CN114134087B

CN114134087B - 一种溶藻链霉菌及其在小麦茎基腐病防治中的应用

Info

Publication number: CN114134087B
Application number: CN202111593801.XA
Authority: CN
Inventors: 潘月敏; 侯晓岩; 羊国根; 鞠玉亮; 杨倩; 陈飞飞
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Jiesheng Biotechnology Co ltd; Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2041-12-22
Also published as: CN114134087A

Abstract

本发明公开了一种溶藻链霉菌及其在小麦茎基腐病防治中的应用，属于植物保护技术领域。所述的溶藻链霉菌的编号WY3，2021年4月25日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2021455。本发明首次使用溶藻链霉菌应用到小麦茎基腐病的防治中；数据表明，与对照组相比，溶藻链霉菌（编号为WY3）对小麦幼苗的生长有促进作用，株高与根长明显增加；溶藻链霉菌无菌发酵液对小麦茎基腐病原菌的抑制率为68.65%；对小麦茎基腐病的平均防治效果达60.87%。

Description

一种溶藻链霉菌及其在小麦茎基腐病防治中的应用

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体地说，涉及一种溶藻链霉菌及其在小麦茎基腐病防治中的应用。

背景技术

小麦是我国主要的粮食作物之一，种植面积已达2600万hm²，其在种植中面临的病害问题也就是世界性的粮食安全问题。小麦茎基腐是由多种镰孢菌侵染的世界性土传病害，目前亚洲镰孢菌、禾谷镰孢菌以及假禾谷镰孢菌是我国长江流域和黄淮麦区的主要致病菌。其中亚洲镰孢菌(F.asiaticum)作为我国冬小麦主产区茎基腐镰孢菌的优势种群，对小麦生产造成巨大损失。

亚洲镰孢菌能危害小麦的各个生育阶段，小麦茎基腐病从小麦苗期到成熟期均可发生，可使茎基部叶鞘和茎秆变褐，茎节坏死，严重时可使植株死亡，影响小麦产量。近年来，在小麦-玉米两熟种植制度下，大量玉米、小麦秸秆还田致使还田地块病原菌数量和农田生态小环境发生变化，茎基腐镰孢菌主要以菌丝体、厚垣孢子和分生孢子形式存活于土壤及病株残体上，带菌秸秆存留田间，导致病害发生危害加重。

目前，对小麦茎基腐病的防治以化学防治为主，辅以农业防治、选育优良品种，由于育种周期长以及田间管理的局限性，化学防治是最常用的防治方法。化学农药虽能有效控制病情，却对生态环境和小麦生产造成了严重的二次污染，同时重复使用农药使病菌抗药性增强。因此，环境友好型的生物防治技术逐渐引起重视，关于镰孢菌拮抗菌的研究也在日益增多。在生防微生物类群中，放线菌资源丰富，具有较大的开发应用前景，极大促进我国生物农药产业及其他产业的发展，利用有益微生物来控制小麦茎基腐病符合我国现代农业绿色可持续发展的要求。目前小麦茎基腐病生防菌筛选中关于放线菌的研究成果相对较少，现阶段仍缺乏有效防治小麦茎基腐病的拮抗菌。

发明内容

1、要解决的问题

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种溶藻链霉菌及其在小麦茎基腐病防治中的应用，它可以有效防治小麦茎基腐病。

2、技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种溶藻链霉菌，所述的溶藻链霉菌的拉丁学名为Streptomycesamritsarensis，其编号为WY3，2021年4月25日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2021455。

上述所述的溶藻链霉菌中，所述的溶藻链霉菌的最佳发酵条件为：采用LB培养基进行振荡培养，振荡培养速度为180r/min，培养温度为28℃，初始pH为8-9，发酵时间为3d。

一种如上述所述的溶藻链霉菌在小麦茎基腐病防治中的应用。

上述所述的溶藻链霉菌在小麦茎基腐病防治中的应用，所述小麦茎基腐病的病原菌为亚洲镰刀菌(F.asiaticum)。

上述所述的溶藻链霉菌在小麦茎基腐病防治中的应用，所述的溶藻链霉菌的剂型是药学上可接受的剂型。

上述所述的溶藻链霉菌在小麦茎基腐病防治中的应用，所述的溶藻链霉菌的剂型为菌悬液。

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明从小麦产区(安徽省安庆市)发病小麦根际的土壤中分离并筛选到一株亚洲镰孢菌的拮抗菌WY3，其抑制率为64.35％。研究WY3的广谱抑菌活性，结果表明链霉菌WY3对玉米穗腐病菌(Fusarium proliferatum)的抑菌率达55.38％；对烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)等多种病原菌的抑菌率均达60％以上。盆栽实验表明，WY3菌液浇灌的小麦，小麦株高显著增加，与对照组相比增加2.14cm。表明WY3对小麦幼苗的生长具有促进作用。将分别用WY3菌悬液与无菌水灌根的小麦幼苗，二叶期同时接种小麦茎基腐病菌病麦粒，防效达到60.87％。表明WY3对苗期小麦茎基腐病具有防护作用。

附图说明

图1为实施例1中菌株筛选及对峙培养图；图中：A：小麦根际土壤细菌分离，B：链霉菌WY3划线培养，C：链霉菌WY3与F.a对峙培养，D：链霉菌H103与F.a对峙培养；

图2为本发明中链霉菌WY3的进化树图。

图3为实施例2中链霉菌WY3与链霉菌H103的发酵液、无菌发酵液、菌悬液分别对小麦茎基腐病菌的生长影响图；

图4为实施例2中病原菌菌丝形态；图中：A：正常的小麦茎基腐病菌萌发形态，B：链霉菌WY3拮抗后的病原菌菌丝形态，C：链霉菌H103拮抗后的病原菌菌丝形态；

图5为实施例3中WY3对小麦幼苗生长影响的结果图；图中：CK：不接菌；WY3：接入链霉菌WY3；H103：接入链霉菌H103；

图6为实施例4中WY3对小麦茎基腐病盆栽防效研究的结果图；图中：空白：不接菌；F.a：接入茎基腐病菌；F.a+WY3：接入茎基腐病菌和链霉菌WY3；H103+F.a：接入茎基腐病菌和链霉菌H103；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

供试材料如下：

(1)菌种

供试小麦茎基腐病的病原菌(亚洲镰刀菌F.asiaticum)由安徽农业大学植物保护学院菌种库提供。

(2)主要试剂

琼脂、酵母提取物YEAST EXTRACT、胰蛋白胨TRYPTONE、氯化钠、葡萄糖、蔗糖、95％乙醇、冰醋酸、碳酸钙、氢氧化钠、盐酸、碳酸氢二钠、碳酸二氢钠、刚果红、明胶、碘化钾、磷酸氢二钾、无水对氨基苯磺酸、二苯胺、氢氧化钠戊二醛、丙酮、乙酸乙酯。

(3)培养基

玉米粉培养基、明胶液化培养基、硝酸盐液体培养基、高氏1号培养基、绿豆培养基、牛奶凝固胨化培养基、格里斯氏试剂A液、格里斯氏试剂B液、淀粉水解培养基、纤维素水解培养基、LB培养基、PDA培养基、柠檬酸盐培养基。

实施例1

小麦茎基腐病拮抗菌的筛选与鉴定

自小麦茎基腐病发病田块采集表层土壤(10cm-15cm处土壤)。过2mm不锈钢筛后，称取10g土壤样品，放入盛有90mL无菌水的三角瓶，200rpm震荡1h，制成土壤悬液。吸取1mL土壤悬液，采用灭菌水梯度稀释10¹-10⁷倍。随后，分别吸取各稀释度土悬液0.1mL，均匀涂布于LB和高氏一号固体培养基平板上，28℃恒温培养2d-3d。待菌落长出后，连续划线培养获得纯培养物，4℃保存。挑取放线菌接入高氏1号液体培养基中，置于28℃、180r/min的摇床中培养3d。

将活化好的F.a菌块，接种于PDA平板中心位置，置于22℃的培养箱中，培养1d后，在平板中心位置四周2.5cm放置四片无菌滤纸片(Φ＝6mm)，吸取5μL菌液至滤纸片上，空白对照放置滴加5μL无菌水的滤纸片，置于22℃培养箱中培养。待对照组菌丝接近满板时，测量菌落直径，每组试验重复3次，计算抑菌率。

小麦根系土壤放线菌对小麦茎基腐病菌的抑制率计算公式：

式中：A是指对照组病原菌菌落的直径；

B是指处理组病原菌菌落的直径；

实验分离筛选获得一株溶藻链霉菌菌株，编号WY3。对比菌株为淡紫灰链霉菌(Strepto myces lavendulae)，编号H103。经过平板对峙实验链霉菌WY3对小麦茎基腐病有明显拮抗作用，对小麦茎基腐病菌的抑制率达到64.35％，链霉菌H103抑制率仅29.35％，菌株筛选及对峙培养结果如图1。

结合图2来看，将链霉菌WY3的16S rDNA序列在NCBI数据库中进行Blast比对，与WY3菌株同源性较高的菌株均属于链霉菌属；用MEGA11软件构建***发育树，放线菌WY3与溶藻链霉菌(Streptomyces amritsarensis MH482895.1)在同一***进化分支上，相似度为99.86％。将链霉菌H103的16S rDNA序列在NCBI数据库中进行Blast比对，与H103菌株同源性较高的菌株均属于链霉菌属；放线菌H103与淡紫灰链霉菌相似度为99.50％。

实施例2

链霉菌WY3发酵液、无菌发酵液、菌悬液对小麦茎基腐病菌生长影响

挑取活化好的链霉菌WY3新鲜菌苔接入LB培养基中，28℃、180r/min的摇床中培养3d，随后将发酵液分装到离心管中，放入低温高速离心机(4℃、10000r/min)，取上清液弃沉淀。用无菌的细菌过滤器(Φ＝0.22μm)过滤，得到菌株WY3的无菌发酵液。

将无菌发酵液加入PDA培养基中，制成含10％发酵代谢产物平板。使用6mm内径的打孔器打取已活化的小麦茎基腐病菌边缘菌丝块，转接于PDA平板中心位置，以未加入无菌发酵液的平板为空白对照，置于22℃下恒温培养。待对照组菌丝铺满整个培养皿时，记录数据并计算抑菌率。

由实施例1可知，菌株WY3对小麦茎基腐病菌有较强的抑制作用。因此，使用接种针挑取平板抑菌圈边缘菌丝，置于载玻片上，盖上盖玻片，于显微镜下观察。如图4所示，对照组菌丝生长正常，表面平滑，形状均匀；WY3作用后菌丝膨大畸形，出现扭曲、和异常分枝的现象，H103作用后菌丝生长正常，表面微膨大。

结果表明，链霉菌WY3的上清液、无菌发酵液、菌悬液均对小麦茎基腐病有明显拮抗作用，其中发酵液抑制率达到84.55％，无菌发酵液抑制率达到68.65％，菌悬液抑制率达到82.56％；链霉菌H103发酵液抑制率仅27.5％，无菌发酵液抑制率6.62％，菌悬液抑制率仅24.61％。

表1 WY3发酵液、无菌发酵液、菌悬液对小麦茎基腐病菌平板抑制抑菌率

实施例3

WY3对小麦幼苗生长作用研究

挑取菌株WY3单菌落接种到LB培养基中，放于28℃、180r/min的摇床中培养3d。小麦消毒催芽后种植，待麦苗出芽0d、3d、7d，将WY3菌悬液浇灌于小麦的根部，对照组浇灌无菌水。

结果表明，WY3的菌液在小麦生长过程中对于小麦的幼苗生长有促生作用，浇灌菌液的小麦，单株小麦的株高比未处理的小麦平均长2.14cm，小麦单株根长平均增加1.49cm(如表2所示)。小麦在生长过程中，浇灌一定量的菌液，有一定的促生效果，植株比未浇灌菌液的小麦要粗壮，同等样品条件下，浇灌菌液的植株的分蘖更多，生长更旺盛(如图5所示)。H103无明显促生效果。

表2 链霉菌WY3对小麦幼苗生长影响

注：抑制率表示为平均值±标准误差，小写英文字母为组间差异在P＜0.05显著水平的显著性。

实施例4

WY3对小麦茎基腐病盆栽防效研究

种植小麦，待麦苗出芽0d、3d时，将WY3菌液浇灌于小麦的根部，对照组浇灌无菌水。提前制备病麦粒：种子消毒后，浸种12h，121℃湿热灭菌45min，然后接入5-6块亚洲镰孢菌菌块，25℃培养7d。将病麦粒接至二叶期的小麦茎基部，对照组不接种病菌。

结果表明：接种亚洲镰孢菌的小麦幼苗，矮化严重，茎基部发黑，平均病情指数为51.11，经WY3灌根处理的小麦幼苗平均病情指数仅为18.57，防效达到60.87％；经H103灌根处理的小麦幼苗无明显防效。

表3 WY3对F.a小麦茎基腐病的防治效果

以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

Claims

1.一种溶藻链霉菌，其特征在于：所述的溶藻链霉菌的拉丁学名为Streptomyces amritsarensis，其编号为WY3，2021年4月25日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2021455。

2.一种如权利要求1所述的溶藻链霉菌的发酵方法，其特征在于：采用LB培养基进行振荡培养，振荡培养速度为180r/min，培养温度为28℃，初始pH为8-9，发酵时间为3d。

3.一种如权利要求1所述的溶藻链霉菌在小麦茎基腐病防治中的应用，其特征在于：所述小麦茎基腐病的病原菌为亚洲镰刀菌（Fusarium asiaticum）。

4.根据权利要求3所述的溶藻链霉菌在小麦茎基腐病防治中的应用，其特征在于：所述的溶藻链霉菌的剂型是药学上可接受的剂型。

5.根据权利要求4所述的溶藻链霉菌在小麦茎基腐病防治中的应用，其特征在于：所述的溶藻链霉菌的剂型为菌悬液。