CN106491595A - 鸦胆子苦素D在制备Wnt/Notch信号通路抑制剂药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了鸦胆子苦素D在制备Wnt/Notch信号通路抑制剂预防/治疗药物中的应用。本发明所述药物为由鸦胆子苦素D为活性成分与药用辅料组成的药物组合物，为口服制剂、注射剂或皮肤给药制剂。用人肝癌肿瘤细胞系和人正常肝细胞系模型评估鸦胆子苦素D体外抗肿瘤功效；用斑马鱼模型评价化合物鸦胆子苦素D对Wnt/Notch信号通路的抑制作用，实验结果100μM鸦胆子苦素D在不引起斑马鱼死亡的条件下，观察到Wnt信号通路抑制后所引起的体轴发育异常。通过鸦胆子苦素D的体内外抗肿瘤活性研究实验，首次公开鸦胆子苦素D对Wnt/Notch信号通路中关键蛋白的影响，验证了Wnt/Notch信号通路在肝癌中的重要作用以及Wnt/Notch信号通路的内在关系，提供鸦胆子苦素D在制备预防/治疗肝癌药物的新用途，为临床提供预防/治疗肝癌药物，有很大的应用价值。

Description

鸦胆子苦素D在制备Wnt/Notch信号通路抑制剂药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药，具体涉及中药提取物单体鸦胆子苦素D在制备Wnt/Notch信号通路抑制剂药物中的应用，尤其涉及中药提取物单体鸦胆子苦素D在制备预防/治疗肝癌药物中的应用。

背景技术

肝癌既包括肝细胞癌(HCC)和肝内胆管癌(CC)，是世界第五大癌症，每年,大约有750000例被诊断,而700000人死于肝癌，使其成为全球死亡率第三大癌症，严重影响着人们的健康。近年来，在肝癌的诊断及治疗方面虽然取得一些进展，但晚期肝癌存活率仍较低。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),是原发性肝癌的最主要类型。肝细胞癌的主要特点为侵袭性强，易转移，其发生，并且其发生发展是一个多基因参与、多步骤、多阶段的过程。目前，针对肝细胞癌的治疗方法主要分为手术治疗和非手术治疗，由于肝切除术可根治肝细胞癌，提高患者生存率，是公认的最有效的治疗肝细胞癌的手段之一，然而仍然存在其局限性：肿瘤细胞增殖快，恶性程度高，极易发生散播和转移；多数肿瘤为多中心发生，很难彻底根除；肝细胞癌患者大部分具有肝硬化基础，导致肝功能代偿无法实施手术。因此，联合应用手术治疗与各种非手术治疗成为治疗肝细胞癌的优先选择。肝癌的发生发展涉及到多种信号转导通路共同参与完成，如Notch信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路，TLR4/NF-kB信号通路，Ras、Jnk信号通路，mTOR通路等，近年来Wnt/Notch信号通路成为肝细胞癌发病机制的研究热点而倍受关注。

鸦胆子也叫老鸦胆或苦参子。系苦木科植物Brucea javanica(L)Merr的干燥成熟果实。性苦寒，归大肠，肝经。始载于《本草纲目拾遗》。鸦胆子是中国常用中药，具有清热解毒、截疟、止痢的功效。治疗热性赤痢或便血、疟疾、鸡眼等。在我国的南方沿海热带地区发现有鸦胆子生长。此外，亚热带地区和云南等地区也有鸦胆子分布。鸦胆子主要产于中国南方沿海热带、亚热带地区及云南等地。鸦胆子的主要活性成分----苦木内酯化合物具有抗疟、抗病毒、抗炎及抗肿瘤活性。四环三萜类内酯-苦木内酯类化合物最早是由J.Polansky于1967年从该属植物中分离的，后续不断有研究人员陆续从该属植物中发现新的抗肿瘤活性的苦木内酯类化合物。19世纪70年代。鸦胆子就开始用于治疗各种恶性肿瘤。对鸦胆子油乳抗肿瘤机制研究发现，鸦胆子油乳对肿瘤细胞的细胞形态、周期、免疫功能及多药耐药方面均有影响。该药现已成为当代***最活跃的中药制剂之一。对肺癌、肝癌、食管癌、胃癌、大肠癌、白血病、胰腺癌、脑癌、***癌、膀胱癌等多种肿瘤具有良好的疗效。鸦胆子(Brucea javanica)中含有一类特征性的化合物，苦木素类(四环三萜苦木内酯、苦木内酯)化合物，也是鸦胆子中主要的抗癌活性成分，目前从鸦胆子水提取物中已经分离得到30多种苦木素类化合物。主要包括苦木素A-I和鸦胆子苷A-P。也有其它成分如鸦胆子苦内酯A-D，鸦胆子苦醇，鸭胆丁等等。另外从鸦胆子中还可以提取到油酸，亚油酸，硬脂酸和棕榈酸等脂溶性成分。鸦胆子中含量较高的苦木素类化合物包括：鸦胆苦醇(Brusatol)，鸦胆子苦素D(Bruceine D)，鸦胆子苦素E(Bruceine E)，鸦胆子苦素H(Bruceine H)，鸦胆子苷A(Yadanzioside A)，鸦胆子苷B(Yadanzioside B)。其中对鸦胆子苦素D的抗肿瘤机制研究的较为深入，2008年由Lau et al课题组发现鸦胆子苦素D具有显著的抗胰腺癌增殖和促凋亡的作用(Lau,S.T.,et al.,Brucea javanica fruit induces cytotoxicity and apoptosis inpancreatic adenocarcinoma cell lines.Phytother Res,2008.22(4):p.477-86.)。

Wnt/Notch信号通路与肿瘤的发生，发展密切相关，在肝细胞癌中也具有重要的作用。目前关于通路通路的抑制剂普遍局限于γ-分泌酶抑制剂上，关于鸦胆子苦素D的抗肿瘤活性报道较多，对多种肿瘤具有抑制作用，但其作用机制仍不十分明确，并且未见有Wnt/Notch信号通路抑制活性的报道。本发明人以293T作为工具细胞用报告基因的方法筛选到Wnt/Notch信号通路抑制剂的活性化合物，从活性化合物中选择鸦胆子苦素D(BD)作为研究对象，考察鸦胆子苦素D体外抗肿瘤活性，鸦胆子苦素D对Wnt/Notch信号通路中关键蛋白的影响。Wnt/Notch信号通路之间有着复杂的相互联系，验证了通路在癌中的重要作用的同时也阐述了Wnt/Notch信号通路之间的内在关系，宜进一步开发鸦胆子苦素D新的治疗用途。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，克服上述不足之处，研究设计鸦胆子苦素D(BD)用以制备药物的用途。

本发明提供了鸦胆子苦素D在制备Wnt/Notch信号通路抑制剂药物中的应用。

本发明提供了鸦胆子苦素D在制备预防/治疗肝癌药物中的应用。

鸦胆子苦素D(BD)的化学结构式如下：

本发明人利用人肝癌肿瘤细胞系和人正常肝细胞系模型评估鸦胆子苦素D体外抗肿瘤功效。将两种肝癌肿瘤细胞和两种人正常肝细胞给予不同浓度的鸦胆子苦素D(0-20μM)处理48h,并通过CCK-8检测其对细胞生长的抑制活力。结果显示，鸦胆子苦素D可以显著抑制人肝癌细胞的生长能力，其半数抑制浓度为1.87μM(图1)。而对正常肝细胞的细胞毒性较小，说明鸦胆子苦素D对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用。相同浓度下不同时间点鸦胆子苦素D抑制Hep3B细胞增殖的效率不同(图1)。另外，软琼脂克隆形成结果表明，经(0.25-1μM)鸦胆子苦素D处理24h后的肝细胞癌细胞与对照组比较克隆形成能力明显降低(图1)。利用蛋白免疫印迹的方法和RT-PCR方法发现鸦胆子苦素D可以抑制Notch信号通路关键蛋白的表达，尤其对最上游关键配体Jagged1在基因和蛋白水平的表达抑制作用显著。Notch信号通路与细胞的增殖凋亡密切相关，用鸦胆子苦素D处理Huh7和Hep3B细胞系后发现周期素D1(cyclinD1),生存素(survivin)和凋亡相关蛋白PARP,caspase3显著下调。此外用三种方法验证了鸦胆子苦素D对Notch信号通路中关键酶γ-分泌酶活性的没有影响：对γ-分泌酶亚基表达量没有影响；对转染了γ-分泌酶的直接底物Notch1NEXT的293T细胞,鸦胆子苦素D对Notch1NEXT的产物NICD(NOTCH细胞内片段)表达量没有影响，而γ-分泌酶阳性抑制剂DAPT(氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯)确可显著抑制内源性NICD(NOTCH细胞内片段)的产生；另外鸦胆子苦素D对Hela细胞转染的人源γ-分泌酶底物N100的变化没有影响。肝癌细胞系转染Jagged1质粒后可抵抗鸦胆子苦素D对其促凋亡抗增殖作用，同时肝癌细胞系转染shJagged1质粒后也可显著促进肝癌细胞的凋亡并抑制其增殖，以上结果说明了鸦胆子苦素D是通过抑制Notch信号通路中上游Jagged1的表达而抑制了肝癌细胞的增殖，同时也说明了Jagged1在肝癌细胞增殖过程中的重要作用。

本发明人还利用放线菌酮(放线菌酮)考察鸦胆子苦素D对Jagged1稳定性的影响，经1μM鸦胆子苦素D处理huh7细胞24h后加入15μg/ml的放线菌酮与单独经放线菌酮处理后Jagged1的半衰期没有变化。再利用蛋白酶抑制剂MG132发现鸦胆子苦素D对jagged1蛋白的降解没有影响。而鸦胆子苦素D对Jagged1的基因水平有显著下调作用，推测鸦胆子苦素D对Notch信号通路以外的通路有抑制作用。接着，用FOP/TOP荧光素酶报告基因的方法证实了鸦胆子苦素D对Wnt信号通路中β-catenin/Tcf4转录后水平有抑制作用。另外，斑马鱼实验也证明了鸦胆子苦素D对Wnt信号通路具有抑制作用。用shβ-catenin质粒转染Huh7细胞后β-catenin、Jagged1表达水平都显著下调，而shJagged1处理后的Huh7细胞β-catenin蛋白水平没有变化,据此得出β-catenin处于Jagged1的上游，Jagged1是β-catenin/Tcf4的靶基因之一。蛋白免疫印迹实验结果表明鸦胆子苦素D对肝癌细胞系胞浆中的β-catenin的表达量没有影响，然而却引起TOP Flash活性降低。因此进一步考察了鸦胆子苦素D对细胞核中β-catenin的影响。分别提取胞浆蛋白和核蛋白发现鸦胆子苦素D处理后细胞核中的β-catenin表达量降低，免疫荧光实验结果同样显示鸦胆子苦素D影响了β-catenin的入核。最后采用Pull-down的方法将Huh7细胞裂解液或人重组蛋白β-catenin与结合或未结合鸦胆子苦素D的琼脂糖磁珠共孵育，结果显示只有结合了鸦胆子苦素D的磁珠经洗脱后能检测到β-catenin的表达。考察鸦胆子苦素D对肝癌肿瘤干细胞活性的影响，实验结果表明鸦胆子苦素D具有潜在的抗肝癌肿瘤干细胞活性。

本发明人进行了鸦胆子苦素D的体内抗肿瘤活性研究，用肝细胞癌皮下肿瘤模型评估了鸦胆子苦素D对裸鼠皮下Huh7细胞的生长抑制作用。结果发现中剂量组1.5mg/kg与对照组相比显著抑制肝细胞癌细胞Huh7细胞的生长，其抑制率为50％(p<0.001),且给药组体重与对照组比较无明显变化。而高剂量组3mg/kg由于具有一定毒性，使个别裸鼠体重有下降趋势。为了进一步验证鸦胆子苦素D的抗肿瘤机制，我们分别取三只独立的对照组和给药组裸鼠皮下的肿瘤组织分别用免疫组化和蛋白免疫印迹方法检测了notch及Wnt信号通路相关蛋白的表达差异。结果表明，经鸦胆子苦素D治疗后的肿瘤组织中jagged1，cyclinD1和survivin的表达量显著降低。上述体内结果与体外细胞水平结果再一次验证了鸦胆子苦素D的抗肝细胞癌的分子机制，因此在细胞水平和体内水平同时证实了鸦胆子苦素D是通过抑制wnt和notch信号通路来发挥抗肿瘤作用的。

本发明人用斑马鱼模型评价化合物鸦胆子苦素D对Wnt信号通路的抑制作用，实验结果显示100μM鸦胆子苦素D在不引起斑马鱼死亡的条件下可以观察到Wnt信号通路抑制后所引起的体轴发育异常。

上述实验结果表明鸦胆子苦素D能用于制备预防/治疗肝癌药物。

鸦胆子苦素D能用于制备抑制wnt和notch信号通路预防/治疗肝癌药物。

本发明所述药物为由鸦胆子苦素D为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。

本发明所述药物组合物为口服制剂、注射剂或皮肤给药制剂。

本发明揭示了鸦胆子苦素D的体内外抗肿瘤活性，首次公开鸦胆子苦素D对wnt和notch信号通路中关键蛋白的影响，验证了wnt和notch信号通路在肝癌中的重要作用，阐述了两通路之间的内在关系，提供鸦胆子苦素D在制备预防/治疗肝癌药物的新用途，为临床提供新的预防/治疗肝癌药物，有很大的应用价值。

附图说明

图1实施例1左上图表示鸦胆子苦素D(0-10μM)浓度范围内对正常肝细胞系7701及两株肝癌细胞系huh7和hep3B增殖抑制作用，其中圆圈代表正常细胞7701，正方形代表肝癌细胞系huh7，三角形代表肝癌细胞系hep3B；右上图表示24h,48h,72h三个时间点鸦胆子苦素D(0-20μM)浓度范围内对肝癌细胞系hep3B增殖抑制作用，其中圆圈代表24h，正方形代表48h，三角形代表72h；左下图表示经(0.5-1μM)鸦胆子苦素D处理24h后的肝细胞癌细胞huh7与对照组(DMSO)比较克隆形成能力明显降低，左起第一皿表示DMSO对照，第二皿表示0.5μM鸦胆子苦素D处理，第三皿表示1μM鸦胆子苦素D处理；右下图表示经(0.25-0.5μM)鸦胆子苦素D处理24h后的肝细胞癌细胞Hep3B与对照组(DMSO)比较克隆形成能力明显降低，左起第一皿表示DMSO对照，第二皿表示0.25μM鸦胆子苦素D处理，第三皿表示0.5μM鸦胆子苦素D处理。

图2实施例1鸦胆子苦素D浓度依赖性的促进肝癌细胞系凋亡。流式凋亡图中上右区代表晚期凋亡，下右区为早期凋亡，一般用这两个象限之和代表凋亡细胞总数，柱形图为根据凋亡细胞数做的图*表示t检验时，P值<0.1,**表示t检验时，P值<0.05,***表示t检验时，P值<0.01

图3实施例1左上图和右上图表示鸦胆子苦素D对γ-分泌酶组nicastrin,presenilin1,presenilin2蛋白表达量没有影响，其中第一行表示nicastrin蛋白表达量，第二行表示presenilin1蛋白表达量，第三行表示presenilin2蛋白表达量；中图表示western方法检测鸦胆子苦素D(100nM-200nM)条件下对γ-分泌酶活性没有影响；下图表示酶标仪检测鸦胆子苦素D(100nM-200nM)条件下对γ-分泌酶活性没有影响。

图4实施例1鸦胆子苦素D对notch信号通路的影响。左图表示鸦胆子苦素D处理huh7细胞，左图第一列表示DMSO对照，第二列表示0.5μM鸦胆子苦素D处理，第三列表示1μM鸦胆子苦素D处理，左图第一行表示jagged 1蛋白的表达，第二行表示Notch1蛋白的表达，第三行表示notch2蛋白的表达，第四行表示notch3蛋白的表达，第五行表示NICD(NOTCH细胞内片段)蛋白的表达，第六行表示HES1蛋白的表达，第七行表示caspase9蛋白的表达，第八行表示PARP蛋白的表达，第九行表示参比GAPDH蛋白的表达。左图表示鸦胆子苦素D处理Hep3B细胞，左图第一列表示DMSO对照，第二列表示0.5μM鸦胆子苦素D处理，第三列表示1μM鸦胆子苦素D处理，左图第一行表示jagged 1蛋白的表达，第二行表示Notch1蛋白的表达，第三行表示notch2蛋白的表达，第四行表示notch3蛋白的表达，第五行表示NICD(NOTCH细胞内片段)蛋白的表达，第六行表示HES1蛋白的表达，第七行表示caspase9蛋白的表达，第八行表示PARP蛋白的表达，第九行表示参比GAPDH蛋白的表达。结果显示，鸦胆子苦素D(0.5μM-1μM)下调huh7和Hep3B细胞中jagged1、NICD(NOTCH细胞内片段)、HES1、caspase9、PARP蛋白的表达，对Notch1,notch2,notch3的表达没有影响。其中，第一行

图5鸦胆子类似物对Notch信号通路jagged1表达的影响

图6过表达和干扰jagged1后鸦胆子苦素D对肝癌细胞增殖凋亡的影响

左图表示干扰jagged1对肝癌细胞具有抑制增殖促进凋亡的作用；右图表示过表达jagged1可以保护鸦胆子苦素D对肿瘤细胞的伤害。左右图均使用Huh7细胞。

图7鸦胆子苦素D对Wnt信号通路的作用及wnt与Notch信号通路之间的关系

左上图表示TOP-flash实验结果。肝癌细胞系分别转染含β-catenin/Tcf结合位点(TOP-flash)的萤火虫荧光素酶报告基因、突变的β-catenin/Tcf结合位点(FOP-flash)的萤火虫荧光素酶报告基因和海肾荧光素酶(Renillaluciferase)基因后经不同浓度的鸦胆子苦素D处理24小时。结果证实鸦胆子苦素D可以抑制wnt通路下游β-catenin/Tcf4转录水平。

右上图表示用免疫印迹方法证明鸦胆子苦素D对Wnt通路相关蛋白c-Myc，cyclinD1，survivin具有抑制作用而对β-catenin和Tcf4的蛋白表达没有影响

左下图表示用RT-PCR的方法检测到鸦胆子苦素D对wnt通路靶基因LEF1，AXIN2，c-Myc，jagged1，cyclinD1，survivin的mRNA水平具有抑制作用(Huh7细胞)

右下图表示用RT-PCR的方法检测到鸦胆子苦素D对wnt通路靶基因LEF1，AXIN2，c-Myc，jagged1，cyclinD1，survivin的mRNA水平具有抑制作用(Hep3B细胞)

图8鸦胆子苦素D抑制β-catenin的入核

在正常情况下细胞中β-catenin的量很少，大部分会被胞浆中蛋白酶体降解途径降解而不会进入细胞核中。肿瘤细胞中如肝癌细胞中的β-catenin是过量表达的，过量的β-catenin就会进入细胞核中与核中的转录因子如Tcf4等结合启动下游靶基因的表达进而促进细胞的增殖。

左上图表示用免疫印迹方法考察经鸦胆子苦素D处理Huh7细胞24h后提取胞浆蛋白，发现鸦胆子苦素D对胞浆蛋白中β-catenin表达没有影响。

右上图表示用免疫印迹方法考察经鸦胆子苦素D处理Huh7细胞24h后提取细胞核蛋白，发现鸦胆子苦素D显著下调了核蛋白中β-catenin的表达。

下图表示用免疫荧光的方法再次验证了鸦胆子苦素D可以抑制β-catenin的入核。

图9鸦胆子苦素D体内抗肿瘤活性评价

左上图表示鸦胆子苦素D对裸鼠皮下肝细胞癌细胞系(Huh7细胞)皮下肿瘤接种模型的生长抑制作用。上方曲线表示对照组；下方曲线表示1.5mg/kg鸦胆子苦素D尾静脉给药组。结果显示与对照组相比，鸦胆子苦素D可显著抑制肝细胞癌细胞Huh7的体内成瘤能力。

右上图表示鸦胆子苦素D给药对裸鼠体重没有明显影响。

左下图表示蛋白免疫印迹方法检测对照组和给药组裸鼠皮下的肿瘤组织Notch及wnt通路相关蛋白的表达差异。结果表明，经鸦胆子苦素D治疗后的肿瘤组织中jagged1，cyclinD1和survivin的表达量显著降低。

右下图表示用免疫组化方法检测对照组和给药组裸鼠皮下的肿瘤组织Notch及wnt通路相关蛋白的表达差异。结果表明，经鸦胆子苦素D治疗后的肿瘤组织中jagged1，cyclinD1和survivin的表达量显著降低。

具体实施方式

下列实施例所用试剂和材料通过市售得到。

实施例1 鸦胆子苦素D的体外抗肿瘤活性及其机制研究

一、实验材料

(一)细胞株

人肝癌细胞系Huh7,Hep3B及人正常肝细胞系QSG7701均购自中科院上海细胞库。

(二)药品和试剂

鸦胆子苦素D化合物购自上海源叶生物科技有限公司

(三)主要仪器

二、实验方法

(一)细胞培养方法

1、细胞的传代

(1)当细胞密度长至90％左右即可传代，弃去培养基，用PBS洗涤细胞两次，洗去培养基中的血清成分；

(2)加入适当体积的胰酶，放入孵箱中数分钟，待细胞开始从培养皿上脱落时加入完全培养基终止消化，一般加入的完全培养基的体积是胰酶体积的2倍；

(3)轻轻吹打细胞，使细胞吹散成单细胞悬液后，1000rpm离心5min；

(4)弃去上清，用新鲜的培养基重悬细胞，按1:2-1:3将细胞接种到新培养基中培养。

2、细胞的冻存

(1)当细胞密度达到70％-80％左右时，挑取生长状态良好的细胞，消化，离心；

(2)去掉上层培养基，将细胞沉淀加入1ml冻存液(900μl完全培养基+100μlDMSO)于冻存管中，立刻放入预冷的程序冻存盒中，于-80℃冰箱保存过夜，第二天移到液氮中可长期保存。

3、细胞的计数：

(1)将用酒精清洗过的计数板和盖玻片，吹干后备用；

(2)细胞消化离心后，用新鲜培养基重悬，按一定比例稀释细胞悬液；

(3)将细胞悬液吹打均匀后，取10μl轻轻加到计数板盖玻片的一侧，避免产生气泡；

(4)用10×物镜观察四大方格中的细胞数，计算细胞数；

(5)细胞数/ml＝(四个方格中的细胞数的平均值)×10⁴/ml。

4、细胞的复苏

(1)从液氮中取出冻存的细胞后立刻于37℃水浴锅中不断摇晃使之快速融化；

(2)待冻存管中的细胞融化后，用75％的酒精喷洗冻存管，将融化的冻存细胞加入到5ml 37℃预热好的完全培养基中，轻轻吹打均匀；

(3)1000rpm离心5min之后尽可能的吸去旧培养基，用新鲜的完全培养基将细胞沉淀重悬，接种于10cm新培养皿中，于常规培养箱中培养过夜，第二天更换培养基去除死细胞和DMSO(二甲基亚砜)成分。

(二)Notch信号通路抑制剂筛选

1、实验原理

萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)可以催化荧光素(luciferin)氧化成oxyluciferin，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。萤火虫荧光素酶也称为发光酶，是催化生物发光的酶系的总称。荧光素酶(Firefly luciferase)催化的氧化过程中释放的生物荧光(bioluminescence)可以通过荧光酶标仪测定。所要检测的基因就可以通过荧光素酶(Fireflyluciferase)和其底物(luciferin)这一生物发光体系被灵敏、高效地表达出来。在实际研究中firefly luciferase的上游常常克隆一些所要研究的基因转录的调控元件。报告基因质粒就是这样构建的。利用这种构建好的报告基因质粒转染特定研究的细胞，然后加入药物或干预因素处理适当时间后将细胞裂解。通过酶标仪测定裂解液中的荧光值反应荧光素酶的活性。药物对所研究的基因的影响即可通过荧光素酶活性的高低进行评价。Rinilla luciferase(海肾荧光素酶基因)通常作为转染效率的内参，用来消除细胞数量和转染效率造成的差异。萤火虫荧光素酶催化luciferin发光的最强发光波长为560nm。

2、实验步骤

(1)HEK293细胞系最适puromycin浓度的筛选

1.1第1d(天)，将HEK293细胞加入24孔板；

1.2第2d，配制puromycin(嘌呤霉素)(sigma，Cat#P8833)母液1mg/ml。待HEK293细胞长至80％时，将puromycin按照0,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μg/ml的工作浓度加入到细胞中；

1.3第3-6d观察细胞的生长状态：从第4d开始，加入puromycin的细胞出现死亡现象；在第6d，puromycin的2-10μg/ml浓度组的细胞全部死亡。据此得出结论2μg/ml的puromycin是最低剂量筛选浓度。鉴于后期实验需要，选取6μg/ml的puromycin为最终阳性细胞筛选浓度。

(2)稳定表达调控型Luciferase(荧光素酶)293细胞系的筛选

说明：由于订购Qiagen的CLS-014L试剂盒，没有荧光报告基因，所以不适合做最佳MOI的筛选，只能根据经验选择最佳MOI；为了达到实验的严谨性，实验室分别构建了表达CMV-Luciferase(荧光素酶)阳性和CMV-TRAIL的阴性慢病毒，用于下游的荧光检测。

2.1第1d，接种细胞于25cm的培养瓶中；

2.2第2d，观察细胞长至60％左右，换新鲜培养基，每瓶分别加入100μl的lentivirus(CLS-014L)(慢病毒)、50MOI的CMV-Luciferase lentivirus(表达荧光素酶的慢病毒)和CMV-TRAIL lentivirus(慢病毒)；

2.3第3天，继续培养；第4天，换含有6μg/ml puromycin(嘌呤霉素)的新鲜培养基，继续培养；

2.4每天观察细胞状态。约3-6d后，未整合puromycin的细胞大量死亡，同时在培养瓶底零星出现单克隆细胞，继续培养3-4d，若单克隆能够生长，则用吸管吸取克隆团，轻轻吹打混匀，按照极限稀释法，置于24孔板中继续培养，并标记克隆号；

2.5待单克隆细胞长满瓶底后，转移至25cm培养瓶继续培养；每个单克隆细胞冻存3支以上，剩余细胞进行下游luciferase检测实验；

(三)细胞活力检测(CCK8法)

1、接种细胞及加药

将处于对数生长期的人肝癌细胞系或人正常肝细胞系制成7×10⁴cells/ml的混悬液。

(1)取96孔板，每孔加100μl细胞混悬液，每组设3个复孔。

(2)设以下实验组:

空白组：培养基、CCK8、DMSO(二甲基亚砜)；

对照组：含细胞培养基、CCK8、DMSO；

给药组：含细胞培养基、CCK8、DMSO、鸦胆子苦素D浓度梯度为：0，0.1，0.2，0.5，1，2.5，5，10(μM)。

2、细胞培养

将加好样的细胞培养板放置于5％CO₂，37℃恒温孵育24h，48h或72h。

3、比色

每孔中加入10μl CCK-8培养1-2小时后用酶标仪测定450nm处吸光值(吸光度范围控制在1.5左右为宜)，以百分比计算细胞抑制率。细胞抑制率＝[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100％

分别以细胞增殖率和细胞抑制率为纵坐标，各给药剂量为横坐标绘制细胞增殖抑制曲线。

(四)软琼脂克隆形成实验

1、实验原理

不同细胞体外培养过程中存活率是不一样的，细胞接种存活率可以反应贴壁的细胞数多少。然而贴壁的细胞不代表都能存活并形成克隆。我们将可以形成克隆的贴壁细胞称为有增殖能力的细胞。不同细胞由于自身特性不同，增殖能力也不尽相同。细胞增殖能力和群体依赖性可以用克隆形成率表示。一般情况下，传代细胞系的克隆形成率大于原代细胞克隆形成率；肿瘤细胞的克隆形成率大于正常细胞克隆形成率。另外，克隆形成率的大小还与接种的细胞密度有关。克隆形成实验所用的细胞一定要是分散的单细胞，持续培养至少一周时间，期间要随时观察细胞生长状况并及时补充培养基。当细胞形成克隆时可以终止培养。

2、主要试剂

(1)用无菌双蒸水分别配置1.2％和0.7％两个浓度的低溶点琼脂糖溶液。注意：该溶液高压灭菌后保持溶液温度在40℃左右防止凝固；

(2)0.25％胰蛋白酶；

(3)20％胎牛血清的培养基。

3、实验步骤

(1)取对数生长期细胞，0.25％胰蛋白酶消化成为单细胞，离心收集细胞沉淀；

(2)用细胞计数仪计数后，用20％胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞；

(3)将1.2％的琼脂糖溶液和20％胎牛血清完全培养基按1:1比例混合均匀后，取3mL该混合培养液于6孔板中，放于超净台中使其冷却凝固；

(4)将0.7％的琼脂糖溶液和20％胎牛血清完全培养基按1:1比例混合均匀后，再向其中加入0.2mL的细胞悬液，使最终细胞密度为1000个/孔。充分混合均匀后加入到凝固好的含1.2％琼脂糖培养基中，超净台中冷却至凝固形成双琼脂层。于37℃5％CO₂培养箱中培养9～14天。

(5)将培养皿置于显微镜下计数克隆数，1个克隆数≥50个细胞，计数克隆形成率，拍照。

集落数＝n孔中细胞集落数总和/n

克隆形成率＝(集落数/接种细胞数)100％

(6)统计学分析：根据集落数和克隆形成率进行t检验，分析不同组别之间的差异。

(五)细胞凋亡测定

1、实验原理

细胞在正常情况下，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧。当细胞发生凋亡的早期时，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)就会由脂质双层的内侧翻向外侧。Annexin V(膜联蛋白V)属于Ca²⁺依赖型的磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸具有非常高的亲和力。因此可以与发生早期凋亡的细胞上的细胞膜暴露的磷脂酰丝氨酸特异性的结合。所以Annexin V成为检测细胞早期凋亡常用蛋白。在细胞凋亡检测中常常用荧光素EGFP和FITC将Annexin V进行标记。这样标记了的Annexin V就可以作为荧光探针存在于处理的细胞中，然后可以利用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。在凋亡实验中还有一种常用的核酸染料即碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)(碘化丙啶)。该染料可以特异性地透过凋亡中晚期细胞和死细胞的细胞膜使细胞核染上红色，而对正常细胞完整的细胞膜没有影响。因此在评价细胞凋亡时期实验中常常将Annexin V与PI两种染料结合使用。

2、实验步骤

人肝癌细胞系Huh7及Hep3B经过不同浓度的鸦胆子苦素D处理24小时后，离心收集细胞，按凋亡试剂盒使用说明书进行试验。使用冷却好的buffer(具体中文缓冲剂名称)000rpm条件下离心5min。将洗涤的细胞重悬于500ul buffer中，调整细胞密度至5×10⁵cells/ml,立即加入5μl的Annexin V和propidiumiodide(PI)染料染色，于4℃条件下避光孵育10min。最后将处理好的细胞用流式细胞仪分析凋亡情况。

(六)γ-分泌酶活性检测

γ-分泌酶(γ-secretase)是一种复杂的由多个亚基组成的复合体，可以水解多种跨膜蛋白，作为Notch信号通路中的关键酶，γ-分泌酶水解Notch信号通路的受体后释放出活性形式的NICD(NOTCH细胞内片段)来发挥作用。γ-分泌酶抑制剂(gamma secretase inhibitor,GSI)最初被用来治疗阿尔茨海默病。近年来研究表明GSI对多种恶性肿瘤具有明显的抗肿瘤作用，如黑色素瘤、大肠癌、随母细胞瘤等。在我们的研究中发现GSI对肝细胞癌细胞系并无增殖抑制作用，而鸦胆子苦素D作为潜在的Notch信号通路抑制具有很好的抗肝癌活性，鸦胆子苦素D是否影响Notch信号通路中的关键酶γ-分泌酶活性，我们用三种方法考察了鸦胆子苦素D对γ-分泌酶活性的影响。

1、提取膜蛋白：

(1)准备试剂：按照碧云天膜蛋白提取试剂盒P0033说明书，室温条件下将膜蛋白抽提试剂A和B融解混匀后分装。取适量的膜蛋白抽提试剂A和B于冰浴上备用，临用前加入PMSF。

(2)收集细胞：将处理好的细胞2-5×10⁷用预冷的PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液洗涤三遍，洗掉培养基中的成分。用细胞刮刮下细胞后离心，尽可能地吸去PBS上清液。注意不要使用胰酶将细胞消化下来而是用刮刀，因为胰酶对膜蛋白有破坏作用。

(3)洗涤细胞：取一定量的预冷过的PBS将细胞沉淀小心重悬起。将细胞在4℃，600g条件下离心5分钟，弃掉上清。在同样条件下再离心1分钟，这次离心的目的是将管壁上可能残留液体离下来并进一步沉淀细胞。最后，尽可能地吸去上清液。

(4)细胞预处理：在洗涤好的细胞沉淀中用1ml加入含有PMSF(苯甲基磺酰氟化物)的膜蛋白抽提试剂A，轻轻并充分悬浮细胞，冰上反应10-15分钟。

(5)细胞的破碎：采用冻融发将上述样品在-80℃和室温交替进行五次，达到反复冻融充分破碎细胞的效果。

(6)去除细胞核和未破碎的细胞：将上述样品于4℃700g离心10分钟，轻轻吸出上清液于新的离心管中。注意一定不要接触到沉淀，甚至可以有少量的上清液残留。

(7)沉淀细胞膜碎片：要想沉淀细胞膜碎片则需要更高的转速通常在4℃，14000g条件下离心30分钟。

(8)收集细胞浆蛋白：离心后得到的上清即为细胞浆蛋白，可保存在-80℃冰箱备用。

(9)抽提膜蛋白：再在4℃14000g的条件下离心10秒，以更好的沉淀膜蛋白。注意要尽可能的吸掉上清液即胞浆蛋白来保证膜蛋白的纯度。根据膜蛋白沉淀的量加入适量的膜蛋白抽提试剂B，用最高速剧烈涡旋震荡10秒是沉淀重新悬起来，冰浴5-10分钟。重复这一步骤涡旋冰浴3次。最后在4℃14000g条件下离心5分钟，得到的上清即为所要的细胞膜蛋白溶液。

2、内源性γ-分泌酶活力检测

(1)实验原理：

T-ERx-HeLa-N100细胞是在人***细胞HeLa细胞上稳定转染表达四环素阻遏蛋白、N100-GV以及荧光素酶luciferase几个质粒后构建的细胞系，该细胞系可以利用四环素诱导与否实现对某一蛋白的表达调控，同时具有荧光素酶报告***，可报告某一基因的表达情况，N100为来自人源的notch跨膜区附近的氨基酸，是γ-分泌酶的直接底物。其设计的具体原理如下：细胞表达的四环素阻遏蛋白结合在N100-GV基因的启动子上，抑制后者的表达，当培养基内加入四环素后，细胞可利用四环素，四环素与四环素阻遏蛋白结合，是四环素阻遏蛋白从启动子上脱落，从而N100-GV基因得到表达。GV即Gal4-VP16，是一段上游激活序列，融合于N100上，N100被细胞内源的γ-分泌酶剪切后，产生的NICD(NOTCH细胞内片段)-GV进入细胞核，激活荧光素酶luciferase的表达。细胞被裂解后，luciferase释放出来，当加入底物荧光素，酶就会催化荧光素发生氧化还原反应，该反应可以发出生物荧光，利用酶标仪可以测得发光强度，数值大小与细胞内源γ-分泌酶活力成正比。

(2)实验步骤：

2.2.1 HeLa细胞的培养：DMEM+10％FBS+1％双抗+5μg/ml Blasticidin S(杀稻瘟菌素)

2.2.2以2×10⁵个HeLa细胞/孔接种于24孔板中，24小时后，细胞汇合度达到约80％左右时，用X-tremeGENE HP转染试剂将pGL4.31[luc2p/GAL4UAS/Hygro]和pcDNA4/TO-N100-GV质粒共同瞬时转染到HeLa细胞中，同时加入四环素(0.5μg/ml),24小时后分别加入不同浓度的DAPT(氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯)和鸦胆子苦素D化合物。每块板均含有对照组包括：仅转染pGL4.31[luc2p/GAL4UAS/Hygro]组，不加四环素诱导组，DMSO处理组。每组均设三个复孔。24小时后吸去培养基，每孔加入100μl裂解液，室温孵育5分钟，吸取其中90μl裂解液于黑色不透光的96孔板中然后加入90μl荧光素酶底物。轻轻混合均匀后用酶标仪读取发光值。

3、内源性γ-分泌酶活力检测(免疫印迹法)

(1)实验原理

293T细胞转染γ-分泌酶的直接底物Notch1NEXT后，如果γ-分泌酶的活性受到抑制，notch1NEXT的直接产物NICD(NOTCH细胞内片段)(Notch细胞内片段)的量就会增多，用免疫印迹的方法检测NICD(NOTCH细胞内片段)的表达量来评价γ-分泌酶的活性。

(2)实验方法

a、将生长状态良好的HEK293T细胞以2×10⁵个/孔的密度接种于多聚赖氨酸包被过的12孔板中，每孔加入培养基1ml。

b、轻摇培养板，是细胞分散均匀后于培养箱中培养。

c、待细胞贴壁后密度接近80％左右时用X-tremeGENE HP转染试剂将Notch0Epc3.1质粒转染到细胞中，pcDNA3作为空白对照。

d、24小时后换液加入不同浓度的DAPT(氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯)和鸦胆子苦素D处理，DMSO作为阴性对照。

e、24小时后加入裂解液，用免疫印迹的方法检测NICD(NOTCH细胞内片段)的表达量。

(七)Western Blot(蛋白免疫印迹)方法检测鸦胆子苦素D对Notch信号通路蛋白表达影响

1、实验原理：

Western blot属于印迹法的一种，印迹法(blotting)指的是先将样品转移到固相载体上，然后利用相应的反应手段来检测样品的方法。二十世纪70年代名叫Southern的研究者首次将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上，并利用DNA-RNA杂交技术成功检测了特定的DNA片段，因此该法命名为Southern印迹法。Western印迹法则是用来检测蛋白分子并可以对蛋白进行半定量的方法。基本原理为在电场的作用下首先将蛋白按分子量的不同分布在SDS-PAGE凝胶上，然后再在电场的作用下将其转移到固相载体(NC膜，PVDF膜)上。固相载体和蛋白分子以非共价键形式结合，然后以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，加入所要研究蛋白的对应的抗体进行免疫反应，再用酶或同位素标记过的二抗与一抗特异地反应，最后通过显色反应来检测反应目的蛋白的表达情况。

2、实验方法

(1)溶液配制

10％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液

在45ml水中溶解5g电泳级SDS，加浓HCl调节溶液的pH值至7.2，加水定容至50ml。

10％过硫酸铵(AP)

称量0.1g AP溶于1ml水中，现用现配。

10×Tris缓冲盐溶液(TBS中文没有，提供供应商)

87.68g NaCl,121.12gTris碱溶解于800ml蒸馏水中，用HCl调至pH值至7.4，用蒸馏水定容至1L，室温保存备用。

1×电泳缓冲液

准确称取3.02g Tris碱，18.8g glycine，1g SDS中文加水溶解定容至1L，室温保存。

1×电转缓冲液

准确称取3.03gTris碱和14.4g glycine，加入200ml甲醇后加水溶解定容至1L，4℃保存。

1M Tris-HCl(pH 6.8)

称取121.1g Tris，加800ml水充分搅拌溶解，用HCl调节pH至6.8，再加水定容至1L，于室温保存。

1.5M Tris-HCl(pH 8.8)(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)

称取181.7g Tris，加800ml水充分搅拌溶解，用HCl调节PH至8.8，再加水定容至1L，于室温保存。

2×TBS缓冲液(三羟甲基氨基甲烷缓冲液)

称取24.2gTris和14.4g NaCl加入1L水中，用HCl调pH至7.6。

TBST缓冲液(蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即WESTERN BLOT中常用的一种缓冲溶液,其中含有Tris-Hcl,NaCl,tween20这三种物质)

1000ml 1×TBS中文中加入1ml吐温20,混匀后室温保存。

封闭缓冲液

称2.5g脱脂奶粉加入到50ml TBS Buffer中，再加入200μl 10％叠氮钠，溶解后于4℃保存一周内使用。

抗体稀释液

同封闭缓冲液。

30％Acrylamide(丙烯酰胺)

150g丙烯酰胺，4gN、N-亚甲基丙烯酰胺，混均加双蒸水，37℃溶解，定溶500ML。

最后用0.2μM的滤纸过滤后于4℃棕色瓶保存备用。

SDS-PAGE浓缩胶(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)(5％Acrylamide)

表1-1SDS-PAGE 5％浓缩胶配方表

SDS-PAGE分离胶(10％Acrylamide)

表1-2SDS-PAGE 10％分离胶配方表

Western细胞裂解液20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1％Triton(聚乙二醇辛基苯基醚)X-100，以及sodium pyrophosphate(焦磷酸钠)，β-glycerophosphate(磷酸甘油)，EDTA(乙二胺四乙酸)，Na₃VO₄(钒酸钠)，leupeptin(亮肽酶素)多种抑制剂。

(2)蛋白样品制备

a、取2×10⁵个Huh7或者Hep3B细胞加入6孔培养板中，每孔加入2ml完全培养基培养12h后，加入药物浓度梯度为(1，2μM)作用24h，同时设置空白组给予等量DMSO。

b、吸弃培养基，用预冷的PBS洗涤两遍后，每孔加入50μl细胞裂解液，用细胞刮将细胞收集于离心管中于冰上裂解30min，12000r/min，4℃离心30min，取上清40μl，再加入8μl 6×loading buffer,煮沸5min后12000r/min，4℃离心2min。另外，取剩余部分蛋白上清用于蛋白含量测定。细胞裂解液进行Western blot分析，检测鸦胆子苦素D对肝癌细胞内jagged1、NICD(NOTCH细胞内片段)、Notch1、Notch2、Notch3、Hes1、PARP、Caspase9、c-Myc、survivin、cyclinD1、β-catenin、Tcf4的影响。

(3)蛋白定量

Bradford法蛋白定量

该方法用于大多数蛋白质定量是相当精确的，特别是用于小分子多肽定量。如核糖核酸酶或溶菌酶等。但是，去污剂的浓度超过0.2％则影响定量结果。如TritonX-100，SDS，NP-40等。

1)Bradford染液配制：(考马斯亮蓝：95％的乙醇：浓磷酸：双蒸水)以(2:1:2：4)的比例溶解后于4℃保存备用；

2)作标准曲线的蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准蛋白，例如进行抗体定量，可用纯化的抗体作为标准蛋白。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20μg-150μg/100μl之间绘制标准曲线；

3)将待测样本溶于100μl缓冲溶液中，该缓冲溶液应于作标准曲线的缓冲溶液相同；

4)按1：5用双蒸水稀释浓染料结合溶液，过滤离心沉淀物；

5)每个样本加5μl稀释的染料结合溶液，作用5-30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，即可在595nm光波长下测定其吸光度。注意，颜色反应不得超过30min；

6)应用标准曲线计算待测样本的浓度。

紫外分光光度检测法

蛋白质紫外光吸光率是所有的蛋白质定量方法中最快的方法。通常在280nm光波长下读数。其在280nm光波长下的最大吸光率主要处决于酪氨酸和色氨酸的存在。在205nm光波长的吸收也常用到。其在205nm光波长下的最大吸光率主要处决于肽链，尽管氨基酸也有影响。另外，一个主要的优点是在测定蛋白质浓度时，样本不会遭到损害。

BCA(2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠)法蛋白定量

按照试剂盒说明书，BSA(牛血清白蛋白)配成0.5mg/ml，将A液与B液按照50:1混合混匀后得到工作液。

按下表绘制标准曲线：

样品浓度测定：96孔板放于冰上，每孔加入2μl蛋白样品，PBS补足到20μl。各孔加入200μl BCA工作液，于37℃孵育30min后利用酶标仪检测562nm处吸光值。根据标准曲线得出样品最终浓度。

BCA法特点：

1)灵敏度高，最低检测浓度可以达到25μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl。

2)BCA工作液在检测样品的蛋白浓度时可以不受样品中大部分化学物质的影响。SDS、Triton X-100及Tween 20，60，80的浓度控制在5％以下即可。

3)在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。

4)检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。

5)螯合剂和还原剂对BCA溶液的检测会产生影响：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巯基乙醇低于1mM

(4)SDS-PAGE电泳

配胶

配制10％分离胶、5％浓缩胶，4℃保存于保鲜膜内备用

电泳

A上样前先检查玻璃板的安装，保证不漏液。

B加入电泳液后，每孔中加入煮沸过的样品(40-60μg)，为了保证蛋白条带的美观最好在样品两侧的泳道加入等体积的1×loading buffer，最后在边缘一侧的泳道加入5μl Marker。

C先以80V进行恒压电泳，20min后改为120V恒压电泳。

D当溴酚蓝跑到玻璃板下边缘处即可结束电泳。

转膜

A浸泡NC膜：用无水甲醇浸泡NC膜5min左右

B取胶：轻轻的将胶从玻璃板上卸下，保持胶的完整及湿润。保留所要研究蛋白的分子量范围的胶，按海绵-三层滤纸-胶-PVDF(聚偏二氟乙烯)膜-滤纸-海绵的顺序紧密排列，最后用玻璃棒赶走气泡。

C电转：将膜和胶分别对应于电转槽的正负极，加满电转液(含冰块)于220mA恒流条件下根据分子量的大小电转60-120min。注意蛋白分子量不同转膜时间不同：分子量越大转膜时间越长。

封闭

封闭的目的是为了去除抗体与膜的非特异性结合产生的背景。将膜从电转槽中取出，于封闭液(5％脱脂奶粉)中室温缓慢摇晃封闭1h。

孵育一抗

将抗体按照推荐的比例用封闭液(5％脱脂奶粉)稀释，4℃缓慢摇晃过夜。

一抗孵育结束后，用TBST洗膜三次，每次5min，一抗回收后于4℃保存可重复利用。

孵育二抗

根据一种属来源选择相对应的二抗，按(1:2000-1:5000)比例稀释，室温避光孵育1-2h。

二抗孵育结束后，回收的二抗于-20℃避光保存。TBST洗膜三次，每次5min。

扫膜

将洗过的NC膜保持湿润状态，置于Odyssey双色红外激光成像***仪器中扫膜，用自带软件进行灰度扫描分析。(软件提供美国LICOR公司)

(八)RT-PCR方法检测鸦胆子苦素D对相关基因mRNA水平影响

1、实验原理

PCR技术(olymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。该反应需要在模板、引物、四种脱氧核苷酸及DNA聚合酶共同存在的条件下才能进行。该反应具有特异性，特异性由设计的引物序列决定。反应分三步：

A、变性：利用加热的方法破坏DNA双螺旋结构使氢键断裂，形成单链DNA；

B、退火：将反应混合液冷却到一定的温度，让引物与模板很好地结合。

C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg²⁺存在下，退火引物沿5‘3’方向延伸。以上三步为一个循环，如此反复。

RT-PCR为反转录RCR(reverse transcription PCR)和实时PCR(real timePCR)共同的缩写。逆转录PCR，也叫反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此DNA为模板通过PCR进行DNA扩增。

逆转录酶(reverse transcriptase)是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：

a、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；

a、Rnase(RNA酶)水解活性：水解RNA杂合体中的RNA；

c、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.

(1)RNA抽提(细胞RNA的提取)

1)每组取约1*10⁶个细胞，将细胞消化离心后，去上清，按RNA提取试剂盒操作说明书进行(飞捷生物RNAfast200)。

2)在处理好的样品管中，加入RA2液500μl，充分颠倒混匀10次，静置1min。

3)将样本裂解物全部吸入内套管(已插在外套管中)离心1min。

4)取出内套管，吸去外套管中的液体后放回内套管，加入500μl洗液，离心1min。

5)重复1.4步骤再洗一次。

6)取出内套管，吸去外套管中液体后放回内套管，不加洗液，离心1min。

7)将内套管移入新的1.5ml Buffer(离心管)，在膜中央加入洗脱液30μl。

8)室温静置1min后，离心1min，获得总RNA

9)将获取的RNA混匀后定量。

注：提取过程离心速度为12000rpm；操作过程中要避免RNA酶的污染。

(2)检测所得RNA纯度

定量检测

取2μl提取的RNA样品于Epoch超微量微孔板分光光度计中，在Take3模块下根据OD₂₆₀/OD₂₈₀的值确定RNA的含量和纯度。当R在1.9-2.1的范围内，说明提取的RNA符合实验要求；当R<1.8，则表明样品中有蛋白或其它有机物污染；当R>2.2时，提示RNA发生了水解，应当舍弃。

(3)引物设计

采用Pubmed提供引物设计网站进行引物设计，并利用blast网页进行同源性分析，优选score值最高，Evalue值最低的设计引物，委托Invitrogen公司合成引物。

(4)mRNA测定所用引物序列

Jagged1引物序列：

上游引物，ACAAAGGGCACAGCGAGTG

下游引物，GGAGACTGGAAGACCGACAC

c-Myc引物序列：

上游引物，GCTGCTTAGACGCTGGATTT

下游引物，CGAGGTCATAGTTCCTGTTGG

Survivin引物序列：

上游引物，TAGTGTGGTGGTGCCCTATG

下游引物，CCAGTGTGATGATGGTGAGG

cyclinD1引物序列：

上游引物，CCTGTCCTACTACCGCCTCA

下游引物，TCCTCCTCTTCCTCCTCCTC

AXIN2引物序列：

上游引物，CCTGCCACCAAGACCTACAT

下游引物，TTTCCTCCATCACCGACTG

LEF1引物序列：

上游引物，CGAAGAGGAAGGCGATTTAG

下游引物，GAGAGGTTTGTGCTTGTCTGG

Oct4引物序列：

上游引物，CTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAA

下游引物，CTGCAGTGTGGGTTTCGGGCA

Sox2引物序列：

上游引物，AAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGGAG

下游引物，CAGCTGTCATTTGCTGTGGGTGATG

Nanog引物序列：

上游引物，AATACCTCAGCCTCCAGCAGATG

下游引物，TGCGTCACACCATTGCTATTCTTC

Nestin引物序列：

上游引物，GGCGCACCTCAAGATGTCC

下游引物，CTTGGGGTCCTGAAAGCTG

Bmi-1引物序列：

上游引物，TCATCAGCCTCGATATTCCATCT

下游引物，TTCTGAATACAAGGTGCCCGG

GAPDH引物序列：

上游引物，CTCAGACACCATGGGGAAGGT

下游引物，TGATCTTGAGGCTGTTGTCATA

(5)合成DNA

A、反转录反应

1)将DEPC(二乙基焦磷酰胺)处理过的PCR管放在冰上，分别加入

随机引物(0.5μg/μl) 1μl

无RNA酶水 9ul

至总体积 12μl

轻轻充分混合均匀后，在3000rpm条件下离心30s。

2)将上述混合物于PCR仪上在70℃的条件下变性反应5分钟后，于冰上冷却。

3)PCR管置冰上，依次加入

5×RT缓冲液 4μl

RNase inhibitor(20U/μl) 1μl

10mM dNTP Mix 2μl

轻轻充分混合均匀后，在3000rpm的条件下离心30s。

4)置PCR仪上25℃5分钟。取出置冰上冷却。

5)加入M-MuLV逆转录酶(200U/μl)1μl至终体积20μl。

6)于PCR仪中按照下面条件进行反应

25℃ 10分钟

42℃ 60分钟

70℃ 10分钟

上述反应结束后得到的是cDNA产物，立刻于冰上冷却。也可于-20℃保存。

B、PCR扩增

1)取200μIPCR管依次加入

在3000rpm的条件下离心30s。

2)按以下条件进行PCR反应：

(九)细胞核细胞质分离实验

1、细胞核蛋白提取方法

(1)准备溶液：室温融解试剂盒(碧云天细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒P0027)中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀备用。分别根据细胞的量相应的细胞浆蛋白抽提试剂和细胞核蛋白抽提试剂，按比例加入PMSF(苯甲基磺酰氟)。其余试剂于-20℃保存。

(2)对于贴壁细胞：用预冷的PBS洗两遍细胞，洗掉培养基成分。彻底吸净PBS后用刮刀刮下细胞。1000rpm条件下离心收集细胞沉淀部分。注意不要用胰酶消化细胞。

(3)细胞沉淀和细胞浆蛋白抽提试剂A按照1:10的比例加入。

(4)用最高的速度剧烈涡旋震荡10-20s，让细胞沉淀完全溶解在细胞浆蛋白抽提试剂A中。

(5)冰浴10-15分钟。

(6)再加入10μl细胞浆蛋白抽提试剂B。同样用最大的速度剧烈涡旋震荡5-10s，冰浴1分钟。

(7)最高速剧烈Vortex 5秒，4℃12,000-16,000g离心5分钟。

(8)得到的上清即为细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。吸取上清时为了保证细胞浆蛋白的纯度要剩余少量上清不要吸到沉淀部分。

(9)沉淀部分要离心后尽可能的吸掉上清，根据沉淀部分的量加入适量的冰冷的细胞核蛋白抽提试剂。

(10)用最高的速度剧烈涡旋震荡20s，然后放回冰浴中2min。如此反复两个过程15-20次达到充分将沉淀部***解的目的。

(11)4℃12,000-16,000g离心10分钟。

(12)得到的上清部分即为细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃冻存。

(十)免疫荧光实验

1、实验原理：

免疫细胞化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞(或组织)化学。免疫荧光细胞化学顾名思义也是一种免疫反应，离不开抗原抗体的反应。首先需要将已知的抗体标记上荧光素，利用这种带荧光标记的抗体作为探针与细胞或组织内的相应抗原反应。荧光素受到特定激发波长的光照射后会发出一定颜色的光。因此可以利用荧光共聚焦显微镜或荧光显微镜通过荧光的位置进行定性和定量分析。免疫荧光化学的的优点在于特异性强，可以在细胞水平进行准确的定位，因此在分子生物学领域有着广泛的应用价值。

2、实验方法

(1)固定

弃掉培养基，用PBS室温洗涤三遍，每次5min。用4％多聚甲醛室温固定20min。PBS漂洗三次，每次5min。

(2)打孔

用含0.5％Triton-X-100的PBS在室温通透化处理15min,用PBS漂洗三次，每次5min。

(3)封闭

用含5％BSA的PBS室温封闭1h,PBS漂洗三次，每次5min。

(4)孵一抗

加入β-catenin一抗(用1％BSA稀释)4℃缓慢摇晃过夜。

(5)孵二抗

回收一抗，用PBS漂洗三次，每次5min,加入FITC标记的二抗(用1％BSA稀释)室温缓慢摇晃孵育1h。

(6)染核

DAPI(1μg/ml)进行核染15min,PBS漂洗后于荧光显微镜下观察。

(十一)质粒转染

1、实验原理

将外源的特定分子如DNA、RNA等导入到真核细胞中的技术称为转染技术。常用的转染技术主要分为两种，即瞬时转染和稳定转染。

瞬时转染后的细胞中的外源DNA/RNA没有整合到其染色体中，但在细胞中可以转入多个拷贝，因此可以实现特定基因高表达的目的。瞬时转染的优点是所需时间短，一般48h即可成功转染进行后续研究。缺点是这种转染效果只可保持几天，随着细胞的不断增殖复制会逐渐丢失。

稳定转染是指外源基因被整合到真核细胞的基因组中。外源基因成为细胞基因的一部分随着染色体的复制而复制。因此可以得到永久性表达某种基因的细胞系。然而要想得到稳定转染的细胞系需要长时间的筛选过程。其中常用的方法是将外源基因与抗生素抗性基因共同转染到基因组中。这样就可以利用相应的抗生素筛选获得稳定转染特定基因的细胞。

转染效率的影响因素主要有：

A、转染试剂：每种转染试剂的说明书上都会标明已经成功转染的细胞系的参考文献。因此在进行转染前应根据需要选择最适合的高效并且低毒转染试剂。

B、细胞状态：确保细胞代数在50代以下，且处于指数生长期。因为细胞生长越旺盛最容易成功转染。除此之外细胞密度也与转染效率有着很大的关系。因此在选用新的转染试剂或细胞系时，首先要优化实验条件。

C、血清的存在不会影响转染效率，但血清的存在会影响DNA-转染复合物的形成，因此在DNA-转染复合物形成时要用无血清培养基稀释DNA和转染试剂。

D、抗生素：细胞培养过程中通常要添加抗生素来防止细菌造成的污染。但有些转染试剂会增加细胞的通透性，这样抗生素就可以进入细胞，造成一定的细胞毒性。

E、DNA质量：DNA质量的好坏也是能否成功转染的决定因素。首先要保证DNA的浓度，高浓度的DNA比低浓度的DNA转染效率高。另外要保证DNA的纯度。盐离子，蛋白，内毒素，脂多糖分子等的污染都会影响转染效率。

2、实验步骤

(1)LB培养基的配置：

称取蛋白胨10g,酵母提取物5g，氯化钠10g，用去离子水溶解定容至1L，调PH至7.0，高压灭菌后待冷却至室温加入1ml 1000×Amp后，4℃保存备。

(2)1000×抗生素配置：

称取50mg氨苄青霉素，用1ml去离子水溶解后过滤(0.2μM)配成浓度为50mg/ml的储备液分装备用。

(3)菌液扩增：

取20μl shjagged1,shβ-catenin菌种于25ml LB培养基中(装于50ml离心管中)，37℃200rpm，摇菌过夜12-14h。

(4)保种

培养细菌，一般12-16个小时(至OD600到0.6-0.8时)，用一个1.5mlEP管，50％的甘油和菌液1比1混匀，直接放入-80度冰箱可长期保存。

(5)提取质粒：

原理：质粒提取除了可以根据染色体DNA分子大小不同进行分离，还可以根据碱基组成的差异提取分离。

材料：过夜培养的大肠杆菌质粒菌、异丙醇、70％乙醇、灭菌离心管、微型离心机、ThePlasmid DNA Miniprep Kit。

步骤：

1)平衡柱子：将试剂盒中的核酸纯化柱放好，加2ml平衡缓冲液(EQ1)到柱上。让平衡缓冲液凭重力自然流过柱子。

2)收集菌液：将过夜扩增后的菌液20ml于5000rpm离心10分钟，去掉上清。

3)重悬：加入0.4ml的重悬缓冲液(含RNaseA)于沉淀中，将菌体重新悬起直到均一的菌液产生。

4)裂解：加入0.4ml裂解液(L7)，上下颠倒离心管五次，轻柔混匀不要涡旋，室温孵育5min.

5)沉淀：加入0.4ml沉淀缓冲液(N3)后立刻上下颠倒离心管至沉淀均一，注意不要涡旋。12000g每分钟转速室温离心10min。

6)结合：将上清液载入平衡好的柱子上，自然流过

洗涤：用洗涤液(W8洗脱柱子两次，每次都尽可能让洗脱液流干净。

洗脱：将灭菌离心管放于洗脱柱子下，加入0.9ml洗脱液(E4)于柱子上，让洗脱液慢慢流下，洗脱液中含有纯化的质粒。

7)沉淀及洗涤：在洗脱液中加入0.63ml异丙醇，充分混合，在4℃12000g离心30分钟。去掉上清液，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀后4℃12000g离心5分钟去掉上清。

8)重悬：将质粒在空气中干燥10min，加入20μl TE缓冲液重悬，控制质粒浓度≥1μg/ml左右。质粒保存在-20℃。

(6)质粒定量检测

原理：利用核酸在260nm处具有紫外吸收特性，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。

方法：

1)取2μl质粒溶液，点于Biotec(美国生物技术公司)RNA/DNA检测板上，置于Biotec酶标仪中检测。

2)记录OD260值，通过计算确定DNA浓度，公式如下:

质粒DNA(μg/ml)＝50×OD260×稀释倍数

3)纯度

根据在260nm以及在280nm的读数比值(A260/280＝OD260/OD280)估计核酸的纯度

A260/280＝1.8 DNA样品较纯,符合实验要求

A260/280>1.9 RNA污染

A260/280<1.6 有蛋白质或其它杂质的污染

(7)转染：

a、Huh7细胞以2×10⁵个细胞每孔铺于六孔板中，37℃，5％CO₂培养过夜。

b、细胞密度最好在70-80％的时候进行转染。

C、每孔取2.5μg质粒于25μl Opi-MEM混匀孵育5min，取LipofentamineTM2000 5μl于25μl Opti-MEM转染稀释液中混匀孵育5min。

d、将质粒复合物和转染试剂复合物混匀后室温孵育20min。

e、每孔缓慢滴加50μl转染混合试剂于六孔板中，转染24h后换液，加药继续培养24h后进行蛋白免疫印迹等后续实验。

四、实验结果

(一)稳定表达调控型Luciferase293(荧光素酶)细胞系的鉴定

1、PCR鉴定

提取TRE-luciferase单克隆细胞株的DNA，利用PCR方法分别鉴定Puromycin、luciferase(荧光素酶)检测该基因是否整合入基因组。

检测结果表明Puromycin和luciferase均整合入细胞基因组DNA。

表1-3 引物序列

Tab.1-3Sequence of primers

2、Luciferase鉴定

利用promega的E1500试剂盒于96孔板中检测luciferase的活性。实验组TRE-luciferase clone1-14均能检测到luciferase的活性，其发光系数从380380-903850不等，均为6个数量级；阳性对照组CMV-Luciferaseclone4,5,6,8,9的luciferase活性，其发光系数从137830-445360不等，均为6个数量级；阴性对照组CMV-TRAIL clone1-6的luciferase活性，其发光系数从20-137不等，仅为2个数量级。

(二)Notch信号通路天然小分子抑制剂的筛选

根据上述筛选的细胞系，选取clone3(克隆3)作为下游筛选用的细胞系。将1600种化合物，分别按照10μM,5μM,2μM,1μM,500nM,200nM,100nM的浓度梯度，3个重复加入到96孔板中，48h后测试luciferase，获得11个候选化合物(图1)。根据化合物活性及文献调研结果最终选择鸦胆子苦素D化合物做后续抗肿瘤活性研究

(三)鸦胆子苦素D对肝癌细胞活力的影响

利用人肝癌肿瘤细胞系和人正常肝细胞系模型评估鸦胆子苦素D体外抗肿瘤功效。我们将两种肝癌肿瘤细胞和两种人正常肝细胞给予不同浓度的鸦胆子苦素D(0-20μM)处理48h,并通过CCK-8检测其对细胞生长的抑制活力。结果显示，鸦胆子苦素D可以显著抑制人肝癌细胞的生长能力，其半数抑制浓度为1.87μM。而对正常肝细胞的细胞毒性较小，这说明鸦胆子苦素D对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用。相同浓度下不同时间点鸦胆子苦素D抑制Hep3B细胞增殖的效率不同。

另外，软琼脂克隆形成结果表明，经(0.25-1μM)鸦胆子苦素D处理24h后的肝细胞癌细胞与对照组(DMSO)比较克隆形成能力明显降低(图1)。

(A)鸦胆子苦素D对肝细胞癌细胞Huh7、Hep3B细胞和肝正常细胞QSG-7701生长的影响。三种细胞系给予不同浓度的鸦胆子苦素D处理48小时，细胞活力通过CCK-8方法进行测定。(B)以不同浓度鸦胆子苦素D处理24、48、72小时后对Hep3B细胞生长活力的抑制作用。(C)以不同浓度鸦胆子苦素D处理24后软琼脂培养10天对Huh7、Hep3B细胞的克隆形成能力的抑制作用。

(四)鸦胆子苦素D浓度依赖性的促进肝癌细胞系凋亡

Huh7、Hep3B细胞经不同浓度鸦胆子苦素D(0，2，4μM)处理24小时后，经.Annexin V-FITC(膜融合蛋白V异硫氰酸荧光素)和propidium iodide(PI)染料染色用流式细胞仪分析细胞的凋亡情况,结果来自三次独立实验(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001与对照组比较)。

见(图2)

(五)鸦胆子苦素D对γ-分泌酶的影响

γ-分泌酶是位于细胞膜上的由四种亚基组成的蛋白复合体，我们用膜蛋白提取试剂盒提取Huh7及Hep3B细胞系膜蛋白后用western(蛋白免疫印迹)的方法发现(1-2μM)鸦胆子苦素D处理后对两种细胞系中四种组分的蛋白表达没有影响(图3)。

用△ENotch质粒转染293T细胞后加入不同药物发现，空载质粒组由于没有γ-分泌酶的底物未检测到NICD(NOTCH细胞内片段)表达，DAPT(氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯)可以很好的抑制γ-分泌酶活性，使得底物不能被催化产生NICD(NOTCH细胞内片段)，鸦胆子苦素D则与DMSO阴性对照组一样不能抑制γ-分泌酶活性(图3)。

将来源于酵母的转录激活因子Gal4的DNA结合序列与来源于单纯疱疹病毒的转录激活序列VP16融合表达于N100的C末端，即构成N100-GV质粒。当N100被γ-分泌酶在细胞膜上剪切后，GV即跟随被剪切下的NICD(NOTCH细胞内片段)离开细胞膜，进入细胞核，激活靶基因荧光素酶的表达。因此，荧光素酶的表达量与γ-分泌酶剪切N100-GV活性呈直接关联关系。本研究结果再一次证明了鸦胆子苦素D对γ-分泌酶活性没有影响(图3)。

(A)(0-1μM)鸦胆子苦素D处理肝癌细胞系48h后对γ-分泌酶不同组分表达量的影响。(B)蛋白免疫印迹法验证鸦胆子苦素D对γ-分泌活力的影响。(C)通过酶标仪检测鸦胆子苦素D对γ-分泌酶活性的影响。

(六)鸦胆子苦素D对notch信号通路的影响

鉴于鸦胆子苦素D从Notch信号通路抑制剂筛选模型中筛得，而鸦胆子苦素D对于Notch信号通路中关键的γ-分泌酶活性没有影响，因此我们用免疫印迹的方法考察鸦胆子苦素D对Notch信号通路中关键蛋白是否有影响，并同时考察了鸦胆子苦素D对于凋亡增殖相关蛋白的影响。

结果表明，经鸦胆子苦素D处理24h后huh7和hep3B细胞中Jagged1,NICD(NOTCH细胞内片段),Hes1,显著下调。凋亡增殖相关蛋白cyclinD1,survivin(生存素),c-Myc,caspase9,PARP(DNA修复酶)也显著下调(图4)。因此我们推断鸦胆子苦素D可能是通过抑制Notch信号通路中最上游的配体jagged1的表达进而导致下游NICD(NOTCH细胞内片段)、Hes1的表达下降从而发挥生长抑制和促进凋亡的抗肿瘤功效，另外从凋亡蛋白caspase9和PARP的表达再次验证了鸦胆子苦素D可以诱导肝癌细胞的凋亡(图4)。

Huh7和Hep3B细胞给予鸦胆子苦素D(1或2μM)处理24小时后，利用免疫印迹分析Notch信号通路及与细胞增殖凋亡相关蛋白的表达情况，其中GAPDH(磷酸甘油醛脱氢酶)作为内参。

除了鸦胆子苦素D，本发明人从鸦胆子(云南西双版纳热带植物园)分离得到的苦木素类化合物还包括鸦胆子苦苷A，鸦胆子苦苷B，鸦胆子苦素E，鸦胆子苷A，鸦胆子苷G(表1-4)

表1-4 鸦胆子类似物名称及编号

我们用蛋白免疫印迹的方法分别考察这些类似物对Notch信号通路上游配体jagged1表达的影响，结果发现除了鸦胆子苦素D对jagged1表达有影响外其它类似物不能下调jagged1的表达(图5)。

鸦胆子及其类似物在2μM的条件下处理huh7细胞24h后对Notch信号通路配体jagged1表达的影响。考察鸦胆子苦素D对jagged1蛋白抑制作用的浓度依赖性和时间依赖性。用1μM鸦胆子苦素D处理huh7细胞发现8小时后jagged1的表达量开始降低，另外用不同浓度的鸦胆子苦素D处理huh7细胞24小时发现500nM的鸦胆子苦素D即可下调jagged1的表达量

(七)过表达jagged1后鸦胆子苦素D对肝细胞癌细胞系huh7增殖凋亡的影响

由以上结果推测鸦胆子苦素D通过抑制β-catenin(β-连环蛋白)的入核，使得细胞核中β-catenin/Tcf4转录活性降低，导致下游靶基因jagged1的表达降低进而抑制了肝癌细胞的增殖和促凋亡，因此我们在jagged1质粒转染huh7细胞的条件下评价鸦胆子苦素D对huh7细胞的增殖凋亡作用。结果发现，过表达jagged1的条件下(图6)加入鸦胆子苦素D台盼蓝实验结果显示与转染前比较鸦胆子苦素D对抑制huh7细胞的增殖作用减弱。流式细胞仪凋亡结果显示jagged1过表达后可以抵抗鸦胆子苦素D对huh7细胞的促凋亡作用。另外，shjagged1质粒转染huh7细胞，发现在干扰jagged1后可以起到抑制huh7细胞增殖和促进huh7细胞凋亡的作用。

(A)Huh7细胞经jagged1质粒过表达48h以及过表达jagged124h后再加入鸦胆子苦素D化合物处理24h或jagged1干扰48h后不同情况jagged1表达量的情况。

(B)jagged1过表达或干扰掉之后对Huh7细胞增殖的影响。(C)jagged1过表达或干扰掉之后对Huh7细胞凋亡的影响。

(八)鸦胆子苦素D抑制Wnt信号通路及Wnt与Notch信号通路的关系

鉴于鸦胆子苦素D明显下调Notch信号通路中Jagged1的基因水平，因此推测鸦胆子苦素D可能作用于Notch信号通路的上游某个蛋白，根据文献报道wnt和notch的密切关系，Jagged1是Wnt/β-catenin通路的靶基因，因此我们先用FOP/TOP方法考察鸦胆子苦素D是否对Wnt下游有抑制作用，结果表明，鸦胆子苦素D在Hep3B和Huh7细胞中抑制基础的和LiCl-诱导的Top flash activity，且呈浓度依赖性；同时对Fop activity无影响。接着用免疫印迹的方法证明了鸦胆子苦素D对Wnt信号通路靶基因c-Myc，cyclinD1，survivin相关蛋白的抑制作用而对β-catenin和Tcf4的表达没有影响，另外，用RT-PCR的方法发现鸦胆子苦素D对Wnt信号通路靶基因LEF1，AXIN2，c-Myc，jagged1，cyclinD1，survivin的mRNA水平具有抑制作用(图7)。

(A)肝癌细胞共同转染了含β-catenin/Tcf结合位点(TOP-flash)或者突变的β-catenin/Tcf结合位点(FOP-flash)的萤火虫荧光素酶报告基因和海肾荧光素酶(Renilla luciferase)基因后经不同浓度的鸦胆子苦素D处理24小时。海肾荧光素酶作为内参，相对荧光素酶活性(萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶)代表报告基因启动子的转录活性；每组实验样品3个平行实验孔，并至少进行3次重复实验(*P<0.05，***p<0.001)。(B)不同浓度的鸦胆子苦素D化合物对肝癌细胞系中Wnt信号通路相关蛋白表达的影响(C)RT-PCR检测鸦胆子苦素D对Wnt信号通路靶基因的影响。为进一步在HCC细胞中证明Wnt和notch的上下游关系，我们用shβ-catenin,shjagged1质粒分别干扰掉Huh7、Hep3B细胞中的Jagged1和β-catenin基因，结果发现干扰掉β-catenin的同时Jagged1的表达量下调，在shβ-catenin和鸦胆子苦素D的共同作用下可使jagged1下调更加明显，而干扰掉Jagged1，β-catenin的表达量没有影响。因此有理由推测β-catenin处于Jagged1的上游。鸦胆子苦素D是通过影响上游β-catenin的活性导致jagged1基因水平的改变。

(九)鸦胆子苦素D抑制β-catenin的入核

β-catenin在细胞质和细胞核中都有表达，过量的β-catenin通过入核后与Tcf4等蛋白的结合启动下游靶基因的表达进而影响细胞的增殖。经鸦胆子苦素D处理huh7、Hep3B细胞后分别提取胞浆蛋白和核蛋白发现鸦胆子苦素D对胞浆蛋白中β-catenin表达没有影响，确显著下调了核蛋白中β-catenin的表达。用免疫荧光的方法再次验证了鸦胆子苦素D可以抑制β-catenin的入核(图8)。由此可以推断鸦胆子苦素D化合物有可能是通过抑制β-catenin的入核，导致β-catenin/Tcf4复合物减少，进而影响了下游jagged1以及增殖凋亡相关蛋白的表达。(图8)

五、统计分析方法

体外实验结果均采用SPSS软件运用单因素方差分析进行统计检验，两两比较采用Dunnett’s进行分析，检验水平为p<0.05，所有数据表示为mean±SEM(标准误)。

实施例2 鸦胆子苦素D的体内抗肿瘤活性研究

一、裸鼠成瘤实验

(一)实验材料

1、实验动物

裸鼠：Balb/c，雄性，4周龄，体重10-14g，12只。购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证编号：2007000516082，动物饲养于第二军医大学无特定病原体(specific pathogen free，SPF)环境中，恒温(23±2)℃，湿度45％-60％，每日光照12h。常规高压灭菌饮食。

2、药品与试剂

3、实验仪器

(一)实验方法

1、溶液配制

(1)动物组织固定液4％多聚甲醛

称取4g多聚甲醛(EM级)和100ml PBS,然后加入几滴NaOH。用磁力搅拌棒在通风厨中加热到60℃直至溶解。冷却至室温后调整PH值至7.4。注意现用现配。

(2)1.68％γ-cylodextrin

取1.68gγ-cylodextrin于100ml 0.9％生理盐水中，过滤，4℃备用。

(3)50％Matrigel

将Matrigel基质胶于冰上过夜融化，用预冷的DMEM稀释Matrigel至50％浓度。

2、裸鼠皮下荷瘤模型建立

选取四周龄的BALB/C裸鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)按规定饲养于SPF级动物房适应4天后，称重编号。将对数生长期Huh7细胞消化离心后重悬于无血清并含50％(v/v)Matrigel的DMEM培养基中，随后皮下注射到裸鼠右侧腹股沟处，每只裸鼠5×10⁶Huh7。每天观察并检测裸鼠的生长状况，肿瘤大小和体重变化。

3、给药及取材

将肿瘤大小均一，健康状况良好的裸鼠随机分成四组(n＝6)，分别为对照组，低剂量组，中剂量组和高剂量给药组。鸦胆子苦素D溶于含1.68％γ-环糊精的生理盐水(经0.22μm微孔滤膜过滤)中，由低到高剂量分别为0.75mg/ml,1.5mg/ml,3mg/ml。对照组给予相同体积的1.68％γ-环糊精的生理盐水。通过裸鼠尾静脉给药，给药频率为每天给药，共治疗10天。肿瘤大小按如下公式计算：1/2×a×b²。

末次给药24h后，测量并记录各组肿瘤大小计算肿瘤体积，称重。脱臼法将裸鼠处死后立刻取出皮下肿瘤，用PBS清洗两遍后，随机取其中三只的肿瘤组织于4％多聚甲醛中免疫组化实验备用。另外三只-80℃保存WB实验备用。

统计分析：除特别指出外，所有数据以“平均值+_标准误(mean+_s.e.m)”表示，结果来自至少三次独立实验并用Student’s t test进行检验，P值小于0.05时认为有统计学差异。*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001。

4、免疫组化及WB

免疫组化操作步骤：

(1)切片常规脱蜡至水，如需抗原修复，可在此步后进行；

(2)缓冲液洗3min/2次；

(3)为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色,将切片放在Hydrogen Peroxide Block中孵育10-15分钟；

(4)缓冲液洗2次，5min/次；

(5)滴加Ultra V Block，在室温下孵育5分钟以封闭非特异性的背景染色。

(注：孵育不要超过10分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有5-10％正常羊血清，这一步可以省略。)

(6)缓冲液洗2次，5min/次。

(7)滴加一抗工作液37℃孵育1-2小时。(具体孵育时间和温度由试验者最终决定)

(8)缓冲液洗2次，5min/次。

(9)滴加Primary Antibody Enhancer(增强子),在室温下孵育20分钟。

(10)缓冲液洗5min/2次。

(11)滴加HRP Polymer(酶标二抗)，在室温下孵育30分钟。

(注：HRP Polymer对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。)(12)缓冲液洗5min/2次。

(13)向1ml DAB Plus Substrate(底物)(或AEC Plus Substrate(底物))中滴加1-2滴DAB Plus Chromogen(铬精)(或AEC Plus Chromogen(铬精)),混匀后滴加到切片上，孵育3－15分钟。(具体时间由染色深浅决定。)

(14)自来水充分冲洗,复染，脱水,透明,封片。

组织样品的WB实验前处理方法：

称重肿瘤组织，先将肿瘤组织用小的眼科剪剪碎，然后充分研磨捣碎，按1mg肿瘤组织加入1ml裂解液，冰上充***解1h,离心后取上清进行蛋白定量，其余方法同第一章中WB方法。

(三)实验结果

为了在体内进一步验证鸦胆子苦素D的抗肝癌肿瘤活性，用肝细胞癌皮下肿瘤模型评估了鸦胆子苦素D对裸鼠皮下Huh7细胞的生长抑制作用。结果发现中剂量组1.5mg/kg与对照组相比显著抑制肝细胞癌细胞Huh7细胞的生长，其抑制率为50％(p<0.001),且给药组体重与对照组比较无明显变化(图9)。而高剂量组3mg/kg由于具有一定毒性，使个别裸鼠体重有下降趋势。为了进一步验证鸦胆子苦素D的抗肿瘤机制，分别取三只独立的对照组和给药组裸鼠皮下的肿瘤组织分别用免疫组化和蛋白免疫印迹方法检测了notch及Wnt信号通路相关蛋白的表达差异。结果表明，经鸦胆子苦素D治疗后的肿瘤组织中jagged1，cyclinD1和survivin的表达量显著降低。上述体内结果与体外细胞水平结果再一次验证了鸦胆子苦素D的抗肝细胞癌的分子机制，因此在细胞水平和体内水平同时证实了鸦胆子苦素D是通过抑制wnt和notch信号通路来发挥抗肿瘤作用的。

(A)对照组和给药组体内肝细胞癌Huh7细胞生长曲线。Huh7细胞皮下注射到雄性裸鼠腹股沟，并尾静脉给予对照或1.5mg/kg鸦胆子苦素D连续治疗10天，每天测量肿瘤的大小和裸鼠的体重变化。(B)给药组和对照组裸鼠的体重变化。(C)图例显示了对照组和给药组裸鼠肿瘤组织。(D)蛋白免疫印迹分析对照组和给药组裸鼠肿瘤组织wnt和notch信号通路相关蛋白的表达情况。(E)免疫组化方法分析对照组和给药组wnt和Notch信号通路相关蛋白的表达情况。

二、斑马鱼模型评价化合物鸦胆子苦素D对Wnt信号通路的抑制作用

(一)、实验方法

1、材料与方法

1.1实验材料

1.1.1药物

化合物鸦胆子苦素D购自上海源叶生物科技有限公司，母液为10mM，-20℃保存，临用前稀释。

1.1.2实验仪器与试剂

解剖显微镜(SZX7，Olympus公司)；96孔板(Nest Biotech)；MESAB(Sigma，批号20120216)；IWR-1(Lot#101M4624V，Sigma)。

1.1.3实验动物

斑马鱼胚胎由环特生物自行生产。斑马鱼的繁殖方式属于自然成对交配，一对成年斑马鱼可产200-300个胚胎，每次实验数目在4-5对左右。在胚胎产生后，在6h及24h两个点进行筛选，选择存活的合适胚胎，使其进入养鱼专用水孵育((养鱼用水水质：28℃下，每1L反渗透水中含200mg速溶海盐，电导率为480～510μS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/L CaCO3))。斑马鱼胚胎营养物质来源于自身的卵黄囊，故9d内无需喂食。实验结束时，将不同发育阶段的斑马鱼分别使用三卡因甲磺酸过度暴露并麻醉处死。麻醉处死的操作步骤符合美国兽医协会(AVMA)对动物麻醉处死的规范要求。

1.2.基于斑马鱼表型评价化合物鸦胆子苦素D对Wnt信号通路的抑制作用

–化合物鸦胆子苦素D的四个评价浓度为：3μM、10μM、30μM、100μM；

–阳性对照组：IWR-1；

–阴性对照组：溶剂组；

–所有实验组(除空白对照组)均含有相同浓度的溶剂；

–空白对照组用于证明溶剂不会对斑马鱼产生有害影响；

–用96孔板处理斑马鱼，每个浓度处理2个孔，每个孔处理5尾斑马鱼，每孔200μL养鱼用水。在16个细胞期时分别加入化合物鸦胆子苦素D，8h后移除药物，48h观察结果；

–化合物鸦胆子苦素D处理结束后，在显微镜下观察有无Wnt信号通路抑制后的特异表型：体轴发育异常(身体变短、尾部缺失、背侧弯曲)。根据表型判断化合物鸦胆子苦素D是否对斑马鱼Wnt信号通路有影响；

–(三)、实验结果

100μM鸦胆子苦素D在不引起斑马鱼死亡的条件下可以观察到Wnt信号通路抑制后所引起的体轴发育异常。实验结果见表3.1、。

表3.1 化合物对斑马鱼表型的影响

不同浓度的鸦胆子苦素D化合物处理斑马鱼后，斑马鱼表型的改变情况，10μMIWR-1为阳性对照化合物。

Claims (4)

1.鸦胆子苦素D在制备Wnt/Notch信号通路抑制剂药物中的应用，其特征在于，所述鸦胆子苦素D为下列结构式的化合物：

2.根据权利要求1所述鸦胆子苦素D在制备Wnt/Notch信号通路抑制剂药物中的应用，其特征在于，所述应用为鸦胆子苦素D在制备预防/治疗肝癌药物中的应用。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物为由鸦胆子苦素D作为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物组合物为口服制剂、注射剂或皮肤给药制剂。