CN113913554A - 一种实时荧光定量pcr检测jc多瘤病毒的方法 - Google Patents

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沈施佳
董元舒
童涌
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Abstract

本发明公开了一种实时荧光定量PCR检测JC多瘤病毒的方法，所述方法提供了一组用于实时荧光定量PCR检测生物制品中的JC病毒的正向引物、反向引物和探针，并提供了利用该正反向引物和探针进行荧光定量PCR检测的PCR程序。本发明提供的检测方法可用于检测所有不同基因型的JC病毒，专一性良好，灵敏性高，变异株覆盖性高，且相比于普通病毒细胞培养检测，大大缩短了检测时间，并节省了人工和物料成本，适用于生物制品大批量生产的繁复检测。

Description

一种实时荧光定量PCR检测JC多瘤病毒的方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种实时荧光定量PCR检测JC多瘤病毒的方法。
背景技术
JC病毒(JCV)属人类多瘤病毒，是一种小双链DNA病毒，可分为30多个基因型。JC病毒感染是世界范围的，全世界不同地区的统计，成人的JCV感染率是50％一90％。JC病毒可能通过呼吸道感染，一般没有明显的临床表现。原发感染后，可致病毒血症，病毒到达肾脏潜伏下来，在机体免疫力下降时，如肾移植或骨髓移植后的病人，妊娠妇女，老年人，癌症和艾滋病患者等免疫功能不全者，病毒可重新激活并复制，此时病毒有可能通过血脑脊液屏障，选择性破坏中枢神经***寡树突细胞，引起进行性多灶性白质脑病(PML)。另外，JC病毒像SV40和其他多瘤病毒一样，是一种肿瘤病毒，能促使正常的细胞转化为肿瘤细胞。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，JC多瘤病毒在2B类致癌物清单中。在使用生物制品的患者中，免疫功能不全的比例较高，因此，检测生物制品中的JC病毒污染是很有必要的。
由于JC病毒主要经由尿液排出，其临床检测主要采取尿液的细胞学或核酸检测技术。细胞学检查主要是进行病理形态学的观察并定性，作为一种初步定性检测技术，细胞学检查的检测灵敏度及特异性都较低，因此，适用范围广且检测灵敏度较高的核酸检测技术是检测JC多瘤病毒的较好选择。目前，较常用的核酸检测技术为实时荧光定量PCR法，是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法，通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析，在利用实时荧光定量PCR法检测JC病毒时，通过PCR扩增过程中荧光信号的强弱，对PCR产物进行实时检测，从而快速、高效、准确的检测出JC病毒基因组DNA。
目前现有的对JC病毒进行检测的方法，JC病毒变异株覆盖率较低，且PCR方法做检测时，检测样本DNA中也包含大量的细胞DNA与微量的病毒DNA，PCR反应常常受到大量的细胞DNA的抑制，因此，需要开发一种尽可能多地覆盖JC病毒变异株，且不受大量背景细胞DNA影响的，高灵敏度的检测方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种实时荧光定量PCR检测JC多瘤病毒的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品的总DNA；
2)对NCBI数据库中所有JC病毒分离株基因组DNA序列做同源性对比，设计出1组用于实时荧光定量PCR的正向引物、反向引物和探针；
所述正向引物的核苷酸序列为：ACAGAGCACAAGGCGTAC(如SEQ ID NO:1所示)；
所述反向引物的核苷酸序列为：TCCTCCTGTTAGTGTCCCAAA(如SEQ ID NO:2所示)；
所述探针的核苷酸序列为：ATCCTGTTGAATGTTGGGTTCCTGATCC(如SEQ ID NO:3所示)；
3)制备反应体系，所述反应体系包括预混液、正向引物、反向引物、探针和模板，所述预混液为TaqMan Universal Master Mix，所述模板为包含模板靶序列的质粒；
4)对模板进行梯度稀释；
5)进行试剂的阴性对照和待测样品的阴性对照，再将加入了标准品的待测样品上样；
6)进行荧光定量PCR反应；
7)根据检测结果绘制标准曲线并对结果进行分析。
具体地，步骤1)中，所述总DNA的浓度设定为0.1μg/μL。
具体地，步骤4)中，所述梯度稀释是指将所述质粒梯度稀释为每5μL中含有1x105、1x104、1x103、1x102及10个靶序列拷贝的标准样品。
具体地，步骤6)中，所述荧光定量PCR反应采用ABI 7500PCR仪进行。
具体地，步骤6)中，所述荧光定量PCR反应程序为：
S1：95℃，10min；
S2：95℃，15s后，60℃，1min。
具体地，所述S2执行40个循环。
本发明通过对NCBI数据库中所有JC病毒分离株基因组DNA序列(共689个)做同源性对比，设计出用于实时荧光定量PCR的正、反向引物以及探针，能够高效、准确的检测出所有类型的JC病毒DNA，且将来可能出现的变异株被该方法检测到的几率很高，因此本方法能够适用于生物制品大批量生产的繁复检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本方法能够检测出NCBI数据库中现有的所有JC病毒分离株的基因组DNA，选择的扩增检测区域是JC病毒基因组中非常保守的区域，将来新出现的变异株被该方法检测到的几率很高；
2.本方法用时约1.5h，与病毒细胞培养检测相比，时间缩短较大，降低了人工和物料成本；
3.本方法可以检测出低至10个病毒基因组拷贝，灵敏度高，能够更好地保证生物制品的安全性；
4.本方法不被细胞基因组DNA所干扰，特别适合于检测含细胞的样品中的病毒污染。
附图说明
图1为使用本发明提供的引物、探针、扩增模板minigene及方法步骤得到的扩增曲线图。图中数字(10，102，103，104，105)为模板拷贝数。结果表示检测体系可检测到10拷贝的模板。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中所使用的材料、仪器和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所使用的技术手段，如无特殊说明，均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例一
1.对待测细胞进行提取，提取待测样品的总DNA，并将DNA模板的浓度调整为0.1μg/μL。
2.对NCBI数据库中所有JC病毒分离株基因组DNA序列做同源性对比，设计出1组用于实时荧光定量PCR的正向引物、反向引物和探针；
正向引物的核苷酸序列为：ACAGAGCACAAGGCGTAC(如SEQ ID NO:1所示)；
反向引物的核苷酸序列为：TCCTCCTGTTAGTGTCCCAAA(如SEQ ID NO:2所示)；
探针的核苷酸序列为：ATCCTGTTGAATGTTGGGTTCCTGATCC(如SEQ ID NO:3所示)。
3.计算实时荧光定量PCR的反应数N，并制备反应体系，反应体系包括预混液、正向引物、反向引物、探针和模板，预混液为TaqMan Universal Master Mix，模板为包含模板靶序列的质粒，预混液的制备按下表1：
表1：预混液的制备
Figure BDA0003342218140000041
4.对模板进行梯度稀释，至每5μL中含有1x105、1x104、1x103、1x102及10个靶序列拷贝的标准样品；
5.上样，在样品孔中分别加入如下表2所示的样品：
表2：样品及其作用
Figure BDA0003342218140000042
每个反应的上样终体积为10μL。
6.荧光定量PCR反应，采用ABI 7500PCR仪，设定反应程序如下：
S1：95℃，10min；
S2：95℃，15s后，60℃，1min，S2执行40个循环。
7.结果分析，如图1所示的扩增曲线图可以看出，通过本方法设计的正向引物、反向引物以及探针，使用实时荧光定量PCR，能够检测出低至10个拷贝数的模板DNA，是一种灵敏度高、变异株覆盖率高且特异性良好的JC病毒检测方法，且检测方法仅需1.5h左右，与普通的病毒细胞培养检测相比较，时间大幅缩短，降低了人工和物料的成本，低至10拷贝数的检测限更好的保证了生物制品的安全性，且采用本检测方法进行JC病毒检测时，细胞基因组不会产生任何阳性信号来影响目的DNA的检测，即本检测方法不会被细胞基因组DNA所干扰，能够适用于检测生物制品大批量生产的繁复检测。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 苏州药明检测检验有限责任公司
<120> 一种实时荧光定量PCR检测JC多瘤病毒的方法
<130> CPC-NP-21-102957
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 正向引物(人工序列)
<400> 4
acagagcaca aggcgtac 18
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 反向引物(人工序列)
<400> 5
tcctcctgtt agtgtcccaa a 21
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 探针(人工序列)
<400> 6
atcctgttga atgttgggtt cctgatcc 28

Claims (6)

1.一种实时荧光定量PCR检测JC多瘤病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测样品的总DNA；
2)对NCBI数据库中所有JC病毒分离株基因组DNA序列做同源性对比，设计出1组用于实时荧光定量PCR的正向引物、反向引物和探针；
所述正向引物的核苷酸序列为：ACAGAGCACAAGGCGTAC；
所述反向引物的核苷酸序列为：TCCTCCTGTTAGTGTCCCAAA；
所述探针的核苷酸序列为：ATCCTGTTGAATGTTGGGTTCCTGATCC；
3)制备反应体系，所述反应体系包括预混液、正向引物、反向引物、探针和模板，所述预混液为TaqMan Universal Master Mix，所述模板为包含模板靶序列的质粒；
4)对模板进行梯度稀释；
5)进行试剂的阴性对照和待测样品的阴性对照，再将加入了标准品的待测样品上样；
6)进行荧光定量PCR反应；
7)根据检测结果绘制标准曲线并对结果进行分析。
2.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测JC多瘤病毒的方法，其特征在于，步骤1)中，所述总DNA的浓度设定为0.1μg/μL。
3.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测JC多瘤病毒的方法，其特征在于，步骤4)中，所述梯度稀释是指将所述质粒梯度稀释为每5μL中含有1x105、1x104、1x103、1x102及10个靶序列拷贝的标准样品。
4.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测JC多瘤病毒的方法，其特征在于，步骤6)中，所述荧光定量PCR反应采用ABI 7500PCR仪进行。
5.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测JC多瘤病毒的方法，其特征在于，步骤6)中，所述荧光定量PCR反应程序为：
S1：95℃，10min；
S2：95℃，15s后，60℃，1min。
6.根据权利要求5所述的实时荧光定量PCR检测JC多瘤病毒的方法，其特征在于，所述S2执行40个循环。
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