溶液相比，具有反应条件温和、成型性好、对环境无污染等优势。所获得的双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶具有可调节的压缩强度、亲疏水性以及优良的细胞相容性和血液相容性，非常有潜力应用于组织工程领域。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将纤维素溶液、丝素蛋白溶液、环氧氯丙烷混合均匀，搅拌条件下使之交联得到交联溶液；
(2)将所述步骤(1)得到的交联溶液离心脱气泡后倒入模具中，反应固化后得到低密度化学交联纤维素/丝素蛋白水凝胶；
(3)将所述步骤(2)得到的纤维素/丝素蛋白水凝胶放置于二氧化碳培养箱中进行气氛物理交联；
(4)将所述步骤(3)得到的纤维素/丝素蛋白水凝胶用流水冲洗，得到双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶。
优选的，所述步骤(1)中，所述纤维素溶液是通过以下方法制备得到的：将7重量份的氢氧化钠和12重量份的尿素共同溶解在81重量份的去离子水中，得到氢氧化钠/尿素溶液，再将纤维素和该氢氧化钠/尿素溶液分别预冷至-12℃然后混合，剧烈搅拌直至溶解即可得到纤维素溶液。
优选的，所述丝素蛋白溶液是通过以下方法制备得到的：将7重量份的氢氧化钠和12重量份的尿素共同溶解在81重量份的去离子水中，得到氢氧化钠/尿素溶液，再将丝素蛋白与该氢氧化钠/尿素溶液混合后机械搅拌直至完全溶解即可得到丝素蛋白溶液。
优选的，所述步骤(1)得到的交联溶液中，纤维素的质量分数为1.5～4.0％，丝素蛋白的质量分数为0～2.0％，环氧氯丙烷的质量分数为0.5-10％。
优选的，所述步骤(1)中，所述交联是在室温下进行的，交联时间为5-15min。
优选的，所述步骤(2)中，所述离心脱气泡条件为1500-3000rpm离心5-10min；
优选的，所述步骤(4)中，所述用流水冲洗具体是用去离子水冲洗48h以上。
优选的，所述步骤(2)中，所述反应固化条件为室温下静置4-24h。
优选的，所述步骤(3)中，所述物理交联是在室温下、于CO2气体浓度为3-30vol％的含CO2气氛下处理2-12h。
按照本发明的另一方面，本发明提供了利用上述制备方法制备得到的双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶。
按照本发明的又一方面，本发明提供了上述双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶的应用，其特征在于，应用于组织工程领域。
本发明所获得的双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶中，通过调节纤维素和丝素蛋白的质量比可得到不同的压缩强度和亲疏水性。
体外细胞毒性实验和溶血实验表明，本发明纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶具有良好的细胞相容性和血液相容性。因此，本发明在组织工程领域具有一定的应用潜力。
本发明具有如下优点和有益效果：(1)联合使用低密度化学交联和CO2气氛交联显著的提高了水凝胶的力学强度；(2)通过加入丝素蛋白提高了水凝胶的生物活性，实现了水凝胶力学强度和亲疏水性的简便调控；(3)CO2气氛交联与浸泡乙醇和酸性溶剂相比反应条件更温和，凝胶成型性更好，环境污染更小(4)所获得的纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶具有良好的细胞相容性和血液相容性，非常有潜力应用于组织工程领域。
附图说明
图1是对比例1和实施例1所获得的双网络交联高强度水凝胶压缩测试的结果。
图2是对比例1和实施例1所获得的双网络交联高强度水凝胶水接触角测定实验的结果。
图3是对比例1和实施例1所获得的双网络交联高强度水凝胶体外细胞毒性实验的结果。
图4是对比例1和实施例1所获得的双网络交联高强度水凝胶溶血实验的结果，其中，DS代表蒸馏水(distilled water)，NS代表生理盐水(normal saline)。
图5是本发明双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶制备流程的示意图，自左向右、自上而下分别对应为共混、低密度化学交联、气氛交联、冲水。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
如图5所述，本发明中双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶的制备方法概括来说，是将纤维素、丝素蛋白单独的分别溶解于氢氧化钠/尿素溶液中，经共混、低密度化学交联、CO2气氛交联以及冲水等工艺制备得到双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶。
对比例1
将7g氢氧化钠和12g尿素溶于81g去离子水中，得到氢氧化钠/尿素溶液。将纤维素和氢氧化钠/尿素溶液分别预冷至-12℃，混合后剧烈搅拌4min，得到质量分数为2.5％的纤维素溶液。向上述溶液中逐滴加入占纤维素溶质总质量100％的环氧氯丙烷，继续搅拌交联15min，在2000rpm的条件下离心10min后将交联溶液倒入模具中，室温下静置，反应固化12h，然后转移至5vol％CO2培养箱中继续交联6h，用去离子水冲洗48h后得到双网络交联纤维素高强度水凝胶。
实施例1
将7g氢氧化钠和12g尿素溶于81g去离子水中，得到氢氧化钠/尿素溶液。将纤维素和氢氧化钠/尿素溶液分别预冷至-12℃，混合后剧烈搅拌4min，得到质量分数为3％的纤维素溶液。将丝素蛋白溶于氢氧化钠/尿素溶液中得到质量分数为10％的丝素蛋白溶液。将纤维素溶液和丝素蛋白溶液按照一定的比例混合均匀，然后向其中加入少量氢氧化钠/尿素溶液调整纤维素的质量分数为2.5％，丝素蛋白的质量分数依次为0.5％,1％,1.5％。向上述的混合溶液中加入占纤维素和丝素蛋白溶质总质量100％的环氧氯丙烷，继续搅拌交联15min，在2000rpm的条件下离心10min后将交联溶液倒入模具中，室温下静置，反应固化12h，然后转移至5％CO2培养箱中继续交联6h，用去离子水冲洗48h后得到双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶。CCS-0，CCS-0.5,CCS-1,CCS-1.5分别代表水凝胶中丝素蛋白的最终质量分数分别为0％、0.5％、1％和1.5％。CCS-0即对应对比例1的产物。
实施例2
将对比例1和实施例1所获得的双网络交联高强度水凝胶切割成直径为10mm，高度为8mm的圆柱体。采用万能材料试验机检测水凝胶的压缩强度，压缩速率为2mm/min。
图1是对比例1和实施例1所获得的双网络交联高强度水凝胶压缩测试的结果，如图所见，CCS-0，CCS-0.5，CCS-1，CCS-1.5的压缩强度分别为2.51MPa,1.58MPa，0.91MPa和0.55MPa，表明本发明制备的水凝胶具有良好的力学强度。随着丝素蛋白含量的增加，水凝胶的力学强度明显下降，各组之间均具有统计学差异(P<0.05)。通过控制丝素蛋白的含量可以简便的调控高强度水凝胶的力学强度，从而在实际应用中满足不同组织器官对水凝胶力学强度的需求。
实施例3
将对比例1和实施例1所获得的双网络交联高强度水凝胶放置于60℃烘箱中干燥24h,然后剪成1cm×1cm大小的样品粘贴于载玻片上。采用水接触角测量仪测定凝胶表面的亲疏水性。
图2是对比例1和实施例1所获得的双网络交联高强度水凝胶水接触角测定实验的结果。如图2所示，CCS-0,CCS-0.5,CCS-1,CCS-1.5的水接触角分别为53.8°，64.7°，85.8°，115.8°。随着丝素蛋白含量的增加，水凝胶亲水性能逐渐减弱，实现了由亲水性到疏水性的转变。细胞在材料表面的黏附能力与材料的亲疏水性具有显著的相关性，针对不同组织来源的细胞应酌情增减丝素蛋白的含量。
实施例4
将对比例1和实施例1所获得的双网络交联高强度水凝胶烘干后剪成粉末，高压灭菌后浸泡在α-DMEM培养基中。每0.05g粉末加1mL培养基，37℃孵育72h，过滤后得到水凝胶的浸提液。采用体外细胞毒性实验(MTT法)检测水凝胶的细胞相容性。将小鼠成纤维细胞(L929)接种于96孔板中，接种密度为1×103细胞/孔。常规培养24h后弃去培养基，加入200μL材料浸提液，继续培养24，48和72h.用α-DMEM培养L929作为阴性对照，空白培养板作为空白对照。向每孔中加入20μL噻唑蓝(MTT)试剂。继续培养4小时后，将培养板内的液体全部弃去，每孔加入150μL二甲亚砜(DMSO)，避光震荡10min后，采用多功能酶标仪检测其在490nm波长处的吸光度。经统计分析得到L929的细胞增殖率。
图3是对比例1和实施例1所获得的双网络交联高强度水凝胶体外细胞毒性实验的结果。如图所见,对照组的细胞增殖率设定为100％，与对照组相比，CCS-0，CCS-0.5,CCS-1,CCS-1.5的细胞增殖率在第1-3天均显著大于80％，展现出良好的细胞相容性。
实施例5
将对比例1和实施例1获得的双网络交联高强度水凝胶剪成1cm×1cm的样品放入15mL离心管中，用生理盐水漂洗3次，每次30min。向每支离心管中加入10mL生理盐水，37℃恒温水浴30min，接着加入全血与生理盐水质量比为1:1.25的稀释全血0.2mL混匀，37℃恒温水浴60min，于1500rpm下离心10min。用10mL蒸馏水稀释0.2mL全血为阳性对照，10mL生理盐水稀释0.2mL全血为阴性对照。最后用多功能酶标仪检测上清液在545nm波长处的吸光度。经统计分析得到溶血率。
图4是对比例1和实施例1所获得的双网络交联高强度水凝胶溶血率的结果。如图所见，血液在去离子水中的溶血率定义为100％，在生理盐水中的溶血率定义为0％。CCS-0,CCS-0.5,CCS-1,CCS-1.5的溶血率分别为0.12％,2.66％,0.11％和1.20％,均显著低于美国药典规定的5％溶血率(P<0.05)。上述的实验结果表明：本发明双网络交联高强度水凝胶符合医疗器材溶血性能的一般要求。
本发明通过共混形成的交联溶液中，优选将纤维素与丝素蛋白的质量比控制为5:0到5:3。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将纤维素溶液、丝素蛋白溶液、环氧氯丙烷混合均匀，搅拌条件下使之交联得到交联溶液；
(2)将所述步骤(1)得到的交联溶液离心脱气泡后倒入模具中，反应固化后得到低密度化学交联纤维素/丝素蛋白水凝胶；
(3)将所述步骤(2)得到的纤维素/丝素蛋白水凝胶放置于二氧化碳培养箱中进行气氛物理交联；
(4)将所述步骤(3)得到的纤维素/丝素蛋白水凝胶用流水冲洗，得到双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶。
2.如权利要求1所述双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述纤维素溶液是通过以下方法制备得到的：将7重量份的氢氧化钠和12重量份的尿素共同溶解在81重量份的去离子水中，得到氢氧化钠/尿素溶液，再将纤维素和该氢氧化钠/尿素溶液分别预冷至-12℃然后混合，剧烈搅拌直至溶解即可得到纤维素溶液。
3.如权利要求1所述双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白溶液是通过以下方法制备得到的：将7重量份的氢氧化钠和12重量份的尿素共同溶解在81重量份的去离子水中，得到氢氧化钠/尿素溶液，再将丝素蛋白与该氢氧化钠/尿素溶液混合后机械搅拌直至完全溶解即可得到丝素蛋白溶液。
4.如权利要求1所述双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)得到的交联溶液中，纤维素的质量分数为1.5～4.0％，丝素蛋白的质量分数为0～2.0％，环氧氯丙烷的质量分数为0.5-10％。
5.如权利要求1所述双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述交联是在室温下进行的，交联时间为5-15min。
6.如权利要求1所述双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述离心脱气泡条件为1500-3000rpm离心5-10min；
优选的，所述步骤(4)中，所述用流水冲洗具体是用去离子水冲洗48h以上。
7.如权利要求1所述双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述反应固化条件为室温下静置4-24h。
8.如权利要求1所述双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述物理交联是在室温下、于CO2气体浓度为3-30vol％的含CO2气氛下处理2-12h。
9.利用如权利要求1－8任意一项所述制备方法制备得到的双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶。
10.如权利要求9所述双网络交联纤维素/丝素蛋白高强度水凝胶的应用，其特征在于，应用于组织工程领域。
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