KR101824770B1 - 적하수오 부정근 추출물을 함유하는 피부 주름개선 기능성 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생약재 추출물을 함유하는 인체 피부주름 예방 및 개선 기능성 화장료 조성물 및 그 추출 방법에 관한 것으로 적하수오 부정근으로부터 추출된 유효성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부주름 예방 및 개선 기능성 화장료 조성물을 제공하며 나아가 인체 피부의 항산화, 엘라스테이즈 활성저해, 콜라게네이즈 발현저해 및 피부주름개선 임상시험에서 우수한 효과를 발휘할 뿐만 아니라 피부에 부작용이 없는 동시에 피부주름개선 효과가 뛰어난 효과를 제공한다.

Description

적하수오 부정근 추출물을 함유하는 피부 주름개선 기능성 화장료 조성물{Anti-wrinkle cosmetic composition comprising essentially Polygonum multiflorum adventitious extract}

본 발명은 적하수오 조직배양결과 얻은 부정근 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름개선용 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

인체의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리화학적인 변화가 일어난다. 그 원인으로는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 자외선, 스트레스, 질병 상태, 환경 인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 프리라디칼이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다.

한편, 노화에는 이러한 프리라디칼 뿐만 아니라 콜라겐 분해효소인 기질 금속 단백질 분해 효소(Matrix Metalloproteinase; MMP)라는 효소도 관여한다. 즉, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되고 있는데, 노화가 진행되면서 콜라겐 합성이 감소하고, 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해 효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한, 자외선 조사에 의해서도 이러한 분해 효소가 활성화되기도 한다.

본 발명의 피부주름개선 기능성 화장료 조성물을 구성하는 생약재 추출물의 제조에 사용되는 적하수오(赤何首烏, Polygonum multiflorum Thunberg)는 마디풀과에 속하는 다년생 만년 초본이며, 뿌리를 자른 면은 엷은 유황색 또는 갈색으로서, 원형의 특이한 무늬를 이루고 있으며 국내에서는 전남, 경남북, 충북, 강원, 경기, 함남 지방 등 각지에 분포되었고, 중국, 일본 및 한국에서 가장 유명한 강장제 중의 하나로 알려져 있다.

적하수오추출물과 관련된 선행기술로는 피부미백과 관련하여 대한민국 공개특허 제10-2009-0120810호, 대한민국 등록특허 제10-1052189호가 공지되어 있고 피부노화와 관련하여서는 대한민국 등록특허 제10-0829846호가 공지되어 있다. 또, 대한민국 등록특허 제10-0966835호에는 감초, 승마, 하수오, 흑임자, 상황버섯, 당귀, 상백피, 백작약, 고삼, 황금으로 구성되어진 식물혼합 추출물이 미백 및 항주름 효과가 있다는 사실이 개시되어 있고 대한민국 등록특허 제10-1178594호에는 하수오추출물, 대추추출물 및 황촉규추출물을 함유하는 보습 및 항산화 효과의 화장료 조성물에 대하여 개시된 바 있다. 또한, 적하수오 추출물을 함유하는 피부주름개선 기능성 화장료 조성물(특허출원 제10-2013-0055367, 적하수오 추출물을 함유하는 피부주름 개선 기능성 화장료 조성물)에 대한 연구가 진행되었다.

그러나 현재까지 적하수오의 조직배양 및 그의 산물에 대한 연구는 전무한 실정이며 적하수오의 조직배양 결과 얻은 부정근의 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 대하여는 상기 선행기술의 어디에도 암시되거나 개시된 바 없다.

식물의 조직배양은 기관의 조직이나 세포를 식물체로부터 분리하여 적당한 환경조건하에서 무균적으로 배양하여 식물체로서 완전한 기능을 갖는 개체로 재생시키는 일련의 기술을 말한다. 조직배양의 장점으로 바이러스가 없는 개체를 얻을 수 있고, 유전적으로 특이한 새로운 특성을 가진 식물체를 분리해 낼 수 있으며, 일정한 식물체를 단시간 내에 대량으로 번식시킬 수 있으며, 좁은 실내에서도 연중 증식이 가능함과 동시에 육종 연한을 단축시킬 수 있다는 장점이 있다. 조직배양의 방법에는 완전식물체배양, 배배양, 기관배양, 캘러스배양, 단일세포배양, 원형질체배양 등이 공표되어 있다.

따라서 본 발명의 목적은 식물조직배양기술과 생물반응기를 이용하여 얻은 적하수오 부정근 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름개선 기능성 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 피부에 부작용을 초래하지 않고, 피부자극이 없이 안전하며, 항산화, 엘라스테이즈 활성저해, 콜라게네이즈 발현저해 효과가 뛰어난 피부주름개선 기능성 화장료 조성물을 이용한 다양한 제형을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 본 발명은 피부 주름개선 효과를 갖는 적하수오 부정근 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

(a) 적하수오의 뿌리로부터 무균상태의 기내 유도배지로부터 부정근을 유도하는 단계와; (b) 상기 단계에서 얻은 적하수오 부정근을 소정의 추출용매를 가하여 추출하는 단계와; (c) 상기 단계에서 수득한 추출물에 분획용 유기용매를 가하여 분획하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

여기서, 상기(a)단계의 부정근 유도는 당업계에서 통상적으로 이용되는 방법으로 수행될 수 있다. 상기 부정근 유도 배지는 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 특별한 제한없이 사용이 가능하다. 바람직하기로는 SH (Schenk and Hildebrandt), MS (Murashige &Skoog, 1962) 배지 또는 화이트 배지(White 배지)를 이용하는 것이 바람직하나 단지 이에만 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 부정근 유도배지에 병용할 수 있는 식물 생장조절제는 IBA (indole butyric acid), IAA (indole acetic acid), NAA (naphthalene acetic acid), GA (gibberellin) 또는 BAP (benzyl amino purine) 등이 첨가될 수 있으나, 이들에 특히 제한되지는 않는다. 또 유인제로서는 생리활성물질을 증가시킬 수 있는 자극이라면 화학적 혹은 물리적인 유인제가 될 수 있으며, MJ (Methyl jasmonate) 및 SA (Salicylic acid) 등이 첨가될 수 있으며 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 배지에 첨가되는 상기 성분들의 함량은 본 발명의 효과를 달성할 수 있는 범위 내에서 변동될 수 있다는 것은 당업자가 용이하게 인식할 수 있다.

상기 (a)단계에서 부정근은 생체중 기준으로 1~20 g/L로 접종할 수 있으며, 바람직하게는 5 g/L로 접종할 수 있다.

상기 (b)단계에서 추출용매는 정제수, 탄소수 1 내지 4인 무수 또는 함수 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올, 글리세린, 프로필렌글라이콜 및 부틸렌글라이콜을 포함한 용매군 중에서 선택된 어느 하나의 순수용매 또는 둘 이상이 조합된 혼합용매가 이용되며, 상기 약재에 가해지는 추출용매는 상기 약재 전체 부피 대비 1 내지 20배의 양이면 바람직하다. 또한, 상기 추출용매를 가한 후 진행되는 추출공정은, 5 내지 37℃의 온도조건에서 1 내지 15일간 침적 추출하는 침지법, 냉각콘덴서를 장착시킨 후 50 내지 95℃의 온도조건에서 4 내지 20시간동안 가열 추출하는 환류 냉각법 또는 30 내지 60℃의 온도조건에서 4 내지 20시간 동안 초음파 조사를 수행하여 추출하는 초음파추출법 중에서 선택하여 병행할 수도 있다.

상기 (c)단계에서 사용되는 분획용 유기용매로는 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 트리클로로메탄 및 부틸알코올 중에서 선택된 유기용매 단독 또는 이들을 혼합하여 사용될 수 있다.

한편, 상기 본 발명 방법에 따라 수득한 상기 적하수오 부정근 추출물을 화장료에 적용하는 경우에는 화장료 전체 조성물 중량을 기준으로 0.001 내지 10중량%이면 피부 주름개선에 충분한 효과를 발휘할 수 있다. 상기 추출된 화장료 유효성분의 함량이 전체 화장료 중량대비 0.001중량% 미만인 경우에는 본래 목적하는 효과를 충분하게 달성할 수 없어 바람직하지 못하며, 상기 추출된 화장료 유효성분의 함량이 전체 화장료 중량대비 10중량%를 초과하는 경우에는 화장료의 안정성에 문제를 발생시킬 수 있으며, 이로 인하여 화장료의 외관이나 사용시 충분한 화장효과를 발현시킬 수 없는 단점으로 인해 바람직하지 못하다.

본 발명은 적하수오 부정근 추출물의 용매분획물, 특히 에칠아세테이트 분획물이 안전하면서도 피부주름개선에 유용하다는 발견에 기초한다.

본 발명에 따르면 적하수오 부정근 추출물로부터 항산화, 엘라스테이즈 활성저해, 콜라게네이즈 발현저해 효과 및 피부주름개선 효과가 있는 유효성분을 추출하여 이를 유효성분으로 하는 화장료 조성물을 제공하고 특히 피부주름개선을 위해 다양한 제형으로 사용될 수 있으며, 예컨대 스킨류, 로션류, 에센스류, 크림류, 팩류, 파운데이션류 및 메이크업베이스류와 같은 다양한 상품 유형으로 제조될 수 있다. 물성적인 측면에서는 액상, 크림상, 페이스트상 및 고체상 등 다양한 성상으로 적용가능하며, 통상적인 화장료 제조법에 적용시킬 수 있음은 또한 자명하다.

본 발명 적하수오 부정근 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 항산화, 엘라스테이즈 활성저해 및 콜라게네이즈 발현저해 활성에 뛰어난 효과가 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예, 실험예 등의 구체적인 예를 들어 설명하기로 한다. 그러나 본 발명에 따른 실시예 또는 실험예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 예들에 한정되는 것으로 해석되어지지 않아야 한다. 본 발명에 따른 실시예 및 실험예들은 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공 되어지는 것에 불과하므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

이하, 본 발명의 구체적인 내용을 실시예와 실험예를 들어 상세히 설명한다.

<실시예 1> 적하수오 부정근의 유도 및 증식

적하수오를 4% 및 2% 차아염소산 나트륨(sodium hypochlorite)용액으로 각각 20분, 10분씩 표면 살균한 뒤 멸균수로 3회 세척하였다. 그 후 30 g/L가 첨가된 MS 배지(Murashige and Skoog)를 이용하여 무균상태의 기내 식물체를 유도하였다. 유도된 식물체를 절단하여 30 g/L가 첨가된 3/4 MS 배지에 IBA (Indole-3-butyric acid) 1 mg/L의 생장조절물질을 첨가하여 22±1℃, 암조건에서 4, 혹은 8주간 배양하였다. 배지는 1 N 수산화칼륨(KOH)을 이용하여 pH 5.8로 조정하고 공기주입량을 0.1 vvm로 하여 3 L 풍선형 생물반응기로 배양하였다. 적하수오 부정근은 세척 후 동결건조 및 열풍건조를 통해 건조하여 실험에 사용하였다.

< 실시예 2> 적하수오 부정근 추출물 제조

(1) 적하수오 부정근 유기용매 추출물

건조된 적하수오 부정근 100 g에 75% 에탄올 수용액 600 mL를 가한 후 1차 열수추출하고, 용매를 여과한 후 다시 75% 에탄올 수용액 600 mL를 가하여 2차 추출하고 용매를 여과한 후, 1차 및 2차 추출물을 합하고 감압농축기를 이용하여 용매를 제거함으로써 에탄올 추출물을 얻었다.

(2) 적하수오 부정근 에틸아세테이트 분획추출물

상기 실시예 2-(1)에 600 mL의 물을 가하고 초음파조사를 통해 적하수오 에탄올 추출물이 고르게 분산된 현탁액을 제조한 후, 동량의 에칠아세테이트를 첨가하여 분획추출하였다. 이를 와트만(Whatman) No. 2여과지로 여과하고 감압농축기를 이용하여 농축하고, 동결건조시켜 에칠아세테이트 분획물을 얻었다.

(3) 적하수오 부정근 부틸알코올 분획추출물

상기 실시예 2-(1)에 600 mL의 물을 가하고 초음파조사를 통해 적하수오 에탄올 추출물이 고르게 분산된 현탁액을 제조한 후, 동량의 부틸알코올을 첨가하여 분획추출하였다. 이를 와트만(Whatman) No. 2여과지로 여과하고 감압농축기를 이용하여 농축하고, 동결건조시켜 부틸알코올 분획물을 얻었다.

< 실험예 1> 항산화효과시험

본 발명의 상기 실시예 2-(1), 2-(2), 2-(3)에 따라 수득된 적하수오 부정근 추출물에 대하여 주름의 억제 및 개선 효과 검정시험으로 항산화효과를 알아보기 위하여 자유라디칼소거실험(Free Radical Scavenging Activity Test), 활성산소(superoxide anion)소거활성실험을 실시하였다. 자유라디칼소거시험은 Kim 등(Kor. J. Pharmacogn., 24 (4), 299~303 (1993))의 방법을 변형한 것으로써, 안정한 자유라디칼인 DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical) (Sigma)을 사용하였다.

먼저, 0.2 mM DPPH 용액 1 mL에 상기 실시예에 따라 수득된 각각의 적하수오 부정근 추출물 각각의 시료를 메탄올에 적당한 농도로 희석하여 2 mL 혼합하고, 실온에서 10분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정한다.

한편, 상기 자유라디칼소거시험에서의 대조군은 시료용액 대신 메탄올을 넣어 같은 방법으로 측정하며, DPPH 용액 대신 메탄올을 넣어 생약재 추출물 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였고, 비교군으로서 일반적인 항산화제로 잘 알려진 α-tocopherol을 사용하였다(참고문헌: Muruhan, S. 외, In vitro antioxidant activities of solanum surattense leaf extract, Asian Pacific journal of tropical biomedicine, 3(1), 28-34 (2013)).

하기 [수학식 1]을 이용하여 자유라디칼소거율을 수치로 계산하여 하기 [표 2]에 나타내었다. 하기 [표 1]에서, IC₅₀은 자유라디칼소거율 50%를 달성하기 위해 소요되는 시료의 농도로서 다른 성분물질과 상대적으로 비교할 때 사용하는 수치로서 값이 작을수록 소거율이 높음을 나타낸다.

활성산소소거실험은 Noro 등(Chen. Pharm. Bull., 31, 3984~3987 (1983))의 방법을 변형한 것으로, 활성산소(superoxide anion)소거활성평가는 잔틴/잔틴옥시다제(xanthine/xanthine oxidase)효소반응에 의한 활성산소 발생계를 이용하여 활성산소에 의한 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolim, NBT)의 산화에 의한 흡광도의 변화를 측정하였다.

Na₂CO₃ 2.4 mL, xanthine 0.1 mL, EDTA 0.1 mL, BSA 0.1 mL, NBT 0.1 mL, 시료 0.1 mL을 넣고 잘 혼합하여 25℃에서 10분간 정치하였다. Xanthine oxidase 0.1 mL을 넣고 25℃에서 20분간 반응시킨 후, 6 mM CuCl₂를 넣어 반응을 정지시켰다. ELISA reader를 사용하여 파장 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.

한편, 상기 활성산소소거활성시험에서의 대조군은 시료용액 대신 정제수를 넣어 같은 방법으로 측정하며, xanthine oxidase 용액 대신 정제수를 넣어 생약재 추출물 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였고, 비교군으로서 일반적인 항산화제로 잘 알려진 α-tocopherol을 사용하였다.

하기 [수학식 2]를 이용하여 활성산소소거율을 수치로 계산하여 하기 [표 2]에 나타내었다. 하기 [표 1]에서, IC₅₀은 활성산소소거율 50%를 달성하기 위해 소요되는 시료의 농도로서 다른 성분물질과 상대적으로 비교할 때 사용하는 수치로서 값이 작을수록 소거능이 높음을 나타낸다.

본 발명 적하수오 추출물의 항산화 효과

구 분	추출 및 분획방법	자유라디칼소거능 IC50(㎍/mL)	활성산소소거능 IC50(㎍/mL)
실시예 2-1	적하수오 부정근 에탄올 추출물	13.037±0.093	455.007±6.422
실시예 2-2	적하수오 부정근 에칠아세테이트 분획물	7.464±0.836	165.766±6.776
실시예 2-3	적하수오 부정근 부틸알코올 분획물	8.722±0.265	198.859±3.077
비교군	α-tocopherol	18.316±7.366	222.121±5.405

상기한 [표 1]에서 보는 바와 같이, 특히 에칠아세테이트 분획물에서 상대적으로 항산화 효과가 우수한 것으로 확인되었으며, 이러한 결과는 일반적인 항산화제로 알려진 α-tocopherol의 효과보다 더 양호한 것으로 확인되었다.

< 실험예 2> 엘라스테이즈 활성저해 시험

본 발명의 상기 각 실시예에 따라 수득된 추출물을 시료로 하여 피부주름의 억제 및 개선효과 검정시험으로서 엘라스테이즈 활성저해 시험(Elastase Inhibition Activity Test)을 실시하였다.

엘라스틴(Elastin)을 분해하는 효소인 엘라스테이즈의 활성을 측정하는 방법으로 엘라스테이즈 기질인 N-Succinyl-Ala-Ala-Ala ρ-nitroaniline을 이용하여 ρ-nitroaniline이 분해되면서 생기는 색의 변화를 410 nm의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 엘라스테이즈 활성을 측정하는 방법이다. 완충액은 pH 8.0, 0.267 M Trizma-HCl(Sigma), 기질액은 8.8 mM N-Succinyl-(Ala)₃ ρ-nitroaniline (Sigma), 효소액은 돼지췌장 엘라스테이즈를 10 ㎍/mL (Sigma)의 농도로 사용하였다. 완충액 60 μL, 기질액 20 μL와 상기 각 실시예에 따른 추출물 각각을 농도별로 정제수에 녹여 100 μL로 한 시료액을 섞은 후, 효소액 20 μL를 넣어 25℃ 항온수조에서 15분간 반응시켜 ρ-nitroaniline의 생성량을 ELISA reader를 사용하여 파장 405 nm에서 측정한다.

한편, 상기 엘라스테이즈 활성도를 측정하기 위한 대조군은 생약재 추출물 대신 정제수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 효소액 대신 정제수를 넣어 각각에 대한 색 보정값을 얻은 경우를 설정하였고, 비교군으로서 일반적인 엘라스테이즈 저해제로 잘 알려진 ursolic acid를 사용하였다(참고문헌: Lim, Suk-Won외, The effect of two terpenoids, ursolic acid and oleanolic acid on epidermal permeability barrier and simultaneously on dermal functions, 대한화장품학회지, 29(2), 205-232 (2003)).

하기 [수학식 3]를 이용하여 엘라스테이즈 활성저해율을 수치로 계산하여 하기 [표 2]에 나타내었다. 하기 [표 2]에서, IC₅₀은 엘라스테이즈 활성저해율 50%를 달성하기 위해 소요되는 추출물 시료의 농도로서 다른 성분물질과 상대적으로 비교할 때 사용하는 수치로서 값이 작을수록 저해능이 높음을 나타낸다.

본 발명 적하수오 추출물의 엘라스테이즈 활성저해능

구 분	엘라스테이즈 활성저해능 IC50(㎍/mL)
실시예 2-1	63.156±0677
실시예 2-2	54.416±0.900
실시예 2-3	31.999±0.926
비교군 (ursolic acid)	107.859±2.113

상기한 [표 2]에 나타낸 바와 같이, 엘라스테이즈 활성저해 효과는 실시예 대부분에서 좋은 효과를 보였으며, 특히 부틸알코올 분획물에서 상대적으로 엘라스테이즈 활성저해 효과가 현저히 우수한 것으로 확인되었으며, 이러한 결과는 일반적인 엘라스테이즈 저해제로 알려진 ursolic acid의 효과보다 더 양호한 것으로 확인되었다.

< 실험예 3> 콜라게네이즈 ( MMP -1) 발현 저해효과 시험

본 발명의 상기 각 실시예 2-(1), 2-(2), 2-(3)에 따라 수득된 적하수오 부정근 추출물을 시료로 하여 UV-A 조사에 의해 발현이 증가되는 콜라게네이즈(MMP-1)의 발현저해 효과를 실시하였다.

본 실험예에 사용된 정상 사람 섬유아세포(HS68, CRL 1635)는 ATCC으로부터 분양받아 사용하였다.

*세포를 10% 소혈청과 1% 항생제를 첨가한 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 1 x 10⁵ 세포의 밀도로 접종하고 하루 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양시켰다. 자외선 챔버를 이용하여 배양한 섬유아세포에 영향을 주지 않는 범위에서 UV-A를 조사한 후 시료가 첨가된 배지로 교환하여 48시간 배양한 다음 배지를 회수하여 콜라게네이즈 측정기구(미국 아머샴파마샤 사)를 이용하여 생성 정도를 측정하였다. 먼저 콜라게네이즈 1차 항체가 균일하게 도포된 96-웰 플레이트에 상기 세포배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라게네이즈 항체를 넣고 다시 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 발색유발물질을 넣어 실온에서 30분간 발색을 유발시키고, 다시 1 M 황산을 넣어 발색을 중지시켜 ELISA reader를 사용하여 파장 450 nm에서 측정하였다. 측정값은 하기 [수학식 4]에 의해 콜라게네이즈 발현 정도를 나타내었으며, 비처리군의 콜라게네이즈 발현 정도를 100으로 하여 [표 3]에 나타내었다. 이때 시료를 처리하지 않은 세포 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였으며, 비교군으로서 일반적인 콜라게네이즈 발현저해제로 잘 알려진 EGCG를 사용하였다.

본 발명 적하수오 추출물의 콜라게네이즈 발현저해 효과

구 분	콜라게네이즈 발현 정도(%)
실시예 2-1	60.241±0.965
실시예 2-2	27.108±0.432
실시예 2-3	57.531±1.358
EGCG	73.555±2.867

상기 [표 3]에 나타낸 바와 같이, 콜라게네이즈 발현저해 효과는 실시예 대부분에서 좋은 효과를 보였으며, 특히 에칠아세테이트 분획물에서 상대적으로 콜라게네이즈 발현저해 효과가 현저히 우수한 것으로 확인되었으며, 이러한 결과는 일반적인 콜라게네이즈 발현저해제로 알려진 EGCG의 효과보다 더 양호한 것으로 확인되었다.

이의 결과로 보아, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제로서 본 발명에 따른 적하수오 부정근 추출물은 주름개선효과를 검정하는 항산화, 엘라스테이즈 활성저해 효과, 콜라게네이즈 발현저해 효과를 가지며, 특히 적하수오 부정근 추출물의 에칠아세테이트 및 부틸알코올 분획물은 일반적으로 잘 알려진 항산화제인 α-tocopherol과 엘라스테이즈 활성저해제인 ursolic acid, 콜라게네이즈 발현저해제인 EGCG의 효과 보다 더 우수한 효과를 확인함으로써, 우수한 피부 주름개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

<제형 실시예 1> 제형 실시예 1 및 그 비교예 1

상기 실시예 2-(2)에 따른 생약재 추출물을 함유한 피부 주름개선용 화장수의 성분구성을 하기 [표 4]와 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다.

제형 실시예 1 및 그 비교예 1

번호	성 분	제형 실시예 1	제형 비교예 1
1	정제수	잔량	잔량
2	카보머	0.15	0.15
3	하이드록시에칠셀루로오스	0.05	0.05
4	부틸렌글라이콜	3.0	3.0
5	글리세린	2.0	2.0
6	피이지-1500	0.5	0.5
7	에탄올	6.0	6.0
8	폴리소르베이트 80	0.2	0.2
9	트리에탄올아민	0.15	0.15
10	방부제	미량	미량
11	실시예 2-2에 따른 생약재 추출물	0.5	-

상기 [표 4]의 각 성분 번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1(정제수)에 성분 2와 3을 교반 분산시킨 후, 성분 4 내지 6을 가하고, 성분 8 내지 10을 성분 7에 용해시킨 물질과 성분 11을 차례로 가하여 혼합하는 방식으로 제조하였다.

상기 제형 실시예 1에 대한 그 비교예 1은 성분 11인 실시예 2-(2)에 따른 생약재 추출물을 제외한 나머지 성분 구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

<제형 실시예 2> 제형 실시예 2 및 그 비교예 2

상기 실시예 2-(2)에 따른 생약재 추출물을 함유한 탄력로션의 성분구성을 하기 [표 5]과 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다.

제형 실시예 2 및 그 비교예 2

번호	성 분	제형 실시예 2	제형 비교예 2
1	세테아릴알코올	1.2	1.2
2	글리세릴스테아레이트	0.4	0.4
3	폴리소르베이트 60	0.9	0.9
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.3	0.3
5	유동파라핀	5.0	5.0
6	스쿠알란	5.0	5.0
7	마카데이나넛오일	4.0	4.0
8	글리세린	4.0	4.0
9	카보머	0.12	0.12
10	산탄검	0.03	0.03
11	방부제	미량	미량
12	정제수	잔량	잔량
13	아르기닌	0.12	0.12
14	실시예 2-2에 따른 생약재 추출물	1.0	-

하기 [표 6]의 각 성분 번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1 내지 7을 70℃의 온도에서 가열 용해시킨 다음, 성분 8 내지 11을 성분 12에 용해 분산시켜 70℃로 가열한 것에 유화한다. 이후, 상기 유화한 것을 성분 13으로 중화하고, 56℃의 온도로 냉각한 후, 성분 14를 가하여 교반하고 실온으로 냉각하여 제조하였다.

상기 제형 실시예 2에 대한 그 비교예 2는 성분 14인 실시예 2-(2)에 따른 생약재 추출물을 제외한 나머지 성분 구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

<제형 실시예 3> 제형 실시예 3 및 그 비교예 3

상기 추출 실시예 2-(2)에 따른 생약재 추출물을 함유한 탄력영양크림의 성분구성을 하기 [표 6]과 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다.

제형 실시예 3 및 그 비교예 3

번호	성 분	제형 실시예 3	제형 비교예 3
1	세테아릴알코올	1.5	1.5
2	글리세릴스테아레이트	1.0	1.0
3	폴리소르베이트 60	1.0	1.0
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.3	0.3
5	세틸옥타노에이트	6.0	6.0
6	스쿠알란	8.0	8.0
7	아프리코드커넬오일	4.0	4.0
8	디메치콘	2.0	2.0
9	글리세린	5.0	5.0
10	마그네슘알루미늄실리케이트	0.4	0.4
11	산탄검	0.03	0.03
12	방부제	미량	미량
13	정제수	잔량	잔량
14	실시예 2-2에 따른 생약재 추출물	2.0	-

상기 [표 6]의 각 성분 번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1 내지 7을 70 ℃의 온도에서 가열 용해시킨 다음, 성분 9 내지 12를 성분 13에 용해 분산시켜 70 ℃로 가열한 것에 유화한다. 이후, 상기 유화한 것을 56℃의 온도로 냉각한 후, 성분 14를 가하여 교반하고 실온으로 냉각하여 제조하였다.

상기 제형 실시예 3에 대한 그 비교예 3은 성분 14인 실시예 2-(2)에 따른 생약재 추출물을 제외한 나머지 성분 구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

이상에서 설명된 본 발명의 최적 실시예들이 개시되었다. 여기서 특정한 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 본 발명을 설명하기 위한 목적에서 사용된 것이지 의미한정이나 특허 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하기 위해 사용된 것이 아니다.

< 실험예 4> 피부노화 방지 및 피부자극 평가

본 발명에 따른 피부 주름 개선 및 노화방지용 화장료 조성물의 피부 주름개선효과 및 피부자극을 평가하기 위하여, 상기 제형 실시예 3과 비교예 3에서 제조된 탄력영양크림을 이용하여 관능시험을 실시하였다.

관능시험은 피부의 주름개선효과 항목에 대하여는 제형 실시예 3의 탄력영양크림을 기준으로 비교예 3의 탄력영양크림이 나타내는 주름개선효과를 상대적으로 평가하게 하였고, 피부자극에 대한 관능평가는 피부의 가려움, 따가움 및 홍반 등의 현상을 평가하게 하였다. 평가는 매우 우수(5점), 우수(4점), 보통(3점), 나쁨(2점), 매우 나쁨(1점)의 오점법 기준에 의거하여 수행하였으며, 그 결과를 하기 [표 7]에 나타내었다. 하기 [표 7]에서 피부자극은 피부자극이 없는 정도를 나타낸다.

제형 실시예 3과 비교예 3의 피부자극에 대한 관능평가 및 상대적 주름개선 효과

번호	피부자극		주름개선효과
	제형예 3	비교제형예 3
1	4	4	4
2	5	5	5
3	4	4	4
4	5	5	5
5	4	4	5
6	5	4	5
7	5	5	4
8	5	5	5
9	4	5	4
10	5	5	5
11	4	4	4
12	4	4	5
13	5	5	5
14	4	4	5
15	4	4	4
16	5	5	5
17	5	4	4
18	4	5	5
19	5	4	5
20	4	4	4
평균	4.50	4.45	4.60

상기 [표 7]에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 제형예 3의 화장료 조성물에 대한 피부자극 평가점수는 4.50점으로 매우 양호하게 평가되어, 비교제형예 3과 마찬가지로 피부자극 정도가 낮아 피부 안전성이 우수함을 확인할 수 있었다.

또한, 비교제형예 3 대비 제형예 3의 화장료 조성물이 가진 상대적인 피부의 주름개선효과는 평가점수 4.60점으로 개선 정도가 매우 우수함을 알 수 있었다.

< 실험예 5> 피부의 안전성 실험

상기한 본 발명의 실시예 2-(2)에 따른 적하수오 부정근 추출물과 상기 적하수오 부정근 추출물을 포함하는 화장료 조성물인 제형 실시예 3의 피부 안전성, 즉 피부반응의 관찰을 통해서 자극 혹은 알레르기성 반응의 발생 여부를 알아보기 위하여 한국식품의약품안전처 기준 피부안전성 검사법에 따라 인체첩포시험을 실시하였다.

피험자로 20세 이상 50세 이하의 건강한 성인 남, 여 30명을 선정하였고, 첩포시험은 대상자 상박 내측에 첩포를 부착하였으며 48시간이 지난 후 첩포를 제거하였다. 약 60분간 안정을 취하도록 한 후 첫 판독을 시행하였고, 첩포 부착 후 96시간이 경과한 후 2차 판독을 시행하였다. 판정기준은 하기 [표 8]에 나타낸 바와 같다.

첩보시험의 판정기준

반응	가중치	판정의 기준
-	0	무반응
	0.5	희미한 반응
+	1	경계가 뚜렷하나 약한, 홍반, 부종 및 구진
++	2	뚜렷한 홍반, 구진 및 수포
+++	3	대수포

첩포 부착 후 48시간과 96시간에 판독한 결과를 하기 [수학식 5]를 이용하여 시료에 대한 피부 반응도를 산출하였다.

첩포시험의 검사 결과에 근거하여 계산된 양성 반응을 보인 시료의 피부 자극도를 하기 [표 9]에 나타내었다.

첩포시험의 검사결과에 근거한 양성반응 시료의 피부 자극도

시료	48시간		96시간		반응도(%)
	+	++	+	++	48시간	96시간	평균
실시예 2-(2) (1% in Propanediol)	-	-	-	-	0.00	0.00	0.00
제형 실시예 3	-	-	-	-	0.00	0.00	0.00

피부의 평균 반응도 판정

피부의 평균 반응도	판정 기준
0.0 0.9	무자극
1.0 2.9	경자극
3.0 4.9	중자극
5.0 이상	강자극

상기 [표 9]에 제시된 바와 같이, 본 발명의 적하수오 부정근 추출물인 실시예 2-(2)와 상기 적하수오 부정근 추출물을 포함하는 화장료 조성물인 제형 실시예 3에 대한 인체첩포시험에서 상기 [표 10]에 나타낸 피부 반응도 판정 기준에 의하면 무자극으로 민감한 피부에 사용해도 좋은 결과로 나타났다. 따라서 상기한 본 발명의 생약재추출물 및 이를 포함하는 화장료 조성물은 피부부작용이 없는 안전한 성분으로 나타났다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 적하수오 부정근 추출물을 유효성분으로 함유한 피부주름개선 기능성 화장료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 화장품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (6)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 조직배양하여 얻은 적하수오(Polygonum multiflorum Thunberg) 부정근을 에탄올 추출하여 얻은 추출물에 가수하고 초음파 처리하여 얻은 현탁액을 다시 동량의 에틸아세테이트나 부틸알코올을 더 첨가하여 분획추출하고 여과 후 감압농축하여 제조된 적하수오 부정근의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름개선 기능성 화장료 조성물
6. 제 5항의 화장료 조성물이 스킨류, 로션류, 에센스류, 크림류, 팩류, 파운데이션류 및 메이크업베이스류 중에서 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 주름개선 기능성 화장료 조성물