CN104548196B - 一种基于乙烯基‑巯基交联的组织工程支架材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于乙烯基‑巯基交联的组织工程支架材料及其制备方法。所述巯基‑乙烯基交联反应具有低氧敏感性,可光引发等特性;制备得到的多孔凝胶材料具有可生物降解性、空间可控性、无细胞毒性,满足生物细胞生长的要求,并且具有良好的机械性能,适用于组织工程用支架材料;通过该法可实现对组织工程进行按需治疗;所述组织工程材料制备方法简单易行,原料来源广泛,制备过程绿色环保,无污染。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程领域,具体涉及一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料及其制备方法。
背景技术
组织工程学最基本的思路是在体外分离、培养细胞,将一定量的细胞接种到具有一定空间结构的支架上,通过细胞之间的相互粘附、生长繁殖、分泌细胞外基质,从而形成具有一定结构和功能的组织或器官。材料作为组织工程研究的人工细胞外基质(extracellular matrix, ECM),是组织工程研究的一个重要的方面,它为细胞的停泊、生长、繁殖、新陈代谢、新组织的形成提供支持。组织工程支架材料是指能与组织活体细胞结合并能植入生物体内的材料,它可为细胞提供获取营养、气体交换、***废物和生长发育的场所,也是形成新的具有形态和功能的组织、器官的物质基础。理想的组织工程材料应具有三维立体多孔结构、生物可降解、良好的生物相容性、可塑性及机械强度。对于组织工程角膜更应具有透明屈光、透氧等特性。
明胶是胶原水解而成的水溶性蛋白质混合物,分子量一般在几万至几十万之间。明胶保持了胶原的三螺旋结构,含有类似精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD) 序列,具有优良的亲水性和生物相容性,能够促进细胞的粘附与生长;同时,明胶去除了胶原的免疫原性,减少了可能存在的病原体感染。作为优良的天然生物材料,明胶已经广泛应用于组织工程领域。然而,明胶的脆性较大,单独使用时,降解较快,因此,常常通过化学交联增加明胶的强度,延长明胶降解的时间。
光固化交联提供了一种快速可控形成凝胶网络的方法。所谓光固化交联是指借助光 引发剂,通过可见光或紫外光引发交联固化而形成凝胶。通过光固化交联法具有如下优点:可使前驱体水溶液原位交联,因而可用于制备可注射凝胶;产物几何形状易于控制;在室温或生理温度下固化时间短(从不到一秒到几分钟);较低的反应热等。光聚合水凝胶的前驱体具有良好的流动性,因而可用于异型修复材料的制备,成为当前组织工程支架材料的研究热点。例如,受损的软骨由于缺少血管很难自身修复。目前,较常用的治疗方法是移植同源软骨细胞。但是这种方法要通过外科手术移植健康的软骨,并且受到软骨形状的限制。相比之下,软骨组织工程技术可以将软骨细胞包埋于具有生物相容性、可生物降解的支架中,以完成软骨细胞的移植。
近年来,国内外不少学者采用各种方法制备组织工程支架材料,以期能应用于临床。发明专利CN 103157141 A “一种医用组织工程支架的制备工艺”,通过首先制备得到聚二甲基硅氧烷的弹性体模具,再通过溶液浇铸-冷冻干燥法制得支架单层,最后采用层叠法将制得的单层支架固定得到组织工程支架,但是通过该法得到的组织工程支架材料层与层之间不稳定,使用溶剂粘合对组织工程支架材料的生物相容性产生较大影响;并且制备模具这一前趋步骤增加了工艺的复杂性。发明专利CN 103520770 A“组织工程支架用多孔状材料”以聚己内酯和聚氧化乙烯为基底材料,通过添加碳酸氢钠双螺杆挤出造粒之后再微孔发泡法制得中间产品,对中间产品进行沥滤后真空烘干得到多孔支架材料,但是该法制备工艺复杂,采用双螺杆挤出造粒使原料的利用率降低,并且对制得的多孔支架材料的生物相容性产生了较大的影响。专利CN 202654450 U“一种组织工程支架”采用气泡静电纺丝技术制得纤维状组织工程支架材料,但是该法对设备要求较高,并且静电纺丝与聚合物基体的结构性能极为相关,能用于静电纺丝的天然高分子品种十分有限,对所得的产品结构和性能稳定性的把握也不够。
发明内容
根据现有技术中存在的不足之处,本发明的目的在于提供一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料及其制备方法。本发明制备的组织工程支架材料具有良好生物相容性并且兼具优良机械性能,制备方法绿色环保、无污染,原料来源广泛。本发明提供了一种可原位交联制备生物相容性的组织工程支架材料,可实现对组织进行按需治疗。
本发明采用的技术解决方案是:一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料,所述的组织工程支架材料为基于乙烯基-巯基交联的网状结构。
所述的一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料,所述的组织工程支架材料原料为带有氨基和羧基的生物可降解高分子材料,如明胶、胶原、蛋白质、多肽、聚多糖等。
一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料的制备方法,对原料分别用乙烯基化改性试剂和巯基化改性试剂进行乙烯基化改性处理和巯基化改性处理,再将经过乙烯基化改性处理和巯基化改性处理的原料充分混合并在紫外灯辐照下进行光固化交联。
所述的一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料的制备方法,所述的乙烯基化改性试剂为甲基丙烯酸酐、戊酐、丙烯酸酐、马来酸酐中的一种。
所述的一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料的制备方法,所述的乙烯基化改性处理的反应温度为50℃,反应环境为碱性条件,PH值控制在7.4—8之间。
所述的一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料的制备方法,所述的乙烯基化改性处理的原料溶液浓度为5%—20%%w/v。
所述的一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料的制备方法所述的乙烯基化改性试剂的添加速率为0.2mL/min—0.5mL/min,添加量为0.5%—1.5%v/v。
所述的一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料的制备方法所述的巯基化改性处理的原料液浓度为0.5%—2.0% w/v。
所述的一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料的制备方法所述的巯基化改性处理反应体系PH值稳定控制在4.71—4.81。
所述的一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料的制备方法,所述的巯基化改性处理反应温度为37℃。
所述的一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料的制备方法,所述的巯基基化改性试剂为半胱胺。
所述的一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料的制备方法,所述的乙烯基化改性原料与巯基化改性原料混合的质量比为2:1。
所述的一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料的制备方法,所述的巯基化改性原料在混合前要经过通氮排氧处理。
所述的一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料的制备方法所述的光固化交联添加的光引发剂为l2959型光引发剂,添加量为0.1%—1.0% w/v。
所述的一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料的制备方法所述的紫外光辐照强度为50-300mW,辐照时间为20s—3min。
本发明得到的有益效果是:本发明提供了一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料及其制备方法。本发明制备得到的组织工程支架材料生物相容性好,具有适宜的机械强度,能与潜在的应用相匹配,生物可降解,可实现按需治疗。本发明提供了一种原位紫外光固化交联制备技术,制备过程绿色环保、无污染、无毒。
附图说明
图1为明胶乙烯基化改性反应示意图。
图2为明胶巯基化改性反应示意图。
图3为紫外光固化交联反应示意图。
图4为本发明组织工程支架材料表面及断面扫描电镜图。
图5为细胞在组织工程支架材料中的3D生长荧光显微共聚焦图片。
具体实施方式:
下面通过实施例进一步描述本发明,但本发明不仅限于此。
改性的带有氨基和羧基的生物可降解高分子材料可为明胶、胶原、蛋白质、多肽、聚多糖等。
乙烯基化明胶的制备
所用乙烯基化改性试剂为甲基丙烯酸酐(Methacrylic anhydride, MA):首先,取20g明胶溶于200mLDPBS溶液中,调节温度至50℃,磁力搅拌,得到均匀澄清的明胶溶液;调节溶液的PH值,使溶液呈碱性环境。其次,将2mLMA缓慢加入以上溶液中,以0.2mL/min—0.5mL/min的速率,缓慢滴加的同时,注意控制整个反应体系的PH值,用5MNaOH来调节,使整个反应体系的PH稳定在7.4-8之间,用精密PH试纸判断。第三,反应3小时之后,透析,所用透析袋的截留分子量为1KDa,透析5-7天,透析溶剂为水,以除去多余未反应MA,透析温度设定为50℃。第四,冻干。第五,避光保存。
所用乙烯基化改性试剂还可为戊酐、丙烯酸酐、马来酸酐中的一种。
改性的带有氨基和羧基的生物可降解高分子材料
巯基化明胶的制备
取5g明胶粉末,溶于500mLPBS溶液中,用5MNaH2PO4和5MNaOH来调节PH,使得体系中PH值稳定在4.71—4.81。加入EDC1.9871g,NHS0.3683g,混合均匀,以鼓泡形式通氮气20-30min以除氧。随后,迅速加入半胱胺(Cysteamine)0.6712g,继续通氮气鼓泡。搅拌反应12h,控制反应温度为37℃。将反应产物旋蒸,透析,以水为透析液,透析时在透析液中加入少量的EDTA(0.2mmol/L)抑制端巯基氧化。透析5-7天。旋蒸,冻干,避光保存。
紫外光固化交联
取200mg制备所得的乙烯基化明胶溶于1mLPBS溶液中;取100mg制备所得的巯基化明胶溶于50mLPBS溶液中,此溶解过程通氮气鼓泡15分钟;称取50mg2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(l2959)溶于1mL75%乙醇溶液中;将溶解好的乙烯基化明胶与巯基化明胶混合,量取7.5uLl2959乙醇溶液添加到混合液中,涡旋震荡3min;取150uL混合液浇铸于模具中,置于紫外光下,辐照20s—3min;取出,得到交联组织工程支架材料;保存于PBS溶液中,4℃条件下储存。所述模具腔体规格为:φ15mm×100um、φ15mm×200um。所述紫外光强度为50-300mmW。
将紫外光固化交联所得的支架用含双抗的PBS溶液浸泡灭菌24小时,将其平铺于24孔板中,用完全培养基(90% F12:DMEM = 1:1,10% FBS, 1% anti-anti, 5μg/mLinsulin, 10ng/mLEGF)进行预培养24小时以除去杂质,将小鼠成纤细胞(l929)种植于支架材料上,体外静态培养7天后电镜观察及MTS测试分析,如图4所示,见细胞能在支架上良好生长,且细胞存活率高达70%以上。
取第一步所得乙烯基化明胶100mg,溶于1mLPBS溶液中;取第二步所得巯基化明胶50mg,溶于500uLPBS溶液中;将两溶液分别置于100℃沸水中煮5min。无菌条件下,将两者混溶,添加0.5%的l2959乙醇溶液,充分混合。取100uL混合物,将其与l929细胞混合,细胞浓度为20000个/孔,涡旋震荡2min;添加到96孔板中。置于365nm紫外光下辐照1min。培养24小时,通过死活检测装置检测发现,细胞在该组织工程支架材料上存活率高达90%以上。
预先用荧光染料DilC(3)对l929细胞进行着色处理;取第一步所得乙烯基化明胶150mg,溶于1mLPBS溶液中;取第二步所得巯基化明胶75mg,溶于500uLPBS溶液中;将两溶液分别置于100℃沸水中煮5min。无菌条件下,将两者混溶,添加0.5%的l2959乙醇溶液,充分混合。取100uL混合物,将其与经过着色处理的l929细胞混合,细胞浓度为20000个/孔,涡旋震荡2min;添加到96孔板中。置于365nm紫外光下辐照1min。然后分别培养1、4、7天后,通过激光共聚焦荧光显微镜观察细胞在材料三维生长情况,如图5所示,见细胞在组织工程支架材料上生长良好。
具体实施方式只用于对本发明进行进一步说明,不能作为对本发明保护范围的限定,同时该领域的技术人员根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整,都位于本发明的保护范围内,本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (5)
1.一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料,其特征在于:所述的组织工程支架材料为基于乙烯基-巯基交联的网状结构,所述的组织工程支架材料原料为带有氨基和羧基的生物可降解高分子材料,所述的带有氨基和羧基的生物可降解高分子材料为明胶,所述的基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料的制备方法为:对原料分别用乙烯基化改性试剂和巯基化改性试剂进行乙烯基化改性处理和巯基化改性处理,再将经过乙烯基化改性处理和巯基化改性处理的原料充分混合并在紫外灯辐照下进行光固化交联,所述的乙烯基化改性处理的制备步骤为,所用乙烯基化改性试剂为甲基丙烯酸酐,首先,取20g明胶溶于200mLDPBS溶液中,调节温度至50℃,磁力搅拌,得到均匀澄清的明胶溶液;调节溶液的pH值,使溶液呈碱性环境,其次,将2mLMA缓慢加入以上溶液中,以0.2mL/min—0.5mL/min的速率,缓慢滴加的同时,注意控制整个反应体系的pH值,用5M NaOH来调节,使整个反应体系的pH稳定在7.4-8之间,用精密pH试纸判断,第三,反应3小时之后,透析,所用透析袋的截留分子量为1KDa,透析5-7天,透析溶剂为水,以除去多余未反应MA,透析温度设定为50℃,第四,冻干,第五,避光保存,所述的巯基化改性处理的制备步骤为,取5g明胶粉末,溶于500mLPBS溶液中,用5MNaH2PO4和5MNaOH来调节pH,使得体系中pH值稳定在4.71—4.81,加入EDC1.9871g,NHS0.3683g,混合均匀,以鼓泡形式通氮气20-30min以除氧,随后,迅速加入半胱胺0.6712g,继续通氮气鼓泡,搅拌反应12h,控制反应温度为37℃,将反应产物旋蒸,透析,以水为透析液,透析时在透析液中加入少量0.2mmol/L的EDTA抑制端巯基氧化,透析5-7天,旋蒸,冻干,避光保存。
2.根据权利要求1所述的一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料,其特征在于:所述的乙烯基化改性处理和巯基化改性处理的原料混合的质量比为2:1。
3.根据权利要求1所述的一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料,其特征在于:所述的巯基化改性处理的原料在混合前要经过通氮排氧处理。
4.根据权利要求1所述的一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料,其特征在于:所述的光固化交联添加的光引发剂为l2959型光引发剂,添加量为0.1%—1.0% w/v。
5.根据权利要求1所述的一种基于乙烯基-巯基交联的组织工程支架材料,其特征在于:所述的紫外光辐照强度为50-300mW,辐照时间为20s—3min。
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