CN108785155A

CN108785155A - 用于治疗皮肤色素沉着的组合物和相关方法

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Publication number: CN108785155A
Application number: CN201710292478.XA
Authority: CN
Inventors: 张翌; 韩强; 李廷钊
Original assignee: Access Business Group International LLC
Current assignee: Access Business Group International LLC
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2017-04-28
Publication date: 2018-11-13
Also published as: US20180311142A1; US10537516B2; TW201841618A; TWI735779B; WO2018200768A1

Abstract

用于治疗皮肤色素沉着的组合物和制备用于治疗皮肤色素沉着的组合物的方法。所述组合物包括至少一种黑色素产生抑制剂，其是化合物或植物提取物，以有效抑制人皮肤细胞中的黑色素产生的量存在。所述黑色素产生抑制剂选自：环常绿黄杨碱D、硫辛酸、荷叶碱、贝母辛碱、洋橄榄苦甙、唐古特红景天(Rhodiola algida)提取物、狭叶红景天(Rhodiola kirilowii)(Regel)Maxim提取物、Glycyrrhizae Radix et Rhizoma提取物、大蓟(Cirsii japonici herba)提取物、柏子仁(Platycladi semen)提取物、红缨合耳菊(Synotis erythropappa)提取物、沙苑子(Astragali complanati)种子提取物、车前子(Plantaginis)种子提取物、泽兰(Lycopi herba)提取物、芡实(Euryales)种子提取物、菟丝子(Cuscutae)种子提取物、Amomi fructus提取物、塔拉豆(Tara seed)提取物、侧柏叶(Platycladi cacumen)提取物、杜仲(Eucommiae cortex)提取物、山药(Dioscoreae rhizoma)提取物和小蓟(Cirsii herba)提取物。

Description

用于治疗皮肤色素沉着的组合物和相关方法

发明领域

本发明总体上涉及用于治疗人皮肤中的色素沉着的组合物和形成所述组合物的方法。

发明背景

黑色素对于保护人皮肤免于由辐射引起的损伤是重要的。黑色素在人皮肤细胞中积聚可导致色素沉着病症，例如黑斑病、雀斑(freckles)、雀斑(ephelides)和衰老性着色斑(亦称为褐黄斑或老年斑)。衰老和暴露于来自阳光的紫外辐射可增加这些和其它类型的色素沉着病症的发生。

黑色素在称为黑素细胞的特化细胞组中产生，其位于表皮的基底层中。黑色素产生至少部分地由酪氨酸酶控制，和通过氨基酸酪氨酸的氧化，接着聚合以产生色素黑色素来产生。

尽管黑色素可用于保护人皮肤免于阳光损伤，但由于黑色素产生导致的皮肤变暗对于一些个体而言可能在美容上是不期望的。皮肤亮化处理和美容剂通常由个体使用以减少色素沉着病症例如雀斑或老年斑的出现。美容剂仅暂时减少不需要的色素沉着的能见度，和可能不方便经常性使用和在身体的某些部分上使用。

常规皮肤亮化处理可降低某些色素沉着病症的出现，但经常伴有不需要的副作用。氢醌是常用的皮肤亮化剂的一个实例，然而较高的剂量可能需要来自皮肤科医生的处方。在一些个体中，氢醌可导致不期望的皮肤变色。熊果苷是皮肤亮化剂的一个实例，其来源于植物，例如桑树、蔓越橘、熊莓和越橘叶。熊果苷是一种糖基化的氢醌，因此可在一些个体中导致类似于氢醌的不期望的副作用。

尽管已经做出了各种努力，但仍有机会提供另外的方法和组合物用于治疗皮肤色素沉着病症，特别是亮化皮肤上黑斑的外观和任选地防止在皮肤上形成可见的黑斑。

发明简述

公开了方法和组合物。所述方法和组合物可用于提供用于治疗在人受试者的皮肤中的色素沉着的组合物。治疗人皮肤中的色素沉着可包括抑制在治疗的人皮肤细胞中的黑色素产生。任选地，治疗人皮肤中的色素沉着包括在治疗后减少在受试者的皮肤细胞中存在的黑色素的量。本文公开的用于抑制黑色素产生和任选地减少在受试者的皮肤细胞中存在的黑色素的量的方法和组合物可用于在视觉上亮化受试者的皮肤和任选地抑制受试者皮肤的进一步暗化。

根据本发明的一个实施方案，用于治疗人皮肤中的色素沉着的组合物包括一种或多种药学上可接受的添加剂和至少一种黑色素产生抑制剂。所述至少一种黑色素产生抑制剂可以选自环常绿黄杨碱D、硫辛酸、荷叶碱、贝母辛碱、洋橄榄苦甙、唐古特红景天(Rhodiola algida)提取物、狭叶红景天(Rhodiola kirilowii) (Regel) Maxim提取物、Glycyrrhizae Radix et Rhizoma提取物、大蓟(Cirsii japonici herba)提取物、柏子仁(Platycladi semen)提取物、红缨合耳菊(Synotis erythropappa)提取物、沙苑子(Astragali complanati)种子提取物、车前子(Plantaginis)种子提取物、泽兰(Lycopi herba)提取物、芡实(Euryales)种子提取物、菟丝子(Cuscutae)种子提取物、Amomi fructus提取物、塔拉豆(Tara seed)提取物、侧柏叶(Platycladi cacumen)提取物、杜仲(Eucommiae cortex)提取物、山药(Dioscoreae rhizoma)提取物和小蓟(Cirsii herba)提取物。所述至少一种黑色素产生抑制剂可以有效抑制人皮肤细胞中的黑色素产生的量存在。

在另一个实施方案中，所述至少一种黑色素产生抑制剂以有效抑制人皮肤细胞中的酪氨酸酶活性的量存在。用于抑制酪氨酸酶活性的所述至少一种黑色素产生抑制剂可选自硫辛酸、唐古特红景天提取物、狭叶红景天(Regel) Maxim提取物、Glycyrrhizae Radix et Rhizoma提取物、大蓟提取物、柏子仁提取物和红缨合耳菊提取物。

在另一个实施方案中，所述至少一种黑色素产生抑制剂以有效减少人皮肤细胞中存在的黑色素的浓度的量存在。用于减少黑色素的浓度的所述至少一种黑色素产生抑制剂可选自环常绿黄杨碱D、硫辛酸、荷叶碱、贝母辛碱、狭叶红景天(Regel) Maxim提取物和柏子仁提取物。

在另一个实施方案中，药学上可接受的添加剂可选自：水、甘油、蜡、醇、植物油、矿物油、硅酮、脂肪酯、脂肪醇、二醇和聚二醇。组合物可以包括适合于局部施用至人皮肤的以下至少一种的形式提供：凝胶、霜剂、气溶胶喷雾剂、分散液、水包油乳液、油包水乳液、硅酮包水乳液、泡沫、液体、摩丝、润发脂、粉末、固体和软膏。

在另一个实施方案中，在人皮肤的局部治疗中包含的混合物包括至少一种除色素剂。所述至少一种除色素剂可选自环常绿黄杨碱D、硫辛酸、荷叶碱、贝母辛碱、洋橄榄苦甙、狭叶红景天(Regel) Maxim提取物和柏子仁提取物。所述至少一种除色素剂可以在人皮肤上施用局部治疗后有效减少人皮肤细胞中存在的黑色素的浓度的量存在。

在另一个实施方案中，在人皮肤的局部治疗中包含的混合物包括至少一种黑色素产生抑制剂。所述至少一种黑色素产生抑制剂可选自环常绿黄杨碱D、硫辛酸、荷叶碱、贝母辛碱、洋橄榄苦甙、唐古特红景天提取物、狭叶红景天(Regel) Maxim提取物、Glycyrrhizae Radix et Rhizoma提取物、大蓟提取物、柏子仁提取物、红缨合耳菊提取物、沙苑子种子提取物、车前子种子提取物、泽兰提取物、芡实种子提取物、菟丝子种子提取物、Amomi fructus提取物、塔拉豆提取物、侧柏叶提取物、杜仲提取物、山药提取物和小蓟提取物。所述至少一种黑色素产生抑制剂可以在人皮肤上施用局部治疗后有效抑制人皮肤细胞中的黑色素产生的量存在。

在另一个实施方案中，提供制备用于治疗人皮肤的组合物的方法。所述方法包括提供一种或多种药学上可接受的添加剂和提供有效抑制人皮肤细胞中的黑色素产生的量的至少一种黑色素产生抑制剂。黑色素产生抑制剂可选自环常绿黄杨碱D、硫辛酸、荷叶碱、贝母辛碱、洋橄榄苦甙、唐古特红景天提取物、狭叶红景天(Regel) Maxim提取物、Glycyrrhizae Radix et Rhizoma提取物、大蓟提取物、柏子仁提取物、红缨合耳菊提取物、沙苑子种子提取物、车前子种子提取物、泽兰提取物、芡实种子提取物、菟丝子种子提取物、Amomi fructus提取物、塔拉豆提取物、侧柏叶提取物、杜仲提取物、山药提取物和小蓟提取物。

不受任何特定理论的束缚或限制，认为本公开内容的方法和组合物可用于治疗皮肤色素沉着，和更特别是用于亮化皮肤和/或抑制使用者皮肤的色素沉着的暗化。

参照当前的实施方案的描述和附图，将更全面地领会和理解本发明的这些和其它目标、优点和特征。

在详细解释本发明的实施方案之前，应理解本发明不限于操作的细节或以下描述中提供的或附图中说明的组分的构成和排列的细节。本发明可以各种其它实施方案实施，和以本文未明确公开的可选方式实践或实施。另外，应理解，本文使用的措辞和术语是为了描述的目的，和不应视为限制。“包括”和“包含”和其变化的使用意图涵盖下文所列的项目和其等同物，以及另外的项目和其等同物。此外，在各个实施方案的描述中可使用列举。除非另外明确说明，否则列举的使用不应解释为限制本发明至任何特定的次序或组分数。列举的使用也不应解释为从本发明的范围中排除可能与所列举的步骤或组分组合或并入所列举的步骤或组分中的任何另外的步骤或组分。

附图简述

图1是说明根据一个实施方案的荷叶碱的细胞毒性的图；

图2是说明根据一个实施方案的贝母辛碱的细胞毒性的图；

图3是说明根据一个实施方案的柏子仁提取物的细胞毒性的图；

图4是说明根据一个实施方案的泽兰提取物的细胞毒性的图；

图5是说明用根据一个实施方案的荷叶碱处理的细胞的黑色素合成抑制的百分比的图；

图6是说明用根据一个实施方案的贝母辛碱处理的细胞的黑色素合成抑制的百分比的图；

图7是说明用根据一个实施方案的柏子仁提取物处理的细胞的黑色素合成抑制的百分比的图；

图8是说明用根据一个实施方案的泽兰提取物处理的细胞的黑色素合成抑制的百分比的图；

图9是说明用根据一个实施方案的荷叶碱处理的细胞的黑色素清除的百分比的图；

图10是说明用根据一个实施方案的贝母辛碱处理的细胞的黑色素清除的百分比的图；和

图11是说明用根据一个实施方案的柏子仁提取物处理的细胞的黑色素清除的百分比的图。

本发明的实施方案的详细描述

公开了用于形成皮肤治疗组合物的皮肤治疗组合物和方法。所述皮肤治疗组合物和方法可用于提供用于在人受试者中治疗皮肤色素沉着的组合物。如本文所用的，治疗皮肤色素沉着涉及抑制人皮肤细胞中的黑色素产生和/或减少人皮肤细胞中存在的黑色素的量。术语“除色素剂”用于指能够减少皮肤细胞中存在的黑色素的量或减少皮肤细胞中已经存在的黑色素的色素沉着效果的化合物、植物提取物或物质组合。术语“黑色素产生抑制剂”用于指能够抑制皮肤细胞中的黑色素产生的化合物、植物提取物或物质组合。治疗皮肤色素沉着可包括亮化受试者的皮肤，亮化受试者的皮肤上的黑斑或痣，抑制受试者的皮肤中的色素沉着的增加(亦称为“暗化”)，和/或抑制在受试者的皮肤上的黑斑或痣的形成。本文描述了其它可能的非限制性益处。

所述皮肤治疗组合物包括至少一种能够抑制受试者的皮肤细胞中的黑色素产生的组分。任选地，所述皮肤治疗组合物包括至少一种用于减少受试者的皮肤细胞中存在的黑色素的浓度的除色素剂。在一个实施方案中，皮肤治疗组合物包括一种或多种黑色素产生抑制剂和一种或多种除色素剂的组合。在另一个实施方案中，皮肤治疗组合物包括同时为黑色素产生抑制剂和除色素剂的组分。

黑色素产生抑制剂可以是能够抑制皮肤细胞中的黑色素产生的化合物。任选地，黑色素产生抑制剂是能够抑制皮肤细胞中的黑色素产生的植物提取物。用于抑制皮肤细胞中的黑色素产生的化合物可选自环常绿黄杨碱D、硫辛酸、荷叶碱、贝母辛碱、洋橄榄苦甙和其组合。用于抑制皮肤细胞中的黑色素产生的植物提取物可以是以下的提取物：唐古特红景天、狭叶红景天(Regel) Maxim、Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (包括胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.))、大蓟(包括Cirsium japonicum Fisch. ex DC)、柏子仁(包括Platycladus orientalis L. Franco)、红缨合耳菊、沙苑子种子(包括Astragalus complanatus R. Br.)、车前子种子(包括Plantago asiatica L.和Plantago depressa Willd.)、泽兰(包括Lycopus lucidus turcz. Var. hirtus Regel)、芡实种子(包括Euryale ferox Salisb.)、菟丝子种子(包括Cuscuta australis R. Br.和Cuscuta chinensis Lam.)、Amomi fructus (包括Amomum villosum Lour.、Amomum villosum Lour. var. xanthioides T.L. Wu et Senjen和Amomum longiligulare T.L. Wu)、塔拉豆(包括Caesalpinia spinose Kuntze)、侧柏叶(包括Platycladus orientalis L. Franco)、杜仲(包括杜仲和Eucommia ulmoides Oliv.)、山药(包括Dioscorea opposita Thunb.)、小蓟(包括Cirsium setosum (Willd.) MB)或其组合。

所述除色素剂可以是能够减少皮肤细胞中存在的已有黑色素的量的化合物。任选地，除色素剂是能够减少皮肤细胞中存在的黑色素的量的植物提取物。除色素剂化合物可选自环常绿黄杨碱D、硫辛酸、荷叶碱、贝母辛碱、洋橄榄苦甙和其组合。除色素剂植物提取物可以是狭叶红景天(Regel) Maxim、柏子仁和其组合的提取物。

任选地，皮肤治疗组合物包括同时为黑色素产生抑制剂和除色素剂的化合物或植物提取物。同时显示黑色素产生抑制能力和除色素能力的组分的实例包括环常绿黄杨碱D、硫辛酸、荷叶碱、贝母辛碱、狭叶红景天(Regel) Maxim提取物和柏子仁提取物。

所述皮肤治疗组合物包括至少一种黑色素产生抑制剂和/或除色素剂，和任选地基本上由黑色素产生抑制剂和/或除色素剂组成。如本文所用的，词语"基本上由……组成"通常包括对于具体的实施方案特别陈述的要素/组分。此外，词语"基本上由……组成"通常包括和允许另外的或任选的要素/组分的存在，其不实质影响该具体实施方案的基础和/或新颖的特征。在某些实施方案中，"基本上由……组成"允许基于组合物的总重量计，≤10、≤5或≤1重量百分比(wt.%)的另外或任选的组分的存在。

任选地，本发明的皮肤治疗组合物包括药学上可接受的添加剂，其为无活性的成分。无活性成分的实例包括但不限于，香味剂；防腐剂；醇，例如乙醇、丙醇和苯甲醇；甘油；粘合剂；流动剂；甘油三醋酸酯；植物油，例如氢化植物油；矿物油；水；硅酮，例如硅酮油；二氧化硅；蜡，例如棕榈蜡和蜂蜡；脂肪酯和脂肪醇；二醇和聚二醇；和其组合。如果用于形成组合物，所述无活性成分可以各种量和与黑色素产生抑制剂和/或除色素剂组合使用，以形成适合于局部施用至人皮肤的组合物。应进一步理解，本文所述的活性剂的量可相对于组合物的100份重量进行归一化，以说明存在无活性成分(如果使用的话)。

如本文所用的，对“植物提取物”的提及通常是指包含来自所指定的属内的任何物种的物质的提取物，除非指定了具体的物种。除非另外指定，否则植物的任何部分可用于获得在组合物中使用的提取物，包括但不限于，根、茎、根状茎、叶、花、果实和/或这些部分的提取物。植物提取物可市售获自各种来源。此外，合适的植物提取物可通过使用任何常规提取技术获得，包括但不限于，下文进一步描述的一种或多种技术。

黑色素产生抑制剂可以当局部施用至人皮肤细胞时有效抑制黑色素产生的量存在于皮肤治疗组合物中。任选地，黑色素产生抑制剂以有效抑制人皮肤细胞中的酪氨酸酶活性的量存在于皮肤治疗组合物中。在一个实例中，黑色素产生抑制剂的浓度是约20%重量(% wt.)或更低。任选地，多种黑色素产生抑制剂经组合或混合用于皮肤治疗组合物中。当多种黑色素产生抑制剂组合时，各黑色素产生抑制剂的单独浓度或组合浓度可以是当局部施用至人皮肤细胞时有效抑制黑色素产生的量。任选地，各黑色素产生抑制剂的单独浓度或组合浓度是有效抑制人皮肤细胞中的酪氨酸酶活性的量。

除色素剂可以有效减少人皮肤细胞中存在的黑色素的浓度的量存在于皮肤治疗组合物中。任选地，除色素剂以在人皮肤细胞中有效抑制黑色素产生和减少黑色素的浓度的量存。在一个实例中，黑色素产生抑制剂的浓度是约20%重量(% wt.)或更低。任选地，除色素剂经组合或混合用于皮肤治疗组合物中。当多种除色素剂组合时，各除色素剂的单独浓度或组合浓度可以是有效降低人皮肤细胞中存在的已有黑色素的浓度的量。

植物提取物可通过本领域已知的常规提取方法获得，例如通过水(例如蒸汽)提取或通过溶剂(例如醇)提取。本公开内容的组合物不限于具体的提取方法，也不一定需要提取，因为合适的提取物(例如，标准化的提取物)可容易地获自许多商业供应商，例如Sinphar Tian-Li Pharmaceutical, of Hongzhou, China和Beijing Gingko group ofBeijing, China。示例性的提取方法在下文描述。

为了获得提取物，极性溶剂例如醇(例如甲醇、乙醇、丁二醇)、醚(例如***)、酮(例如丙酮)、酯(例如乙酸乙酯)、水或其混合物，可用作溶剂。某些提取物也可通过用非极性溶剂从极性溶剂进一步萃取提取物获得。合适的非极性溶剂包括但不限于，乙酸乙酯、己烷、二氯甲烷、氯仿或其混合物。

各种提取方法可用于生产适合于所述组合物的提取物。这些方法包括但不限于，美国专利7,897,184中公开的提取方法，其通过引用以其整体结合到本文中和关于一些提取方法在下文中部分地重复。尽管描述的提取溶剂特别提及乙醇，但除了乙醇之外或作为乙醇的备选方案，可使用其它醇，例如但不限于异丙醇、乙醇和/或甲醇。示例性的醇溶剂包括但不限于，C₁-C₄醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇；水-醇或醇和水的混合物，包括水-乙醇；多元醇，例如丙二醇和丁二醇；和脂肪醇。可使用任何这些醇溶剂。其它溶剂，例如但不限于丙酮，也可用作提取溶剂。也可使用任何比率的溶剂-水混合物，例如醇-水和/或丙酮-水混合物。

在一个实例中，提取物可使用有机溶剂提取技术获得。在另一个实例中，溶剂连续分馏可用于获得提取物。全水-乙醇提取技术也可用于获得提取物。一般而言，这称为整批(lump-sum)提取。在该过程中产生的提取物将包含在提取的物质中存在的各种植物化学品，包括脂肪溶性、脂溶性和水溶性的植物化学品。在收集提取物溶液后，将溶剂蒸发，得到提取物。

也可使用全乙醇提取。该技术使用乙醇作为溶剂。该提取技术产生提取物，除了水溶性化合物之外，其还可包括脂肪溶性、脂溶性和/或亲脂性化合物。以类似的方式，也可使用全甲醇提取，得到类似的结果。

可用于获得提取物的提取技术的另一个实例是二氧化碳超临界液体提取("SFE")。在该提取程序中，待提取的物质未暴露于任何有机溶剂。而是，提取溶剂是在超临界条件(例如>31.3℃和>73.8巴)下的二氧化碳(CO₂)，含或不含改性剂。本领域技术人员将理解，可改变温度和压力条件以获得最佳收率的提取物。该技术产生脂肪溶性、脂溶性和/或亲脂性化合物的提取物，类似于也可使用的全己烷和乙酸乙酯提取技术。

皮肤治疗组合物可使用各种方法制备。例如，组合物的活性剂，和任选地一种或多种无活性剂，可使用本领域已知的各种技术来混合或共混，和压制或配制。本公开内容的组合物不限于制备步骤或制备方法的特定次序。

通常，皮肤治疗组合物通过施用至受试者的皮肤来局部给予。受试者通常是人，和可包括各年龄的男性和女性。本公开内容的方法/组合物不限于特定的受试者。

所述皮肤治疗组合物可以呈各种形式。合适的形式的实例包括固体、凝胶和液体。例如，皮肤治疗组合物可经配制以作为凝胶、霜剂、洗剂、润发脂、摩丝、粉末或泡沫施用，以施用至受试者的皮肤。在另一个实例中，皮肤治疗组合物可经配制用于喷射至受试者的皮肤上。所述组合物可经配制以作为气溶胶喷雾剂或泵送喷雾剂进行喷射。在又一个实例中，皮肤治疗组合物可经配制以使用预湿纸巾施用。在另一个实例中，组合物可配制为固体，其搓擦至受试者的皮肤上。在另一个实例中，组合物经配制以通过粘附至受试者的皮肤的贴剂递送。

除了黑色素产生抑制剂和/或除色素剂(即，“活性剂”或“活性成分”)之外，组合物可包括无活性的药学上可接受的添加剂(或“无活性成分”)，包括但不限于，赋形剂，例如稀释剂和粘合剂；成粒剂；助流剂(或流动助剂)；填充剂；润滑剂；防腐剂；稳定剂；涂覆剂；崩解剂；香味剂；和色素。上文描述的无活性成分的其它实例。活性成分和药学上可接受的添加剂可按需要组合或配制，以形成单独的剂量，当局部施用时其提供需要量的活性成分至人受试者。

皮肤治疗组合物可按需要，每日一次、每日数次或以任何合适的方案施用，以实现需要的结果。在本公开内容的方法中，给予(例如局部施用)的频率可取决于数个因素，包括需要的皮肤亮化水平或黑斑的频率和/或颜色。一般而言，方案包括每日一次或两次施用皮肤治疗组合物，以包括早晨给予和/或晚上给予。施用皮肤治疗组合物的量和/或频率可取决于数个因素，包括需要的结果水平和特定的组成。

所述皮肤治疗组合物可用于通过抑制受试者的皮肤细胞中的黑色素产生和/或通过减少受试者的皮肤细胞中已有的黑色素的浓度，治疗受试者的皮肤中的色素沉着。皮肤治疗组合物可局部施用以亮化受试者的总体皮肤外观，和阻止由于黑色素产生引起的受试者皮肤的暗化。任选地，皮肤治疗组合物施用至受试者皮肤的特定区域，例如黑斑或痣，以亮化该区域和/或阻止该区域的进一步暗化。

适合于治疗受试者的皮肤中的色素沉着的活性成分包括能够抑制皮肤细胞的黑色素产生和/或能够减少皮肤细胞中已有黑色素的浓度的化合物和植物提取物。令人惊讶的是，发现数种化合物和植物提取物能够抑制皮肤细胞的黑色素产生和/或能够减少皮肤细胞中已有黑色素的浓度至与常规皮肤亮化化合物相同的程度，或高于常规皮肤亮化化合物的程度。此外，本发明的皮肤治疗组合物的许多化合物和植物提取物的性能在体外试验中类似于或好于常规皮肤亮化化合物，具有类似或更好的毒性。

以下实施例，说明了本公开内容的组合物和方法，意图说明而非限制本公开内容。

实施例

本发明的皮肤治疗化合物和植物提取物的效果在体外使用B16-F10 (ATCC# CRL-6475)细胞模型评价。B16-F10细胞模型是mus musculus (小鼠)黑素瘤皮肤细胞系。评价皮肤治疗化合物和植物提取物的细胞毒性、黑色素合成的抑制、酪氨酸酶活性的抑制和在B16F10细胞中已有黑色素的清除。下表1和2分别列出了评价的5种皮肤治疗化合物和17种皮肤治疗植物提取物。

表1：皮肤治疗化合物

化合物
	环常绿黄杨碱D
硫辛酸
	荷叶碱
贝母辛碱
	洋橄榄苦甙

表2：皮肤治疗植物提取物

毒性

皮肤治疗化合物和提取物的毒性使用来自Promega Corporation的CellTiter-Glo®(CTG) 发光细胞活性测定(Luminescent Cell Viability Assay)来评价。该测定法基于存在的ATP的定量来测定培养中的活细胞的数量，ATP指示代谢活性细胞的存在。氢醌是一种常规的皮肤亮化化合物，因此在该测定法中选择用作阳性对照。

细胞用在范围0.01-100 ug/mL内的多个浓度的皮肤治疗化合物或提取物或阳性对照处理72小时。CellTiter-Glo®试剂加入至细胞，和根据由Promega Corporation提供的测定说明书获得发光。对于各皮肤治疗化合物或提取物和相应的阳性对照，计算IC₅₀。结果在下表3中概述。

表3：细胞毒性

皮肤治疗化合物/提取物	IC₅₀ (氢醌IC₅₀) (µg/mL)
		环常绿黄杨碱D	>100 (3.7)
硫辛酸	>100 (2.2)
		荷叶碱	62.2 (1.9)
贝母辛碱	>50 (3.4)
		洋橄榄苦甙	90.3 (3.3)
唐古特红景天提取物	>100 (4.4)
		狭叶红景天(Regel) Maxim提取物	>100 (5.2)
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma提取物	74.5 (4.1)
		大蓟提取物	77.6 (7.0)
柏子仁提取物	78.8 (8.1)
		红缨合耳菊提取物	>100 (5.9)
沙苑子种子提取物	>100 (5.4)
		车前子种子提取物	>100 (7.0)
泽兰提取物	>100 (6.8)
		芡实种子提取物	>100 (3.2)
菟丝子种子提取物	75.9 (4.8)
		Amomi fructus提取物	>100 (4.2)
塔拉豆提取物	>100 (4.2)
		侧柏叶提取物	>100 (9.3)
杜仲提取物	95.8 (5.0)
		山药提取物	>100 (4.5)
小蓟提取物	>100 (4.1)

图1-4分别说明了荷叶碱、贝母辛碱、柏子仁提取物和泽兰提取物(方块)的毒性曲线，与氢醌阳性对照(三角形)比较。表3和图1-4的数据证实，每种皮肤亮化化合物和植物提取物的毒性显著低于常规的皮肤亮化化合物氢醌。

黑色素合成抑制

评价了皮肤治疗化合物和提取物抑制黑色素合成的能力。黑色素是皮肤细胞中的色素，其是皮肤着色和各种色素沉着病症例如老年斑和雀斑的原因。黑色素合成的抑制可导致皮肤颜色的亮化和/或抑制皮肤颜色的进一步暗化。熊果苷是一种用于皮肤亮化处理的常规植物来源的化合物，因此选择用作阳性对照。

程序

B16-F10细胞使用胰蛋白酶-EDTA (GIBCO Cat. #25200-072)经胰蛋白酶化，和测定细胞密度。在包含补充有胎牛血清(GIBCO Cat. #10099-141)的RPMI 1640 (GIBCO Cat. #22400-089)的生长培养基中，将细胞浆液稀释至18,000个细胞/毫升(mL)的浓度。以1 mL/孔(18,000个细胞/孔)将稀释的细胞浆液分配至24孔细胞培养板的各孔中(BD FalconCat. #353047)。在37℃和5% CO₂下在潮湿条件下将细胞孵育过夜。

将铺板的细胞通过在100%二甲基亚砜(DMSO) (Sigma Cat. #D2650)中制备各皮肤亮化化合物、植物提取物和熊果苷(阳性对照; Sigma Cat. #A4256)的200x稀释液进行处理。将5 µL的200x稀释液加入至各孔。在37℃和5% CO₂下在潮湿的条件下将处理的细胞孵育72小时。评价浓度为0 (未处理)、10、50和100 µg/mL的皮肤亮化化合物和提取物。评价浓度为0 (未处理)、25、125和250 µg/mL的熊果苷。

当处理阶段完成时，弃去各孔的培养基，细胞用1 mL/孔的DPBS (Biosera Cat. #LM-S2041)洗涤一次。除去DPBS洗涤液，加入150 µL的1N氢氧化钠至各孔，持续30分钟，同时在80℃孵育细胞以溶解细胞。接下来，将来自各孔的145 µL转移至UV板，和测试剩余的5 µL以测定蛋白浓度。各孔的UV吸光度使用读板器测定，主波长设定在400 nm。

根据以下方程，黑色素合成抑制使用400 nm处的UV吸光度测定：

%Inh = (最大信号 - 化合物信号)/(最大信号 – 最小信号)x100

其中“%Inh”是黑色素合成的百分比抑制，“最大信号”是未处理细胞的UV吸光度，和“最小信号”是用500 µg/mL熊果苷处理的细胞的UV吸光度。

结果

黑色素合成抑制测定法的结果提供在下表4中。将100 µg/mL处理浓度的各皮肤亮化化合物和提取物的黑色素合成抑制的百分比与125 µg/mL处理浓度的熊果苷的百分比抑制比较。

表4：皮肤亮化化合物和提取物的黑色素合成抑制

* 对于100 µg/mL处理浓度的皮肤治疗化合物/提取物和125 µg/mL的熊果苷测定的%抑制。值是两个处理孔的平均值。

** 对于浓度50 µg/mL的硫辛酸的%抑制是53.9 %，与用125 µg/mL熊果苷处理的61.4 %抑制相比。

-- 未获得数据。

图5-8说明了与熊果苷阳性对照(三角形)相比，分别对于荷叶碱、贝母辛碱、柏子仁提取物和泽兰提取物(方块)的示例性的黑色素合成抑制数据。

表4和图5-8的数据证实了测试的许多皮肤亮化化合物和提取物显示与较高浓度的阳性对照熊果苷相比，类似的或增加的抑制黑色素合成产生的能力。

酪氨酸酶活性

评价了皮肤治疗化合物和提取物抑制酪氨酸酶活性的能力。酪氨酸酶参与黑色素产生，因此酪氨酸酶的抑制可抑制黑色素产生，这可导致皮肤颜色的亮化和/或抑制皮肤颜色进一步暗化。熊果苷是一种用于皮肤亮化处理的常规植物来源的化合物，因此选择用作阳性对照。

程序

B16-F10细胞使用胰蛋白酶-EDTA经胰蛋白酶化，和测定细胞密度。在包含补充有胎牛血清的RPMI 1640的生长培养基中，将细胞浆液稀释至18,000个细胞/毫升(mL)的浓度。以1mL/孔(18,000个细胞/孔)，将稀释的细胞浆液分配至24孔细胞培养板的各孔中(BD FalconCat. #353047)。在37℃和5% CO₂下在潮湿条件下将细胞孵育过夜。

铺板的细胞通过在100%二甲基亚砜(DMSO)中制备200x稀释的各皮肤亮化化合物、植物提取物和熊果苷(阳性对照)进行处理。将5 µL的200x稀释液加入至各孔。在37℃和5%CO₂下在潮湿条件下将处理的细胞孵育72小时。评价了浓度为0 (未处理)、10、50和100 µg/mL的皮肤亮化化合物和提取物。评价了浓度为0 (未处理)、25、125和250 µg/mL的熊果苷。

当处理阶段完成时，弃去各孔的培养基，细胞用1 mL/孔的DPBS洗涤一次。除去DPBS洗涤液，和将80 µL的含0.1 % Triton-X的PBS加入各孔，和在-80℃下冷冻细胞以溶解细胞。将细胞冷冻和恢复3次。溶解的细胞转移至V-底板中和在4℃以3000 rpm离心10 min。接下来，将60 µL的各样品上清液加入UV板和用140 µL的3,4-二羟基-L-苯丙氨酸(L-DOPA;SIGMA Cat. #D9628)稀释。将样品在37℃下孵育1小时。各孔的UV吸光度使用读板器测定，主波长设定在475 nm。

根据以下方程，酪氨酸酶抑制使用475 nm处的UV吸光度测定：

%Inh = (最大信号 - 化合物信号)/(最大信号 – 最小信号)x100

其中“%Inh”是酪氨酸酶的百分比抑制，“最大信号”是用L-DOPA处理的细胞的UV吸光度，和“最小信号”是未用L-DOPA处理的细胞的UV吸光度。

结果

酪氨酸酶抑制测定法的结果提供在下表5中。将对于100 µg/mL处理浓度的各皮肤亮化化合物和提取物的酪氨酸酶抑制的百分比与对于125 µg/mL处理浓度的熊果苷的百分比抑制进行比较。

表5：对于皮肤亮化化合物和提取物的酪氨酸酶抑制

表5的数据证实测试的许多皮肤亮化化合物和提取物显示与较高浓度的阳性对照熊果苷相比，类似的或增加的抑制酪氨酸酶活性的能力。

黑色素清除

评价了皮肤治疗化合物和提取物清除皮肤细胞内已有的黑色素的能力。黑色素是皮肤细胞中的一种色素，其是皮肤着色和各种色素沉着病症例如老年斑和雀斑的原因。清除细胞内已有的黑色素可导致皮肤颜色的亮化和/或抑制皮肤颜色的进一步暗化。熊果苷是一种用于皮肤亮化处理的常规植物来源的化合物，因此选择用作阳性对照。

程序

B16-F10细胞使用胰蛋白酶-EDTA经胰蛋白酶化，和测定细胞密度。在包含补充有胎牛血清的RPMI 1640的生长培养基中，将细胞浆液稀释至18,000个细胞/毫升(mL)的浓度。以1mL/孔(18,000个细胞/孔)，将稀释的细胞浆液分配至24孔细胞培养板的各孔中。在37℃和5% CO₂下在潮湿条件下，将细胞孵育过夜。

在过夜孵育后，弃去培养基，和用1mL/孔的包括50 µM福斯高林(Sigma Cat.#F6886)和10 µM 8-甲氧沙林(8-MOP; Alfa Aesar Cat. #A17108)的生长培养基替换。然后在37℃和5% CO₂下在潮湿条件下将细胞孵育72小时。

铺板的细胞通过在100%二甲基亚砜(DMSO)中制备200X稀释的各皮肤亮化化合物、植物提取物和熊果苷(阳性对照)进行处理。弃去各孔的培养基和用1 mL/孔替换。将5 µL的200X稀释液加入各孔。在37℃和5% CO₂下在潮湿条件下将处理的细胞孵育72小时。评价浓度为0 (未处理)、10、50和100 µg/mL的皮肤亮化化合物和提取物。评价浓度为0 (未处理)、25、125和250 µg/mL的熊果苷。

当处理阶段完成时，弃去各孔的培养基，和将细胞用1 mL/孔的DPBS洗涤一次。除去DPBS洗涤液，和加入150 µL的1N氢氧化钠至各孔，持续30分钟，同时在80℃将细胞孵育以溶解细胞。接下来，将来自各孔的145 µL转移至UV板，和测试剩余的5 µL以确定蛋白浓度。各孔的UV吸光度使用读板器测定，主波长设定至400 nm。

根据以下方程，黑色素清除使用400 nm处的UV吸光度测定：

%Inh = (最大信号 - 化合物信号)/(最大信号 - 最小信号)x100

其中“%Inh”是从细胞清除的黑色素百分比，“最大信号”是对于用福斯高林和8-MOP处理的细胞的UV吸光度，和“最小信号”是未处理细胞的UV吸光度。

结果

黑色素清除测定法的结果提供在下表6中。将用100 µg/mL处理浓度的各皮肤亮化化合物和提取物处理后的黑色素的百分比降低与对于用125 µg/mL处理浓度的熊果苷处理的细胞的百分比降低进行比较。

表6：对于皮肤亮化化合物和提取物的黑色素清除

** 对于100 µg/mL处理浓度的皮肤治疗化合物/提取物和100 µg/mL的氢醌测定的%抑制。值是两个处理孔的平均值。

图9-11说明了分别对于荷叶碱、贝母辛碱和柏子仁提取物(方块)的示例性的黑色素清除数据，与熊果苷阳性对照(三角形)相比较。表6和图9-11的数据证实了测试的许多皮肤亮化化合物和提取物显示与较高浓度的阳性对照熊果苷相比，类似的或增加的清除细胞内已有的黑色素的能力。清除黑色素的能力表明，这些化合物和提取物可在皮肤治疗组合物中用作除色素剂以减少或甚至清除皮肤斑和不需要的皮肤色素沉着。

表3-5的数据证实了当前实施方案的数种皮肤亮化化合物和提取物能够抑制细胞中的黑色素产生至类似于常规皮肤亮化化合物的程度，和有时好于该常规化合物，对细胞具有类似或更低的毒性。因此，这些皮肤亮化化合物和提取物可用于治疗皮肤色素沉着病症。表3和6的数据证实了当前实施方案的数种皮肤亮化化合物和提取物能够降低细胞中已有的黑色素的浓度至类似于常规皮肤亮化化合物的程度，和有时好于该常规化合物，对细胞具有类似或更低的毒性。这些皮肤亮化化合物和提取物可在皮肤治疗组合物中用作除色素剂。

示例性的皮肤治疗组合物可包括单独或组合存在的荷叶碱和贝母辛碱的组合，其量有效抑制人皮肤细胞中的黑色素产生。皮肤治疗组合物可包括一种或多种药学上可接受的添加剂以形成适合于在受试者的皮肤上局部施用的组合物。任选地，荷叶碱和贝母辛碱单独或组合存在，其量有效抑制人皮肤细胞中的酪氨酸酶活性。任选地，荷叶碱和贝母辛碱单独或组合存在，其量有效降低在人皮肤细胞中存在的已有黑色素的浓度。在一个实例中，荷叶碱和贝母辛碱存在于皮肤治疗组合物中，其量使得在根据预定的治疗方案局部治疗受试者的皮肤后，有效地明显亮化受试者的皮肤。在另一个实例中，荷叶碱和贝母辛碱组合形成混合物，其可被包括在皮肤治疗组合物中用于亮化受试者的皮肤。

另一个示例性的皮肤治疗组合物可包括单独或组合存在的柏子仁提取物和泽兰提取物的组合，其量有效抑制人皮肤细胞中的黑色素产生。皮肤治疗组合物可包括一种或多种药学上可接受的添加剂，以形成适合于在受试者的皮肤上局部施用的组合物。任选地，柏子仁提取物和泽兰提取物单独或组合存在，其量有效抑制人皮肤细胞中的酪氨酸酶活性。任选地，柏子仁提取物和泽兰提取物单独或组合存在，其量有效降低人皮肤细胞中存在的已有黑色素的浓度。在一个实例中，柏子仁提取物和泽兰提取物存在于皮肤治疗组合物中，其量使得根据预定的治疗方案在局部治疗受试者的皮肤后，有效地明显亮化受试者的皮肤。在另一个实例中，柏子仁提取物和泽兰提取物组合形成混合物，其可被包括在皮肤治疗组合物中用于亮化受试者的皮肤。

术语“包含”或“包括”在本文中以其最广泛的含义使用，意指和涵盖“包括”、“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”的概念。使用“例如”和“包括”以列举示例性的实例，不仅仅限于所列出的实例。因此，“例如”意指“例如但不限于”，和涵盖其它类似或等同的实例。本文使用的术语“约”用于合理地包括或描述通过仪器分析测量的或由于样品处理导致的数值的较小变动。这样的较小变动可以大约为数值的±0-10、±0-5或±0-2.5%。此外，当关系到数值范围时，术语“约”适用于两个数值。此外，术语“约”可适用于数值，甚至当未明确说明时。

一般而言，如本文所用的，在数值范围中的连字符“-”或短划线“–”是指“至”或“到”；“>”是指“高于”或“大于”；“≥”是指“至少”或“大于或等于”；“<”是指“低于”或“小于”；和“≤”是指“至多”或“小于或等于”。单独地，各个上述对于一个专利、多个专利和/或专利申请公布的应用在一种或多种非限制性实施方案中通过引用以其整体明确地结合到本文中。

应理解，随附权利要求不限于表述在详细描述中描述的特定化合物、组合物或方法，在特定实施方案之间其可变化，这落入随附权利要求的范围内。关于依赖于本文以描述各个实施方案的特定特征或方面的任何马库什组，应理解不同的、专门的和/或意外的结果可从各马库什组的各成员获得，不依赖于所有其它的马库什成员。可单独和/或组合地依赖于马库什组的各成员，和对在随附权利要求范围内的特定实施方案提供足够的支持。

还应理解，任何范围和子范围依赖于描述本发明的各个实施方案，独立和共同落入随附权利要求的范围内，和应理解为描述和预期所有范围，包括其中的全部和/或部分的值，即使这样的值没有在本文明确写出。本领域技术人员容易地认识到，列举的范围和子范围足以描述和完成本发明的各个实施方案，和这样的范围和子范围可进一步描述成相关的一半、三分之一、四分之一、五分之一等。仅作为一个实例，范围“从0.1至0.9”可进一步描述成下三分之一，即从0.1至0.3，中间三分之一，即从0.4至0.6，和上三分之一，即从0.7至0.9，其单独和共同地在随附权利要求的范围内，和可单独和/或共同地依赖，并对随附权利要求的范围内的特定实施方案提供足够的支持。此外，关于定义或修饰范围的语言，例如“至少”、“大于”、“小于”、“不超过”等，应理解这样的语言包括子范围和/或上限或下限。作为另一个实例，范围“至少10”固有地包括从至少10至35的子范围，从至少10至25的子范围，从25至35的子范围等，和可单独或共同依赖各个子范围，和为随附权利要求的范围内的特定实施方案提供足够的支持。最后，可依赖在所公开的范围内的单个值，和为随附权利要求的范围内的特定实施方案提供足够的支持。例如，范围“从1至9”包括不同的各单独整数，例如3，以及包括小数点(或分数)的各单独成员，例如4.1，其可依赖，并对随附权利要求的范围内的特定实施方案提供足够的支持。

在本文中以说明的方式已经描述了本发明，和应理解，已经使用的术语意图预期在本质上是描述性词语而不是限制性词语。根据上述教导，本发明的许多变化和改变是可能的。除了在随附权利要求的范围内明确描述的之外，本发明可以其它方式实践。本文明确预期独立和从属权利要求(单一从属和多重从属)的所有组合的主题。

Claims

1.用于治疗人皮肤中的色素沉着的组合物，所述组合物包含：

一种或多种药学上可接受的添加剂；

至少一种选自以下的黑色素产生抑制剂：

环常绿黄杨碱D、硫辛酸、荷叶碱、贝母辛碱、洋橄榄苦甙、唐古特红景天(Rhodiola algida)提取物、狭叶红景天(Rhodiola kirilowii) (Regel) Maxim提取物、Glycyrrhizae Radix et Rhizoma提取物、大蓟(Cirsii japonici herba)提取物、柏子仁(Platycladi semen)提取物、红缨合耳菊(Synotis erythropappa)提取物、沙苑子(Astragali complanati)种子提取物、车前子(Plantaginis)种子提取物、泽兰(Lycopi herba)提取物、芡实(Euryales)种子提取物、菟丝子(Cuscutae)种子提取物、Amomi fructus提取物、塔拉豆(Tara seed)提取物、侧柏叶(Platycladi cacumen)提取物、杜仲(Eucommiae cortex)提取物、山药(Dioscoreae rhizoma)提取物和小蓟(Cirsii herba)提取物，和

其中所述至少一种黑色素产生抑制剂以有效抑制人皮肤细胞中的黑色素产生的量存在。

2.权利要求1的组合物，其中所述至少一种黑色素产生抑制剂以有效抑制人皮肤细胞中的酪氨酸酶活性的量存在。

3.权利要求2的组合物，其中所述至少一种黑色素产生抑制剂选自：

硫辛酸、唐古特红景天提取物、狭叶红景天(Regel) Maxim提取物、Glycyrrhizae Radix et Rhizoma提取物、大蓟提取物、柏子仁提取物和红缨合耳菊提取物。

4.权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述至少一种黑色素产生抑制剂以有效减少人皮肤细胞中存在的黑色素的浓度的量存在。

5.权利要求4的组合物，其中所述至少一种黑色素产生抑制剂选自：

环常绿黄杨碱D、硫辛酸、荷叶碱、贝母辛碱、狭叶红景天(Regel) Maxim提取物和柏子仁提取物。

6.权利要求1的组合物，其中所述药学上可接受的添加剂选自：水、甘油、蜡、醇、植物油、矿物油、硅酮、脂肪酯、脂肪醇、二醇和聚二醇。

7.权利要求1的组合物，其中所述组合物被包括在适合于局部施用至人皮肤的凝胶、霜剂、气溶胶喷雾剂、分散液、水包油乳液、油包水乳液、硅酮包水乳液、泡沫、液体、摩丝、润发脂、粉末、固体和软膏的至少一种中。

8.在人皮肤的局部治疗中包含的一种混合物，所述混合物包含：

至少一种除色素剂，其选自：

环常绿黄杨碱D、硫辛酸、荷叶碱、贝母辛碱、洋橄榄苦甙、狭叶红景天(Regel) Maxim提取物和柏子仁提取物，和

其中所述至少一种除色素剂以在人皮肤上施用局部治疗后有效减少人皮肤细胞中存在的黑色素的浓度的量存在。

9.权利要求8的混合物，其中所述至少一种除色素剂以有效实现以下至少一项的量存在：抑制人皮肤细胞中的黑色素产生，和抑制人皮肤细胞中的酪氨酸酶活性。

10.在人皮肤的局部治疗中包含的一种混合物，所述混合物包含：

至少一种黑色素产生抑制剂，其选自：

环常绿黄杨碱D、硫辛酸、荷叶碱、贝母辛碱、洋橄榄苦甙、唐古特红景天提取物、狭叶红景天(Regel) Maxim提取物、Glycyrrhizae Radix et Rhizoma提取物、大蓟提取物、柏子仁提取物、红缨合耳菊提取物、沙苑子种子提取物、车前子种子提取物、泽兰提取物、芡实种子提取物、菟丝子种子提取物、Amomi fructus提取物、塔拉豆提取物、侧柏叶提取物、杜仲提取物、山药提取物和小蓟提取物，和

其中所述至少一种黑色素产生抑制剂以在人皮肤上施用局部治疗后有效抑制人皮肤细胞中的黑色素产生的量存在。

11.权利要求10的混合物，其中所述至少一种黑色素产生抑制剂以有效抑制人皮肤细胞中的酪氨酸酶活性的量存在。

12.权利要求11的混合物，其中所述至少一种黑色素产生抑制剂选自：

13.权利要求10-12中任一项的混合物，其中所述至少一种黑色素产生抑制剂以有效减少人皮肤细胞中存在的黑色素的浓度的量存在。

14.权利要求13的混合物，其中所述至少一种黑色素产生抑制剂选自：

15.制备用于治疗人皮肤的组合物的方法，其中所述方法包括：

提供一种或多种药学上可接受的添加剂；

提供有效抑制人皮肤细胞中的黑色素产生的量的至少一种黑色素产生抑制剂，所述黑色素产生抑制剂选自：

环常绿黄杨碱D、硫辛酸、荷叶碱、贝母辛碱、洋橄榄苦甙、唐古特红景天提取物、狭叶红景天(Regel) Maxim提取物、Glycyrrhizae Radix et Rhizoma提取物、大蓟提取物、柏子仁提取物、红缨合耳菊提取物、沙苑子种子提取物、车前子种子提取物、泽兰提取物、芡实种子提取物、菟丝子种子提取物、Amomi fructus提取物、塔拉豆提取物、侧柏叶提取物、杜仲提取物、山药提取物和小蓟提取物。

16.权利要求15的方法，包括提供有效抑制人皮肤细胞中的酪氨酸酶活性的量的所述至少一种黑色素产生抑制剂。

17.权利要求16的方法，其中所述至少一种黑色素产生抑制剂选自：

18.权利要求15-17中任一项的方法，包括提供有效减少人皮肤细胞中存在的黑色素的浓度的量的所述至少一种黑色素产生抑制剂。

19.权利要求18的方法，其中所述至少一种黑色素产生抑制剂选自：

20.权利要求15的方法，包括使所述组合物形成为适合于局部施用至人皮肤的凝胶、霜剂、气溶胶喷雾剂、分散液、水包油乳液、油包水乳液、硅酮包水乳液、泡沫、液体、摩丝、润发脂、粉末、固体和软膏的至少一种。