CN112430554A - 一种瓜果猝倒病生防细菌BTh05及其菌剂、菌剂制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物植物保护应用技术领域，具体涉及一种瓜果猝倒病生防细菌BTh05及其菌剂、菌剂制备方法和在瓜果猝倒病防治中的应用，生防细菌BTh05已在CGMCC保藏，保藏编号为CGMCC NO.20906，保藏日期为2020年10月19日，分类命名为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis，所述菌剂的制备方法包括获得用于发酵的种子液、发酵和加入添加剂。本发明生防细菌BTh05及其菌剂对茄科植物和葫芦科植物的猝倒病具有明显生物防治作用，尤其能有效对辣椒、番茄和黄瓜种子进行消毒，防治瓜果猝倒病病原菌的繁殖，节约大量成本，使瓜果生产效益最大化，对瓜果菜的栽培具有重大应用价值。

Description

一种瓜果猝倒病生防细菌BTh05及其菌剂、菌剂制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及微生物植物保护应用技术领域，具体涉及一种瓜果猝倒病生防细菌BTh05及其菌剂、菌剂制备方法和应用。

背景技术

猝倒病的爆发严重影响了瓜果蔬菜的产量和品质，制约了农业经济的发展。目前化学农药和化学肥料是防治瓜果猝倒病和提高农作物产量的主要手段，但长期使用化学农药和化学肥料带来的农药残留和环境污染等诸多问题让人们对食品安全感到十分忧虑。随着人们对无污染、无公害绿色食品的日益关注，生物防治手段替代化学防治手段逐渐得到了广大群众的认可。

自然界中存在着许多对植物健康生长有益的微生物，这些有益微生物有的能够促进植物生长，通常被称作植物促生菌株；有的能够防治植物病害，通常被称作植物病害生防菌。植物生防菌通常通过定殖在植物根围，提高植物对周围生物的压力。其中，假单胞菌和芽孢杆菌是两个重要的生防细菌类群，它们在农作物根茎病害的防治上发挥着重要的作用。尤其，芽孢杆菌属能够产生抗逆芽孢，广泛分布于大自然界中，并且具有生物多样性，是植物生长环境中重要的微生物种群。芽孢杆菌的特性使得其成为理想的生防制剂候选者，在促进植物健康和生长方面起着重要的作用。

为解决化学农药施用带来的环境污染、人畜安全等问题，同时利于可持续农业的发展，提供一种瓜果猝倒病生防细菌BTh05及其菌剂、菌剂制备方法和应用十分重要，为生物农药的开发利用打下基础。

发明内容

针对化学农药施用带来的环境污染、人畜安全问题，本发明提供一种瓜果猝倒病生防细菌BTh05及其菌剂、菌剂制备方法和应用，本发明生防细菌BTh05及其菌剂对茄科植物和葫芦科植物的猝倒病具有明显生物防治作用，尤其能够有效对辣椒、番茄和黄瓜种子进行消毒，防治瓜果猝倒病病原菌的繁殖，从而节约大量成本，使瓜果生产效益最大化，对瓜果菜的栽培具有重大应用价值。

第一方面，本发明提供一种生防细菌BTh05，所述生防细菌BTh05已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.20906，保藏日期为2020年10月19日，分类命名为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis。

第二方面，本发明提供一种含有上述生防细菌BTh05的菌剂。

进一步的，所述菌剂的剂型为悬浮剂。

进一步的，所述菌剂的活菌浓度不低于1.0×10¹⁰cfu/mL，室温条件下半年后菌剂中活菌数目不低于8.0×10⁹cfu/mL。

第三方面，本发明提供一种上述菌剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将-80℃保存的生防细菌BTh05菌株接种至固体LB培养基进行活化，在30℃±1℃条件下倒置培养16h或过夜培养，挑取单菌落并接种于液体LB培养基，30℃±1℃条件下震荡培养至对数期，获得用于发酵的种子液，作为种子液浓度不低于1.0×10⁸cfu/mL；

(2)室温条件下，将种子液以体积比1:10的接种量接种至发酵培养基，保证发酵培养体系中生防细菌BTh05菌体初始浓度不低于1.0×10⁷cfu/mL；

(3)按质量百分比向发酵完毕的发酵液中依次加入0.1％～0.2％表面活性剂﹑1％～2％防腐剂﹑4％～5％悬浮助剂﹑0.3％～0.4％增稠剂，添加过程中待每个添加剂完全溶解后再加入下一种添加剂，获得生防细菌BTh05菌剂。

进一步的，所述步骤(2)的培养条件为：在28～30℃条件下，通气保压0.05～0.1MPa，溶氧量28％～30％，转速180～200r/min，发酵过程中保持发酵液pH7.2～7.5，培养48h后检测活菌总量，产孢率达到92％，活菌计数浓度不低于1.1×10¹⁰cfu/mL，发酵结束。

进一步的，所述步骤(2)的发酵培养基包括玉米粉2％、豆粕粉1％、酵母粉0.3％、蛋白胨0.2％、CaCl₂ 0.2％、MgSO₄·7H₂O 0.1％、K₂HPO₄·3H₂O 0.3％、KH₂PO₄ 0.15％和FeSO₄·7H₂O0.003％(皆为质量体积比)，余量为水；

所述发酵培养基在pH7.0～7.5、0.1Mpa、121℃条件下，连同发酵罐一起灭菌60min，自然冷却到常温。

进一步的，所述步骤(3)的表面活性剂为有机硅BD-3077，防腐剂为苯甲酸钠，悬浮助剂为聚羧酸钠，增稠剂为黄原胶。

第四方面，本发明提供一种上述生防细菌BTh05和/或菌剂在瓜果猝倒病防治中的应用，优选为在茄科植物和/或葫芦科植物猝倒病防治中的应用。

进一步的，所述应用为采用含有上述生防细菌BTh05的菌剂或菌剂的稀释液浸种、灌根和/或喷施茎部。

本发明的有益效果在于，

本发明提供的瓜果猝倒病生防细菌BTh05及其菌剂与市场常规化学农药(如甲霜灵)相比，对畸雌腐霉菌和瓜果腐霉菌引起的瓜果猝倒病防治效果良好，为探究该应用方向的微生物源农药的研发提供新的方法。使用100倍稀释液进行浸种处理对畸雌腐霉菌和瓜果腐霉菌的防效接近85％；使用50倍稀释液进行灌根处理对畸雌腐霉菌和瓜果腐霉菌的防效达到75％以上；使用100倍稀释液进行茎部喷施处理对畸雌腐霉菌和瓜果腐霉菌的防效达到70％以上。同时，本发明菌剂制备方法简单，田间施用方便。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1生防细菌BTh05对畸雌腐霉菌和瓜果腐霉菌的抑制研究

在PDA培养基(马铃薯糖水琼脂培养基)条件下培养畸雌腐霉菌和瓜果腐霉菌，28℃倒置培养3d，待菌丝生长，备用。挑取生防细菌BTh05单菌落接种至LB液体培养基，获得培养液，用LB液体培养基调整培养液浓度至1.0×10⁸cfu/mL。设6组处理：清水处理组﹑培养液上清组﹑菌体悬浮液(培养液离心获得的菌体经等体积的LB液体培养基重新悬浮获得)组﹑10倍稀释培养液组﹑50倍稀释培养液组和100倍稀释培养液组。将新鲜番茄叶片置于各处理组(每组5mL)，叶片背面朝上，接种Φ＝5mm的菌块(菌体)，5d后观察统计其结果。研究其对畸雌腐霉菌和瓜果腐霉菌的降解作用。所使用的生防细菌BTh05已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.20906，保藏日期为2020年10月19日，分类命名为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis。结果如表1所示。

表1生防细菌BTh05对畸雌腐霉菌和瓜果腐霉菌的抑制作用

结果显示，在含有生防细菌BTh05菌体的样品中，接种畸雌腐霉菌和瓜果腐霉菌的叶片接种点没有扩大，随着处理时间的增长叶片仍保持健康。生防细菌BTh05培养液稀释到100倍时，接种畸雌腐霉菌和瓜果腐霉菌的叶片接种点没有扩大，随着处理时间的增长叶片仍保持健康；在处理后5d后，施用生防细菌BTh05菌体﹑10倍稀释培养液组和50倍稀释培养液组的叶片的接种点处观察不到菌丝，接种处形成枯斑；100倍稀释培养液组的叶片的接种点处形成枯斑，观察到少许菌丝的存在，接种点处有3-5mm的菌点。

实施例2一种含有生防细菌BTh05的菌剂

一种含有生防细菌BTh05的菌剂，生防细菌BTh05已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.20906，保藏日期为2020年10月19日，分类命名为苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis，菌剂的剂型为悬浮剂；

菌剂的制备方法包括如下步骤：

(1)将-80℃保存的苏云金芽孢杆菌BTh05菌株接种至固体LB培养基进行活化，在30℃±1℃条件下倒置培养过夜培养(或24h)，挑取单菌落并接种于液体LB培养基，30℃±1℃条件下震荡培养至对数期，获得用于发酵的种子液，作为种子液浓度不低于1.0×10⁸cfu/mL；

(2)室温条件下，将种子液以体积比1:10的接种量接种至发酵培养基，保证发酵培养体系中生防细菌BTh05菌体初始浓度不低于1.0×10⁷cfu/mL；

发酵培养基包括玉米粉2％、豆粕粉1％、酵母粉0.3％、蛋白胨0.2％、CaCl₂0.2％、MgSO₄·7H₂O 0.1％、K₂HPO₄·3H₂O 0.3％、KH₂PO₄ 0.15％和FeSO₄·7H₂O 0.003％(皆为质量体积比)，余量为水；发酵培养基在pH值7.2、0.1Mpa、121℃条件下，连同发酵罐一起灭菌60min，自然冷却到常温；

培养条件为：在30℃条件下，通气保压0.075MPa，溶氧量30％，转速200r/min，发酵过程中保持发酵液pH7.2～7.5，培养48h后检测活菌总量，产孢率达到92％，活菌计数浓度不低于1.1×10¹⁰cfu/mL，发酵结束；

(3)按质量百分比向发酵完毕的发酵液中依次加入0.15％有机硅BD-3077﹑1％苯甲酸钠﹑4％聚羧酸钠和0.3％黄原胶，添加过程中待每个添加剂完全溶解后再加入下一种添加剂，获得生防细菌BTh05菌剂，菌剂的活菌浓度不低于1.0×10¹⁰cfu/mL，室温条件下半年后菌剂中活菌数目不低于8.0×10⁹cfu/mL。

实施例3菌剂在工厂化育苗中的浸种应用

试验分为生防细菌BTh05处理组和对照组，试验方法为将每升灭菌处理的营养土混合0.5g畸雌腐霉菌菌体和0.5g瓜果腐霉菌菌体，充分混匀后获得栽培基质，按照常规方法播种处理组和对照组种子并常规管理瓜果植物，每组处理33株，重复3遍，14d后观察统计感染畸雌腐霉菌/瓜果腐霉菌引发的辣椒猝倒病﹑番茄猝倒病﹑黄瓜猝倒病的发病率和病级。其中，

生防细菌BTh05处理组：将浓度为1.0×10¹⁰cfu/mL的实施例2菌剂分别配制成100倍稀释液、200倍稀释液和500倍稀释液(体积比)，充分混匀后，对辣椒“中椒6号”﹑番茄“中研100”﹑黄瓜“园丰元6号”种子进行12h浸泡处理；

对照组：未经实施例2菌剂浸种处理的辣椒“中椒6号”﹑番茄“中研100”﹑黄瓜“园丰元6号”种子。

各供试作物发病现象如下：

瓜果猝倒病主要危害未出土或刚出土不久的幼苗，幼苗受害后茎基部出现水渍状病斑。随着病情的发展病部绕茎一周后形成缢缩，往往子叶未凋萎，幼苗即突然折倒而贴伏地面，但植株仍保持青绿色，故称猝倒病。干燥时，其茎部干枯、缢缩呈线状。

各供供试作物的病级分级标准参考“E.K.Ligoxigakis.and D.J.Vaiounakis的分级标准”，具体如下：

0级：全株未发病；1级：茎基部发黄﹑出现水状病斑﹑植株挺立；2级：茎基部干枯﹑缢缩﹑水渍状病斑局部扩大；3级：茎基部干枯缢缩呈线状﹑植株突然折倒而贴伏地面；4级：植株死亡。

发病率、病情指数、相对防效的计算公式如下：

发病率(％)＝(发病植株数/调查植株数)×100％；

病情指数＝100×Σ(各级病叶数×相对病级)/(调查总叶数×最高病级)；

相对防效(％)＝[(对照区病指-处理区病指)/对照区病指]×100％。

利用EXCEL2010和SPSS19.0软件对数据进行统计分析，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法，试验结果如下表2所示。

表2菌剂浸种处理对辣椒猝倒病﹑番茄猝倒病﹑黄瓜猝倒病防治效果

结果显示，相较对照组，使用实施例2菌剂的植物的发病均明显下降。100倍稀释液时，对辣椒猝倒病﹑番茄猝倒病﹑黄瓜猝倒病的相对防效分别为80.51％、80.06％和80.35％；200倍稀释液时，对辣椒猝倒病﹑番茄猝倒病﹑黄瓜猝倒病的相对防效分别为84.48％、83.27％和82.67％；500倍稀释液时，对辣椒猝倒病﹑番茄猝倒病﹑黄瓜猝倒病的相对防效分别为79.35％、78.83％和75.63％；因此，本发明菌剂能够明显抑制畸雌腐霉菌和/或瓜果腐霉菌引起的辣椒猝倒病﹑番茄猝倒病﹑黄瓜猝倒病病害发病。

实施例4菌剂的灌根应用

试验按农业部药检所田间试验准则设计，试验地点为济南市涝坡鲁青园艺设施田地，试验地土壤为深褐土，土壤肥力中上，具有灌溉条件，该地区于常年种植辣椒﹑番茄﹑黄瓜，并于2018～2019年种植过程中爆发过畸雌腐霉菌和瓜果腐霉菌引起的辣椒猝倒病﹑番茄猝倒病﹑黄瓜猝倒病；供试作物分别为辣椒“中椒6号”﹑番茄“中研100”﹑黄瓜“园丰元6号”；试验时间分别为2020年5月、2020年6月和2020年6月，试验肥料用量与施用方法、田间栽培管理按当地最佳措施进行；

辣椒种植、番茄种植和黄瓜种植各设置5个处理，浓度为1.0×10¹⁰cfu/mL的实施例2菌剂100倍稀释液、200倍稀释液和500倍稀释液(体积比)分别作为处理组I、II、III，50％甲霜灵750倍稀释液以及清水对照；

各处理以灌根形式伴随移苗期进行，每处理0.02亩，各3次重复，共15个小区面积0.9亩，各小区留2行保护行。随机区组设计，选取15d进行田间调查。每小区采用双对角线固定5点取样，每点调查6株，记录调查对象的生长情况，发病情况及病级(病级调查后将发病病株除去)。病级分级标准及发病率、病情指数和相对防效的计算方法与实施例3相同，利用EXCEL2010和SPSS19.0软件对数据进行统计分析，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法，试验结果如下表3所示。

表3菌剂灌根处理对瓜果猝倒病防效影响

表3结果显示，相较对照组，使用实施例2菌剂的瓜果植物的发病均明显下降，施用100倍稀释液时，对辣椒猝倒病﹑番茄猝倒病﹑黄瓜猝倒病的防治效果最佳，相对防效能够达到或优于化学保护剂甲霜灵的相对防效，能够明显抑制畸雌腐霉菌和/或瓜果腐霉菌引起的辣椒猝倒病﹑番茄猝倒病﹑黄瓜猝倒病病害发病，保护辣椒﹑番茄﹑黄瓜移苗后的健康生长。

实施例5菌剂的喷施茎部应用

试验按农业部药检所田间试验准则设计，试验地点为济南市涝坡鲁青园艺设施田地，试验地土壤为棕褐土，土壤肥力中上，具有灌溉条件，该地区于常年种植辣椒﹑番茄﹑黄瓜，并于2018～2019年种植过程中爆发过畸雌腐霉菌和瓜果腐霉菌引起的辣椒猝倒病﹑番茄猝倒病﹑黄瓜猝倒病；供试作物分别为辣椒“中椒6号”﹑番茄“中研100”﹑黄瓜“园丰元6号”；试验时间分别为2020年5月、2020年6月和2020年6月，试验肥料用量与施用方法、田间栽培管理按当地最佳措施进行；

辣椒种植、番茄种植和黄瓜种植各设置5个处理，浓度为1.0×10¹⁰cfu/mL的实施例2菌剂100倍稀释液、200倍稀释液或400倍稀释液(体积比)分别作为处理组I、II、III，50％甲霜灵750倍稀释液以及清水对照；

各处理以喷施形式伴定植后团棵期进行，每间隔7天喷施一次，连续施用3次。每处理0.02亩，各3次重复，共15个小区面积0.9亩，各小区留2行保护行。随机区组设计，选取15d进行田间调查。每小区采用双对角线固定5点取样，每点调查6株，记录调查对象的生长情况，发病情况及病级(病级调查后将发病病株除去)。病级分级标准及发病率、病情指数和相对防效的计算方法与实施例3相同，利用EXCEL2010和SPSS19.0软件对数据进行统计分析，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法，试验结果如下表4所示。

表4菌剂喷施植株茎部对瓜果猝倒病防效影响

表4结果显示，相较对照组，茎部喷施实施例2菌剂的瓜果植物的发病均明显下降，施用100倍稀释液喷施时，对辣椒猝倒病﹑番茄猝倒病﹑黄瓜猝倒病的防治效果最佳，相对防效优于化学保护剂甲霜灵的相对防效。这说明本发明菌剂能够明显抑制畸雌腐霉菌和/或瓜果腐霉菌引起的辣椒猝倒病﹑番茄猝倒病﹑黄瓜猝倒病病害发病，为后续的辣椒﹑番茄﹑黄瓜花果期的生长提供保护，保障其结实。

尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种生防细菌BTh05，其特征在于，所述生防细菌BTh05已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.20906，保藏日期为2020年10月19日，分类命名为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis。

2.一种含有如权利要求1所述的生防细菌BTh05的菌剂。

3.一种如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的剂型为悬浮剂。

4.一种如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活菌浓度不低于1.0×10¹⁰cfu/mL，室温条件下半年后菌剂中活菌数目不低于8.0×10⁹cfu/mL。

5.一种如权利要求2～4任一项所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将-80℃保存的生防细菌BTh05菌株接种至固体LB培养基进行活化，在30℃±1℃条件下倒置培养16h或过夜培养，挑取单菌落并接种于液体LB培养基，30℃±1℃条件下震荡培养至对数期，获得用于发酵的种子液，作为种子液浓度不低于1.0×10⁸cfu/mL；

(2)室温条件下，将种子液以体积比1:10的接种量接种至发酵培养基，保证发酵培养体系中生防细菌BTh05菌体初始浓度不低于1.0×10⁷cfu/mL；

(3)按质量百分比向发酵完毕的发酵液中依次加入0.1％～0.2％表面活性剂﹑1％～2％防腐剂﹑4％～5％悬浮助剂﹑0.3％～0.4％增稠剂，添加过程中待每个添加剂完全溶解后再加入下一种添加剂，获得生防细菌BTh05菌剂。

6.一种如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的发酵培养基包括玉米粉2％、豆粕粉1％、酵母粉0.3％、蛋白胨0.2％、CaCl₂ 0.2％、MgSO₄·7H₂O 0.1％、K₂HPO₄·3H₂O 0.3％、KH₂PO₄ 0.15％和FeSO₄·7H₂O 0.003％(皆为质量体积比)，余量为水；所述发酵培养基在pH7.0～7.5、0.1Mpa、121℃条件下，连同发酵罐一起灭菌60min，自然冷却到常温；

培养条件为：在28～30℃条件下，通气保压0.05～0.1MPa，溶氧量28％～30％，转速180～200r/min，发酵过程中保持发酵液pH7.2～7.5，培养48h后检测活菌总量，产孢率达到92％，活菌计数浓度不低于1.1×10¹⁰cfu/mL，发酵结束。

7.一种如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的表面活性剂为有机硅BD-3077，防腐剂为苯甲酸钠，悬浮助剂为聚羧酸钠，增稠剂为黄原胶。

8.一种如权利要求1生防细菌BTh05和/或如权利要求2～4任一项所述的菌剂在瓜果猝倒病防治中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述瓜果猝倒病包括茄科植物和/或葫芦科植物猝倒病。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为采用含有上述生防细菌BTh05的菌剂或菌剂的稀释液浸种、灌根和/或喷施茎部。