CN112322711A - 一种检测小鼠模型中人源car-t细胞拷贝数的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测小鼠模型中人源CAR‑T细胞拷贝数的引物组、试剂盒及方法，属于CAR‑T细胞拷贝数检测技术领域，所述引物组，包括检测CAR‑T细胞目的基因的引物对和内参基因的引物对；所述目的基因包括WPRE基因，所述内参基因包括ABL基因；所述试剂盒，包括所述的引物组和荧光定量PCR反应试剂。本发明所述方法能够精确有效的检测小鼠模型中人源CAR基因的拷贝数，有效范围在5～5×106copies之间，可以在小鼠模型中有效地评估人源CAR‑T细胞的持续力。
Description
技术领域
本发明属于CAR-T细胞拷贝数检测技术领域，尤其涉及一种检测小鼠模型中人源CAR-T细胞拷贝数的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞杀伤肿瘤细胞，治疗癌症病人，是目前生物技术领域里最为火热的研究方向之一，也是目前临床上，尤其是血液瘤领域，最有希望的疗法之一。从第一代的CAR-T细胞到目前的***CAR-T细胞，CAR-T细胞免疫治疗正在一步一步突破技术瓶颈，造福更多的癌症病人。
小鼠模型是研究与评估肿瘤免疫治疗的常用模型，CAR-T细胞免疫治疗技术的关键是CAR-T细胞的持续力。在小鼠模型中，建立一种有效的评估CAR-T细胞持续力的方法，是充分利用小鼠模型评估CAR-T免疫治疗疗效的关键。
实时荧光定量PCR技术，是在分子水平上评估物质的量的方法。定量PCR技术检测也是CAR-T细胞免疫治疗质量放行，临床检测等的必要步骤。
目前尚没有有效、准确的在小鼠模型中评估CAR-T细胞持续力的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测小鼠模型中人源CAR-T细胞拷贝数的引物组、试剂盒及方法；所述引物组能够特异性识别人源CAR-T细胞中的目的基因，既不非特异性结合小鼠基因组，也不非特异性结合人基因组，能够实现小鼠模型中人源CAR-T细胞拷贝数的准确检测，从而实现对小鼠模型中CAR-T细胞增殖的监测，评估CAR-T细胞的持续力。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种检测小鼠模型中人源CAR-T细胞拷贝数的引物组，包括检测CAR-T细胞目的基因的引物对和内参基因的引物对；所述目的基因包括WPRE基因，所述内参基因包括ABL基因；
检测WPRE基因的引物对选自SEQ ID No.1～SEQ ID No.2、SEQ ID No.3～SEQ IDNo.4和SEQ ID No.5～SEQ ID No.6中的一对；
检测ABL基因的引物对为SEQ ID No.7～SEQ ID No.8或SEQ ID No.9～SEQ IDNo.10。
本发明提供了一种检测小鼠模型中人源CAR-T细胞拷贝数的试剂盒，包括所述的引物组和荧光定量PCR反应试剂。
优选的，所述引物组包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示的检测WPRE基因的引物对和SEQ ID No.7～SEQ ID No.8所示的检测ABL基因的引物对。
优选的，所述引物组中每一种引物的使用浓度为0.1～10μM。
优选的，所述荧光定量PCR反应试剂包括荧光定量PCR Mix、Dye II和水。
本发明提供了一种检测小鼠模型中人源CAR-T细胞拷贝数的方法，包括以下步骤：
1)将CAR-T细胞目的基因和内参基因共同构建到质粒载体上获得标准质粒；
2)提取小鼠外周血的全基因组DNA，并将所述全基因组DNA的浓度调节至25ng/μl获得背景基因组，以所述背景基因组稀释步骤1)中所述的标准质粒获得不同浓度的标准质粒；
3)提取回输CAR-T细胞小鼠的外周血待测样本的全基因组DNA，并将所述全基因组DNA的浓度调节至1～500ng/μl获得待检测DNA；
4)将步骤3)中所述的待检测DNA、目的基因的引物组、内参基因的引物组和荧光定量PCR反应试剂混合获得待测样品荧光定量PCR反应体系；
分别将步骤2)中不同浓度的标准质粒与目的基因的引物组、内参基因的引物组和荧光定量PCR反应试剂混合获得不同浓度的标准质粒荧光定量PCR反应体系；
将所述待测样品荧光定量PCR反应体系、不同浓度的标准质粒荧光定量PCR反应体系上机进行荧光定量PCR检测获得不同浓度的标准质粒的内参基因Ct值、目的基因Ct值、待测样品的内参基因Ct值和待测样品目的基因的Ct值；
用不同浓度的标准质粒目的基因Ct值与对应拷贝数的LOG值进行线性拟合，获得标准质粒目的基因的标准曲线；
用不同浓度的标准质粒内参基因Ct值与对应拷贝数的LOG值进行线性拟合，获得标准质粒内参基因的标准曲线；
将待测样品的目的基因Ct值和待测样品内参基因的Ct值分别带入对应的标准曲线，获得相应的待测样品中目的基因的拷贝数和人源CAR-T细胞的拷贝数；
所述步骤3)和步骤1)无时间顺序限定。
优选的，步骤3)中以所述背景基因组稀释标准质粒，使标准质粒的拷贝数范围在5copies～5×106copies之间。
优选的，所述标准质粒拷贝数的计算公式如下：拷贝数＝6.02×1023×核酸浓度÷(DNA length×660)；所述拷贝数的单位为copies/ml，所述核酸浓度的单位为g/ml，所述DNA length为8399。
优选的，所述待测样品荧光定量PCR反应体系如下：
优选的，所述待测样品荧光定量PCR反应程序如下：95℃30S，95℃5S，60℃34S。
本发明的有益效果：本发明提供了一种检测小鼠模型中人源CAR-T细胞拷贝数的引物组、试剂盒及方法；所述引物组能够特异性识别人源CAR-T细胞中的目的基因，既不非特异性结合小鼠基因组，也不非特异性结合人基因组，能够实现小鼠模型中人源CAR-T细胞拷贝数的准确检测，从而实现对小鼠模型中CAR-T细胞增殖的监测，评估CAR-T细胞的持续力。本发明所述方法能够精确有效的检测小鼠模型中人源CAR基因的拷贝数，其有效范围在5～5×106copies之间，可以在小鼠模型中有效地评估人源CAR-T细胞的持续力。
附图说明
图1A为PZXK质粒的结构图谱
图1B为S1质粒的结构图谱；
图2为标准质粒的结构图谱；
图3A为人基因组背景下ABL1-F/R引物溶解曲线示意图；
图3B为人基因组背景下ABL1-F/R引物扩增曲线示意图；
图3C为人基因组背景下ABL2-F/R引物溶解曲线示意图；
图3D为人基因组背景下ABL2-F/R引物扩增曲线示意图；
图3E为人基因组背景下WPRE1-F/R引物溶解曲线示意图；
图3F为人基因组背景下WPRE1-F/R引物扩增曲线示意图；
图3G为人基因组背景下WPRE2-F/R引物溶解曲线示意图；
图3H为人基因组背景下WPRE2-F/R引物扩增曲线示意图；
图3I为人基因组背景下WPRE3-F/R引物溶解曲线示意图；
图3J为人基因组背景下WPRE3-F/R引物扩增曲线示意图；
图4A为鼠基因组背景下ABL1-F/R引物溶解曲线示意图；
图4B为鼠基因组背景下ABL1-F/R引物扩增曲线示意图；
图4C为鼠基因组背景下ABL2-F/R引物溶解曲线示意图；
图4D为鼠基因组背景下ABL2-F/R引物扩增曲线示意图；
图4E为鼠基因组背景下WPRE1-F/R引物溶解曲线示意图；
图4F为鼠基因组背景下WPRE1-F/R引物扩增曲线示意图；
图5A为鼠基因组背景下ABL1-F/R引物标准曲线示意图；
图5B为鼠基因组背景下WPRE1-F/R引物标准曲线示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测小鼠模型中人源CAR-T细胞拷贝数的引物组，包括检测CAR-T细胞目的基因的引物对和内参基因的引物对；所述目的基因包括WPRE基因，所述内参基因包括ABL基因；
检测WPRE基因的引物对选自SEQ ID No.1～SEQ ID No.2、SEQ ID No.3～SEQ IDNo.4和SEQ ID No.5～SEQ ID No.6中的一对；
检测ABL基因的引物对为SEQ ID No.7～SEQ ID No.8或SEQ ID No.9～SEQ IDNo.10。
本发明中所涉及的具体序列如表1所示。
表1引物组的具体核苷酸序列
| 目的基因 | 目的基因引物序列 |
| WPRE-1-F | cgggtaactcgacaatcaacctc(SEQ ID No.1) |
| WPRE-1-R | ggcattaaagcagcgtatccac(SEQ ID No.2) |
| WPRE-2-F | ggatacgctgctttaatgcctt(SEQ ID No.3) |
| WPRE-2-R | caacgggccacaactcctc(SEQ ID No.4) |
| WPRE-3-F | attgcttcccgtatggctt(SEQ ID No.5) |
| WPRE-3-R | caacgggccacaactcctc(SEQ ID No.6) |
| 内参基因 | 内参基因引物序列 |
| ABL1-F | gagccagagatttcccaaagc(SEQ ID No.7) |
| ABL1-R | accaatgataccaaacgcatcc(SEQ ID No.8) |
| ABL2-F | ccccacacatgagacaaaccc(SEQ ID No.9) |
| ABL2-R | aagcctagacgatgattacagcc(SEQ ID No.10) |
本发明还提供了一种检测小鼠模型中人源CAR-T细胞拷贝数的试剂盒，包括所述的引物组和荧光定量PCR反应试剂。在本发明中，所述试剂盒中优选的使用的引物组包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示的检测WPRE基因的引物对和SEQ ID No.7～SEQ ID No.8所示的检测ABL基因的引物对。本发明对所述引物的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的人工合成方法委托生物技术公司合成即可。在本发明中，所述引物组中每一种引物的使用浓度优选为0.1～10μM，更优选为0.15～5μM，最优选为0.2μM。在本发明中，所述荧光定量PCR反应试剂包括荧光定量PCR Mix、Dye II和水。本发明对所述荧光定量PCR Mix和DyeII的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。在本发明中，所述水优选为荧光定量PCR专用水。
本发明提供了一种检测小鼠模型中人源CAR-T细胞拷贝数的方法，包括以下步骤：
1)将CAR-T细胞目的基因和内参基因共同构建到质粒载体上获得标准质粒；
2)提取小鼠外周血的全基因组DNA，并将所述全基因组DNA的浓度调节至25ng/μl获得背景基因组，以所述背景基因组稀释步骤1)中所述的标准质粒获得不同浓度的标准质粒；
3)提取回输CAR-T细胞小鼠的外周血待测样本的全基因组DNA，并将所述全基因组DNA的浓度调节至1～500ng/μl获得待检测DNA；
4)将步骤3)中所述的待检测DNA、目的基因的引物组、内参基因的引物组和荧光定量PCR反应试剂混合获得待测样品荧光定量PCR反应体系；分别将步骤2)中所述的不同浓度的标准质粒与目的基因的引物组、内参基因的引物组和荧光定量PCR反应试剂混合获得不同浓度的标准质粒荧光定量PCR反应体系；
将所述待测样品荧光定量PCR反应体系、不同浓度的标准质粒荧光定量PCR反应体系上机进行荧光定量PCR检测获得不同浓度的标准质粒目的基因扩增Ct值、内参基因扩增Ct值、待测样品的内参基因Ct值和待测样品目的基因的Ct值。
在本发明中，所述质粒载体优选的为PZXK质粒，质粒图谱如图1A所示。在本发明中，将CAR基因和内参基因共同构建到质粒载体上获得标准质粒；所述标准质粒的作用是制作标准曲线绝对定量样品中目的基因的拷贝数。在本发明中，优选的以所述背景基因组稀释标准质粒，使标准质粒的拷贝数范围在5copies～5×106copies之间；所述稀释优选为梯度稀释，所述梯度稀释优选为10倍梯度稀释。本发明根据所述标准质粒的浓度和分子量计算出相应浓度的标准质粒的拷贝数，所述标准质粒拷贝数的计算公式如下：拷贝数＝6.02×1023×核酸浓度÷(DNA length×660)；所述拷贝数的单位为copies/ml，所述核酸浓度单位为g/ml，所述DNA length为8399。
在本发明中，所述未回输CAR-T细胞的小鼠即为正常小鼠，本发明对所述小鼠的来源和规格没有特殊限定，采用本领域常规市售小鼠即可。本发明对所述小鼠外周血的全基因组DNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的外周血基因组提取方法即可，在本发明具体实施过程中，采用血液基因组DNA提取试剂盒(天根，DP348)试剂盒进行。本发明在提取获得所述全基因组DNA后，优选的对提取获得的全基因组DNA的浓度和纯度进行检测，本发明对具体的检测方法没有特殊限定，采用本领域常规的DNA浓度和纯度的检测方法即可。本发明在提取获得的全基因组DNA的纯度符合要求(260/280在1.7～1.9)后，将所述全基因组DNA的浓度调节至25ng/μl获得背景基因组，以所述背景基因组稀释步骤1)中所述的标准质粒获得不同浓度的标准质粒；在本发明中，所述不同浓度的标准质粒的浓度优选的如下：5×100、5×101、5×102、5×103、5×104、5×105、5×106，单位为copies/孔。
在本发明中，所述回输CAR-T细胞的小鼠优选的通过将CAR-T细胞注射到小鼠体内获得。
在本发明中，所述全基因组DNA的提取方法与上述未回输的小鼠的外周血全基因组DNA相同。在本发明中，所述回输CAR-T细胞的小鼠的全基因组DNA的浓度优选的用水调节至25ng/μl。
在本发明中，所述待测样品荧光定量PCR反应体系优选的如下：
所述待测样品荧光定量PCR反应程序优选的如下：95℃30S，95℃5S，60℃34S。
本发明在所述荧光定量PCR结束后，根据获得的不同浓度的标准质粒内参基因扩增Ct值、目的基因扩增Ct值、待测样品的内参基因Ct值和待测样品目的基因的Ct值计算待测样品中目的基因的拷贝数和人源CAR-T细胞的拷贝数。
本发明用不同浓度的标准质粒目的基因Ct值与对应拷贝数的LOG值进行线性拟合，获得标准质粒目的基因的标准曲线；
用不同浓度的标准质粒内参基因Ct值与对应拷贝数的LOG值进行线性拟合，获得标准质粒内参基因的标准曲线；
将待测样品的目的基因Ct值和待测样品内参基因的Ct值分别带入对应的标准曲线，获得相应的待测样品中目的基因的拷贝数和人源CAR-T细胞的拷贝数。
在治疗或实验过程中，回输的CAR-T细胞为T细胞转染病毒制备所得，纯度达不到100％。回输后CAR阳性细胞在体内扩增表现为目的基因拷贝数和T细胞拷贝数同时升高；CAR阴性细胞扩增表现为T细胞拷贝数上升，目的基因拷贝数不变或下降；根据待测样品中目的基因的拷贝数和内参基因的拷贝数来确定细胞的持续力；如果待测样品中的目的基因的拷贝数和内参基因的拷贝数同步上升，则持续力较好，若测定的内参基因的拷贝数上升，但是目的基因的拷贝数不变或下降，则扩增的为CAR阴性细胞；若目的基因和内参基因的拷贝数同步下降，则说明所回输CAR-T细胞在体内的扩增效果差。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
引物和标准品的设计：
本发明中引物的设计基于PZXK质粒骨架与人ABL基因，涉及获得的具体引物序列如表1所示。本实施例将含有CAR基因的PZXK质粒作为本发明的S1质粒(质粒结构图谱见图1B)，将内参基因片段引入S1质粒，作为本发明的标准质粒(质粒结构图谱见图2)。
引物的筛选：
1)抽提未转染的从人外周血PBMC分离得到的T淋巴细胞全基因组，用水调整浓度为25ng/μl；
2)用1)中的基因组10倍梯度S1质粒，使其拷贝数范围在1.25copies/μl到1.25×106copies/μl之间；
3)配置SYBG反应液，上机检测；
4)分析数据，在人基因组背景下，引物对WPRE-1-F/WPRE-1-R，ABL1-F/ABL1-R，ABL2-F/ABL2-R的特异性最高，灵敏性最好(图3A-J)。
5)抽提小鼠外周血全基因组，调整浓度为25ng/μl；
6)用5)中的基因组10倍梯度稀释标准质粒，使其拷贝数范围在1.25copies/μl到1.25×106copies/μl之间；
7)配置SYBG反应液，上机检测；
8)分析数据，在鼠基因组背景下，引物对WPRE-1-F/WPRE-1-R，ABL1-F/ABL1-R，ABL2-F/ABL2-R的特异性，灵敏性依然良好(图4A-F)。
表2引物特异性筛选反应液配置
| TB Mix | 10μl |
| Dye II | 0.4μl |
| 上游引物 | 0.8μl |
| 下游引物 | 0.8μl |
| 模板 | 4μl |
| H<sub>2</sub>O | 4μl |
表3引物筛选反应程序
| 95℃ | 30S |
| 95℃ | 5S |
| 60℃ | 34S |
实施例2
一种小鼠体内检测CAR-T的方法：
1)6只NPG小鼠分为三组，每组2只。分别回输200μl生理盐水(NACL)、Anti-CD19CAR-T细胞(2×107/只)或Anti-met CAR-T细胞(2×107/只)，3天后采血，6个待测样品全基因组抽提，并稀释成25ng/μl；
2)未回输CAR-T细胞的小鼠外周血全基因组抽提，并稀释成25ng/μl，作为背景基因组；
3)用2)中的背景基因组将标准质粒10倍梯度稀释成拷贝数范围在1.25copies/μl到1.25×106copies/μl之间；
4)配置反应液，上机检测；
5)分析数据，用不同浓度标准质粒的Ct值与对应的拷贝数的LOG值，获得目的基因及内参基因的标准曲线(结果如图5所示)。把待测样品的内参基因Ct内参基因及Ct目的基因分别带入标准曲线，获得相应的
及
根据结果可知，本发明可检测到回输不同CAR-T细胞的小鼠外周血中T细胞和CAR-T细胞的拷贝数，而回输生理盐水组小鼠并未检出，证明本发明方法可行。
表4获得标准曲线回归方程
表5待测样品数据分析
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司
<120> 一种检测小鼠模型中人源CAR-T细胞拷贝数的引物组、试剂盒及方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cgggtaactc gacaatcaac ctc 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggcattaaag cagcgtatcc ac 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ggatacgctg ctttaatgcc tt 22
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
caacgggcca caactcctc 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
attgcttccc gtatggctt 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
caacgggcca caactcctc 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gagccagaga tttcccaaag c 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
accaatgata ccaaacgcat cc 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ccccacacat gagacaaacc c 21
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
aagcctagac gatgattaca gcc 23
Claims (10)
1.一种检测小鼠模型中人源CAR-T细胞拷贝数的引物组，其特征在于，包括检测CAR-T细胞目的基因的引物对和内参基因的引物对；所述目的基因包括WPRE基因，所述内参基因包括ABL基因；
检测WPRE基因的引物对选自SEQ ID No.1～SEQ ID No.2、SEQ ID No.3～SEQ ID No.4和SEQ ID No.5～SEQ ID No.6中的一对；
检测ABL基因的引物对为SEQ ID No.7～SEQ ID No.8或SEQ ID No.9～SEQ ID No.10。
2.一种检测小鼠模型中人源CAR-T细胞拷贝数的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1中所述的引物组和荧光定量PCR反应试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组包括SEQ ID No.1～SEQ IDNo.2所示的检测WPRE基因的引物对和SEQ ID No.7～SEQ ID No.8所示的检测ABL基因的引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组中每一种引物的使用浓度为0.1μM～10μM。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应试剂包括荧光定量PCRMix、DyeII和水。
6.一种检测小鼠模型中人源CAR-T细胞拷贝数的方法，包括以下步骤：
1)将CAR-T细胞目的基因和内参基因共同构建到质粒载体上获得标准质粒；
2)提取小鼠外周血的全基因组DNA，并将所述全基因组DNA的浓度调节至25ng/μl获得背景基因组，以所述背景基因组稀释步骤1)中所述的标准质粒获得不同浓度的标准质粒；
3)提取回输CAR-T细胞小鼠的外周血待测样本的全基因组DNA，并将所述全基因组DNA的浓度调节至1～500ng/μl获得待检测DNA；
4)将步骤3)中所述的待检测DNA、目的基因的引物组、内参基因的引物组和荧光定量PCR反应试剂混合获得待测样品荧光定量PCR反应体系；
分别将步骤2)中不同浓度的标准质粒与目的基因的引物组、内参基因的引物组和荧光定量PCR反应试剂混合获得不同浓度的标准质粒荧光定量PCR反应体系；
将所述待测样品荧光定量PCR反应体系、不同浓度的标准质粒荧光定量PCR反应体系上机进行荧光定量PCR检测获得不同浓度的标准质粒的内参基因Ct值、目的基因Ct值、待测样品的内参基因Ct值和待测样品目的基因的Ct值；
用不同浓度的标准质粒目的基因Ct值与对应拷贝数的LOG值进行线性拟合，获得标准质粒目的基因的标准曲线；
用不同浓度的标准质粒内参基因Ct值与对应拷贝数的LOG值进行线性拟合，获得标准质粒内参基因的标准曲线；
将待测样品的目的基因Ct值和待测样品内参基因的Ct值分别带入对应的标准曲线，获得相应的待测样品中目的基因的拷贝数和人源CAR-T细胞的拷贝数；
所述步骤3)和步骤1)无时间顺序限定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)中以所述背景基因组稀释标准质粒，使标准质粒的拷贝数范围在5copies～5×106copies之间。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述标准质粒拷贝数的计算公式如下：拷贝数＝6.02×1023×核酸浓度÷(DNA length×660)；所述拷贝数的单位为copies/ml，所述核酸浓度的单位为g/ml，所述DNA length为8399。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测样品荧光定量PCR反应体系如下：
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测样品荧光定量PCR反应程序如下：95℃30S，95℃5S，60℃34S。
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