CN108728492A - 一种基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法 - Google Patents

一种基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108728492A
CN108728492A CN201710255423.1A CN201710255423A CN108728492A CN 108728492 A CN108728492 A CN 108728492A CN 201710255423 A CN201710255423 A CN 201710255423A CN 108728492 A CN108728492 A CN 108728492A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fusion
gene
gene mutation
positive reference
reference product
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710255423.1A
Other languages
English (en)
Inventor
高劲松
张英杰
魏潇
魏奇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LIAONING QIRUN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
LIAONING QIRUN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LIAONING QIRUN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd filed Critical LIAONING QIRUN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201710255423.1A priority Critical patent/CN108728492A/zh
Publication of CN108728492A publication Critical patent/CN108728492A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明的目的在于提供一种基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法，所述制备方法采用将外来基因整合到细胞基因组中的慢病毒或逆转录病毒作为载体，制备符合不同基因突变或融合基因的序列，经测序验证无误后，通过病毒嵌入到细胞基因组DNA中，药物筛选出带有基因突变或融合基因的单克隆细胞系，从而获得源源不断的阳性参考品。其中所述的细胞系优选为293T细胞系，所述的突变可以是单一基因单一突变位点、单一基因多个位点突变、多个基因多个位点突变，所述融合基因可以是单一的融合基因，也可以是多个串联的融合基因；该方法具有快速、准确、简单、成本低、灵敏度高、能大规模进行生产的优点，有利于市场的使用和推广。

Description

一种基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法
技术领域
本发明属于基因检测领域，特别提供一种基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法。
背景技术
众所周知，基因诊断是近年来发展极为迅速的一个领域，在肿瘤的分子诊断和靶向治疗、传染病病原体确定及其他疾病个体化治疗的基因型(SNP)检测或分析时都需要用到基因检测技术，因此，基因检测的临床需求越来越大。目前普遍采用的检测方法如二代测序技术(Next-generation sequencing technology)、扩增阻碍突变***(Amplificationrefractory mutation system，ARMS)-PCR、数字PCR(Digital PCR,dPCR)技术等，根据这些技术，正在开发相应基因检测试剂盒，而所开发的试剂盒中不可避免的都需要有阳性参考品作为检测时的阳性对照，因为基于临床应用的试剂盒在开发过程中必须要有阳性对照样本进行试剂盒的相应实验，除了防止假阴性发生外，还需要对试剂盒的各项性能指标做出判断和评价，在后续的试剂盒注册审批过程中也需要有相应的阳性或阴性参考品进行注册检验；所谓参考品，即具有一种或多种足够均匀和确定了很好的特性，用以校准测量装置、评级测量方法或给材料赋值的一种材料或物质。
目前基因突变检测试剂盒中最常见的阳性参考品是带有相应突变位点的人工质粒，但是，质粒DNA不是组织细胞中的基因组DNA，它是人工制备的产物，分子量仅仅为3-4千碱基对，而待检测的标本都是全基因组DNA，分子量为30亿碱基对，在检测的基质上存在较大偏差，因此会导致一定的失真性，同时在制备和检测时，质粒很容易形成气溶胶而污染环境，进而出现假阳性；阳性质粒只有待检测基因的突变位点，不能检测出内控和外控指标，因此以质粒作为阳性标准欠缺完整性，另外，质粒浓度低于一定量时其稳定性不能保持24h，即不具备稳定性。对于融合基因的检测而言，质粒作为阳性参考品存在的诸多不足，因为融合基因检测的靶标，往往是mRNA，而质粒是DNA，检测mRNA必须要经过逆转录成cDNA的步骤，检测DNA则不需要这步，因此两者的检测步骤存在很大的差异，用质粒做参考品同样很容易出现假阴性或假阳性的问题，检测的可靠性大打折扣。除了阳性质粒作为阳性参考品外，一些容易得到的突变组织或细胞来源的基因组DNA也可以作为阳性参考品，但肿瘤基因突变或正常的SNP，其类型多样，可谓***，受临床样本的稀有性和一系列社会学伦理学因素的制约，很难收集到足够量的临床样本，加之肿瘤组织的异质性，用Sanger测序的方法常常存在灵敏度的欠缺而发生混乱，因此，来自肿瘤组织或细胞的这种参考品受到极大限制，而普遍使用的质粒参考品明显是现在一些分子诊断试剂盒组份中的一个短板。
国家食品药品监督管理局医疗器械评审中心对参考品有明确的要求，即参考品的基质应与临床被检样本使用相同的基质，如完全相同基质的样本不易获得，应采用尽可能与临床被检样本基质接近的样本，这里提及的基质，就是待检测样本中的基本构成物质，如检测血液中的病毒，其基质当是血清或血浆，如检测的是肿瘤基因突变，其基质当是来自组织或细胞的基因组DNA，如检测的是肿瘤融合基因，其基质当是细胞RNA，即参考品和临床检测样本中的被测物尽可能的一致。如果参考品的设置不合理或者存在缺陷，那就会造成整个产品的原材料选择、生产工艺的确定和反应体系的组成均存在较大的问题，导致产品的质量不能达到临床使用的安全性和有效性，容易在临床检测过程中出现错误结果而影响临床的诊断和治疗。可见一个好的参考品对检测试剂的生产企业是多么的重要，但现在国家还没有基因突变和融合基因相关检测试剂的参考标准品，这也是国家有关部门亟待解决的问题。
发明内容
针对上述缺陷，本发明要解决的技术问题是提供一种能满足所有基因突变类型和基因融合阳性参考品的制备方法，从而避免因为核酸提取和检测环节失误导致假阴性假阳性和稳定性差的情况发生。
本发明提供了一种基因突变类型和基因融合阳性参考品的制备方法，该方法就是将在细胞外制备好的符合基因突变或融合基因的病毒质粒，通过慢病毒或逆转录病毒能整合入细胞基因组的特性，将突变或融合基因位点嵌合进细胞基因组DNA中，再采用药物筛选出带有外来突变或融合基因的单克隆细胞系，通过对这样细胞系的大量培养和存储，就可以保证源源不断的阳性参考品，而这种带有嵌合进突变或融合基因位点的基因组DNA，完全克服了上述不足，获得稳定的突变DNA或融合基因mRNA，并且取之不竭。
本发明提供了一种基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法，具体步骤如下：
(1)构建相应符合基因突变和融合基因序列的病毒质粒
a.调出要检测基因相应突变位点的基因组DNA序列和融合基因的mRNA序列；
b.在基因突变位点和融合基因的上下游选择扩增引物，并在引物的两端分别添加适当的酶切点序列；
c.对基因突变位点或融合基因进行PCR扩增，对PCR产物进行酶切纯化，同时对相应的病毒载体进行酶切纯化；
d.酶切纯化后的PCR产物和病毒质粒进行连接反应，经过热休克细菌转化，阳性克隆筛选，质粒抽提和基因测序，获得序列完全符合基因突变和融合基因序列的重组质粒；
(2)构建带有基因突变或融合基因的稳定细胞系
a.病毒包装质粒和上述(1)制备的重组病毒质粒一起转染病毒包装细胞制备病毒上清；
b.药物筛选出嵌入重组病毒基因序列的细胞系，具体步骤如下：
在新鲜的培养基中加入适量制备好的病毒上清，并加入终浓度为6μg/ml的polybrene(Sigma产品)，放置于37℃5％CO2的孵箱中培养24h后，加入终浓度为2μg/ml的puromycin(Sigma产品)处理杀灭没有感染的细胞；
c.验证突变位点和融合基因获得基因突变和融合基因阳性参考品；
本发明进一步提供了一种基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法，其中包括以下步骤：分别取Promega公司快速2XT4DNA连接酶反应缓冲液3μl、PCR酶切纯化产物2μl、酶切纯化病毒载体1μl、T4DNA连接酶1μl，离心混匀，放置室温30min，再取连接后产物2μl，加入20μl的DH5α感受态细胞(美国NEB公司)中，冰浴0.5h后，42℃热休克30sec，然后加入200μl SOC培养液，37℃震荡培养1h，再将此培养物均匀涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂培养板上，放置37℃孵箱过夜培养。
本发明又一步提供了一种基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法，其中包括以下步骤：将病毒包装质粒和带有突变位点或融合基因的重组病毒质粒一起转染至准备好的293T细胞，具体如下：取1.5ml灭菌EP管，加入1.0μg包装混合质粒和1.0μg突变病毒质粒以及250μl的无血清Opti MEM(美国Life公司)。轻柔混匀，室温孵育5min，同时取1.5ml灭菌EP管，取6μl脂质体Lipofectamine 2000(美国Life公司产品)溶于250μl无血清Opti-MEM I培养基中，轻柔混匀，室温孵育5min；将质粒溶液和脂质体溶液轻柔混匀，室温孵育20min；在六孔板中，加入质粒脂质体复合物；然后放置于37℃5％CO2的孵箱中培养，24h后用新鲜的DMEM含10％FBS培养基换液；继续培养48-72h后收获含病毒的上清，3000rpm离心20min，去除沉淀，病毒上清-80℃贮存或立即感染细胞。
为提高本发明基因突变和融合基因阳性参考品的纯度，在新鲜的培养基中加入适量制备好的病毒上清，并加入终浓度为6μg/ml的polybrene(Sigma产品)，放置于37℃5％CO2的孵箱中培养24h后，加入终浓度为2μg/ml的puromycin(Sigma产品)处理杀灭没有感染的细胞。
作为本发明基因突变和融合基因阳性参考品制备方法的一个优选方案，选择携带有肿瘤突变位点融合基因或SNP位点的人工重组病毒载体，即可以将外来基因整合到细胞基因组中的病毒载体，包括慢病毒载体和逆转录病毒载体。
作为本发明基因突变和融合基因阳性参考品制备方法的另一个优选方案，其中的细胞系为293T细胞系，还包括多种细胞系可供选择，如其他类型的293、CHO、Hela和A549等等，最佳选择293T细胞系。
本发明再一步提供了一种基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法，其中通过极限稀释法筛选出的单个细胞在37℃5％CO2的孵箱中进行培养，并对测序验证正确的细胞系进行扩大培养，获得单一克隆细胞系。
作为本发明基因突变和融合基因阳性参考品制备方法的又一个优选方案，其中所述的细胞系是单一基因单一突变位点的细胞系、单一基因多个突变位点的细胞系和多个基因多个突变位点的细胞系，单一融合基因和多种融合基因的细胞系。制备基因突变或融合基因的阳性模板，可以通过PCR快速突变方法或RT-PCR对病人标本的扩增而来，也可以直接通过基因合成公司合成得到。
为使本发明基因突变和融合基因阳性参考品能够广泛应用，所述制备方法可以制备碱基置换、移码、缺失、***突变、融合基因、染色体移位及其罕见突变的阳性参考品。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明，其中：
图1为突变位点的扩增结果图；
图2为与突变位点对应的野生型位点扩增结果图；
图3为内参照基因GAPDH扩增结果图；
其中，图1、图2和图3中所示的图中曲线1、2、3、4、5分表表示105个突变细胞，2X104个突变细胞、4X103个突变细胞、8X102个突变细胞和1.6X102个突变细胞的扩增曲线；
图4为A549细胞和含Gly12Ser突变位点293T细胞均加入50ng/μl核酸检测结果图；
图5为A549细胞和含Gly12Ser突变位点293T细胞核酸浓度同时稀释100倍后的检测结果图；
图4和图5中1表示A549细胞的核酸检测结果，2表示含Gly12Ser突变位点293T细胞的核酸检测结果。
具体实施方式
下面就实施案例对本发明做进一步描述：
实施例1
以PCDH慢病毒作为载体制备BRAF V600E基因突变阳性参考品：
(1)首先从NCBI网址的Genbank中调出要检测基因相应突变位点的基因组DNA序列，如：BRAF V600E基因突变，查见围绕V600E突变位点的BRAF基因组DNA序列，并在突变位点上下游约500bp复制其序列，序列如下：ATCTATTAGTCCCTTTCAGACCTCTGACCTTGCTCAGTGGTAGTTGAGATATAACTGAAGACTCTAAATTATATAACAATGAGGTGAGAAAAACATAATATTTCTCTTCCCTAAGTGCAGACTAAGATACTATCTGCAGCATCTTCATTCCAATGAAGAGCCTTTACTGCTCGCCCAGGAGTGCCAAGAGAATATCTGGGCCTACATTGCTAAAATCTAATGGGAAAGTTTTAGGTTCTCCTATAAACTTAGGAAAGCATCTCACCTCATCCTAACACATTTCAAGCCCCAAAAATCTTAAAAGCAGGTTATATAGGCTAAATAGAACTAATCATTGTTTTAGACATACTTATTGACTCTAAGAGGAAAGATGAAGTACTATGTTTTAAAGAATATTATATTACAGAATTATAGAAATTAGATCTCTTACCTAAACTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGATCTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTATTTTTCCACTGATTAAATTTTTGGCCCTGAGATGCTGCTGAGTTACTAGAAAGTCATTGAAGGTCTCAACTATAGTATTTTCATAGTTCCCAGTATTCACAAAAATCAGTGTTCTTATTTTTTATGTAAATAGATTTTTTAACTTTTTTCTTTACCCTTAAAACGAATATTTTGAAACCAGTTTCAGTGTATTTCAAACAAAAATATATGTCTTATAAACAGTGTTTCATATTTTATTCTTAAATAAATATGAACCCTTAAAACGAATATTTTGAAACCAGTTTCAGTGTATTTCAAACAAAAATATATGTCTTATAAACAGTGTTTCATATTTTATTCTAAATTGTTTAAAGTATTTTGTGTTCAAAATGTTCTGTGTACCCTGTTGAAAAAAAAAACAGGTATGCAATTTAAGGCAGGTGTGATCCACAGCCATTATTATGGTTTTGCTAAGAGAACTACTCCTTTTAACAGAGAAGCTGT
其中上游引物序列为：GCTCTAGAGCATCTCACCTCATCCTAAC，下游引物序列为：GGAATTCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAG，其中TCTAGA和GAATTC分别为XbaI和EcoRI酶切位点。
(2)以人血基因组DNA为模板和上述合成成对扩增引物，用含Taq酶常规PCR扩增试剂，按照使用说明进行PCR扩增；
试剂用量：DNA 0.1μg/管；每条引物10pm/管，反应体积30μl/管；
反应条件：94℃3min预变性,94℃30sec,60℃30sec,72℃30sec 32个扩增循环，最后72℃延伸10min，反应完毕后各取PCR产物5μl进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
(3)PCR产物电泳鉴定显示单一条带且分子量正确，采用Qiagen公司的QIAquickPCR纯化试剂盒，对剩余的PCR产物进行纯化，操作按说明书进行。
对纯化后的PCR产物，采用相应的限制性内切酶放置于37℃1小时进行酶切，然后再用Qiagen公司的QIAquick PCR纯化试剂盒，对酶切后的产物进行纯化，操作按说明书进行，纯化后的PCR产物，用紫外分光光度计260nm定量测定，用纯水调整至相应浓度。
(4)以PCDH慢病毒载体为例，用相同的XbaI和EcoRI内切酶对PCDH慢病毒载体进行酶切，得到纯化后的质粒在紫外分光光度计260nm定量测定，用纯水调整至50-100ng/μl；对纯化后的PCR产物和质粒按说明书的比例进行连接，其步骤如下：
取Promega公司快速2XT4DNA连接酶反应缓冲液3μl、PCR产物2μl、病毒载体1μl、T4DNA连接酶1μl，离心混匀，放置室温30分钟，再取连接后产物2μl，加入20μl的DH5α感受态细胞(美国NEB公司)中，冰浴0.5h后，42℃热休克30sec，然后加入200μl SOC培养液，37℃震荡培养1h，再将此培养物均匀涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂培养板上，放置37℃孵箱过夜培养。
(5)用特异引物筛选出阳性克隆，接种至有5ml含100μg/ml氨苄青霉素LB培养液的试管中过夜培养。
(6)提取完毕的质粒，用紫外分光光度计260nm定量测定。
(7)对制备好的质粒作DNA测序，确定序列完全符合野生型的质粒作为下一步实验的模板。
根据基因发生的突变情况，设计PCR定点快速突变的引物，参照美国Stratagene公司定点快速突变试剂盒的引物设计完成，引物的退火温度比常规PCR引物的退火温度高10℃以上。设计的定点快速突变引物如下，上游引物：GGTCTAGCTACAGAGAAATCTCGATGGAGTG；下游引物：CACTCCATCGAGATTTCTCTGTAGCTAGACC，对设计好的引物序列进行合成。
PCR反应体系如下：
补加ddH2O至50μL
PCR反应条件：95℃预变性，3min；95℃热变性30s，55℃褪火60s，72℃延伸3min，15个热循环；72℃复性10min；4℃保存。
(8)制备0.8％的琼脂糖凝胶。
(9)取PCR产物15μL进行电泳分析，在质粒大片段的位置，可以见到PCR扩增条带。
(10)在剩余的PCR反应产物中加入1μL的Dpnl酶(美国NEB公司)，混匀后放置37℃孵育1h以上。取孵育后的PCR产物2μl，加入20μl的DH5α感受态细胞中，冰浴半小时后，42℃热休克30sec，然后加入200μl SOC培养液，37℃震荡培养1h，再将此培养物均匀涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂培养板上，放置37℃孵箱过夜培养。
(11)对培养板上长出来的克隆，随机挑选若干个，分别接种至5ml含100μg/ml氨苄青霉素LB培养液的试管中过夜培养。对过夜培养的菌液，采用Qiagen公司的QIAprep SpinMiniprep质粒小抽试剂盒，进行质粒抽提，操作按说明书进行。
(12)提取完毕的质粒，用紫外分光光度计260nm定量测定。
(13)对制备好的质粒作DNA测序，确定序列完全符合突变型的质粒可作为下一步制备病毒的质粒。
(14)将病毒包装细胞293T培养在DMEM(美国Life公司)10％FBS的培养基，放置于37℃5％CO2的孵箱中培养，于转染前一天按3X106细胞/板准备一个六孔培养板。
(15)将包装质粒和带有突变的病毒质粒一起转染至准备好的293T细胞，具体如下：
取1.5ml灭菌EP管，加入1.0μg包装混合质粒和1.0μg突变病毒质粒以及250μl的无血清Opti MEM(美国Life公司)。轻柔混匀，室温孵育5min，同时取1.5ml灭菌EP管，取6μl脂质体Lipofectamine 2000(美国Life公司产品)溶于250μl无血清Opti-MEM I培养基中，轻柔混匀，室温孵育5min；将质粒溶液和脂质体溶液轻柔混匀，室温孵育20min；在六孔板中，加入质粒脂质体复合物；然后放置于37℃5％CO2的孵箱中培养，24h后用新鲜的DMEM含10％FBS培养基换液；继续培养48-72h后收获含病毒的上清，3000rpm离心20min，去除沉淀，病毒上清-80℃贮存或立即感染细胞。
(16)在预先准备好的细胞系中，在新鲜的培养基中加入适量制备好的病毒上清，并加入终浓度为6μg/ml的polybrene(Sigma产品)，放置于37℃5％CO2的孵箱中培养24h后，加入终浓度为2μg/ml的puromycin(Sigma产品)处理杀灭没有感染的细胞。
(17)验证含有突变位点和嵌入基因拷贝数获得基因突变阳性参考品，具体步骤如下：
采用极限稀释法稀释，筛选出单个细胞在37℃5％CO2的孵箱中进行培养，之后并继续扩大培养，待这些细胞长满后，一部分放置于液氮保存，一部分进行DNA的抽提，并进行突变位点的验证，和嵌入基因拷贝数的验证，前者验证方法可采用测序和ARMS-PCR等方法，后者与单拷贝基因采用定量PCR技术进行比较验证，验证正确的细胞系和适宜的嵌合拷贝数就是正确的基因突变阳性参考品。
实施例2
以pMXs拟转录病毒作为载体制备BRAF基因突变阳性参考品：
以pMXs逆转录病毒作为载体进行相同的构建，BRAF的上下游引物酶切位点要发生变化，上游引物序列为：GGAATTCGCATCTCACCTCATCCTAAC；，
下游引物序列为：CCCAAGCTTTAGTAACTCAGCAGCATCTCAG，
其中GAATTC和AAGCTT分别为EcoRI和HindIII酶切位点，分别对载体和引物用这两个相同的酶进行酶切，然后进行纯化、连接、热休克转化、重组质粒的抽提鉴定、定点快速突变及后面的病毒包装制备和稳定细胞系的建立，都和上述实施例1步骤相同。
实施例3
以PCDH慢病毒作为载体制备Kras和BRAF的两基因联合突变的基因突变阳性参考品：
(1)从NCBI网址的Genbank中调出要检测的Kras基因相应突变位点的基因组DNA序列，序列如下：
CCGCAGAACAGCAGTCTGGCTATTTAGATAGAACAACTTGATTTTAAGATAAAAGAACTGTCTATGTAGCATTTATGCATTTTTCTTAAGCGTCGATGGAGGAGTTTGTAAATGAAGTACAGTTCATTACGATACACGTCTGCAGTCAACTGGAATTTTCATGATTGAATTTTGTAAGGTATTTTGAAATAATTTTTCATATAAAGGTGAGTTTGTATTAAAAGGTACTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGGTGCAGGACCATTCTTTGATACAGATAAAGGTTTCTCTGACCATTTTCATGAGTACTTATTACAAGATAATTATGCTGAAAGTTAAGTTATCTGAAATGTACCTTGGGTTTCAAGTTATATGTAACCATTAATATGGGAACTTTACTTTCCTTGGG AGTATGTCAGGGTCCATGATGTTCACTCTCTGTGCATTTTGATTGGAAGTGTATTTCAGAGTTTCGTGAGAGGGTAGAAATTTGTATCCTATCTGGACCTAAAAGACAATCTTTTTATTGTAACTTTTATTTTTATGGGTTTCTTGGTATTGTG，
其中上游引物为：GCTCTAGAGCGTCGATGGAGGAGTTTG，下游引物为：GAGTATGTCAGGGTCCATG，GGTGGC为发生突变位点的位置，TCTAGA为XbaI酶切位点，对设计好的引物序列合成。
(2)以人血基因组DNA为模板和上述合成成对扩增引物，用含Taq酶常规PCR扩增试剂，按照使用说明进行PCR扩增，DNA用量：0.1μg/管；每条引物用量：10pm/管，反应体积为30μl/管，反应条件为：94℃3min预变性,94℃30sec,60℃30sec,72℃30sec 32个扩增循环，最后72℃延伸10min，反应完毕后各取PCR产物5μl进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。电泳显示单一条带，分子量与预期分子量相符，则将PCR产物放置于-20℃备用。
(3)将PCR扩增片段的Kras和BRAF两个基因序列合并在一起，其序列如下：
GCGTCGATGGAGGAGTTTGTAAATGAAGTACAGTTCATTACGATACACGTCTGCAGTCAACTGGAATTTTCATGATTGAATTTTGTAAGGTATTTTGAAATAATTTTTCATATAAAGGTGAGTTTGTATTAAAAGGTACTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGGTGCAGGACCATTCTTTGATACAGATAAAGGTTTCTCTGACCATTTTCATGAGTACTTATTACAAGATAATTATGCTGAAAGTTAAGTTATCTGAAATGTACCTTGGGTTTCAAGTTATATGTAACCATTAATATGGGAACTTTACTTTCCTTGGGAGTATGTCAGGG TCCATG ACATTTCAAGCCCCAAAAATCTTAAAAGCAGGTTATATAGGCTAAATAGAACTAATCATTGTTTTAGACATACTTATTGACTCTAAGAGGAAAGATGAAGTACTATGTTTTAAAGAATATTATATTACAGAATTATAGAAATTAGATCTCTTACCTAAACTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGATCTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTATTTTTCCACTGATTAAATTTTTGGCCCTGAGATGCTGCTGAGTTACTAG
其中overlapping上游引物：GGGTCCATGGCATCTCACCTCATCCTAAC；overlapping下游引物：GAGGTGAGATGCCATGGACCCTGACATACTC。
将Kras的上游引物与overlapping下游引物配对，overlapping上游引物与BRAF下游引物配对，其扩增的模板分别是前述的PCR产物，扩增产物通过overlapping后，再用Kras的上游引物与BRAF下游引物配对对overlapping后的产物进行PCR扩增，克隆所需的两个酶切点分别是XbaI和EcoRI，然后克隆至PCDH载体中，各自的各种突变位点通过快速定点突变方法完成，方法同前所述。
(4)制备病毒及随后的稳定细胞系筛选鉴定均同上述实施例1。
实施例4
检测突变稳定细胞系
以BRAF突变稳定细胞系105个细胞/管，分别用正常293T细胞按5倍梯度稀释成含突变细胞2X104、4X103、8X102和1.6X102个细胞/管，其细胞数总量依然保持在105个细胞/管；
采用DNA提取试剂盒对这五管细胞进行DNA抽提；
用紫外分光光度计测定其浓度，浓度调整至50ng/μl；
用通过本发明制备的BRAF V600E突变检测ARMS-PCR荧光探针法试剂盒，在ABI7500型荧光定量PCR仪上进行验证；
其中，荧光检测采用Taqman探针，突变探针用FAM标记，内参照基因GAPDH采用VIC标记探针；
试剂用量：各种引物用量分别为10pm/tube，各种探针用量分别为5pm/tube，Taq酶1.5U/tube，反应体积为25μl；
反应条件：95℃2min预变性,95℃5sec,65℃32sec,15个循环，不收集荧光，然后95℃5sec,62℃32sec,40个循环，收集荧光。
反应结束后，突变位点的扩增情况见图1，与之对应的野生型位点扩增情况见图2，内参照基因GAPDH扩增情况见图3，图中曲线1、2、3、4、5分表表示105个突变细胞，2X104个突变细胞、4X103个突变细胞、8X102个突变细胞和1.6X102个突变细胞的扩增曲线。从图中可以看出，突变基因组在低浓度时依然很稳定，内参照和外参照的扩增情况也同时检出且扩增曲线较好，完全满足试剂盒的要求。
实施例5
对比带有突变位点的稳定细胞株与天然含基因突变位点的细胞株
具体步骤如下：
采用肺癌来源的细胞株A549，含Kras基因Gly12Ser突变位点，把105个A549细胞铺在10cm培养皿中，加入含10％FBS的DMEM培养基，放置于37℃5％CO2的孵箱中培养6-7天细胞长满，胰酶消化收集细胞，然后用核酸提取试剂盒进行核酸提取，操作按说明书，然后紫外分光仪测定DNA浓度，一个10cm培养皿细胞可以提取大概75-100μg DNA，用纯水调节浓度为50ng/μl置于-20℃备用。
对含Kras基因Gly12Ser突变位点的人工构建稳定的105个293T细胞铺在10cm培养皿中，加入含10％FBS的DMEM培养基，放置于37℃5％CO2的孵箱中培养，培养5-6天后细胞长满，直接收获细胞，用核酸提取试剂盒进行核酸提取，操作按说明书，然后紫外分光仪测定DNA浓度，一个10cm培养皿细胞可以提取大概100-150μg DNA，用纯水调节浓度为50ng/μl置于-20℃备用。
采用本发明制备Kras基因Gly12Ser突变位点的ARMS-PCR荧光探针法试剂盒，A549和含Gly12Ser突变位点293T细胞的核酸进行检测，结果显示两个细胞株的核酸不管浓度高低，两者CT值完全一致，其中图4为A549细胞和含Gly12Ser突变位点293T细胞均加入50ng/μl核酸检测结果；图5为两者的核酸浓度同时稀释100倍后的检测结果，图4和图5中1表示A549细胞的核酸检测结果，2表示含Gly12Ser突变位点293T细胞的核酸检测结果。
实施例6
以PCDH慢病毒作为载体制备融合基因阳性参考品，以导致慢性粒细胞性白血病(CML)的融合基因BCR-ABL为例：
从CML病人的外周血中抽取5毫升血液，用淋巴细胞分离液分离有核细胞，在分离出来的有核细胞中加入1毫升的Trizol试剂提取总RNA，操作按说明书进行，然后紫外分光仪测定RNA浓度，采用美国NEB公司逆转录试剂盒，取1μgRNA用随机引物做逆转录反应，得到cDNA库，操作按说明书进行。
从基因库中调出BCR-ABL融合基因AF113911.1序列如下：
Gtaccagccctaccagagcatctacgtcgggggcatgatggaaggggagggcaagggcccgctcctgcgcagccagagcacctctgagcaggagaagcgccttacctggccccgcaggtcctactccccccggagttttgaggattgcggaggcggctataccccggactgcagctccaatgagaacctcacctccagcgaggaggacttctcctctggccagtccagccgcgtgtccccaagccccaccacctaccgcatgttccgggacaaaagccgctctccctcgcagaactcgcaacagtccttcgacagcagcagtccccccacgccgcagtgccataagcggcaccggcactgcccggttgtcgtgtccgaggccaccatcgtgggcgtccgcaagaccgggcagatctggcccaacgatggcgagggcgccttccatggagacgcaga ggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcgggatcaatggcagcttcttggtgcgtgagagtgag agcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgtaccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccccaactacgacaagt
其中gagacgcaga和的交接处就是两个基因的融合处，上游引物：CGGAATTCgagcaggagaagcgccttac，下游引物：CGGGATCCtgctctcactctcacgcacca，在上游引物的5’端已加上EcoRI的酶切位点，在下游引物的5’端已加上BamHI酶切位点，用这对引物对上述获得的cDNA库进行扩增，这段cDNA序列也可以直接通过基因合成公司合成得到。
反应体系：10XPCR buffer 5μl,cDNA 1μl；每条引物用量：15pm/管，反应体积为50μl，Pfu DNA聚合酶用量为1.5U；
反应条件：94℃3min预变性,94℃30sec,60℃30sec,72℃30sec 35个扩增循环，最后72℃延伸10min；
反应完毕后各取PCR产物5μl进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，后面纯化PCR产物和融合基因稳定细胞系的构建方法和上述实施例1相同。
1. SEQUENCE LISTING
2.
3. <110> 辽宁琦润生物科技有限公司
4.
5. <120> 一种制备基因突变和融合基因阳性参考品的方法
6.
7. <130> 1
8.
9. <160> 1
10.
11. <170> PatentIn version 3.3
12.
13. <210> 1
14. <211> 1120
15. <212> DNA
16. <213> 人类
17.
18. <400> 1
19. atctattagt ccctttcaga cctctgacct tgctcagtgg tagttgagat ataactgaag 60
20.
21. actctaaatt atataacaat gaggtgagaa aaacataata tttctcttcc ctaagtgcag 120
22.
23. actaagatac tatctgcagc atcttcattc caatgaagag cctttactgc tcgcccagga 180
24.
25. gtgccaagag aatatctggg cctacattgc taaaatctaa tgggaaagtt ttaggttctc 240
26.
27. ctataaactt aggaaagcat ctcacctcat cctaacacat ttcaagcccc aaaaatctta 300
28.
29. aaagcaggtt atataggcta aatagaacta atcattgttt tagacatact tattgactct 360
30.
31. aagaggaaag atgaagtact atgttttaaa gaatattata ttacagaatt atagaaatta 420
32.
33. gatctcttac ctaaactctt cataatgctt gctctgatag gaaaatgaga tctactgttt 480
34.
35. tcctttactt actacacctc agatatattt cttcatgaag acctcacagt aaaaataggt 540
36.
37. gattttggtc tagctacagt gaaatctcga tggagtgggt cccatcagtt tgaacagttg 600
38.
39. tctggatcca ttttgtggat ggtaagaatt gaggctattt ttccactgat taaatttttg 660
40.
41. gccctgagat gctgctgagt tactagaaag tcattgaagg tctcaactat agtattttca 720
42.
43. tagttcccag tattcacaaa aatcagtgtt cttatttttt atgtaaatag attttttaac 780
44.
45. ttttttcttt acccttaaaa cgaatatttt gaaaccagtt tcagtgtatt tcaaacaaaa 840
46.
47. atatatgtct tataaacagt gtttcatatt ttattcttaa ataaatatga acccttaaaa 900
48.
49. cgaatatttt gaaaccagtt tcagtgtatt tcaaacaaaa atatatgtct tataaacagt 960
50.
51. gtttcatatt ttattctaaa ttgtttaaag tattttgtgt tcaaaatgtt ctgtgtaccc 1020
52.
53. tgttgaaaaa aaaaacaggt atgcaattta aggcaggtgt gatccacagc cattattatg 1080
54.
55. gttttgctaa gagaactact ccttttaaca gagaagctgt 1120
56. SEQUENCE LISTING
57.
58. <110> 辽宁琦润生物科技有限公司
59.
60. <120> 一种制备基因突变和融合基因阳性参考品的方法
61.
62. <130> 2
63.
64. <160> 1
65.
66. <170> PatentIn version 3.3
67.
68. <210> 1
69. <211> 28
70. <212> DNA
71. <213> 人类
72.
73. <400> 1
74. gctctagagc atctcacctc atcctaac 28
75. <110> 辽宁琦润生物科技有限公司
76.
77. <120> 一种制备基因突变和融合基因阳性参考品的方法
78.
79. <130> 3
80.
81. <160> 1
82.
83. <170> PatentIn version 3.3
84.
85. <210> 1
86. <211> 29
87. <212> DNA
88. <213> 人类
89.
90. <400> 1
91. ggaattctag taactcagca gcatctcag 29
92. <110> 辽宁琦润生物科技有限公司
93.
94. <120> 一种制备基因突变和融合基因阳性参考品的方法
95.
96. <130> 4
97.
98. <160> 1
99.
100. <170> PatentIn version 3.3
101.
102. <210> 1
103. <211> 31
104. <212> DNA
105. <213> 人类
106.
107. <400> 1
108. ggtctagcta cagagaaatc tcgatggagt g 31
109. <110> 辽宁琦润生物科技有限公司
110.
111. <120> 一种制备基因突变和融合基因阳性参考品的方法
112.
113. <130> 5
114.
115. <160> 1
116.
117. <170> PatentIn version 3.3
118.
119. <210> 1
120. <211> 31
121. <212> DNA
122. <213> 人类
123.
124. <400> 1
125. cactccatcg agatttctct gtagctagac c 31
126. <110> 辽宁琦润生物科技有限公司
127.
128. <120> 一种制备基因突变和融合基因阳性参考品的方法
129.
130. <130> 5
131.
132. <160> 1
133.
134. <170> PatentIn version 3.3
135.
136. <210> 1
137. <211> 27
138. <212> DNA
139. <213> 人类
140.
141. <400> 1
142. ggaattcgca tctcacctca tcctaac 27
143. <110> 辽宁琦润生物科技有限公司
144.
145. <120> 一种制备基因突变和融合基因阳性参考品的方法
146.
147. <130> 5
148.
149. <160> 1
150.
151. <170> PatentIn version 3.3
152.
153. <210> 1
154. <211> 31
155. <212> DNA
156. <213> 人类
157.
158. <400> 1
159. cccaagcttt agtaactcag cagcatctca g 31
160. <110> 辽宁琦润生物科技有限公司
161.
162. <120> 一种制备基因突变和融合基因阳性参考品的方法
163.
164. <130> 5
165.
166. <160> 1
167.
168. <170> PatentIn version 3.3
169.
170. <210> 1
171. <211> 770
172. <212> DNA
173. <213> 人类
174.
175. <400> 1
176. ccgcagaaca gcagtctggc tatttagata gaacaacttg attttaagat aaaagaactg 60
177.
178. tctatgtagc atttatgcat ttttcttaag cgtcgatgga ggagtttgta aatgaagtac 120
179.
180. agttcattac gatacacgtc tgcagtcaac tggaattttc atgattgaat tttgtaaggt 180
181.
182. attttgaaat aatttttcat ataaaggtga gtttgtatta aaaggtactg gtggagtatt 240
183.
184. tgatagtgta ttaaccttat gtgtgacatg ttctaatata gtcacatttt cattattttt 300
185.
186. attataaggc ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag ctggtggcgt 360
187.
188. aggcaagagt gccttgacga tacagctaat tcagaatcat tttgtggacg aatatgatcc 420
189.
190. aacaatagag gtaaatcttg ttttaatatg catattactg gtgcaggacc attctttgat 480
191.
192. acagataaag gtttctctga ccattttcat gagtacttat tacaagataa ttatgctgaa 540
193.
194. agttaagtta tctgaaatgt accttgggtt tcaagttata tgtaaccatt aatatgggaa 600
195.
196. ctttactttc cttgggagta tgtcagggtc catgatgttc actctctgtg cattttgatt 660
197.
198. ggaagtgtat ttcagagttt cgtgagaggg tagaaatttg tatcctatct ggacctaaaa 720
199.
200. gacaatcttt ttattgtaac ttttattttt atgggtttct tggtattgtg 770
201. <110> 辽宁琦润生物科技有限公司
202.
203. <120> 一种制备基因突变和融合基因阳性参考品的方法
204.
205. <130> 5
206.
207. <160> 1
208.
209. <170> PatentIn version 3.3
210.
211. <210> 1
212. <211> 975
213. <212> DNA
214. <213> 人类
215.
216. <400> 1
217. gcgtcgatgg aggagtttgt aaatgaagta cagttcatta cgatacacgt ctgcagtcaa 60
218.
219. ctggaatttt catgattgaa ttttgtaagg tattttgaaa taatttttca tataaaggtg 120
220.
221. agtttgtatt aaaaggtact ggtggagtat ttgatagtgt attaacctta tgtgtgacat 180
222.
223. gttctaatat agtcacattt tcattatttt tattataagg cctgctgaaa atgactgaat 240
224.
225. ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgacg atacagctaa 300
226.
227. ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggtaaatctt gttttaatat 360
228.
229. gcatattact ggtgcaggac cattctttga tacagataaa ggtttctctg accattttca 420
230.
231. tgagtactta ttacaagata attatgctga aagttaagtt atctgaaatg taccttgggt 480
232.
233. ttcaagttat atgtaaccat taatatggga actttacttt ccttgggagt atgtcagggt 540
234.
235. ccatggcatc tcacctcatc ctaacacatt tcaagcccca aaaatcttaa aagcaggtta 600
236.
237. tataggctaa atagaactaa tcattgtttt agacatactt attgactcta agaggaaaga 660
238.
239. tgaagtacta tgttttaaag aatattatat tacagaatta tagaaattag atctcttacc 720
240.
241. taaactcttc ataatgcttg ctctgatagg aaaatgagat ctactgtttt cctttactta 780
242.
243. ctacacctca gatatatttc ttcatgaaga cctcacagta aaaataggtg attttggtct 840
244.
245. agctacagtg aaatctcgat ggagtgggtc ccatcagttt gaacagttgt ctggatccat 900
246.
247. tttgtggatg gtaagaattg aggctatttt tccactgatt aaatttttgg ccctgagatg 960
248.
249. ctgctgagtt actag 975
250. <110> 辽宁琦润生物科技有限公司
251.
252. <120> 一种制备基因突变和融合基因阳性参考品的方法
253.
254. <130> 5
255.
256. <160> 1
257.
258. <170> PatentIn version 3.3
259.
260. <210> 1
261. <211> 29
262. <212> DNA
263. <213> 人类
264.
265. <400> 1
266. gggtccatgg catctcacct catcctaac 29
267. <110> 辽宁琦润生物科技有限公司
268.
269. <120> 一种制备基因突变和融合基因阳性参考品的方法
270.
271. <130> 5
272.
273. <160> 1
274.
275. <170> PatentIn version 3.3
276.
277. <210> 1
278. <211> 31
279. <212> DNA
280. <213> 人类
281.
282. <400> 1
283. gaggtgagat gccatggacc ctgacatact c 31
284. <110> 辽宁琦润生物科技有限公司
285.
286. <120> 一种制备基因突变和融合基因阳性参考品的方法
287.
288. <130> 5
289.
290. <160> 1
291.
292. <170> PatentIn version 3.3
293.
294. <210> 1
295. <211> 1079
296. <212> DNA
297. <213> 人类
298.
299. <400> 1
300. gtaccagccc taccagagca tctacgtcgg gggcatgatg gaaggggagg gcaagggccc 60
301.
302. gctcctgcgc agccagagca cctctgagca ggagaagcgc cttacctggc cccgcaggtc 120
303.
304. ctactccccc cggagttttg aggattgcgg aggcggctat accccggact gcagctccaa 180
305.
306. tgagaacctc acctccagcg aggaggactt ctcctctggc cagtccagcc gcgtgtcccc 240
307.
308. aagccccacc acctaccgca tgttccggga caaaagccgc tctccctcgc agaactcgca 300
309.
310. acagtccttc gacagcagca gtccccccac gccgcagtgc cataagcggc accggcactg 360
311.
312. cccggttgtc gtgtccgagg ccaccatcgt gggcgtccgc aagaccgggc agatctggcc 420
313.
314. caacgatggc gagggcgcct tccatggaga cgcagaagcc cttcagcggc cagtagcatc 480
315.
316. tgactttgag cctcagggtc tgagtgaagc cgctcgttgg aactccaagg aaaaccttct 540
317.
318. cgctggaccc agtgaaaatg accccaacct tttcgttgca ctgtatgatt ttgtggccag 600
319.
320. tggagataac actctaagca taactaaagg tgaaaagctc cgggtcttag gctataatca 660
321.
322. caatggggaa tggtgtgaag cccaaaccaa aaatggccaa ggctgggtcc caagcaacta 720
323.
324. catcacgcca gtcaacagtc tggagaaaca ctcctggtac catgggcctg tgtcccgcaa 780
325.
326. tgccgctgag tatctgctga gcagcgggat caatggcagc ttcttggtgc gtgagagtga 840
327.
328. gagcagtcct ggccagaggt ccatctcgct gagatacgaa gggagggtgt accattacag 900
329.
330. gatcaacact gcttctgatg gcaagctcta cgtctcctcc gagagccgct tcaacaccct 960
331.
332. ggccgagttg gttcatcatc attcaacggt ggccgacggg ctcatcacca cgctccatta 1020
333.
334. tccagcccca aagcgcaaca agcccactgt ctatggtgtg tcccccaact acgacaagt 1079
335. <110> 辽宁琦润生物科技有限公司
336.
337. <120> 一种制备基因突变和融合基因阳性参考品的方法
338.
339. <130> 1
340.
341. <160> 1
342.
343. <170> PatentIn version 3.3
344.
345. <210> 1
346. <211> 28
347. <212> DNA
348. <213> 人类
349.
350. <400> 1
351. cggaattcga gcaggagaag cgccttac 28
352. <110> 辽宁琦润生物科技有限公司
353.
354. <120> 一种制备基因突变和融合基因阳性参考品的方法
355.
356. <130> 1
357.
358. <160> 1
359.
360. <170> PatentIn version 3.3
361.
362. <210> 1
363. <211> 29
364. <212> DNA
365. <213> 人类
366.
367. <400> 1
368. cgggatcctg ctctcactct cacgcacca 29

Claims (9)

1.一种基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)构建相应符合基因突变或融合基因序列的病毒质粒
a.调出要检测基因相应突变位点上下游的基因组DNA序列或融合基因的mRNA序列；
b.在基因突变位点或融合基因的上下游选择扩增引物，并在引物的两端分别添加与病毒载体上对应的酶切点序列；
c.对基因突变位点或融合基因进行PCR扩增，对PCR产物和相应的病毒载体进行酶切纯化；
d.酶切纯化后的PCR产物和病毒质粒进行连接反应，经过热休克细菌转化，阳性克隆筛选，质粒抽提和基因测序，获得序列完全符合基因突变和融合基因序列的重组质粒；
(2)构建带有基因突变或融合基因的稳定细胞系
a.病毒包装质粒和上述(1)制备的重组病毒质粒一起转染病毒包装细胞制备病毒上清；
b.药物筛选出嵌入重组病毒基因序列的细胞系；
c.验证突变位点或融合基因，获得基因突变或融合基因阳性参考品。
2.根据权利要求1所述基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法，其特征在于：(1)具体步骤如下：
取快速2XT4DNA连接酶反应缓冲液3μl、酶切后PCR产物2μl、酶切后病毒载体1μl、T4DNA连接酶1μl，离心混匀，放置室温30分钟，再取连接后产物2μl，加入20μl的DH5α感受态细胞中，冰浴半小时后，42℃热休克30sec，然后加入200μl SOC培养液，37℃震荡培养1小时，再将此培养物均匀涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂培养板上，放置37℃孵箱过夜培养。
3.根据权利要求1所述基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法，其特征在于：(1)具体步骤如下：
将病毒包装质粒和带有突变位点或融合基因的慢病毒或逆转录病毒质粒一起转染至准备好的293T细胞，具体如下：
将1.0μg病毒包装混合质粒、1.0μg重组突变病毒质粒、250μl无血清Opti MEM加入1.5ml灭菌EP管中轻柔混匀并室温孵予5min；
将6μl脂质体Lipofectamine 2000溶于250μl无血清Opti-MEM I培养基中，轻柔混匀并室温孵育5min；
将质粒溶液和脂质体溶液轻柔混匀并室温孵育20min；
在六孔板中，加入质粒脂质体复合物；放置于37℃5％CO2的孵箱中培养，24h后用新鲜的DMEM含10％FBS培养基换液，48-72h后收获含病毒的上清，3000rpm离心20min，去除沉淀，病毒上清-80℃贮存或立即感染细胞。
4.根据权利要求1所述基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法，其特征在于：(2)具体步骤如下：
在新鲜的培养基中加入适量制备好的病毒上清，并加入终浓度为6μg/ml的polybrene，放置于37℃5％CO2的孵箱中培养24h，加入终浓度为2μg/ml的puromycin处理杀灭未感染的细胞。
5.根据权利要求1所述基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法，其特征在于：所述的载体为能将外来基因整合到基因组中的病毒载体，包括慢病毒载体和逆转录病毒载体。
6.根据权利要求1所述基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法，其特征在于：所述的细胞系为293T细胞系。
7.根据权利要求1所述基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法，其特征在于：通过极限稀释法筛选出的单个细胞在37℃5％CO2的孵箱中进行培养，并对测序验证正确的细胞系进行扩大培养，获得阳性参考品。
8.根据权利要求1所述基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法，其特征在于：所述的细胞系是单一基因单一突变位点的细胞系、单一基因多个突变位点的细胞系和多个基因多个突变位点的细胞系，单一融合基因和多种融合基因的细胞系。
9.根据权利要求1所述基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法，其特征在于：通过本发明制备出碱基置换、移码、缺失、***突变、融合基因、染色体移位及其罕见突变的阳性参考品。
CN201710255423.1A 2017-04-19 2017-04-19 一种基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法 Pending CN108728492A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710255423.1A CN108728492A (zh) 2017-04-19 2017-04-19 一种基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710255423.1A CN108728492A (zh) 2017-04-19 2017-04-19 一种基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108728492A true CN108728492A (zh) 2018-11-02

Family

ID=63924689

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710255423.1A Pending CN108728492A (zh) 2017-04-19 2017-04-19 一种基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108728492A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110438230A (zh) * 2019-08-19 2019-11-12 南京科佰生物科技有限公司 Ntrk融合突变标准品及其制备方法和应用
CN113106149A (zh) * 2021-04-26 2021-07-13 福建和瑞基因科技有限公司 融合基因检测参考品的制备方法及融合基因检测参考品的应用
CN113774029A (zh) * 2021-09-18 2021-12-10 江西中洪博元生物技术有限公司 含人源app和psen1基因的细胞模型及其构建方法
CN116286982A (zh) * 2022-09-09 2023-06-23 广州凯普医药科技有限公司 一种hpv基因分型检测阳性参考品及其制备方法和应用
CN116355991A (zh) * 2023-05-31 2023-06-30 臻悦生物科技江苏有限公司 一种用于检测点突变、***和缺失突变的rna参考品及其制备方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101372683A (zh) * 2008-08-19 2009-02-25 上海之江生物科技有限公司 人丙肝病毒的人工假病毒及其制备和应用
CN101418286A (zh) * 2008-12-05 2009-04-29 上海之江生物科技有限公司 人免疫缺陷病毒ⅰ型的人工假病毒及其制备和应用
CN106434564A (zh) * 2016-11-01 2017-02-22 南宁输血医学研究所 导致cd36缺失的cd36突变基因真核稳定表达细胞株的建立方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101372683A (zh) * 2008-08-19 2009-02-25 上海之江生物科技有限公司 人丙肝病毒的人工假病毒及其制备和应用
CN101418286A (zh) * 2008-12-05 2009-04-29 上海之江生物科技有限公司 人免疫缺陷病毒ⅰ型的人工假病毒及其制备和应用
CN106434564A (zh) * 2016-11-01 2017-02-22 南宁输血医学研究所 导致cd36缺失的cd36突变基因真核稳定表达细胞株的建立方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
曹雪峰: "含5种烈性出血热病毒的假病毒阳性参考品的制备", 《军事医学》 *
李阳: "基于四引物ARMS-PCR技术的G6PD缺陷症6个热点突变的检测方法的建立与评价", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊） 医药卫生科技辑》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110438230A (zh) * 2019-08-19 2019-11-12 南京科佰生物科技有限公司 Ntrk融合突变标准品及其制备方法和应用
CN113106149A (zh) * 2021-04-26 2021-07-13 福建和瑞基因科技有限公司 融合基因检测参考品的制备方法及融合基因检测参考品的应用
CN113106149B (zh) * 2021-04-26 2023-01-17 福建和瑞基因科技有限公司 融合基因检测参考品的制备方法及融合基因检测参考品的应用
CN113774029A (zh) * 2021-09-18 2021-12-10 江西中洪博元生物技术有限公司 含人源app和psen1基因的细胞模型及其构建方法
CN116286982A (zh) * 2022-09-09 2023-06-23 广州凯普医药科技有限公司 一种hpv基因分型检测阳性参考品及其制备方法和应用
CN116286982B (zh) * 2022-09-09 2024-01-30 广州凯普医药科技有限公司 一种hpv基因分型检测阳性参考品及其制备方法和应用
CN116355991A (zh) * 2023-05-31 2023-06-30 臻悦生物科技江苏有限公司 一种用于检测点突变、***和缺失突变的rna参考品及其制备方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108728492A (zh) 一种基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法
CN112359022B (zh) 检测用新型冠状病毒核酸假病毒标准物质及其制备方法
Sastry et al. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods
CN105524924B (zh) 环状RNA circ‑ZKSCAN1的用途
WO2020224395A1 (zh) 检测复制型慢病毒的探针、引物对、荧光定量pcr试剂盒及方法
CN108517360A (zh) 一种循环肿瘤游离dna突变检测质控品及其制备方法
WO2022160562A1 (zh) 一种慢病毒滴度检测引物、试剂盒及检测方法
CN107955839A (zh) 用于检测猪圆环病毒2型和圆环病毒3型的双重pcr引物、检测方法及试剂盒
CN107365875A (zh) 定量检测重组慢病毒的滴度的方法
CN108165549A (zh) 人工环状rna的通用表达框架及其应用
CN109929949A (zh) 基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的EBV的检测方法及应用
CN111909931A (zh) 一种荧光探针、引物对、荧光定量pcr试剂盒及检测方法
Martelli et al. BK polyomavirus microRNA levels in exosomes are modulated by non-coding control region activity and down-regulate viral replication when delivered to non-infected cells prior to infection
CN109402132A (zh) 一种编码scn1a基因突变体的核酸及其应用
CN109908369B (zh) 一种新的环状RNA circCRKL在***癌治疗中的应用
CN107557461A (zh) 一种用于肝癌易感基因早筛的核酸质谱的检测方法
CN108949743A (zh) 一种全基因组杂交克隆方法
CN110317878A (zh) 一种用于膀胱癌诊治监测的长链非编码rna及其应用
CN114045292B (zh) 一种导致先天性白内障的maf基因突变体、多肽、试剂盒、构建体、重组细胞及应用
CN113234832B (zh) 人类egfr基因错义突变分子标志物及其在预测靶向抑制剂抗药性中的应用
CN115125271A (zh) 一种适用于多位点新型冠状病毒核酸检测的假病毒阳性标准品
CN113913554A (zh) 一种实时荧光定量pcr检测jc多瘤病毒的方法
CN112322711A (zh) 一种检测小鼠模型中人源car-t细胞拷贝数的引物组、试剂盒及方法
Bianco et al. Persistent SARS-CoV-2 infection in a patient with non-Hodgkin lymphoma: Intra-host genomic diversity analysis
CN109722465A (zh) 一种hiv耐药检测载体和构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181102