CN107043831A

CN107043831A - 鸭腺病毒A型和2型Real time PCR检测引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN107043831A
Application number: CN201710443593.2A
Authority: CN
Inventors: 万春和; 黄瑜; 陈翠腾; 程龙飞; 傅光华; 施少华; 陈红梅; 傅秋玲; 刘荣昌
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-06-13
Filing date: 2017-06-13
Publication date: 2017-08-15
Anticipated expiration: 2037-06-13
Also published as: CN107043831B

Abstract

本发明提供鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型实时荧光定量PCR检测引物、探针及试剂盒，所述引物和探针序列如SEQ ID NO.1‑6所示，具有很高的特异性和灵敏度。当前国内外尚未见可同时对鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型进行检测双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的引物和探针的研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

Description

鸭腺病毒A型和2型Real time PCR检测引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明提供鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型实时荧光定量PCR检测引物、探针及试剂盒，属于兽医学领域。

背景技术

根据国际病毒分类委员会分类，腺病毒科Adenoviridae下设5个属，分别为富AT腺病毒属Atadenovirus、禽腺病毒属Aviadenovirus、鱼腺病毒属Ichtadenovirus、哺乳动物腺病毒属Mastadenovirus和唾液酸酶病毒属Siadenovirus。其中富AT腺病毒属有5个种，分别为牛腺病毒D型Bovine adenovirus D、绵羊腺病毒D型Ovine adenovirus D、袋鼠腺病毒A型Possum adenovirus A、蛇腺病毒A型Snake adenovirus A和鸭腺病毒A型Duck adenovirus A（简称DAdV-A）。

腺病毒基因组全长约为33 kd，基因组为线性双链DNA；该类病毒颗粒为无囊膜的核衣壳呈二十面体对称，其中腺病毒的核衣壳有3个主要结构蛋白，分别为六邻体蛋白（Hexon）、纤维蛋白 (Fiber)和五邻体蛋白（Penton）。其中，Hexon蛋白是腺病毒科各属病毒最主要的结构蛋白，每个Hexon蛋白表面携带有病毒主要的属的种特异性抗原决定簇，是病毒中和抗体的靶目标，含有病毒主要的保护性抗原基因簇，与病毒的致病性密切相关。

鸭腺病毒2型（duck adenovirus 2，DAd V-2）是近年来利用病毒宏基因组学发现的一种鸭源新型腺病毒，该病主要发生在20～30日龄鸭中，以肝和脾肿大、出血为主要特征，死亡率约为7％。核苷酸同源性分析比较发现，鸭腺病毒2型（GR株）和鸭腺病毒A型分离株的核苷酸同源性约为50.0%。通过对其基于Hexon蛋白的遗传进化分析发现，所有鸭腺病毒A型分离株在遗传进化上均处于相同的亚分支，且和绵羊腺病毒D型（OAV287株）均处于富AT腺病毒属遗传进化分支。但鸭腺病毒2型（GR株）和禽腺病毒A型Phelps株（鸡源）与P29株（鹅源）处于同一遗传进化分支，均属于禽腺病毒属遗传进化分支。

实时荧光定量PCR方法（Real time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高，目前常用的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标molecular Beacon。TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团，如FAM、VIC、ROX、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团，如Eclipse、TAMRA等。实时荧光定量PCR技术在检测病原时不仅可以定性检测病原的有无，而且还可以定量分析病毒含量的多少，在病原核酸检测技术上被广泛使用。多重实时荧光定量PCR是一种特殊的荧光定量PCR形式，其突出的特点是一次实时荧光定量PCR反应可同时检测多种病原，对病原复杂或存在多种基因型的病原鉴别检测十分有效。

当前，在鸭群中存在2种腺病毒科但分属于不同腺病毒属的病原：鸭腺病毒A型（属于腺病毒科富AT腺病毒属）和鸭腺病毒2型（属于属于腺病毒科禽腺病毒属）。因此，建立能够同时对鸭群中鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型的检测方法，既可简化操作程序、节约成本，又可以对鸭群中2种腺病毒科但分属于不同腺病毒属的病原（鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型）的流行病学调查及开展相关病原学致病机理研究均具有重要的意义。但是，当前国内外尚未见可同时对鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型进行检测双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的引物和探针的研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域研究空白。

发明内容

本发明提供鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型实时荧光定量PCR检测引物、探针及试剂盒, 建立能够同时对鸭群中鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型的检测方法，简化操作程序、节约成本。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型实时荧光定量PCR检测引物和探针，包括如下：

用于检测鸭腺病毒A型：

上游引物DAdV-A-F：5’- TCCTCCTCATGGTTTTATG-3’，

下游引物DAdV-A-R：5’- CGAAGATTGCAGTAGTATTAG-3’，

荧光探针DAdV-A-P：5’- CCTGACACTGGCACGGCTAT-3’；

用于检测鸭腺病毒2型：

上游引物DAdV-2-F：5’- CGATGATGCAGATGATAAC-3’；

下游引物DAdV-2-R：5’- GATCGCTCTGAGTTTAGG-3’；

荧光探针DAdV-2-P：5’- ACCAGAACATACTCCAGAATCGTGA-3’；

其中，鸭腺病毒A型的荧光探针DAdV-A-P的5′端标记有荧光报告基团ROX、鸭腺病毒2型的荧光探针DAdV-2-P的5′端标记有荧光报告基团FAM；，鸭腺病毒A型的荧光探针DAdV-A-P的3′端和鸭腺病毒2型的荧光探针DAdV-2-P的3′端均标记淬灭基团Eclipse。

用于检测鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型的实时荧光定量PCR方法的试剂盒，包括所述的引物和探针。

双重TaqMan实时荧光定量PCR反应体系为：

双重实时荧光定量PCR方法反应条件为： 95 ℃预变性60 s；95 ℃ 10s，56 ℃退火10s，72 ℃延伸15 s，40个循环。

实时荧光定量PCR反应结束后，分析试验结果，在605nm处选择ROX通道见有阳性扩增信号，表明检测样品中存在鸭腺病毒A型感染；在520nm处选择FAM通道见有阳性扩增信号，表明检测样品中存在鸭腺病毒2型感染；若605nm处选择ROX通道和520nm处选择FAM通道均见有阳性扩增信号，表明样品中存在鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型感染。

本发明提供鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型实时荧光定量PCR检测引物、探针及试剂盒，具有以下优点和效果：

1、同时检测：建立的方法能够同时对鸭群中鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型感染进行检测，简化操作程序、节约成本。实时荧光定量PCR反应结束后，分析试验结果，在605nm处选择ROX通道见有阳性扩增信号，表明检测样品中存在鸭腺病毒A型感染；在520nm处选择FAM通道见有阳性扩增信号，表明检测样品中存在鸭腺病毒2型感染；若605nm处选择ROX通道和520nm处选择FAM通道均见有阳性扩增信号，表明样品中存在鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型感染。

2、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过实时荧光定量PCR机器自带的进行结果判定。从核酸提取到结果判定仅需90 min，且一次可以同时进行96个样品检测。

3、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型的Ct值，直接对其感染鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型进行准确定量。

4、灵敏度高：鸭腺病毒A型最低可检测8.37个拷贝；鸭腺病毒2型最低可检测6.92个拷贝，较常规PCR检测灵敏度提高100倍。

5、特异性强：和鸭群中的常见传染病如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒均无反应信号，仅对鸭腺病毒A型（605nm ROX通道）和鸭腺病毒2型（520nm FAM通道）检测出现荧光信号。

对85份临床送检鸭源病料进行鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型感染的双重实时荧光定量PCR检测，用商品化病毒核酸提取试剂盒提取相应的DNA，按照建立双重实时荧光定量PCR体系和条件进行检测。结果发现，在605nm处选择ROX通道见有6份样品阳性扩增信号，表明6份检测样品中存在鸭腺病毒A型感染，阳性率为7.06%；在520nm处选择FAM通道见有2份样品阳性扩增信号，表明2份检测样品中存在鸭腺病毒A型感染，阳性率为2.35%；其中还有1份样品在605nm处选择ROX通道和520nm处选择FAM通道均有扩增信号，表明该1份样品中存在鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型感染，阳性率为1.17%。

附图说明

图1鸭腺病毒A型实时荧光定量PCR方法的扩增动力学曲线。

图2 鸭腺病毒A型实时荧光定量PCR方法的标准曲线。

图3鸭腺病毒A型实时荧光定量PCR方法的特异性试验。

图4 鸭腺病毒2型实时荧光定量PCR方法的扩增动力学曲线。

图5 鸭腺病毒2型实时荧光定量PCR方法的标准曲线。

图6鸭腺病毒2型实时荧光定量PCR方法的特异性试验。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、相关试验病原

试验用病原鸭腺病毒A型、鸭腺病毒2型、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

、引物和探针设计

根据GenBank中检索到的鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型的特异性Hexon基因编码区序列，设计特异性的针对鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型的引物和探针，其序列如下：

鸭腺病毒A型（DAdV-A）：

上游引物DAdV-A-F：5’- TCCTCCTCATGGTTTTATG-3’；

下游引物DAdV-A-R：5’- CGAAGATTGCAGTAGTATTAG-3’；

荧光探针DAdV-A-P：5’- CCTGACACTGGCACGGCTAT-3’；

鸭腺病毒2型（DAdV-2）：

上游引物DAdV-2-F：5’- CGATGATGCAGATGATAAC-3’；

下游引物DAdV-2-R：5’- GATCGCTCTGAGTTTAGG-3’；

荧光探针DAdV-2-P：5’- ACCAGAACATACTCCAGAATCGTGA-3’；

上述引物均在宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

、鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型的双重实时荧光定量PCR检测方法的建立

3.1 鸭腺病毒A型阳性标准品的构建

根据鸭腺病毒A型（JX2016株）Hexon蛋白编码区基因特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：DAdV-A-F2：5′- ATGATAAATTTGTACGTGTTATTG-3′和DAdV-A-R2：5′- ACGCAGCATCAATTCCAGCTC -3′，用于扩增约719 bp的Hexon基因片段，引物由宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

用商品化病毒核酸提取试剂盒提取鸭腺病毒A型（JX2016株）核酸DNA，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix (+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上下游引物（DAdV-A-F2和DAdV-A-R2，10μM）各1μL、提取的核酸DNA1μL，补充灭菌去离子水22μL至终体积50μL。反应条件为：94 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 50 s，54 ℃ 35 s，72 ℃ 45 s，35个循环；循环结束后72 ℃延伸 10 min。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将Hexon基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（DAdV-A-F2和DAdV-A-R2）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T- DAdV-A），分装后置于-20 ℃保存备用。

3.2 鸭腺病毒2型阳性标准品的构建

根据鸭腺病毒2型（FJ20171株）Hexon蛋白编码区基因特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：DAdV-2-F2：5′- CGAAACAAATTCAGACAGACT -3′和DAdV-2-R2：5′- AGTCTTCATACCCATCGTTATT -3′，用于扩增约988 bp的Hexon基因片段，引物由宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

用商品化病毒核酸提取试剂盒提取鸭腺病毒2型（FJ20171株）核酸DNA，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix (+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上下游引物（DAdV-2-F2和DAdV-2-R2，10μM）各1μL、提取的核酸DNA1μL，补充灭菌去离子水22μL至终体积50μL。反应条件为： 94 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 50 s，54 ℃ 35 s，72 ℃ 45 s，35个循环；循环结束后72 ℃延伸 10 min。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将Hexon基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（DAdV-2-F2和DAdV-2-R2）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T- DAdV-2），分装后置于-20 ℃保存备用。

3.3反应条件的优化及标准曲线的建立

按照Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)试剂盒说明书配制20 μL的实时荧光定量PCR反应体系，在不同退火温度（56，58，60，62和64 ℃）、引物浓度（2.5-20 μM）及探针浓度（1.25-20 μM）下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。以鸭腺病毒A型阳性标准品（T-DAdV-A）和鸭腺病毒2型阳性标准品（T- DAdV-2）为模板，在605nm处选择ROX通道，在520nm处选择FAM通道。用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线）。

结果：优化出的双重实时荧光定量PCR方法最佳反应体系（20 μL）如下表1。

表1 优化后的双重TaqMan实时荧光定量PCR反应体系

结果：优化出的双重实时荧光定量PCR方法最佳反应条件为： 95 ℃预变性60 s；95 ℃10s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。

实验结果的判定：

3.4 鸭腺病毒A型敏感性试验

利用微量核酸测定仪测定阳性标准品（T- DAdV-A）的浓度，计算其拷贝数为8.37×10⁷拷贝/μL，对其进行10倍连续稀释，共进行连续稀释（质粒含量分别为8.37×10⁶，8.37×10⁵，8.37×10⁴，8.37×10³，8.37×10²，8.37×10¹和8.37×10⁰拷贝/μL），分装后置于-20 ℃保存备用。分别以上述不同稀释度阳性标准品（T- DAdV-A）作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线（见图1）。以标准品起始拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线）（见图2），获得其敏感性试验数据。

从图1可以看出，本发明建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为8.37拷贝/μL。以各标准品中质粒含量（C）的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，获得鸭腺病毒A型实时荧光定量PCR标准曲线（图2），所获得标准曲线斜率为-3.516，Y轴截距为35.38，相关系数为0.996，扩增效率为99.9%，符合实验预期。

3.5 鸭腺病毒2型敏感性试验

利用微量核酸测定仪测定阳性标准品（T- DAdV-2）的浓度，计算其拷贝数为6.92×10⁷拷贝/μL，对其进行10倍连续稀释，共进行连续稀释（质粒含量分别为6.92×10⁶，6.92×10⁵，6.92×10⁴，6.92×10³，6.92×10²，6.92×10¹和6.92×10⁰拷贝/μL），分装后置于-20 ℃保存备用。分别以上述不同稀释度阳性标准品（T- DAdV-2）作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线（见图3）。以标准品起始拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线）（见图4），获得其敏感性试验数据。

从图4可以看出，本发明建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为6.92拷贝/μL。以各标准品中质粒含量（C）的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，获得鸭腺病毒A型实时荧光定量PCR标准曲线（图5），所获得标准曲线斜率为-3.241，Y轴截距为33.99，相关系数为0.998，扩增效率为100%，符合实验预期。

3.6 特异性检测

用优化后的双重实时荧光定量PCR条件分别对水禽其他常见基因组核酸类型为DNA的常见病原，如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒进行实时荧光定量PCR检测，以鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型为阳性对照。用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取相应病毒的核酸DNA，按照Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)试剂盒说明书用优化后的反应条件进行检测，评价建立的实时荧光定量PCR方法的特异性。

从图3可见，用优化后的双重实时荧光定量PCR条件分别对水禽其他常见基因组核酸类型为DNA的常见病原，如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌病、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒进行实时荧光定量PCR检测，从ROX荧光信号通道，仅见有鸭腺病毒A型特异性荧光信号，该通道鸭腺病毒2型也未见阳性荧光信号。

从图6可见，用优化后的双重实时荧光定量PCR条件分别对水禽其他常见基因组核酸类型为DNA的常见病原，如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒进行实时荧光定量PCR检测，从FAM荧光信号通道，仅见有鸭腺病毒2型特异性荧光信号，该通道鸭腺病毒A型也未见阳性荧光信号。

上述结果表明，建立的的双重实时荧光定量PCR特异性强，对对水禽其他常见基因组核酸类型为DNA的常见病原，如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒均未见非特异***叉干扰。

3.7 临床样品的检测

将相关阳性样品实时荧光定量PCR反应结束后的产物利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将Hexon基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（DAdV-2-F2和DAdV-2-R2）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，均为相应的鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型Hexon基因片段，符合率为100%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 鸭腺病毒A型和2型Real time PCR检测引物、探针及试剂盒

<130> 10

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcctcctcat ggttttatg 19

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgaagattgc agtagtatta g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctgacactg gcacggctat 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgatgatgca gatgataac 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatcgctctg agtttagg 18

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

accagaacat actccagaat cgtga 25

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgataaatt tgtacgtgtt attg 24

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acgcagcatc aattccagct c 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgaaacaaat tcagacagac t 21

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agtcttcata cccatcgtta tt 22

Claims

1.鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型实时荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于：所述引物和探针包括如下：

用于检测鸭腺病毒A型：

上游引物DAdV-A-F：5’- TCCTCCTCATGGTTTTATG-3’，

下游引物DAdV-A-R：5’- CGAAGATTGCAGTAGTATTAG-3’，

荧光探针DAdV-A-P：5’- CCTGACACTGGCACGGCTAT-3’；

用于检测鸭腺病毒2型：

上游引物DAdV-2-F：5’- CGATGATGCAGATGATAAC-3’，

下游引物DAdV-2-R：5’- GATCGCTCTGAGTTTAGG-3’，

荧光探针DAdV-2-P：5’- ACCAGAACATACTCCAGAATCGTGA-3’；

2.一种用于检测鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型的实时荧光定量PCR方法的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针。