KR20220024060A - 질환 치료용 엑소좀 - Google Patents

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KR20220024060A
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로버트 제이. 하리리
샤오쿠이 장
치안 예
슈양 헤
헤일리 엠. 하리리
나브잣 샤
스리니바스 소만치
바바니 스타우트
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셀룰래리티 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 인간 대상체에게 엑소좀의 집단 또는 엑소좀의 집단을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 인간 대상체에서 질환, 장애 및 병태를 치료하는 방법을 제공하되, 상기 엑소좀의 집단은 CD1c, CD20, CD24, CD25, CD29, CD2, CD3, CD8, CD9, CD11c, CD14, CD19, CD31, CD40, CD41b, CD42a, CD44, CD45, CD49e, CD4, CD56, CD62P, CD63, CD69, CD81, CD86, CD105, CD133-1, CD142, CD146, CD209, CD326, HLA-ABC, HLA-DRDPDQ, MCSP, ROR1, SSEA-4 또는 이들의 조합물에 대해서 양성이다. 이러한 질환, 장애 및 병태는 폐, 간, 중추 신경계, 신장, 심혈관, 위장, 비장, 눈, 전신 및 노화 연관 질환, 장애 및 병태를 포함한다.

Description

질환 치료용 엑소좀
본 출원은 미국 가출원 제62/863,767호(출원일: 2019년 6월 19일); 제62/891,700호(출원일: 2019년 8월 26일); 제62/905,117호(2019년 9월 24일) 및 제62/924,147호(2019년 10월 21일)의 이익을 주장하며, 이들 기초출원은 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
기술분야
환자에서 질환 또는 병태를 치료하기 위해서 엑소좀을 사용하는 방법 및 이러한 치료에 특히 효과적인 특정 엑소좀 집단뿐만 아니라 상기 집단의 특징이 본 출원에 교시된다.
엑소좀은 세포-세포 소통에 중요한 역할을 하는 살아있는 세포로부터 분비되는 나노 크기의 이중-지질막 소포(nano-sized bi-lipid membrane vesicle)이다. 인간 임신 동안, 태반은 생리학적 항상성의 조절 및 태아 발달의 지지에 중요한 역할을 한다. 태반에 의해서 분비된 세포외 소포 및 엑소좀은 태반과 모체 조직 간의 소통에 기여하여 모체-태아 내성을 유지시킨다고 공지되어 있다. 엑소좀은 지질, 사이토카인, 마이크로RNA, mRNA 및 DNA, 뿐만 아니라, 엑소좀의 표면 상에 존재할 수 있는 단백질을 비롯한 활성 생물학적 물질을 함유한다. 엑소좀은 면역 조절, 혈관신생의 촉진 및 의약의 전달을 비롯한 다수의 치료적 접근법에 유용하다고 생각된다. 엑소좀의 다량의 단리를 가능하게 하는 보다 양호한 접근법에 대한 요구가 명백하다.
본 발명의 양상은 배양된 태반 또는 이의 일부로부터 엑소좀을 생산, 단리 및 특징규명하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상체에서 질환 또는 장애를 엑소좀의 집단; 특히 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산되거나 본 명세서에 기재된 특징을 갖는 엑소좀의 집단으로 치료하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 기재된 엑소좀은 특정 마커를 포함한다. 이러한 마커는 예를 들어, 엑소좀의 식별에 유용할 수 있고, 이들을 다른 엑소좀, 예를 들어, 태반으로부터 유래되지 않은 엑소좀과 구별하는데 유용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 엑소좀은 유세포 분석법, 예를 들어, 형광-활성화 세포 분류법(fluorescence-activated cell sorting: FACS)에 의해서 결정 가능한 바와 같은 하나 이상의 마커에 대해서 양성이다. 또한, 본 명세서에 제공된 엑소좀은 특정 마커의 부재를 기반으로 식별될 수 있다. 이러한 마커의 존재 또는 부재의 결정은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 형광-활성화 세포 분류법(FACS)을 사용하여 달성될 수 있다.
본 발명은 대상체에게 엑소좀의 집단 또는 엑소좀의 집단을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법을 제공하되, 상기 엑소좀의 집단은 CD1c, CD20, CD24, CD25, CD29, CD2, CD3, CD8, CD9, CD11c, CD14, CD19, CD31, CD40, CD41b, CD42a, CD44, CD45, CD49e, CD4, CD56, CD62P, CD63, CD69, CD81, CD86, CD105, CD133-1, CD142, CD146, CD209, CD326, HLA-ABC, HLA-DRDPDQ, MCSP, ROR1, SSEA-4 또는 이들의 조합물에 대해서 양성이다.
일부 실시형태에서, 상기 엑소좀의 집단은 CD1c, CD20, CD24, CD25, CD29, CD2, CD3, CD8, CD9, CD11c, CD14, CD19, CD31, CD40, CD41b, CD42a, CD44, CD45, CD49e, CD4, CD56, CD62P, CD63, CD69, CD81, CD86, CD105, CD133-1, CD142, CD146, CD209, CD326, HLA-ABC, HLA-DRDPDQ, MCSP, ROR1 및 SSEA-4에 대해서 양성이다. 일부 실시형태에서, 상기 엑소좀의 집단은 CD1c, CD20, CD24, CD25, CD29, CD2, CD3, CD8, CD9, CD11c, CD14, CD19, CD31, CD40, CD41b, CD42a, CD44, CD45, CD49e, CD4, CD56, CD62P, CD63, CD69, CD81, CD86, CD105, CD133-1, CD142, CD146, CD209, CD326, HLA-ABC, HLA-DRDPDQ, MCSP, ROR1 및 SSEA-4로 이루어진 군으로부터 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과의 마커에 대해서 양성이다.
일부 실시형태에서, 상기 엑소좀의 집단은 CD9, CD29, CD42a, CD62P, CD63, CD81, CD133-1, CD146, HLA-DRP 또는 이들의 조합물에 대해서 양성이다. 일부 실시형태에서, 상기 엑소좀의 집단은 CD9, CD29, CD42a, CD62P, CD63, CD81, CD133-1, CD146 및 HLA-DRP에 대해서 양성이다. 일부 실시형태에서, 상기 엑소좀의 집단은 CD9, CD29, CD42a, CD62P, CD63, CD81, CD133-1, CD146 및 HLA-DRP로 이루어진 군으로부터 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 또는 그 초과의 마커에 대해서 양성이다.
일부 실시형태에서, 상기 엑소좀의 집단은 CD3-, CD11b-, CD14-, CD19-, CD33-, CD192-, HLA-A-, HLA-B-, HLA-C-, HLA-DR-, CD11c- 또는 CD34-이다. 일부 실시형태에서, 상기 엑소좀의 집단은 CD3-, CD11b-, CD14-, CD19-, CD33-, CD192-, HLA-A-, HLA-B-, HLA-C-, HLA-DR-, CD11c- 및 CD34-이다.
일부 실시형태에서, 상기 엑소좀의 집단은 비-암호 RNA 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서 상기 비-암호 RNA 분자는 마이크로RNA이다. 일부 실시형태에서, 상기 마이크로RNA는 표 7의 마이크로RNA 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 마이크로RNA는 hsa-mir-26b, hsa-miR-26b-5p, hsa-mir-26a-2, hsa-mir-26a-1, hsa-miR-26a-5p, hsa-mir-30d, hsa-miR-30d-5p, hsa-mir-100, hsa-miR-100-5p, hsa-mir-21, hsa-miR-21-5p, hsa-mir-22, hsa-miR-22-3p, hsa-mir-99b, hsa-miR-99b-5p, hsa-mir-181a-2, hsa-mir-181a-1, hsa-miR-181a-5p 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 상기 엑소좀의 집단은 표 3 또는 표 11의 사이토카인 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 엑소좀의 집단은 표 4의 사이토카인 수용체 및 이들의 조합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 엑소좀의 집단은 표 6의 단백질 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 엑소좀의 집단은 세포질 아코니테이트 하이드라타제(aconitate hydratase), 세포 표면 당단백질 MUC18, 단백질 아르기닌 N-메틸트랜스퍼라제 1, 구아닌 뉴클레오타이드-결합 단백질 G(들) 소단위 알파, 쿨린(Cullin)-5, 칼슘-결합 단백질 39, 글루코시다제 2 소단위 베타, 클로라이드 세포내 채널 단백질 5, 세마포린-3B, 60S 리보솜 단백질 L22, 스플라이소솜(Spliceosome) RNA 헬리카제 DDX39B, 전사 활성화인자 단백질(Transcriptional activator protein) Pur-알파, 세포 예정사 단백질(Programmed cell death protein) 10, BRO1 도메인-함유 단백질 BROX, 카이뉴레닌--옥소글루타레이트 트랜스아미나제 3, 라미닌(Laminin) 소단위 알파-5, ATP-결합 카세트 서브-패밀리 E 구성원 1, 신탁신-결합 단백질 3, 프로테아솜 소단위 베타 타입-7 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 엑소좀의 집단은 엑소좀의 태반-유래 집단이다. 일부 실시형태에서, 상기 태반-유래 엑소좀 집단은 전체 태반 배양물의 배지로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 상기 태반-유래 엑소좀 집단은 태반엽(placental lobe) 또는 태반의 부분을 포함하는 배양물의 배지로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 상기 태반-유래 엑소좀 집단은 태반 줄기세포, 바람직하게는 태반-유래 부착 세포(PDAC)를 포함하는 배양물의 배지로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 배지는 조직 배양 배지, 식염수 용액 및 완충 식염수 용액으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 상기 엑소좀의 집단은 간충직 줄기세포, 제대혈 또는 태반 관류액으로부터 유래된 엑소좀의 집단보다 적어도 2배 더 높은 수준으로 적어도 1종의 마커 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 엑소좀의 집단은 간충직 줄기세포, 제대혈 또는 태반 관류액으로부터 유래된 엑소좀의 집단보다 적어도 2배 더 낮은 수준으로 적어도 1종의 마커 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 대상체에서 질환, 장애 또는 병태의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 제공된 엑소좀의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 대상체에서 질환, 장애 또는 병태의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 본 명세서에 제공된 엑소좀의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태는 폐 질환, 장애 또는 병태이다. 일부 실시형태에서, 폐 질환, 장애 또는 병태는 로 이루어진 군으로부터 선택된 급성 폐 손상, 급성 및 만성 질환, 천식, 만성 페쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease: COPD), 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 폐암 후 폐 수술의 회복, 폐 색전증, 급성 호흡 곤란 증후군, 폐렴, 바이러스 감염, 코로나바이러스 감염, Covid-19 및 인공호흡기 유도된 폐 손상이다.
일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태는 간 질환, 장애 또는 병태이다. 일부 실시형태에서, 간 질환, 장애 또는 병태는 급성 간 손상, 급성 및 만성 질환, 간 경변증, 간 섬유증, 간 염증, 대사 장애, 약물에 의해 유발된 간 손상, 독, 알코올, 바이러스(예를 들어, 간염) 또는 다른 감염 질환 및 담즙정체성 간 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태는 뇌/척수 질환, 장애 또는 병태이다. 일부 실시형태에서, 뇌/척수 질환, 장애 또는 병태는 급성 뇌/척수 손상, 급성 및 만성 질환, 뇌졸중, 일과성 허혈성 발작, 파킨슨 및 다른 운동 장애, 치매, 알츠하이머병 뇌전증/발작, 척수병증, 다발성 경화증, 중추 신경계의 감염, 척수 외상, 척수 염증, 근위축성 측삭 경화증, 척수성 근위축으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태는 신장 질환, 장애 또는 병태이다. 일부 실시형태에서, 신장 질환, 장애 또는 병태는 급성 신장 손상, 급성 및 만성 질환, 외상, 약물(예를 들어, 화학치료제)에 의해서 유도된 신장 손상 또는 신장 부상, 신장 낭종, 신장 결석 및 신장 감염, 신장 이식 후 신장 기능의 회복, 당뇨병성 신장 질환 및 다낭성 신장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태는 위장 질환, 장애 또는 병태이다. 일부 실시형태에서, 위장 질환, 장애 또는 병태는 급성 위장 손상, 자가면역 질환, 급성 및 만성 질환, 크론병, 과민성 대장 증후군, 항문주위 농양, 대장염, 대장 용종 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태는 골수 질환, 장애 또는 병태이다. 일부 실시형태에서, 골수 질환, 장애 또는 병태는 급성 및 만성 질환, 빈혈, 백혈구 감소증, 혈소판감소증 재생불량성 빈혈, 골수증식성 장애 및 줄기세포 이식으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태는 눈 질환, 장애 또는 병태이다. 일부 실시형태에서, 눈 질환, 장애 또는 병태는 급성 눈 손상, 만성 및 급성 눈 질환, 안구 건조 증후군 및 당뇨망막병증 및 황반변성으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태는 비장 질환, 장애 또는 병태이다. 일부 실시형태에서, 비장 질환, 장애 또는 병태는 급성 비장 손상, 만성 및 급성 비장 질환, 비장 기능이 비대하거나 조절되지 않는 것과 연관된 질환 및 루푸스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태는 피부 질환, 장애 또는 병태이다. 일부 실시형태에서, 피부 질환, 장애 또는 병태는 급성 피부 손상, 만성 및 급성 피부 질환, 당뇨병성 족부 궤양, 화학적 화상으로 인한 상처, 불 화상, 예를 들어, 상처로 인해 유발되는 피부 또는 조직 손상, 질환 또는 수술 절차, 탈모, 모낭 질환, 장애 또는 병태, 주름 및 감소된 탄력으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태는 허혈성 질환, 장애 또는 병태이다. 일부 실시형태에서, 허혈성 질환, 장애 또는 병태는 급성 허혈성 손상, 만성 및 급성 허혈성 질환, 허혈성 심장 질환, 허혈성 혈관 질환, 허혈성 대장염, 장간막 허혈, 뇌 허혈(예를 들어, 뇌졸중), 급성 또는 만성 하지 허혈, 피부 허혈, 허혈성 신장 및 혈관신생의 촉진을 필요로 하는 조직 또는 기관에서의 혈관신생의 촉진으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서 질환, 장애 또는 병태는 심장/심혈관 질환, 장애 또는 병태이다. 일부 실시형태에서, 심장/심혈관 질환, 장애 또는 병태는 급성 심장/심혈관 손상, 고혈압, 죽상경화증, 심근경색(myocardial infarction: MI) 및 만성 심부전으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서 질환, 장애 또는 병태는 노화 연관 질환, 장애 또는 병태이다. 일부 실시형태에서 노화 연관 질환, 장애 또는 병태는 노화 관련 허약, 노화 관련 당뇨병성 족부 궤양, 알츠하이머병; 노화 관련 황반변성, 노화 관련 난청, 노화 관련 기억력 저하, 노화 관련 인지력 감퇴, 노화 관련 치매, 노화 관련 핵성 백내장, 노화 연관된 기능 상실 및 노화의 다른 효과로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태는 전신 질환, 장애 또는 병태이다. 일부 실시형태에서, 전신 질환, 장애 또는 병태는 급성 및 만성 질환, 이식편대숙주병 및 감염(예를 들어, 귀 감염)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 조성물은 정맥내 투여를 위해서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 국지 주사를 위해서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 국소 투여를 위해서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 흡입을 위해서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 경구 투여를 위해서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 피하 투여를 위해서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 협측 또는 설하 투여를 위해서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 귀에 대한 투여를 위해서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 비내 투여를 위해서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 안구 투여를 위해서 제형화된다.
일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
특정 실시형태에서, 정제된 엑소좀은 이를 필요로 하는 대상체에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물로 제형화된다. 특정 실시형태에서, 상기 대상체는 인간이다. 본 명세서에 제공된 태반-유래 엑소좀-함유 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 국지적으로, 피하로 전신으로, 비경구로, 정맥내로, 근육내로, 국소로, 경구로, 피내로, 경피로 또는 비강내로 투여하도록 제형화될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 태반-유래 엑소좀-함유 약제학적 조성물은 국지적 투여를 위해서 제형화된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 태반-유래 엑소좀-함유 약제학적 조성물은 전신 피하 투여를 위해서 제형화된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 태반-유래 엑소좀-함유 약제학적 조성물은 비경구 투여를 위해서 제형화된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 태반-유래 엑소좀-함유 약제학적 조성물은 근육내 투여를 위해서 제형화된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 태반-유래 엑소좀-함유 약제학적 조성물은 국소 투여를 위해서 제형화된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 태반-유래 엑소좀-함유 약제학적 조성물은 경구 투여를 위해서 제형화된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 태반-유래 엑소좀-함유 약제학적 조성물은 피내 투여를 위해서 제형화된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 태반-유래 엑소좀-함유 약제학적 조성물은 경피 투여를 위해서 제형화된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 태반-유래 엑소좀-함유 약제학적 조성물은 비강내 투여를 위해서 제형화된다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 태반-유래 엑소좀-함유 약제학적 조성물은 정맥내 투여를 위해서 제형화된다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에는 엑소좀 및/또는 본 명세서에 기재된 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
구체적인 실시형태에서, 엑소좀 및/또는 본 명세서에 기재된 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 및/또는 병태를 치료 및/또는 예방하기 위해서 사용된다. 구체적인 실시형태에서, 엑소좀 및/또는 본 명세서에 기재된 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 혈관신생 및/또는 맥관신생을 촉진시키기 위해서 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 엑소좀 및/또는 본 명세서에 기재된 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 활성을 조절하기 위해서(예를 들어, 면역 반응을 증가시키기 위해서 또는 면역 반응을 감소시키기 위해서) 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 엑소좀 및/또는 본 명세서에 기재된 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 조직 손상, 예를 들어, 급성 또는 만성 상처에 의해서 유발된 조직 손상을 회복시키기 위해서 사용된다.
또 다른 실시형태에서, 유래된 엑소좀 및/또는 본 명세서에 기재된 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 및/또는 병태를 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 및/또는 병태를 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 및/또는 병태를 예방하기 위한 방법에 사용하기 위한 것이다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 혈관신생 및/또는 맥관신생을 촉진시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 활성을 조절하는(예를 들어, 면역 반응을 증가시키거나 면역 반응을 감소시키는) 방법에 사용하기 위한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 조직 손상, 예를 들어, 급성 또는 만성 상처에 의해서 유발된 조직 손상을 회복시키는 방법에 사용하기 위한 것이다.
또 다른 실시형태에서, 엑소좀 및/또는 본 명세서에 기재된 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물은 세포보호제(cytoprotective agent)로서 사용된다. 또 다른 양상에서, 엑소좀 및/또는 본 명세서에 기재된 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적 용도에 적합한 키트의 형태로 제공된다.
도 1은 엑소좀 단리를 위해서 세포를 배양하는 개략도를 도시한 도면.
도 2a 내지 도 2c는 NanoSight에 의해서 크기 분포에 대해서 분석된 3종의 pExo 단리물을 도시한 도면. 이러한 작업은 계약 서비스(www.systembio.com/services/exosome-services/)를 사용하여 에스비아이사(SBI Inc.)(시스템 바이오사이언스사(System Bioscience Inc.))에 의해서 수행 및 기록되었다.
도 3a 내지 도 3c는 MACSPlex 키트를 사용하여 태반 관류액 엑소좀(도 3b) 및 제대혈 혈청 유래 엑소좀(도 3c)과 비교하여 pExo(N=12)(도 3a) 상에 존재하는 단백질 마커를 도시한 도면.
도 4는 태반 엑소좀 집단에서 식별된 단백질의 기능성 경로를 도시한 도면.
도 5는 3개의 태반 엑소좀 샘플에서 식별된 공통적인 그리고 고유한 단백질을 도시한 도면.
도 6은 pExo가 트랜스웰 시스템에서 인간 피부 섬유모세포의 이동을 촉진시킨다는 것을 도시한 도면.
도 7은 pExo가 인간 탯줄 혈관 내피 세포의 이동을 촉진시킨다는 것을 도시한 도면.
도 8은 pExo가 HUVEC의 증식을 자극한다는 것을 도시한 도면.
도 9는 pExo가 인간 CD34+ 세포의 증식을 자극한다는 것을 도시한 도면.
도 10은 pExo가 인간 CD34+ 세포의 집락 형성을 자극한다는 것을 도시한 도면.
도 11은 pExo가 SKOV3 암 세포의 증식을 저해한다는 것을 도시한 도면.
도 12는 pExo가 A549 암 세포의 증식을 저해한다는 것을 도시한 도면.
도 13은 pExo가 MDA321 암 세포의 증식을 저해한다는 것을 도시한 도면.
도 14는 pExo가 배양물에서 CD3+ T 세포의 증식에 영향을 미치지 않는다는 것을 도시한 도면.
도 15는 pExo가 UBC T CD3+ 세포에서 활성화 마커 CD69의 발현을 증가시킨다는 것을 도시한 도면.
도 16은 pExo가 성체 PBMC T CD3+ 세포에서 활성화 마커 CD69의 발현을 증가시킨다는 것을 도시한 도면.
도 17은 pExo가 PBMC에서 CD56+ NK 세포를 증가시킨다는 것을 도시한 도면.
도 18은 MACSPlex Kit를 사용하여 pExo 상에 존재하는 단백질 마커(N=10)를 도시한 도면. 결과는, pExo가 CD2, CD4, CD8, CD14, CD24, CD29, CD31, CD40, CD42a, CD42b, CD44, CD45, CD49e, CD62P, CD63, CD69, CD81, CD86, CD105, CD133-1, CD142, CD146, CD326, HLA-ABC, HLA-DRDPDQ, MCSP, ROR1 및 SSEA4에 대해서 양성인 것을 비롯하여, pExo가 하기 단백질 마커에 대해서 양성이라는 것을 나타낸다.
도 19는 pExo가 인간 신장 상피 세포의 증식을 자극한다는 것을 도시한 도면.
도 20은 pExo가 인간 폐 상피 세포의 증식을 자극한다는 것을 도시한 도면.
도 21 상단 패널은 pExo가 인간 간 위성 세포(hepatic satellite cell)의 증식을 자극한다는 것을 도시한 도면. 하단 패널은 pExo가 아세트아미노펜(APAP)(2mM) 또는 APAP + pExo(10ug/㎖)에 의한 간 세포의 배지 단독 화학물질-유도 간 세포 손상에 비해서 세포 회복을 개선하고, xCELLigence Real Time Cell Analysis(RTCA)에서 15분마다 스윕 간격으로 데이터를 획득한 것을 나타낸다(N=3).
도 22 상단 패널은 pExo가 인간 피부 섬유 모세포의 증식을 자극한다는 것을 도시한 도면.
도 23은 생체내에서 pExo 생체분포의 연구 설계를 도시한 도면.
도 24는 pExo의 생체내 생체분포를 도시한 도면(전신 영상화).
도 25는 마우스에서 pExo의 지속성을 도시한 도면(전신 영상화).
도 26은 생체내에서 pExo의 생체분포를 도시한 도면(생체외 영상화).
도 27은 래트 뇌졸중 모델에 대한 pExo 효과의 연구 설계를 도시한 도면.
도 28 상단 패널은 pExo가 뇌졸중 유도 후 래트에서 전체 신경점수를 상당히 개선시켰다는 것을 도시한 도면. 하단 패널은, 비히클과 비교할 때 pExo-유도 신경학적 결손 감소는 유사한 뇌졸중 모델에서 MSC-유래 엑소좀보다 우수하고(좌측), pExo-유도 신경학적 결손 감소는 동일한 모델에서 과거 PDAC 데이터보다 우세하다는 것을 나타낸다(우측).
도 29는 pExo가 뇌졸중 유도 후 래트에서 보디 스윙을 상당히 개선시켰다는 것을 도시한 도면.
도 30은 pExo가 뇌졸중 유도 후 래트에서 앞다리 배치 점수를 상당히 개선시켰다는 것을 도시한 도면.
도 31은 pExo가 뇌졸중 유도 후 래트에서 보행 검사 점수를 상당히 개선시켰다는 것을 도시함 도면.
도 32는 pExo가 비히클 대조군에 비해서 병변 부피를 감소시켰다는 것을 도시한 도면.
도 33은 MSC-유래 Exo에 의한 병변 부피 감소가 유사한 뇌졸중 모델(문헌[Xin et al. 2013])에서 관찰되지 않았다는 것을 도시한 도면.
도 34는 pExo-유도 병변 부피 감소가 동일한 모델에서 과거 PDAC 데이터와 대등하다는 것을 도시한 도면.
도 35는 pExo가 뇌실하 구역(SVZ) 및 해마 둘 다에서 더블코르틴(doublecortin) 양성 세포를 상당히 증가시켰다는 것을 도시한 도면.
도 36은 pExo가 뇌실하 구역(SVZ) 및 해마 둘 다에서 더블코르틴(doublecortin) 양성 세포를 상당히 증가시켰다는 것을 도시한 도면.
도 37은 뒷다리 허혈(HLI)을 갖는 마우스에 대한 pExo의 효과의 연구 설계를 도시한 도면.
도 38은 pExo가 뒷다리 허혈(HLI) 손상을 갖는 마우스의 혈류를 개선시켰다는 것을 도시한 도면.
도 39는 pExo가 뒷다리 허혈(HLI) 손상을 갖는 마우스의 혈류를 개선시켰다는 것을 도시한 도면.
도 40은 pExo의 생체내 항노화 연구의 개요를 도시한 도면.
도 41은 pExo-처리군이 로타로드 연구에서 비히클 군보다 로타로드 시험에서 더 긴 낙하 대기 시간을 가졌음을 도시한 도면.
도 42는 pExo-처리군이 비히클 군보다 글루코스 투여 후 30분에 글루코스 감소가 더 빠르고, 글루코스 AUC가 더 낮음을 도시한 도면.
도 43은 pExo의 생체내 항-GVHD 연구의 개요를 도시한 도면.
도 44는 pExo의 단일 또는 다중 투여가 GvHD 모델에서 생존을 개선시켰다는 것을 도시한 도면.
도 45는 pExo의 단일 또는 다중 투여가 GvHD 모델에서 생존을 개선시켰다는 것을 도시한 도면.
도 46은 pExo의 다중 투여가 제4주에 CD3+ 인간 T 세포의 생착을 저해하였다는 것을 도시한 도면(주로 CD4+ T 세포에서).
도 47은 pExo의 다중 투여가 제4주에 CD3+ 인간 T 세포의 생착을 저해하였다는 것을 도시한 도면(주로 CD4+ T 세포에서).
도 48은 pExo가 다중 pExo 배양 방법에서 PBTEC 세포에서 증식을 증가시킨다는 것을 도시한 도면.
도 49는 pExo가 PBTEC 세포에서 용량 의존적 방식으로 증식을 증가시킨다는 것을 도시한 도면.
5.1. 태반-유래 엑소좀
본 명세서에 기재된 태반-유래 엑소좀은 하기에 기재된 바와 같이, 모폴로지 및/또는 분자 마커에 의해서 선택 및 식별될 수 있다. 본 명세서에 기재된 태반-유래 엑소좀은 당업계에 공지된 엑소좀, 예를 들어, 융모막 융모 간충직 줄기세포-유래 엑소좀, 예를 들어, 문헌[Salomon et al., 2013, PLOS ONE, 8:7, e68451]에 기재된 것과 구별된다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "태반-유래 엑소좀"은 융모막 융모 간충직 줄기세포로부터 획득되거나 유래된 엑소좀을 포함하는 의미가 아니다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 태반-유래 엑소좀의 집단은 세포, 예를 들어, 유핵 세포, 예를 들어, 태반 세포를 포함하지 않는다.
5.1.1. 태반-유래 엑소좀 마커
본 명세서에 기재된 태반-유래 엑소좀은 상기 엑소좀을 식별 및/또는 단리시키는 데 사용될 수 있는 마커를 함유한다. 이들 마커는 예를 들어, 단백질, 핵산, 당류 분자, 글리코실화된 단백질, 지질 분자일 수 있고, 단량체, 올리고머 및/또는 다량체 형태로 존재할 수 있다. 특정 실시형태에서, 마커는 엑소좀이 유래된 세포에 의해서 생산된다. 특정 실시형태에서, 마커는 엑소좀이 유래된 세포에 의해서 생산되지만, 마커는 상기 세포에 의해서 더 높은 수준으로 발현되지 않는다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀의 마커는 대조군 마커 분자와 비교할 때 기원 세포에 비해서 엑소좀에서 더 높다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀의 마커는 또 다른 세포 유형(예를 들어, 문헌[Salomon et al., 2013, PLOS ONE, 8:7, e68451]에 기재된 융모막 융모 간충직 줄기세포 및 지방전구세포(pre-adipocyte) 간충직 줄기세포)으로부터 획득된 엑소좀과 비교할 때 상기 엑소좀에 풍부하고, 여기서 엑소좀은 동일한 방법을 통해서 단리된다.
엑소좀의 3차원 구조는 엑소좀의 표면 상에서 마커의 보유를 허용하고/하거나 엑소좀 내에 함유되도록 한다. 유사하게, 마커 분자는 부분적으로 엑소좀 내에, 부분적으로 엑소좀의 외면 상에 그리고/또는 엑소좀의 인지질 이중층을 통해서 존재할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀과 회합되는 마커는 단백질이다. 특정 실시형태에서, 마커는 엑소좀 인지질 이중층 내에 앵커링되거나 또는 엑소좀 인지질 이중층을 통과하여 앵커링된 막관통 단백질(이로 인해서 단백질 분자의 부분이 엑소좀 내에 존재하는 반면, 동일한 분자의 일부는 엑소좀의 외면에 노출됨)이다. 특정 실시형태에서, 마커는 엑소좀 내에 전체가 함유된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀과 회합되는 마커는 핵산이다. 특정 실시형태에서, 상기 핵산은 비-암호 RNA 분자, 예를 들어, 마이크로-RNA(miRNA)이다.
5.1.1.1. 표면 마커
본 명세서에 기재된 엑소좀은 식별이 가능하고, 기원 세포 및 다른 세포 및 비세포 물질이 없는 세포 엑소좀의 실질적으로 순수한 집단을 단리/획득하는데 사용될 수 있는 표면 마커를 포함한다. 엑소좀 표면 마커 조성을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 엑소좀 표면 마커는 형광-활성화 세포 분류법(FACS) 또는 웨스턴 블로팅에 의해서 검출될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 예를 들어, FACS에 의해서 결정 가능한 바와 같이, 당업계에 공지된 엑소좀보다 더 많은 양의 표면 마커를 포함한다.
5.1.1.2. 수율
본 명세서에 기재된 엑소좀은 본 명세서에 기재된 방법에 따라서 단리될 수 있고, 이의 수율은 정량될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 배양 배지(예를 들어, 혈청이 있거나 없는 배양 배지) 1리터당 약 0.5 내지 5.0㎎의 농도로 단리된다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 배양 배지(예를 들어, 혈청을 함유하는 배양 배지) 1리터당 약 2 내지 3㎎의 농도로 단리된다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 배양 배지(예를 들어, 혈청이 결핍된 배양 배지) 1리터당 약 0.5 내지 1.5㎎의 농도로 단리된다.
5.1.2. 저장 및 보존
본 명세서에 기재된 엑소좀은 장기간 저장이 가능한 조건 또는 엑소좀의 분해를 저해하는 조건 하에서 보존, 즉 배치될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 적절한 온도에서 완충제를 포함하는 조성물 중에 상기에 기재된 방법에 따라서 수집 후에 저장될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 예를 들어, 약 -20℃ 또는 약 -80℃에서 동결 저장된다.
5.특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 예를 들어, 작은 용기, 예를 들어, 앰플(예를 들어, 2㎖ 바이알) 내에 저온보존될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 10㎎/㎖의 농도로 저온보존될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 약 -80℃ 내지 약 -180℃의 온도에서 저온보존될 수 있다. 저온보존된 엑소좀은 사용을 위한 해동 이전에 액체 질소로 옮겨질 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 앰플이 약 -90℃에 도달되면, 그것은 액체 질소 저장 영역으로 옮겨질 수 있다. 저온보존은 또한 제어형 냉동 장치(controlled-rate freezer)를 사용하여 수행될 수 있다. 저온보존된 엑소좀은 사용 전에 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도에서 해동될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 짧은 시간 기간(예를 들어, 2주 미만) 동안 약 4℃ 내지 약 20℃의 온도에서 저장된다.
5.2. 조성물
추가로 본 명세서에는 명세서에 제공된 엑소좀을 포함하는 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물이 제공된다. 본 명세서에 기재된 조성물은 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에서 특정 질환 및 장애의 치료에 유용하며, 여기서 엑소좀으로의 치료가 이롭다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 엑소좀을 포함하는 것에 더하여, 본 명세서에 기재된 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 동물, 및 보다 특별하게는 인간에서 사용하기 위해서 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식되는 약전에 열거되거나 또는 연방 또는 주 정보의 규제 기관에 의해서 승인된 것을 의미한다. 용어 "담체"는, 본 명세서에 사용된 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 담체와 관련하여, 약제학적 조성물과 함께 투여되는 희석제, 아주반트, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 특히 주사 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탤크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 적합한 약제학적 담체의 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by JP Remington and AR Gennaro, 1990, 18th Edition]에 기재되어 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 1종 이상의 완충제, 예를 들어, 염수, 인산염 완충 염수(PBS), 둘베코(Dulbecco's) PBS(DPBS) 및/또는 수크로스 인산염 글루타메이트 완충제를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 완충제를 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 플라스마라이트(plasmalyte)를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 1종 이상의 염, 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼슘, 인산나트륨, 모노소듐 글루타메이트 및 알루미늄염(예를 들어, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 백반(포타슘 알루미늄 설페이트) 또는 이러한 알루미늄염의 혼합물)을 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 염을 포함하지 않는다.
본 명세서에 기재된 조성물은 투여를 위한 지시서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물은 사용 전에 저장될 수 있고, 예를 들어, 조성물은 동결 저장될 수 있거나(예를 들어, 약 -20℃ 또는 약 -80℃에서); 냉장 조건(예를 들어, 약 4℃에서)에 저장될 수 있거나; 또는 실온에 저장될 수 있다.
5.2.1. 제형 및 투여 경로
질환 또는 병태의 치료 및/또는 예방에서의 치료적 사용에 효과적일 본 명세서에 기재된 엑소좀 또는 조성물의 양은 질환의 특징에 좌우될 것이고, 표준 임상 기술에 의해서 결정될 수 있다. 대상체에 투여될 엑소좀 또는 이의 조성물의 정확한 투여량은 또한 투여 경로 및 치료될 질환 또는 병태의 심각성에 좌우될 것이고, 의사의 판단 및 각각의 대상체의 상황에 따라서 결정되어야 한다. 예를 들어, 유효 투여량은 투여 수단, 목표 부위, 환자의 생리학적 상태(연령, 체중 및 건강 포함), 환자가 인간인지 동물인지의 여부, 투여되는 다른 의약 및 치료가 예방적인지 치료적인지의 여부에 따라서 달라질 수 있다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해서 안전성 및 효능을 최적화하기 위해서 최적으로 적정된다.
엑소좀, 예를 들어, pExo의 제형은 임의의 편리한 형태, 예컨대, 액체, 페이스트 또는 현탁액으로 약제학 또는 화장품 용도를 위해서 제조될 수 있다. 이것은 비경구(예를 들어, 피하, 근육내, 피부내, 정맥내 또는 직접 국지 주사), 경구, 흡입(고체 또는 액체 형태 또는 네불라이저에 의한 투여에 적합한 형태), 직장, 국소, 협측(예를 들어, 설하), 점안액, 이어드롭(eardrop), 공동 헹굼액(cavity rinse)(예를 들어, 구강 헹굼액) 및 경피 투여에 적합한 것을 비롯한 주어진 적응증을 위해서 임의의 필요한 또는 편리한 투여 경로를 위해서 제형화될 수 있다.
대상체 실험이 태반 유래 엑소좀을 사용하여 수행되었지만, 본 출원인은 다중 기관 시스템에 대한 정맥내 엑소좀 전달의 효과적인 전달을 입증하였다. 따라서, 다른 공급원으로부터의 엑소좀이 상기 병태의 치료를 위해 교시되고 고려되는 바와 같이 이들 기관 시스템에 용이하게 전달될 수 있다.
본 명세서에 기재된 엑소좀 또는 이의 조성물의 투여는 당업계에 공지된 다양한 경로를 통해서 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 또는 이의 조성물은 국지적, 전신, 피하, 비경구, 정맥내, 근육내, 국소, 경구, 피내, 경피 또는 비강내 투여에 의해서 투여된다. 구체적인 실시형태에서, 상기 투여는 정맥내 주사를 통한 것이다. 구체적인 실시형태에서, 상기 투여는 피하 주사를 통한 것이다. 구체적인 실시형태에서, 상기 투여는 국소이다. 또 다른 실시형태에서, 엑소좀 또는 이의 조성물은 세포외 매트릭스를 포함하는 제형으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 엑소좀 또는 이의 조성물은 하나 이상의 추가 전달 장치, 예를 들어, 스텐트와 조합하여 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 엑소좀 또는 이의 조성물은 국지적으로, 예를 들어, 상기 엑소좀 또는 조성물, 예컨대, 저산소 조직(예를 들어, 허혈성 질환) 또는 전이 림프절(draining lymph node)로 치료될 면적 부위 또는 그 주변에 투여된다.
5.3. 사용 방법
5.3.1. 혈관신생이 이로운 질환의 치료
본 명세서에 기재된 엑소좀 및 이의 조성물은 혈관신생을 촉진시키고, 따라서 혈관신생이 이로운 질환 및 장애의 치료를 위해서 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에는 본 명세서에 기재된 엑소좀 또는 이의 조성물을 사용하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 혈관신생을 촉진시키는 방법이 제공된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다"는 대상체에서 질환, 장애 또는 병태 또는 이의 임의의 파라미터 또는 증상의 치유, 복원, 개선, 이의 중증도의 경감, 또는 이의 시간 기간의 감소를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공되는 방법에 따라서 치료되는 대상체는 포유동물, 예를 들어, 인간이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에는 대상체에서 맥관신생 또는 혈관신생을 유도하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체에게 본 명세서에 제공된 엑소좀 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 따라서, 본 명세서에 제공된 방법은 혈관신생/맥관신생이 이로운 대상체에서 질환 및 장애를 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 증가된 혈관신생이 이롭고, 따라서 본 명세서에 기재된 엑소좀 및 조성물로 치료될 수 있는 이러한 질환/병태의 예는 비제한적으로 심근 경색증, 울혈성 심부전, 말초 동맥 질환, 중증 하지 허혈, 말초 혈관 질환, 형성저하성 좌심 증후군(hypoplastic left heart syndrome), 당뇨족궤양, 정맥성 궤양 또는 동맥성 궤양을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에는 예를 들어, 말초 맥관 구조에서 말초 혈류의 파괴를 갖는 대상체의 치료 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체에게 본 명세서에 제공된 엑소좀 또는 이의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 허혈을 갖는 대상체를 본 명세서에 제공된 엑소좀 또는 이의 조성물로 처리하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 허혈은 말초 동맥 질환(peripheral arterial disease: PAD)이고, 예를 들어, 중증 하지 허혈(critical limb ischemia: CLI)이다. 특정 다른 실시형태에서, 허혈은 말초 혈관 질환(peripheral vascular disease: PVD), 말초 동맥 질환, 허혈성 혈관 질환, 허혈성 심장 질환 또는 허혈성 신장 질환이다.
5.3.2. 환자 집단
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 본 명세서에 기재된 질환 또는 병태 중 임의의 것에 대한 요법을 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 본 명세서에 기재된 질환 또는 병태 중 임의의 것에 대한 요법을 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 특정 실시형태에서 상기 대상체는 인간이다.
구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 또는 조성물은 혈관신생 및/또는 맥관신생을 증가시키기 위한 요법을 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간)에게 투여된다.
5.4. 키트
본 명세서에는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물, 즉, 본 명세서에 기재된 엑소좀을 포함하는 조성물의 성분 중 하나 이상이 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트가 제공된다. 선택적으로 이러한 용기(들)과 연관된 것은 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해서 규정된 형태의 통지일 수 있고, 이러한 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영한다.
본 명세서에 기재된 키트는 상기 방법으로 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물은 개체에게 쉽게 투여 가능한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 의학적 용도에 적합한 용기 내에 함유될 수 있다. 이러한 용기는 예를 들어, 멸균 플라스틱 백, 플라스크, 자(jar) 또는 조성물이 쉽게 분배될 수 있는 다른 용기일 수 있다. 예를 들어, 용기는 수용자에게 액체를 정맥내 투여하기에 적합한 혈액 백 또는 다른 플라스틱, 의료용으로 허용 가능한 백일 수 있다.
예시적인 태반 배양물
태반은 줄기세포, 예컨대, 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell: HSC) 및 비-조혈 줄기세포를 비롯한 세포의 저장소이다. 본 명세서에는 생물반응기에서 배양된 태반 또는 이의 일부로부터 엑소좀을 단리시키는 방법이 기재된다. 엑소좀은 배양 동안 세포에 의해서 분비되고, 엑소좀은 엑소좀의 추가 가공 및 단리를 용이하게 하는 배지 중에 분비된다. 엑소좀은 또한 상이한 배양 단계에서(예를 들어, 각각의 회수 단계에 사용될 수 있는 상이한 관류액 및 상이한 시간 지점에서) 태반 또는 이의 일부로부터 단리될 수 있다. 배지 중에서, 엑소좀은 예를 들어, 원심분리, 상업적으로 입수 가능한 엑소좀 단리 키트, 렉틴 친화성 및/또는 친화도 크로마토그래피를 사용하여(예를 들어, 고정된 결합제, 예컨대, 작은 Rab 패밀리 GTPase, 아넥신, 플로틸린(flotillin), Alix, Tsg101, ESCRT 복합체, CD9, CD37, CD53, CD63, CD63A, CD81, CD82), Hsp70, Hsp90, 상피 세포 접착 분자(EpCam), 퍼포린, TRAIL, 그랜자임 B, Fas, 하나 이상의 암 마커, 예컨대: Fas 리간드, CD24, EpCAM, EDIL3, 피브로넥틴, 서바이빈, PCA3, TMPRSS2:ERG, Glypican-1, TGF-β1, MAGE 3/6, EGFR, EGFRvIII, CD9, CD147, CA-125, EpCam, 및/또는 CD24 또는 하나 이상의 염증성 또는 병원성 마커, 예컨대: 바이러스, 진균 또는 박테리아 단백질 또는 펩타이드, 예컨대, 비제한적으로 α-시누클레인(synuclein), HIV 또는 HCV 단백질, tau, 베타-아밀로이드, TGF-베타, TNF-알파, 페투인(fetuin)-A, 및/또는 CD133에 대해서 특이적인 기질에 부착된 결합제를 사용하여) 추가로 단리될 수 있다. 단리된 엑소좀은 치료제, 진단제를 위해서 그리고 생명공학 도구로서 사용될 수 있다.
"엑소좀"은 본 명세서에 기재된 바와 같이 복수 유체, 혈액, 소변, 혈청 및 모유를 비롯한 다수의 아마도 모든 진핵생물 유체에 존재하는 소포이다. 이것은 또한 세포외 소포로서 지칭될 수 있다. 엑소좀은 세포-세포 소통에 중요한 역할을 하는 살아있는 세포로부터 분비되는 이중-지질막 소포이다. 엑소좀은 세포, 예컨대, 줄기세포, 상피 세포 및 매트릭스-결합된 나노소포(Matrix-bound nanovesicle: MBV)로서 정의된 바와 같은 엑소좀의 하위유형에 의해서 생산되며, 세포외 매트릭스(ECM) 바이오스캐폴드(비-유체)에 존재한다고 보고되어 있다. 엑소좀의 보고된 직경은 30 내지 100㎚이고, 이것은 저밀도 지질단백질(LDL)보다 더 크지만, 예를 들어, 적혈구보다 훨씬 더 작다. 엑소좀은 다소포체가 혈장과 융합할 때 세포로부터 방출될 수 있거나 혈장막으로부터 직접 방출될 수 있다.
엑소좀은 특별한 기능을 갖고, 응집, 세포간 신호전달 및 폐기물 관리와 같은 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다. 태반에 의해서 분비된 세포외 소포 및 엑소좀은 태반과 모체 조직 간의 소통에 기여하여 모체-태아 내성을 유지시킨다고 공지되어 있다. 인간 태반 외식편(explant)으로부터 단리된 엑소좀은 면역 조절 활성을 갖는다고 밝혀져 있다. 줄기세포 유래 엑소좀은 또한 별아교세포 및 미세아교세포의 활성화를 억제함으로써 신경염증을 감소시키고, 가능하게는 신경틈(neurogenic niche)을 표적으로 함으로써 신경발생을 촉진시키는 것으로 밝혀져 있으며, 이들 둘 모두는 TBI 이후에 신경 조직 수선 및 기능성 회복에 기여한다. (문헌[Yang et al. 2017, Frontiers in Cellular Neuroscience]의 리뷰). 인간 배아 간충직 줄기세포로부터 유래된 엑소좀은 또한 골연골 재생을 촉진시킨다(문헌[Zhang et al. 2016, Osteoarthritis and Cartilage]). 기능성 Fas 리간드 및 Trail 분자를 보유한 인간 태반에 의해서 분비된 엑소좀은 활성화된 면역 세포에서 아포토시스를 전달한다고 밝혀져 있는데, 이는 태아의 엑소좀-매개된 면역 특권을 시사한다(문헌[Ann-Christin Stenqvist et al., Journal of Immunology, 2013, 191: doi:10.4049]).
엑소좀은 지질, 사이토카인, 마이크로RNA, mRNA 및 DNA를 비롯한 활성 생물학적 물질을 함유한다. 이들은 또한 유전 물질 및/또는 단백질 전달을 통해서 세포간 통신의 매개인자로서 기능할 수 있다. 엑소좀은 또한 세포 기능 또는 생리학적 상태를 반영할 수 있는 세포-유형 특이적 정보를 함유할 수 있다. 결론적으로, 임상적 및 생물학적 응용의 개발에서 엑소좀에 대한 관심이 증가하고 있다.
따라서, (예를 들어, 엑소좀 상의 하나 이상의 단백질 또는 마커의 존재 또는 부재를 식별함으로써) 선택적으로 상기 엑소좀의 특징규명을 비롯하여, 본 명세서에 기재된 접근법을 사용하여 인간 태반 또는 이의 일부로부터 단리된 엑소좀은 면역 조절, 항-섬유증 환경 및/또는 프로-재생 효과(pro-regenerative effect)를 자극하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 접근법을 사용하여 인간 태반 또는 이의 일부로부터 단리된 엑소좀은 (예를 들어, 엑소좀 상에 존재하거나 존재하지 않은 마커에 따라서) 치료 제품 및/또는 생명공학 도구로서 선택되고/되거나 정제되고/되거나 동결되고/되거나 동결건조되고/되거나 포장되고/되거나 분포될 수 있다.
일부 대안에서, 종양 마커 또는 펩타이드, 병원성 마커 또는 펩타이드, 예컨대, 바이러스, 진균 또는 박테리아 마커 또는 펩타이드 및/또는 염증성 마커, 예컨대, 염증성 펩타이드를 갖는 엑소좀을 식별하여, 이러한 엑소좀이 엑소좀의 집단으로부터 제거(예를 들어, 이러한 종양 마커 또는 펩타이드, 병원성 마커 또는 펩타이드 및/또는 염증성 마커 또는 펩타이드에 대해서 특이적인 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 결합 부분을 사용한 친화도 크로마토그래피에 의한 제거)될 수 있는 것이 이로울 수 있다. 따라서, 일부 대안에서, 예를 들어, 엑소좀의 제1 집단은 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 인간 태반 또는 이의 일부로부터 단리되고, 엑소좀의 제1 집단이 단리되면, 이러한 엑소좀의 집단은 고정된 항체 또는 이의 결합 부분을 갖는 기질(예를 들어, 상기 고정된 항체 또는 이의 결합 부분을 갖는 막, 수지, 비드 또는 용기)을 사용하여 하나 이상의 엑소좀의 하위집단을 제거하기 위해서 추가로 가공되며, 여기서 고정된 항체 또는 이의 결합 부분은 추가 단리를 위해서 선택된, 엑소좀의 하위집단 상에 존재하는 마커 또는 펩타이드, 예컨대, 하나 이상의 종양 마커 또는 펩타이드, 병원성 마커 또는 펩타이드, 예를 들어, 바이러스, 진균 또는 박테리아 마커 또는 펩타이드 및/또는 염증성 마커 또는 염증성 펩타이드에 대해서 특이적이다. 일부 대안에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 인간 태반 또는 이의 일부로부터 단리된 엑소좀의 제1 집단은 고정된 항체 또는 이의 결합 부분을 갖는 기질(예를 들어, 상기 고정된 항체 또는 이의 결합 부분을 갖는 막, 수지, 비드 또는 용기)과 접촉되며, 여기서 고정된 항체 또는 이의 결합 부분은 고정된 항체 또는 이의 결합 부분에 대한 친화도를 기초로 엑소좀의 제1 집단으로부터 엑소좀의 제2 집단을 단리시키도록 하나 이상의 암 마커, 예컨대: Fas 리간드, CD24, EpCAM, EDIL3, 피브로넥틴, 서바이빈, PCA3, TMPRSS2:ERG, Glypican-1, TGF-β1, MAGE 3/6, EGFR, EGFRvIII, CD9, CD147, CA-125, EpCam 및/또는 CD24에 대해서 특이적이다. 일부 대안에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 인간 태반 또는 이의 일부로부터 단리된 엑소좀의 제1 집단은 고정된 항체 또는 이의 결합 부분을 갖는 기질(예를 들어, 상기 고정된 항체 또는 이의 결합 부분을 갖는 막, 수지, 비드 또는 용기)과 접촉되며, 여기서 고정된 항체 또는 이의 결합 부분은 고정된 항체 또는 이의 결합 부분에 대한 친화도를 기초로 엑소좀의 제1 집단으로부터 엑소좀의 제2 집단을 단리시키도록 하나 이상의 염증성 또는 병원성 마커, 예컨대: 바이러스, 진균 또는 박테리아 단백질 또는 펩타이드, 예컨대, 비제한적으로 α-시누클레인, HIV 또는 HCV 단백질, tau, 베타-아밀로이드, TGF-베타, TNF-알파, 페투인-A 및/또는 CD133 또는 이의 부분에 대해서 특이적이다.
일부 대안에서, 본 명세서에 기재된 접근법에 의해서 단리 및/또는 선택된 엑소좀의 집단은 치료제에 유용한 마커 또는 펩타이드, 예컨대, 시험관내 및 생체내 둘 다에서 항종양 활성을 매개하는 것으로 밝혀진 퍼포린 및/또는 그랜자임 B(J Cancer 2016; 7(9):1081-1087) 또는 표적 암 세포에 대해서 세포독성 활성을 발휘하는 엑소좀에서 발견된 Fas를 갖는다(문헌[Theranostics 2017; 7(10):2732-2745]). 따라서, 일부 대안에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 인간 태반 또는 이의 일부로부터 단리된 엑소좀의 제1 집단은 고정된 항체 또는 이의 결합 부분을 갖는 기질(예를 들어, 상기 고정된 항체 또는 이의 결합 부분을 갖는 막, 수지, 비드 또는 용기)과 접촉되며, 여기서 고정된 항체 또는 이의 결합 부분은 퍼포린, TRAIL 및/또는 그랜자임 B 및/또는 Fas에 대해서 특이적이고, 엑소좀의 제1 집단으로부터의 엑소좀의 제2 집단은 퍼포린, TRAIL 및/또는 그랜자임 B 및/또는 Fas에 대한 고정된 항체 또는 이의 결합 부분에 대한 친화도를 기초로 단리된다. 일부 대안에서, CD63 RNA 및/또는 목적하는 마이크로RNA를 포함하는 엑소좀의 집단이 단리된다. 일부 대안에서, 엑소좀의 집단은 친화도 크로마토그래피 또는 면역학적 기술을 사용하여 단리되고/되거나 단리 후에 특징규명되며, 여기서 상기 엑소좀의 집단은 마커 또는 펩타이드, 예컨대, 작은 Rab 패밀리 GTPase, 아넥신, 플로틸린, Alix, Tsg101, ESCRT 복합체, CD9, CD37, CD53, CD63, CD63A, CD81, CD82), Hsp70, Hsp90) 및/또는 상피 세포 접착 분자(EpCam)를 포함한다. 상술된 바와 같이, 일부 대안에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 인간 태반 또는 이의 일부로부터 단리된 엑소좀의 제1 집단은 고정된 항체 또는 이의 결합 부분을 갖는 기질(예를 들어, 상기 고정된 항체 또는 이의 결합 부분을 갖는 막, 수지, 비드 또는 용기)과 접촉되며, 여기서 고정된 항체 또는 이의 결합 부분은 작은 Rab 패밀리 GTPase, 아넥신, 플로틸린, Alix, Tsg101, ESCRT 복합체, CD9, CD37, CD53, CD63, CD63A, CD81, CD82), Hsp70, Hsp90) 및/또는 상피 세포 접착 분자(EpCam)에 대해서 특이적이고, 엑소좀의 제1 집단으로부터의 엑소좀의 제2 집단은 작은 Rab 패밀리 GTPase, 아넥신, 플로틸린, Alix, Tsg101, ESCRT 복합체, CD9, CD37, CD53, CD63, CD63A, CD81, CD82), Hsp70, Hsp90) 및/또는 상피 세포 접착 분자(EpCam)에 대한 고정된 항체 또는 이의 결합 부분에 대한 친화도를 기초로 단리된다. 다른 대안에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 인간 태반 또는 이의 일부로부터 단리된 엑소좀의 집단은 작은 Rab 패밀리 GTPase, 아넥신, 플로틸린, Alix, Tsg101, ESCRT 복합체, CD9, CD37, CD53, CD63, CD63A, CD81, CD82, Hsp70, Hsp90 및/또는 상피 세포 접착 분자(EpCam) 중 하나 이상에 대해서 특이적인 항체 또는 이의 결합 부분과 접촉되고, 항체 또는 이의 결합 부분의 결합은 단리된 엑소좀 집단 내의 작은 Rab 패밀리 GTPase, 아넥신, 플로틸린, Alix, Tsg101, ESCRT 복합체, CD9, CD37, CD53, CD63, CD63A, CD81, CD82), Hsp70, Hsp90 및/또는 상피 세포 접착 분자(EpCam)의 존재를 확인하도록 (예를 들어, ELISA 또는 블로팅 절차를 사용하여) 상기 항체 또는 이의 결합 부분에 결합하는 검출 가능한 시약을 갖는 2차 결합제로 검출된다.
"단리"는 본 명세서에 기재된 바와 같이 다른 물질로부터 엑소좀을 분리하기 위한 방법이다. 엑소좀의 단리는 원심분리에서의 고원심분리력에 의해서, 상업적으로 입수 가능한 키트(예를 들어, SeraMir 엑소좀 RNA 정제 키트(에스비아이 시스템 바이오사이언시스사(SBI system biosciences)), 무손상 엑소좀 정제 및 RNA 단리(Intact Exosome Purification and RNA Isolation)(콤비네이션키트(CombinationKit))(노르겐 바이오테크사(Norgen BioTek Corp.))에 의해서 그리고 렉틴 친화성 또는 엑소좀 상의 마커 또는 펩타이드, 예컨대, 상기에 언급된 마커 또는 펩타이드에 대해서 특이적인 결합제(예를 들어, 항체 또는 이의 결합 부분)(예를 들어, 작은 Rab 패밀리 GTPase, 아넥신, 플로틸린, Alix, Tsg101, ESCRT 복합체, CD9, CD37, CD53, CD63, CD63A, CD81, CD82), Hsp70, Hsp90, 상피 세포 접착 분자(EpCam), 퍼포린, TRAIL, 그랜자임 B, Fas, 하나 이상의 암 마커, 예컨대: Fas 리간드, CD24, EpCAM, EDIL3, 피브로넥틴, 서바이빈, PCA3, TMPRSS2:ERG, Glypican-1, TGF-β1, MAGE 3/6, EGFR, EGFRvIII, CD9, CD147, CA-125, EpCam, 및/또는 CD24 또는 하나 이상의 염증성 또는 병원성 마커, 예컨대: 바이러스, 진균 또는 박테리아 단백질 또는 펩타이드, 예컨대, 비제한적으로 α-시누클레인, HIV 또는 HCV 단백질, tau, 베타-아밀로이드, TGF-베타, TNF-알파, 페투인-A, 및/또는 CD133에 대해서 특이적인 결합제)를 사용한 친화도 크로마토그래피의 사용에 의해서 수행될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 "태반"은 탯줄을 통해서 태아에게 영양을 곱급하고, 태아를 유지시키는 임신한 진수류 포유동물의 자궁 내의 기관이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 태반은 엑소좀을 획득하기 위한 생물반응기로서 사용될 수 있다. 일부 대안에서, 탈세포화 태반이 스캐폴드 및 생물반응기로서 사용될 수 있는데, 이것은 세포 특이적인 상기 세포로부터의 엑소좀의 집단을 획득하도록 외인성 세포 집단(예를 들어, 탈세포화 태반 상에서 시딩되고, 이와 함께 배양된 세포 집단)을 보유한다. 따라서, 일부 대안에서, 재생 세포 집단(예를 들어, 줄기세포 및/또는 내피 세포 및/또는 전구 세포를 포함하는 세포의 집단)을 탈세포화된 태반에 시딩하고, 생물반응기 내의 상기 탈세포화된 태반 상에서 상기 재생 세포 집단을 배양하고, 원심분리, 상업적으로 입수 가능한 엑소좀 단리 키트, 렉틴 친화성 및/또는 엑소좀 상의 마커 또는 펩타이드, 예컨대, 상기에 언급된 마커 또는 펩타이드에 대해서 특이적인 결합제(예를 들어, 항체 또는 이의 결합 부분)(예를 들어, 작은 Rab 패밀리 GTPase, 아넥신, 플로틸린, Alix, Tsg101, ESCRT 복합체, CD9, CD37, CD53, CD63, CD63A, CD81, CD82), Hsp70, Hsp90, 상피 세포 접착 분자(EpCam), 퍼포린, TRAIL, 그랜자임 B, Fas, 하나 이상의 암 마커, 예컨대: Fas 리간드, CD24, EpCAM, EDIL3, 피브로넥틴, 서바이빈, PCA3, TMPRSS2:ERG, Glypican-1, TGF-β1, MAGE 3/6, EGFR, EGFRvIII, CD9, CD147, CA-125, EpCam, 및/또는 CD24 또는 하나 이상의 염증성 또는 병원성 마커, 예컨대: 바이러스, 진균 또는 박테리아 단백질 또는 펩타이드, 예컨대, 비제한적으로 α-시누클레인, HIV 또는 HCV 단백질, tau, 베타-아밀로이드, TGF-베타, TNF-알파, 페투인-A, 및/또는 CD133에 대해서 특이적인 결합제)를 사용한 친화도 크로마토그래피를 사용한 상기 배양한 세포로부터 세포 특이적 엑소좀을 단리시킨다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 "복수 유체"는 복부를 라이닝하는 막과 복부 기관(복막강) 사이의 공간의 과량의 유체이다. 복수 유체는 엑소좀의 공급원일 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 "혈장"은 혈액의 부피의 약 절반을 구성하는 혈액 및 림프 유체의 액체 부분이다. 혈장은 세포가 없고, 혈청과 달리 응고되지 않는다. 혈액 혈장은 항체 및 다른 단백질을 함유한다. 혈장은 엑소좀의 공급원일 수 있다.
많은 양의 엑소좀을 생산하도록 세포를 배양하는 몇몇 방법이 본 명세서에 제공된다. 엑소좀을 회수 또는 단리시키는데 사용되는 배양 배지는 1종 이상의 영양소, 효소 또는 킬레이터가 제공될 수 있다. 킬레이터는 배양된 세포로부터의 엑소좀의 방출을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 비제한적으로, 방법 중 일부에 사용되는 킬레이터는 포스포네이트, BAPTA 사나트륨염, BAPTA/AM, 다이-노트로펜 TM 시약 사나트륨염, EGTA/AM, 피리독살 아이소니코틴오일 하이드라진, N,N,N',N'-테트라키스-(2 피리딜메틸)에틸렌다이아민, 6-브로모-N'-(2-하이드록시벤질리덴)-2-메틸퀴놀린-4-카보하이드라자이드, 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산 테트라키스(아세톡시메틸 에스터), (에틸렌다이나이트릴로)테트라아세트산(EDTA), 에다타밀, 에틸렌다이나이트릴로테트라아세트산, 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에터)-N,N,N',N'-테트라아세트산, 또는 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에터)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA) 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 킬레이터는 엑소좀을 배양 또는 단리하는데 사용되는 배지 중에 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM, 7mM, 8mM, 9mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM 또는 100mM의 농도 또는 상기에 언급된 임의의 2개의 농도에 의해서 정의된 범위 내인 농도로 제공될 수 있다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 배지 중에 하나 이상의 킬레이터가 존재하는 것은 생물반응기에서 배양된 태반으로부터의 엑소좀의 회수를 예상치 못하게 향상시켰다. 엑소좀을 배양 및/또는 회수하는데 사용되는 배지는 또한 프로테아제를 가질 수 있는데, 이것인 엑소좀의 방출을 추가로 향상시킬 수 있다. 일부 대안에서, 배지에 제공된 프로테아제는 트립신, 콜라게나제, 키모트립신 또는 카복시펩티다제이다. 일부 대안에서, 프로테아제는 배지 중에 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM, 7mM, 8mM, 9mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM 또는 100mM의 농도 또는 상기에 언급된 임의의 2개의 농도에 의해서 정의된 범위 내인 농도로 제공된다. 1종 이상의 당이 또한 배지에 첨가되어 엑소좀을 배양 및/또는 회수할 수 있다. 일부 대안에서, 배지에 첨가되는 당은 글루코스이다. 배지 중의 글루코스의 존재는 엑소좀의 방출을 향상시킨다고 생각된다. 일부 대안에서, 글루코스는 배지 중에 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM, 7mM, 8mM, 9mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM 또는 100mM의 농도 또는 상기에 언급된 임의의 2개의 농도에 의해서 정의된 범위 내인 농도로 제공된다. 배지는 또한 성장 인자, 사이토카인 또는 1종 이상의 약물, 예를 들어, GM-CSF, 혈청 및/또는 AHR 길항제를 포함할 수 있다.
태반 또는 이의 일부로부터 엑소좀을 수집하는 방법
태반으로부터 엑소좀을 회수하는 예시적인 방법을 도 1에 도시한다. 엑소좀 단리를 위한 공급원은 제대혈 혈장: PRP, 태반 관류액(PS), 태반 조직 배양물(PTS), 태반 기관 배양물(PO) 또는 태반이 엑소좀 생성을 위한 생물반응기로서 사용되는 경우 태반 또는 이의 일부에 배치될 수 있는 외인성 세포로부터 유래될 수 있다. 일 접근법에 의해서, 태반 또는 이의 일부를 수집한다(#200010323, 9/25/2017 수집됨). 태반을 배지와 접촉시키거나 정상 PSC-100 수집 방법을 사용하여 관류시키고, PS-1로서 수집한다(9/26/2017). 태반 또는 이의 일부를 적어도 4시간 동안 후드에서 인큐베이션시킨다. 태반 또는 이의 일부를 배지(RPMI 배지)와 접촉시키거나 500㎖ RPMI 베이스 배지(1% 항생제)로 관류시키고, PS-2로서 수집한다. 이어서 태반 또는 이의 일부를 후드에서 밤새 인큐베이션시키고, 회수한다. 태반 또는 이의 일부를 750㎖ 염수 용액과 접촉시키거나 관류시키고, PS-3으로서 수집한다. 이어서 샘플을 분석을 위해서 실험실(Warren)로 이송하였다. PS1, PS2 및 PS3을 RBC 용해 후에 같은 날에 FACS에 의해서 분석하였다.
분석을 위해서, 태반 조직을 1×1×1㎝ 크기로 절단하고, T75 플라스크(각각 태반의 약 1/8) 내의 100㎖의 용액(모두 1% P&S 함유)에 넣었다. 4개의 용액을 검정하였다: A: DMEM 배지; B: PBS; C: PBS+5mM EDTA; D: PBS+0.025% 트립신-EDTA. 이어서 이것을 37℃ 인큐베이터에서 밤새(O/N) 인큐베이션시켰다.
이어서, 상청액을 수거하고, 조직 필터에 통과시키고, 400g로 회전시켜 세포(펠릿)를 수거하였다. 이어서 제1 원심분리 후 상청액을 엑소좀 단리를 위해서 회전시켰다(3000g 스핀 수프(spin soup)>10,000스핀 수프: 100,000g 펠릿).
수집된 세포를 또한 FACS 분석을 위해서 사용하였다. 세포 샘플은 몇몇 완충액(A=PTS1; B=PTS2; C=PTS-3, D=PTS4) 중에 존재하였다. 엑소좀을 회수하고, 이어서 검정하여 엑소좀 마커의 존재를 식별하였는데, 이는 엑소좀이 이러한 절차에 의해서 획득되고 단리되었음을 확인해주었다.
ELISA 및 단백질 검정을 사용한 태반 생물반응기로부터 단리된 엑소좀의 집단의 식별
상기에 기재된 방법에 의해서 태반 생물반응기로부터의 상청액의 분획을 수집하였고, 분획을 여과시켰다. 이어서 상청액을 400g x 10분의 원심분리에 적용시켜 세포를 수집하였다. 제1 원심분리 후, 제2 원심분리를 3000gx30분으로 수행하여 세포 부스러기를 펠릿화시켰다. 제3 원심분리를 10,000g×1시간으로 수행하여 마이크로 소포를 펠릿화시켰다. 이어서 제4 원심분리를 100,000g×1.5시간으로 수행하여 엑소좀을 펠릿화시켰다. 이어서 펠릿화된 엑소좀을 함유하는 원심분리 튜브를 종이 상에 윗면이 아래로 향하게 놓아서 잔류하는 액체를 배출시켰다. 이어서 엑소좀 펠릿을 적절한 부피의 멸균 PBS(예를 들어 2.0㎖) 중에 용해시켜 펠릿을 용해시켰고, 이어서 엑소좀을 함유하는 용액을 멸균 에펜도르프 튜브 내에 분취하고, -20℃/-80℃ 동결기에서 동결시켰다. 이어서 ELISA-63A 및 단백질 정량 키트를 사용하여 엑소좀을 엑소좀-특이적 마커 CD63A의 존재에 대해서 검정하였다.
나타낸 바와 같이, PRP, 태반 관류액 및 태반 조직은 CD63+이고, 초원심분리에 의해서 효율적으로 단리될 수 있는 엑소좀의 집단을 함유한다. 엑소좀 단리를 위해서, 먼저 배양물 상청액을 조직 필터를 통해서 여과시키고, 몇몇 원심분리를 상기에 기재된 바와 같이 수행하여 엑소좀을 획득하였고, 이어서 이것을 동결시켰다. 엑소좀의 ELISA 검출을 위해서, 항-CD63 항체를 사용하였다. 검정에서 엑소좀 결합 완충제(60uL+60uL)를 사용하여 샘플을 1:1로 희석시켰다. CD63+ 엑소좀을 이러한 절차에 의해서 효율적으로 단리시켰다.
엑소좀의 특징규명
엑소좀은 단백질, 펩타이드, RNA, DNA 및 사이토카인을 함유할 수 있다. 방법, 예컨대, miRNA 서열분석, 표면 단백질 분석(MACSPlex 엑소좀 키트, 밀테니이사(Miltenyi)), 프로테오믹 분석, 기능성 연구(효소 검정, 시험관내 상처 치유 검정(스크래치 검정), 엑소좀-유도된 세포 증식(인간 각질세포 또는 섬유모세포)(5개의 공지된 자극제와 비교), 엑소좀-유도된 콜라겐 생산(인간 각질세포 또는 섬유모세포)(TGFb와 비교함, 혈청 및 비-혈청 대조군 포함), 프로-콜라겐 1 C 펩타이드에 대한 ELISA, 염증성 사이토카인의 엑소좀-유도된 저해(반응 세포 유형은 인간 각질세포 또는 인간 섬유모세포 포함함 및 동결건조된 열-사멸된 박테리아 또는 LPS에 대한 비교)가 수행될 수 있다.
일부 대안에서, 단리된 엑소좀을 100-Kda 비바스핀(Vivaspin) 필터(사토리우스사(Sartorius))로 농축시키고, PBS로 1회 세척하고, 대략 40uL를 회수하였다. 엑소좀의 농축된 집단을 1x프로테아제 저해제 칵테일(로슈사(Roche))을 함유한 5XRIPA 용해 완충제 10uL와 혼합하고, 보텍싱시켰고, 이어서 이것을 물 초음파기(울트라소닉 클리너(Ultrasonic Cleaner), JSP)에서 5분 동안 20℃에서 초음파처리하였다. 초음파처리 후, 간헐적으로 혼합하면서 튜브를 얼음 상에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 다음으로, 혼합물을 10,000g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리시켰다. 단리된 투명한 용해물을 새로운 튜브에 옮겼다. 단백질 양을 BCA 키트로 측정하고, 10ug의 단백질을 웨스턴 블롯을 위해서 레인당 로딩하였고, 항체를 관심대상 단백질의 결정을 위해서 사용한다.
또 다른 대안에서, 엑소좀 표지 및 세포에 의한 흡수를 조사한다(예를 들어, HEK293T). 동결된 용리된 엑소좀의 분취물을 1㎖의 PBS 중에 재현탁시키고, PKH26 형광 세포 링커 키트(시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich))를 사용하여 표지하였다. 2x PNK26-염료 용액(1㎖의 희석제 C 중의 4uL 염료)을 제조하고, 2×10e-6M의 최종 염료 농도를 위해서 엑소좀 용액 1㎖와 혼합하였다. 샘플을 증식 5분 동안 혼합하고, 1% BSA 를 첨가하여 여분의 PKH26 염료를 포획함으로써 염색을 중단하였다. 표지된 엑소좀을 100-Kda 비바스핀 필터로 옮기고, 4000g로 회전시키고, 이어서 PBS로 2회 세척하고, NTA를 사용한 엑소좀 농도의 분석을 위해서 대략 50uL의 샘플을 회수하였고, 그 다음 -80℃에서 저장하였다. PBS를 표지 반응에 대한 음성 대조군으로서 사용하였다. 흡수 연구를 수행하기 위해서, HEK293T 세포를 정규 배지를 사용하여 8-웰 챔버 슬라이드 내에 플레이팅하였다(1×10e4개/웰). 24시간 후, 슬라이드를 PBS로 2회 세척하고, DMEM-엑소-프리(exo-free) FBS(10%)와 함께 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 10% 엑소-프리 PBS를 함유한 새로운 DMEM 배지(200uL) 2×10e9개 엑소좀에 상응하는 각각의 표지된 엑소좀 샘플을 각각의 웰에 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 슬라이드를 PBS(500ul)로 2회 세척하고, 실온에서 20분 동안 4% 파라폼알데하이드 용액으로 고정시켰다. 슬라이드를 PBS(500uL)로 2회 세척하고, 건조시키고, DAPI를 함유한 프로롱 골드 안티페이드 시약(ProLong Gold Antifade Reagent)을 사용하여 장착시켰다. 세포를 악시오스콥(Axioskop) 현미경(제이스사(Zeiss))을 사용하여 가시화시켰다.
배양된 산후 인간 태반으로부터의 엑소좀의 고수율 단리
완전 공여자 동의를 얻은 산후 인간 태반을 관류시켰다. 태반으로부터의 잔류하는 혈액을 다량의 멸균 염수로 세척하고, 이어서 항생제가 보충된 무혈청 배양 배지를 함유한 5ℓ 생물반응기에서 배양하고, 37℃ 인큐베이터(5% CO2)에서 배양하고, 4일의 연장된 시간 기간 동안 냉장 조건에서 회전시키면서 교호시켰다. 배양 배지의 상청액을 3000g 및 10,000g에 의한 순차적인 원심분리에 의해서 처리하여 조직, 세포 및 마이크로-소포를 펠릿화시켰다. 엑소좀을 10,000g 원심분리의 상청액으로부터의 100,000g 초원심분리에 의해서 펠릿화시키고, 멸균 PBS로 희석시켰다. 엑소좀의 수율을 BCA 단백질 검정에 의해서 정량하였다.
태반 기관 배양물로부터의 상청액을 방법에 기재된 바와 같이 처리하여 엑소좀을 단리시켰다. 항-CD63A 항체를 사용한 ELISA 검정은, 단리된 엑소좀이 엑소좀에 대한 특이적 단백질 마커인 CD63A 단백질을 함유한다는 것을 입증하였다. 1리터의 배지 중에서 배양된 하나의 태반은 24시간 동안 대략 40㎎의 엑소좀, 또는 대략 1×1013개의 CD63A 양성 엑소좀 입자를 생성시켰다고 추정된다. CD9, CD81의 발현, 크기 및 기능성 활성도를 비롯한 이들 태반-기관 유래된 엑소좀의 추가 특징규명을 수행한다.
또 다른 실험 세트에서, 완전 공여자 동의로 획득된 산후 인간 태반을 관류시켜 상이한 농도의 EDTA를 갖는 배지를 사용하여 엑소좀을 단리시킨다. 항생제 및 다양한 농도의 EDTA(예를 들어, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100mM 또는 상기에 언급된 농도 중 임의의 2개에 의해서 정의된 범위 이내)가 보충된 무혈청 배양 배지를 일정한 속도를 사용하여 연동 펌프를 통해서 탯줄 정맥을 통해서 태반으로 관류시키고, 제어된 조건 하에서 또 다른 24 내지 48시간 동안 배양한다. 이러한 배양 후, 사용되는 EDTA의 양을 함유한 750㎖의 생리학적 배지를 제어된 속도로 관류시킨다. 이어서 엑소좀을 순차적인 원심분리 및 초원심분리에 의해서 단리시키고, 모두 상기에 기재된 CD63A ELISA 검정에 의해서 확인하고, BCA 단백질 검정에 의해서 정량한다. 엑소좀을 회수하는데 사용되는 배지 중의 EDTA의 농도가 생물반응기에서 배양된 태반으로부터 회수되는 엑소좀의 양에 영향을 미친다는 것이 인지될 것이다.
추가 대안
일부 대안에서, 태반 또는 이의 일부로부터의 엑소좀 단리 방법이 제공된다. 이 방법은 a) 태반 또는 이의 일부를 제1 배지와 접촉시키는 단계; b) 엑소좀을 포함하는 제1 분획을 상기 태반 또는 이의 일부로부터 획득하는 단계; c) 상기 태반 또는 이의 일부를 제2 배지와 접촉시키는 단계; d) 엑소좀을 포함하는 제2 분획을 상기 태반 또는 이의 일부로부터 획득하는 단계; e) 상기 태반 또는 이의 일부를 제3 배지와 접촉시키는 단계; f) 엑소좀을 포함하는 제3 분획을 상기 태반 또는 이의 일부로부터 획득하는 단계, 및 선택적으로, 상기 제1 분획, 제2 분획 및/또는 제3 분획으로부터 엑소좀을 단리시키는 단계를 포함한다. 일부 대안에서, 이 방법은 태반 또는 이의 일부를 추가 배지와 접촉시키는 단계; 및 상기 태반 또는 이의 일부로부터 엑소좀을 포함하는 추가 분획을 획득하는 단계의 다수의 단계를 추가로 포함한다. 이들 두 단계는 여러 번 반복될 수 있다. 바람직하게는, 태반 또는 이의 일부는 배양되고/되거나 생물반응기에서 유지된다. 일부 대안에서, 태반 또는 이의 일부는 양막을 포함한다. 일부 대안에서, 태반 또는 이의 일부는 인간 태반 또는 이의 일부이다. 일부 대안에서, 제1 배지, 제2 배지 및/또는 제3 배지는 적어도 45분, 예컨대, 45분 or 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12시간 또는 상기에 언급된 시간 지점 중 임의의 2개에 의해서 정의된 범위 내인 임의의 시간 양 동안 태반 또는 이의 일부와 접촉된다. 일부 대안에서, 제1 배지, 제2 배지 및/또는 제3 배지는 적어도 7, 14, 28, 35 또는 42일 또는 상기에 언급된 시간 지점 중 임의의 2개에 의해서 정의된 범위 내인 임의의 시간 양 동안 태반 또는 이의 일부와 접촉된다. 일부 대안에서, 태반 또는 이의 일부는 분쇄되었거나, 그라인딩되었거나, 또는 효소, 예컨대, 콜라게나제 및/또는 프로테아제로 처리되었다.
일부 대안에서, 태반 또는 이의 일부는 탈세포화되고, 선택적으로 실질적으로 건조된 실질적으로 평탄하거나 시트-유사 스캐폴드 물질로서 제공된다. 탈세포화된 태반 또는 이의 일부는 외인성 세포, 예컨대, 세포 배양물 또는 1차 단리 절차로부터 획득된 균질한 세포 집단(예를 들어, 줄기세포, 내피 세포 및/또는 전구 세포를 비롯한 재생 세포)을 보유하기 위한 스캐폴드로서 사용된다. 이 방법은 유체 또는 탈세포화된 태반 또는 이의 일부에 시딩될 세포를 포함하는 유체를 계대시키는 것을 추가로 포함한다. 세포가 확립되면, 세포로부터 생성된 엑소좀은 상기에 기재된 절차를 사용하여 회수 및 단리된다. 일부 대안에서, 탈세포화된 태반 또는 이의 일부 상에 시딩될 세포를 포함하는 유체는 복수 유체, 혈액 또는 혈장이다. 일부 대안에서, 세포는 기관으로부터 유래된다. 일부 대안에서, 세포는 간, 신장, 폐 또는 췌장으로부터 유래된다. 일부 대안에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 대안에서, 세포는 T-세포 또는 B-세포이다.
일부 대안에서, 제1 배지는 인산염 완충 염수(PBS)를 포함한다. 일부 대안에서, 제2 배지는 성장 인자를 포함한다. 일부 대안에서, 제3 배지는 킬레이터를 포함한다. 일부 대안에서, 킬레이터는 EDTA, EGTA, 포스포네이트, BAPTA 사나트륨염, BAPTA/AM, 다이-노트로펜 TM 시약 사나트륨염, EGTA/AM, 피리독살 아이소니코틴오일 하이드라진, N,N,N',N'-테트라키스-(2-피리딜메틸)에틸렌다이아민, 6-브로모-N'-(2-하이드록시벤질리덴)-2-메틸퀴놀린-4-카보하이드라자이드, 1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산 테트라키스(아세톡시메틸 에스터), (에틸렌다이나이트릴로)테트라아세트산, EDTA, 에다타밀, 에틸렌다이나이트릴로테트라아세트산, 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에터)-N,N,N',N'-테트라아세트산 또는 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에터)-N,N,N',N'-테트라아세트산 사나트륨염 또는 이들의 임의의 조합물이다. 일부 대안에서, 킬레이터는 EDTA 또는 EGTA 또는 이들의 임의의 조합물이다. 일부 대안에서, 킬레이터는 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM, 7mM, 8mM, 9mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM 또는 100mM의 농도 또는 상기에 언급된 임의의 2개의 농도에 의해서 정의된 범위 내인 농도로 제3 배지 중에 존재한다. 일부 대안에서 제3 배지 중의 EDTA의 농도는 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM, 7mM, 8mM, 9 mM 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90 mM 또는 100 mM의 농도 또는 상기에 언급된 임의의 2개의 농도에 의해서 정의된 범위 내인 농도로 제공된다.
일부 대안에서, 제3 배지는 프로테아제를 포함한다. 일부 대안에서, 프로테아제는 트립신, 콜라게나제, 키모트립신 또는 카복시펩티다제 또는 이들의 혼합물이다. 일부 대안에서, 프로테아제는 트립신이다. 일부 대안에서, 프로테아제는 제3 배지 중에 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM, 7mM, 8mM, 9mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM 또는 100mM의 농도 또는 상기에 언급된 임의의 2개의 농도에 의해서 정의된 범위 내인 농도로 제공된다.
일부 대안에서, 방법은 태반 또는 이의 일부를 추가의 복수의 배지와 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 상기 접촉시키는 단계는 엑소좀을 포함하는 다수의 분획의 획득을 야기한다. 일부 대안에서, 제1 배지, 제2 배지, 제3 배지 또는 추가 배지는 글루코스를 포함한다. 일부 대안에서, 제1 배지, 제2 배지, 제3 배지 또는 추가 배지는 GM-CSF를 포함한다. 일부 대안에서, 제1 배지, 제2 배지, 제3 배지 또는 추가 배지는 혈청을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 배지, 제2 배지, 제3 배지 또는 추가 배지는 DMEM을 포함한다. 일부 대안에서, 제1 배지, 제2 배지, 제3 배지 또는 추가 배지는 AHR 길항제를 포함한다. 일부 대안에서, AHR 길항제는 SR1이다. 일부 대안에서, SR1은 1nM, 10nM, 100nM, 200nM, 300nM, 400nM, 500nM, 600nM, 700nM, 800nM, 900nM 또는 1mM의 농도 또는 상기에 언급된 임의의 2개의 값에 의해서 정의된 범위 내인 임의의 다른 농도로 존재한다.
일부 대안에서, 제1 배지는 0℃, 5℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃ 또는 40℃의 온도 또는 상기에 언급된 온도 중 임의의 2개에 의해서 정의된 범위 내인 온도를 유지하면서, 상기 태반 또는 이의 일부와 접촉된다. 일부 대안에서, 제2 배지는 0℃, 5℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃ 또는 40℃의 온도 또는 상기에 언급된 온도 중 임의의 2개에 의해서 정의된 범위 내인 온도를 유지하면서, 상기 태반 또는 이의 일부와 접촉된다. 일부 대안에서, 제3 배지는 0℃, 5℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃ 또는 40℃의 온도 또는 상기에 언급된 값 중 임의의 2개에 의해서 정의된 범위 내인 온도를 유지하면서, 상기 태반 또는 이의 일부와 접촉된다. 일부 대안에서, 추가적인 복수의 배지는 0℃, 5℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃ 또는 40℃의 온도 또는 상기에 언급된 값 중 임의의 2개에 의해서 정의된 범위 내인 온도를 유지하면서, 상기 태반 또는 이의 일부와 접촉된다.
일부 대안에서, 제1 배지, 제2 배지 또는 제3 배지 또는 추가적인 복수의 배지는 항생제를 포함한다.
일부 대안에서, 엑소좀은,
(a) 제1 분획, 제2 분획 및/또는 제3 분획 또는 다수의 분획을 조직 필터에 통과시키는 단계;
(b) (a)에서 수집된 여과액의 제1 원심분리를 수행하여 세포 펠릿 및 제1 상청액을 생성시키는 단계;
(c) 제1 상청액 상에서 제2 원심분리를 수행하여 제2 상청액을 생성시키는 단계; 및
(d) 제2 상청액 상에서 제3 원심분리를 수행하여 엑소좀 펠릿을 생성시키는 단계; 및 선택적으로,
(e) 엑소좀을 용액 중에 재현탁시키는 단계
를 포함하는 방법에 의해서 제1 분획, 제2 분획 및/또는 제3 분획 또는 다수의 분획으로부터 단리된다.
일부 대안에서, 단리된 엑소좀의 집단은 CD63, CD63-A, 퍼포린, Fas, TRAIL 또는 그랜자임 B 또는 이들의 임의의 조합물을 갖는 엑소좀을 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 엑소좀의 집단은 신호전달 분자를 포함하는 엑소좀을 포함한다. 일부 대안에서, 단리된 엑소좀의 집단은 사이토카인, mRNA 또는 miRNA를 포함하는 엑소좀을 포함한다.
일부 대안에서, 방법은 친화도 크로마토그래피에 의해서 엑소좀을 단리시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 친화도 크로마토그래피는 바이러스 항원, 바이러스 단백질, 박테리아 항원, 또는 박테리아 단백질 진균 항원 또는 진균 단백질을 포함하는 엑소좀의 제거에 대해서 선택적이다.
일부 대안에서, 방법은 대안적인 또는 추가 친화도 크로마토그래피 단계에 의해서 엑소좀을 단리시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 대안적인 또는 추가 친화도 크로마토그래피 단계는 염증성 단백질을 포함하는 엑소좀의 제거에 대해서 선택적이다. 일부 대안에서, 방법은 항-염증성 생물분자를 포함하는 엑소좀의 집단을 풍부하게 하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 대안에서, 본 명세서에서 실시형태 중 임의의 하나에 의해서 생성된 엑소좀이 제공된다. 일부 대안에서, 엑소좀은 복수 유체, 혈액 또는 혈장으로부터 유래된다. 일부 대안에서, 엑소좀은 기관으로부터의 세포로부터 유래된다. 일부 대안에서, 엑소좀은 면역 세포로부터 유래된다. 일부 대안에서, 엑소좀은 T-세포 또는 B-세포로부터 유래된다.
일반적으로, 본 명세서 및 특히 첨부된 청구범위(예를 들어, 첨부된 청구범위의 실체)에서 사용된 용어는 일반적으로 "개방" 용어로서 의도된다는 것이 당업자에 의해서 이해될 것이다(예를 들어, 용어 "포함하는"은 "포함하지만 이에 제한되지 않는"으로서 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로서 해석되어야 하고, 용어 "포함한다" 는 "포함하지만 이들로 제한되지 않는" 등으로서 해석되어야 한다). 특정 수의 도입된 청구범위 언급이 의도된 경우 이러한 의도는 청구범위에 명시적으로 언급될 것이며, 이러한 언급이 없이는 그러한 의도가 존재하지 않음이 당업자에 의해서 추가로 이해될 것이다. 예를 들어, 이해를 돕기 위해서, 하기 첨부된 청구범위는 청구범위 언급을 소개하기 위한 소개 문구 "적어도 1종" 및 "하나 이상"의 사용을 포함할 수 있다. 그러나, 이러한 구의 사용은, 동일한 청구범위가 소개 문구 "하나 이상" 또는 "적어도 1종" 및 단수 표현(예를 들어, 단수 표현은 "적어도 1종" 또는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 해석되어야 함)을 포함하는 경우에도, 단지 하나의 이러한 언급을 포함하는 실시형태에 대한 이러한 도입된 청구범위를 함유하는 임의의 특정 청구범위를 제한하는 것을 암시하도록 해석되지 않아야 하고; 청구범위 언급을 도입하기 위해서 사용된 단수 표현의 사용에 대해서도 마찬가지이다. 또한, 특정 수의 도입된 청구범위 언급이 명시적으로 언급되더라도, 당업자는 이러한 언급이 적어도 인용된 수(예를 들어, 다른 수식어가 없는 "2개의 언급"의 기본 언급은 적어도 2개의 언급, 또는 2개 이상의 언급을 의미함)를 의미하는 것으로 해석되어야 한다는 인식할 것이다. 추가로, "A, B 및 C 중 적어도 하나 등"과 유사한 규칙이 사용되는 그러한 예에서, 일반적으로, 그러한 구성은 당업자가 그 규칙을 이해할 것이라는 의미로 의도된다(예를 들어, "A, B 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B 함께, A와 C 함께, B와 C 함께 및/또는 A, B 및 C 함께 등을 갖는 시스템을 포함할 것이지만 이들로 제한되지 않는다). "A, B 또는 C 중 적어도 하나 등"과 유사한 규칙이 사용되는 그러한 예에서, 일반적으로, 그러한 구성은 당업자가 그 규칙을 이해할 것이라는 의미로 의도된다(예를 들어, "A, B 또는 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B 함께, A와 C 함께, B와 C 함께 및/또는 A, B 및 C 함께 등을 갖는 시스템을 포함할 것이지만 이들로 제한되지 않는다). 상세한 설명이든, 청구범위이든 또는 도면이든 간에 둘 이상의 대안 용어를 나타내는 사실상 임의의 분리형 단어 및/또는 구는 용어 중 하나, 용어 중 어느 것 또는 두 용어 다를 포함하는 가능성을 고려하도록 이해되어야 한다는 것이 당업자에게 추가로 이해될 것이다. 예를 들어, 구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
실시예
제1 시리즈의 실험
1. 실시예 1: 인간 태반의 배양
인간 태반을 제공받고, 멸균 PBS 또는 염수 용액으로 세척하여 혈액을 제거한다. 이어서 태반을 항생제 및 2mM EDTA가 보충된 500㎖ 또는 1000㎖의 DMEM 배양 배지의 부피를 갖는 큰 용기에서 전체 기관으로서 용기에서 배양하였다. 상이한 대안에서, 태반을 상이한 크기로 절단하고, 배양 용기에 넣을 수 있다. 배양은 5% CO2를 갖는 세포 배양 인큐베이터 내에서 37℃이다. 배양 시간은 4시간 내지 8시간이고, 배양물의 상청액을 엑소좀의 단리를 위해서 사용한다. 새로운 배지를 각각의 수거 시간 지점(예를 들어, 8시간 마다 또는 12시간 마다)에 첨가하고, 태반 기관 및 조직을 최대 적어도 5일 동안 배양한다.
2. 실시예 2: 태반 엑소좀의 단리 및 정제
배양물의 상청액을 3,000g에서 30분 동안 원심분리시켜 세포 및 조직 부스러기를 펠릿화시켰다. 이어서 상청액을 10,000g에서 1시간 동안 원심분리시키고, 펠릿(작은 세포 부스러기 및 세포 소기관)을 폐기한다. 이어서 상청액을 100,000g에서 2시간 동안 원심분리시킨다. 생성된 펠릿은 엑소좀이다. 하기 방법에 의해서 엑소좀 펠릿을 추가로 정제시킬 수 있다: 상이한 부피의 멸균 PBS 중에 재현탁시키고, 100,000에서 2시간 동안 다시 원심분리시키고, 이어서 최종 펠릿을 멸균 PBS로 재현탁시킨다. 현탁된 엑소좀을 시린지 필터(0.2um)를 통해서 여과시키고, -80℃에서 300uL 내지 1㎖의 상이한 부피로 분취시킨다.
태반 엑소좀을 크기로 특징규명한다. 크기 분포를 나노입자 추적 검정에 의해서 분석한다. pExo의 3개의 대표적인 샘플을 NanoSight를 사용하여 크기로 측정하였다. 각각의 단리물은 보고된 엑소좀의 크기와 일치하는, 각각 117, 101 및 96의 평균 크기를 갖는다. 결과를 도 2a 내지 도 2c에 나타낸다.
3. 실시예 3: FACS 분석에 의한 pExo의 마커
pExo의 단백질 마커를 키트에 의해서 제공된 프로토콜에 따라서 MACSPlex 엑소좀 키트(밀테니이 바이오테크사(Miltenyi Biotec), Cat#130-108-813)를 사용하여 분석하였다. 간략하면, 120uL의 pExo 단리물을 15uL의 엑소좀 포획 비드와 함께 밤새 실온에서 인큐베이션시켰다. 1㎖의 세척 용액으로 1회 세척한 후, 엑소좀을 엑소좀 검출 시약 CD9, CD63 및 CD81 칵테일과 함께 인큐베이션시키고, 추가로 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 2회 세척 후, 샘플을 FACS(BD Canto 10)로 분석하였다. mIgG1 및 REA 대조군을 제외하고 이 키트에는 총 37종의 단백질 마커(표 1)가 포함된다.
Figure pct00001
pExo 샘플은 CD1c, CD9, CD20, CD24, CD25, CD29, CD2, CD3, CD8, CD9, CD11c, CD14, CD19, CD31, CD10, CD41b, CD42a, CD44, CD45, CD19c, CD4, CD15, CD19c, CD4, CD56, CD62P, CD83, CD69, CD81, CD86, CD105, CD133-1, CD142, CD148, HLA-ABC, HLA-DRDPDQ, MSCP, ROR1, SSEA-4를 비롯한 하기 단백질 마커에 대해서 고도로 양성인 것으로 식별되었다. pExo는 CD209에서 매우 낮은 수준(2.6%)을 갖는다. 배지 및 세포 배양 인큐베이터를 사용하여 배양하지 않고 염수 용액으로 태반의 맥관구조를 관류시킴으로써 획득된 인간 태반 관류액을 또한 사용하여 엑소좀을 단리시키고, 마커 단백질 발현과 동일한 방법에 의해서 분석하였다. 관류액 유래된 엑소좀은 또한 pExo에서 발견되는 마커 대부분을 높은 수준으로 발현하지만, 그것은 pExo에 비해서 상당히 더 낮은 CD11c(2.0%), MCSP(3.4%) 및 SSEA-4(3.5%)를 갖는다. pExo는 또한 태반 관류액 엑소좀에 비해서 상당히 더 높은 수준의 CD142 및 CD81을 갖는다. 탯줄 제대혈 혈청을 또한 사용하여 엑소좀을 단리시키고, 마커 단백질 발현과 동일한 방법에 의해서 분석하였다. 제대혈 혈청 유래된 엑소좀은 또한 단백질 마커 대부분에서 양성이지만, 일반적으로 더 낮은 수준의 이들 각각의 마커 단백질 발현을 나타낸다. 구체적으로, pExo와 비교하면, 제대혈 혈청 엑소좀은 더 낮은 수준의 CD56(1.4%), CD3(0.3%) 및 CD25(3.9%)를 갖는다. 제대혈 혈청에서의 SSEA-4 및 MSCP 단백질 발현은 pExo보다 상당히 더 낮지만, 태반 관류액 엑소좀보다는 높다. 제대혈 혈청 엑소좀은 또한 pExo와 비교할 때 더 높은 수준의 MSCP 단백질을 갖는다. 이러한 데이터는, 배양된 태반 조직이 비-배양된 태반 및 제대혈 혈청과 비교할 때 고유한 엑소좀 집단을 생성시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 제대혈 혈청 유래 엑소좀 및 태반 관류액 엑소좀과 비교한, pExo 샘플에 대한 결과를 도 3a 내지 도 3c 및 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
4. 실시예 4: pExo 샘플의 사이토카인 및 성장 인자
pExo 샘플을 41종의 사이토카인을 포함하는 MiltiPlex Luminex 키트를 사용하여 사이토카인의 함량에 대해서 분석하였다. 하기 표는 15종의 상이한 pExo 제제 상에서 검출된 사이토카인의 데이터를 나타낸다. 데이터는, pExo가 FGF2, G-CSF, 프락탈카인(Fractalkine), GDGF-AA/BB, GRO, IL-1RA, IL-8, VEGF 및 RANTES를 비롯한 사이토카인을 상당한 수준(평균 > 50pg/㎖)으로 함유한다는 것을 나타낸다. pExo는 또한 EGF, Flt-3L, IFNa3, MCP-3, PDGF-AA, IL-15, sCD40L, IL6, IP-10, MCP-1, MIP-알파, MIP-1베타, 및 TNF-알파를 비롯한 다른 사이토카인의 사이토카인을 검출 가능한 수준(5pg/㎖ 내지 49pg/㎖)으로 함유한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
pExo(11개의 샘플)를 또한 Multiplex Luminex 분석에 의해서 가용성 사이토카인 수용체의 존재에 대해서 분석하였다. 데이터를 하기 표에 나타낸다. 데이터는, pExo가 높은 수준(>100pg/㎖)의 sEFGR, sgp-130, sIL-1R1, sTNFR1, sTNFRII, sVEGRR1, sVEGFR1, sVEGFR3 및 sCD30를 함유하고, sIL-2Ra, sIL-6R, sRAGE가 또한 일부 샘플에서 검출됨을 나타낸다(>10ng/㎖). <로서 나타낸 데이터는 검출되지 않고, 음성으로서 간주된다.
Figure pct00005
5. 실시예 5: 태반 엑소좀의 프로테오믹 분석
3개의 pExo 샘플을 프로테오믹 분석에 적용하였다. 제출된 샘플을 하기 설정으로 초음파 프로브(sonic probe)(큐소니카사(QSonica))를 사용하여 용해시켰다: 진폭 40%, 펄스10x 1초 온, 1초 오프. 단백질 농도를 Qubit 형광분석법에 의해서 결정하였다. 각각의 샘플 10ug을 SDS 페이지에 의해서 가공하고, 정제된 단백질을 트립신 소화에 적용하였다. 표 5는 각각의 샘플로부터 식별된 총 단백질을 나타낸다. 이들 샘플 중에서, 총 1814종의 단백질이 식별된다. 표 6은 pExo 샘플에서 상위에 식별된 단백질의 식별 및 유전자 ID를 나타낸다. 추가 데이터를 도 4 및 도 5에 나타낸다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
6. 실시예 6: 태반 엑소좀의 RNA 분석
3개의 pExo 샘플을 서열분석에 의해서 RNA 프로파일에 대해서 분석하였다. 간략하면, pExo 샘플로부터의 RNA를 추출하고, cDNA로 전환시키고, 서열분석한다. 이어서, 서열분석 데이터를 데이터베이스와 비교하여 유형을 식별하고, 각각의 서열분석 데이터를 식별한다. 표 7은 RNA 서열분석 결과의 전체 프로파일을 나타낸다. pExo 내의 RNA는 tRNA, 마이크로RNA 및 다른 카테고리의 비-암호 RNA를 함유한다. 마이크로RNA는 pEXO 샘플의 조성물 중에서 두 번째로 가장 풍부한 RNA이다. 총 1500종의 상이한 마이크로RNA가 이들 3개의 pExo 샘플에서 식별되었다. 일부는 3개의 샘플 모두에 공통으로 존재하고, 일부는 하나 또는 두 개의 샘플에 고유하게 존재한다. 가장 풍부한 마이크로RNA의 유전자 ID 및 상대 빈도 및 풍부도(abundance)를 나타낸다. 마이크로RNA는 세포-세포 소통의 기능에서 중요한 역할을 한다고 공지되어 있다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
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Figure pct00018
7. 실시예 7: 태반 엑소좀은 인간 피부 섬유모세포 세포(HDF)의 이동을 촉진시킨다.
사이토카인 프로파일은 pExo가 화학주성(chemotactic) 성장 인자를 포함한다는 것을 나타내는데, 이는 pExo가 세포 이동을 촉진시키는 기능을 갖는다는 것을 시사한다. 이를 조사하기 위해서, 트랜스웰 이동 검정을 하기와 같이 설정하였다: 750uL의 DMEM 기초 배지(basal medium)(혈청 없음)를 트랜스웰(24-웰)의 바닥 챔버에 넣고, pExo를 50uL로 첨가하였다. PBS를 대조군으로서 동일한 부피로 첨가하였다. 1×10e5개의 HDF를 트랜스웰의 상부 챔버에 시딩하였다(8um 기공). 6 내지 24시간 후, 트랜스웰의 상부 챔버 상의 세포를 면봉에 의해서 제거하였다. 이어서 트랜스웰을 PBS 중에 1% 에탄올을 함유하는 용액 중에서 고정시키고, 그 다음 1% 에탄올-PBS 중에 용해된 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 이동된 세포를 현미경으로 관찰한다. 데이터는, HDF의 결과의 예가 트랜스웰의 바닥 면으로 이동한 반면, PBS 대조군 트랜스웰에서는 웰을 통해서 상당히 더 적은 세포가 이동하였음을 나타낸다. 연구는 pExo가 인간 피부 섬유모세포 세포의 이동을 촉진시킬 수 있음을 입증한다. 도 6을 참고하기 바란다.
8. 실시예 8: 태반 엑소좀은 인간 탯줄 제대혈 내피 세포(HUVEC)의 이동을 촉진시킨다
트랜스웰 이동 검정을 또한 하기와 같이 설정하였다: 750uL의 DMEM 기초 배지(혈청 없음)를 트랜스웰(24-웰)의 바닥 챔버에 넣고, pExo를 50uL로 첨가하였다. PBS를 대조군으로서 동일한 부피로 첨가하였다. 2×10e5개의 GFP 단백질 발현 HUVEC를 트랜스웰의 상부 챔버에 시딩하였다(8um 기공). 6 내지 24시간 후, 이동된 웰을 반전 형광 현미경(AMG)으로 직접 관찰한다. 연구는 시험된 3개의 pExo 샘플 모두가 모든 3개의 반복 시험 웰에서 HUVEC의 이동을 촉진시킬 수 있음을 입증한다. HUVEC에 대한 완전 배지는 양성 대조군으로서 사용되며, 상당한 세포 이동을 가지며, PBS는 추가 대조군으로서 사용되며, 완전 배지 또는 pExo 시험된 웰과 비교할 때 훨씬 더 적은 세포 이동을 갖는다. 도 7을 참고하기 바란다.
9. 실시예 9: 태반 엑소좀은 HUVEC의 증식을 자극한다
pExo의 사이토카인 프로파일은, 그것이 HUVEC의 성장에 관여된다고 공지된 몇몇 성장 인자(PGDF-AA,BB, VEGF)를 갖는다는 것을 나타낸다. HUVEC의 성장 및 증식에 대한 pExo의 효과를 조사하기 위함. GFP 발현 HUVEC를 96-웰 플레이트(투명한 바닥 및 불투명한 벽) 내의 100uL의 완전 HUVEC 성장 배지 중에 1×10e4개 세포로 시딩하였다. 2시간 동안 시딩한 후, 세포는 웰의 바닥에 부착하였다. 이어서 웰에 25uL의 상이한 pExo 샘플(샘플당 N=6)을 첨가한다. 이어서 플레이트를 0일 및 시딩 후 2일에 플레이트 판독기(Synergy H4, 여기 395㎚/방출 509㎚)를 사용하여 형광 강도로 평가한다. 도 13에 도시된 바와 같이, 완전 배지는 0일 내지 2일에 더 높은 GFP 신호(세포 수의 지시인자)를 나타낸다. 완전 배지가 50% 희석된 PBS 대조군은 완전 배지와 비교할 때 약간의 성장을 나타내었다. 8개의 상이한 모든 pExo 샘플은 모두 2일에 GFP의 더 높은 성장을 나타내었다. 도 8을 참고하기 바란다.
10. 실시예 10: 태반 엑소좀은 인간 CD34+ 세포의 증식 및 집락 형성을 자극한다
조혈 줄기세포의 증식에 대한 pExo의 효과를 시험하기 위해서, 인간 탯줄 제대혈 CD34+ 세포(인하우스 제조됨)를 해동시키고, ㎖당 1×10e4개/세포로 10% FCS-IMDM과 함께 SCF, Flt-3, KL(배지 A)의 칵테일을 함유하는 확장 배지 중에서 배양하였다(N=4). 배양 웰에 25uL의 PBS 또는 25uL의 pExo 샘플(시험된 2개의 pExo 샘플)을 첨가하였다. 배양 1주 후, 각각의 웰의 총 세포 수를 계수하고, 항-CD34 항체를 사용하여 유세포 분석법(FACS)에 의해서 배양물 중의 CD34+ 세포의 백분율을 평가하였다. 총 CD34+ 세포 수를 배양물 중의 CD34+ 세포의 %에 대한 웰 중의 총 세포 수로서 계산한다. 결과는, pExo 처리된 배양물 모두는 PBS 대조군 배양물과 비교할 때 상당히 더 많은 수의 CD34+ 세포를 갖는다는 것을 나타내었다. pExo를 또한 집락 형성 단위 배양물(CFU)로 CD34+ 세포에 대한 효과에 대해서 시험하였다. CFU 배양물을 MethoCult H4434 배지(스템 셀 테크놀로지스사(Stem Cell Technologies))로 확립하고, pExo 또는 PBS를 50uL/㎖로 첨가하였다. 배양 2주 후, 각각의 35㎜ 접시 내의 총 CFU 수를 계수하였다(N=3). 데이터는, PBS 대조군 배양물과 비교할 때, pExo의 존재 하에서, 상당히 더 많은 수의 CFU가 존재함을 나타내었다. 도 9 및 도 10을 참고하기 바란다.
11. 실시예 11: 암 세포 증식의 저해
마이크로RNA 데이터 및 사이토카인 데이터는, pExo가 암 세포 증식을 저해하는 활성을 갖는다는 것을 시사한다. pExo 샘플을 사용하여 96-웰 플레이트에서 SKOV3(인간 난소암 세포주)의 성장에 대한 효과를 조사하였다. 이러한 SKOV3 세포를 루시퍼라제를 발현하도록 조작하고, 따라서 루시퍼라제 활성도를 측정하는 것이 세포 성장의 지수이다. 총 8개의 상이한 pExo 샘플을 사용하였다. 2000개의 SKOV3 세포를 96-웰 플레이트 내의 100uL의 성장 배지(DMEM-10% FCS)에 첨가하였다. 2시간 후, 40uL의 pExo를 웰에 첨가하고(N=6), 60uL의 성장 배지를 보충하였다. 40uL의 PBS를 대조군으로서 사용하였다. 완전 배지 조건은 웰에 100uL의 배지를 첨가하는 것이다. 인큐베이터에서 2일 동안 배양 후, 루시퍼라제 활성도를 세포를 용해시킴으로써 루시퍼라제 검정 키트(프로메가사(Promega))로 측정하고, 플레이트 판독기(Synergy H4)를 사용하여 발광 방출을 사용하여 루시퍼라제 활성도를 측정하였다. 데이터는, 각각의 세포 농도에서, pExo 처리된 배양물이 PBS 대조군과 비교할 때 상당히 더 낮은 루미넥스 지수(Luminex index)를 가졌음을 나타낸다. 이러한 데이터는, pExo가 SKOV3 세포의 성장을 저해하였음을 나타낸다. 도 11을 참고하기 바란다.
A549 암 세포주(인간 폐 암종 암 세포주)를 96-웰 플레이트(엑스셀리전스사(Xiceligence)) 내에 1500개 세포/웰로 시딩하였다. 시딩 24시간 후, pExo를 성장 배지(100uL) 중에 3개의 상이한 용량(5uL, 25 및 50uL)으로 첨가한다. 동일한 양의 PBS를 대조군으로서 첨가하였다. 시딩 후 1일 내지 3일에 웰 상의 세포의 부착을 반영하는 소프트웨어를 통해서 세포의 성장을 모니터링할 수 있다. 데이터는, pExo의 존재 하에서, 세포의 성장은, 정규화된 세포 지수로서 나타낸 바와 같이, PBS 대조군과 비교할 때 pExo의 존재 하에서 상당히 더 낮다는 것을 나타내었다. 성장 곡선 각각은 3개의 독립적인 웰로부터의 평균 세포 지수이다. 도 12를 참고하기 바란다.
pExo 샘플을 사용하여 상이한 세포 용량을 갖는 96-웰 플레이트에서 MDA231(인간 유방암 세포주)의 성장에 대한 이의 효과를 조사하였다. 이러한 MDA231 세포를 루시퍼라제를 발현하도록 조작하고, 따라서 루시퍼라제 활성도를 측정하는 것이 세포 성장의 지수이다. 상이한 세포 수의 MDA231-루시퍼라제를 96-웰 플레이트(3회 반복물)에 시딩하고, 25uL의 pExo#789를 첨가한다. 인큐베이터에서 2일 동안 배양 후, 루시퍼라제 활성도를 세포를 용해시킴으로써 루시퍼라제 검정 키트(프로메가사)로 측정하고, 플레이트 판독기(Synergy H4)를 사용하여 발광 방출을 사용하여 루시퍼라제 활성도를 측정하였다. 데이터는, 각각의 세포 농도에서, pExo 처리된 배양물이 PBS 대조군과 비교할 때 상당히 더 낮은 루미넥스 지수(Luminex index)를 가졌음을 나타낸다. 이러한 데이터는, pExo가 MDA231 세포의 성장을 저해하였음을 나타낸다. 도 13을 참고하기 바란다.
12. 실시예 12: 태반 엑소좀은 면역 세포의 활성화 및 분화를 조절한다
면역 세포에 대한 pExo의 효과를 조사하기 위해서, 인간 탯줄 제대혈 T 세포를 PKH 형광 염료로 표지하고, 이어서 pExo 또는 자극제로서의 PHA와 함께 인큐베이션시켰다. RPMI+10% FCS 중에서 5일 동안 배양한 후, 세포를 총 T 세포뿐만 아니라 CD4, CD8, CD69, CD27을 비롯한 T 세포의 상이한 유형의 하위유형을 구별할 수 있는 항체와 함께 FACS를 사용하여 분석한다. 데이터는, pExo의 존재 하에서, CD3+ 세포의 MFI는 대조군 배양물과 유사함을 나타내는데, 이는, pExo 단독이 T 세포에 대한 증식 활성도에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. PHA 자극 시, MFI는 상당히 감소되었는데, 이는 세포가 PHA 및 pExo 둘 다의 존재 하에서 증식하였다는 것을 나타내며, MFI는 PHA 단독과 유사한데, 이는 세포 증식이 pExo의 존재에 의해서 영향을 받지 않음을 나타낸다. CD69+ 세포는 pExo로 처리된 세포에서보다 상당히 더 높고, CD69+ 세포는 CD3+ 세포(T 세포)에서 상당히 증가하였음을 발견하였는데, 이는 T 세포 활성화가 pExo에 의해서 증가되었음을 나타낸다. 이러한 관찰은 제대혈 T 세포 및 PBMC 세포 둘 다에서 발견되었다. 또한, pExo는 PBMC에서 CD56+ 세포(NK) 세포의 백분율을 증가시키는 것을 발견하였다. 도 14, 도 15, 도 16 및 도 17을 참고하기 바란다.
13. 실시예 13: 배양된 태반, 태반 관류액 및 PRP(제대혈 혈청)로부터의 엑소좀의 수율
태반 관류액 및 PRP(제대혈 혈청)를 배양된 인간 태반 조직의 동일한 방법에 의해서 단리시켰다. 하기 표는 태반 관류액으로부터의 엑소좀의 수율을 나타내고, PRP는 배양된 태반보다 상당히 더 낮다.
Figure pct00019
논의:
본 발명의 방법은 고유하고 이로운 특성을 갖는 다량의 엑소좀을 생산할 수 있다. 엑소좀은 엑소좀의 입증된 기능으로 인해서 생물활성인 것으로 여겨지는 다수의 단백질 및 RNA를 함유하는 것을 나타낸다. 엑소좀은 결합 파트너로서, 예를 들어, 수용체 또는 리간드로서 작용할 수 있는 다수의 세포 표면 마커를 발현하기 때문에, 목적하는 세포 유형에 대한 이러한 생물학적 활성의 표적화를 가능하게 한다.
본 명세서에 제공된 데이터는 광범위한 적응증, 예컨대, 표 9에 기재된 것의 엑소좀에 대한 유용성을 나타낸다.
Figure pct00020
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Figure pct00022
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Figure pct00024
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Figure pct00029
제2 시리즈의 실험
14. 실시예 14: 인간 태반의 배양 및 엑소좀의 단리
엑소좀 단리를 위한 인간 태반의 배양: 인간 태반을 제공받고, 혈액을 멸균 PBS 또는 식염수 용액으로 세척한다. 이어서 태반을 항생제가 보충된 1000㎖의 DMEM 배양 배지에서 조직 블록(대략 1×1×1㎝)으로 가공한다. 이어서 태반 조직을 롤러 병 생물-생물반응기에 넣고, 5% CO2를 함유한 세포 배양 인큐베이터(가습)에 넣는다. 배양 시간은 4시간 내지 16시간으로 달라지고, 배양물의 상청액을 엑소좀의 단리를 위해서 사용한다. 새로운 배지를 각각의 수거 시간 지점에 첨가하고, 8시간 또는 12시간 내지 최대 적어도 3일 동안 배양한다.
태반 엑소좀의 단리 및 정제 배양물의 상청액을 3,000g에서 30분 동안 원심분리시켜 세포 및 조직 부스러기를 펠릿화시킨다. 3000g의 상청액을 추가 원심분리를 위해서 -80℃ 동결기에서 동결시켰다. 추가 원심분리를 위해서, 동결된 -80℃ 상청액을 실온 또는 4℃에서 해동한다. 풀링된 샘플의 경우, 상이한 태반 공여자로부터의 배지 상청액을 함께 혼합하였다. 단일 공여자의 경우, 단일 태반 공여자로부터의 상청액을 가공한다. 이어서 해동된 3000g의 상청액을 10,000g에서 1시간 동안 원심분리시키고, 펠릿(작은 세포 부스러기 및 세포 소기관)을 폐기한다. 이어서 상청액을 100,000g에서 2시간 동안 원심분리시킨다. 이어서, 생성된 펠릿을 -80℃에서 분취된 멸균 PBS로 재현탁시킨다.
15. 실시예 15: 태반 엑소좀의 특징규명
단리된 pExo의 크기를 나노 입자 트래킹 검정(젠 바이오사(Zen Bio Inc)에 의해서 수행)에 의해서 분석한다. 총 10개의 상이한 제제를 나타낸다. 데이터는 pExo의 "모드" 크기가 118 +/- 15㎚(나노미터)라는 것을 나타낸다. 풀링된 공여자(Lot 1 내지 Lot 6) 및 단일 공여자(Lot 7 내지 Lot 10) 둘 다.
Figure pct00030
pExo의 단백질 마커를 키트에 의해서 제공된 프로토콜에 따라서 MACSPlex 엑소좀 키트(밀테니이 바이오테크사(Miltenyi Biotec), Cat#130-108-813)를 사용하여 분석하였다. 간략하면, 120uL의 pExo 단리물을 15uL의 엑소좀 포획 비드와 함께 밤새 실온에서 인큐베이션시켰다. 1㎖의 세척 용액으로 1회 세척한 후, 엑소좀을 엑소좀 검출 시약 CD9, CD63 및 CD81 칵테일과 함께 인큐베이션시키고, 추가로 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 2회 세척 후, 샘플을 FACS(BD Canto 10)로 분석하였다. mIgG1 및 REA 대조군을 제외하고 이 키트에는 총 37종의 단백질 마커(도 18)가 포함된다.
pExo 샘플을 41종의 사이토카인을 포함하는 MiltiPlex Luminex 키트를 사용하여 사이토카인의 함량에 대해서 분석하였다. 하기 표는 상이한 pExo 제제(풀링된 공여자 또는 단일 공여자)로부터의 사이토카인 및 성장 인자를 나타낸다. 이 데이터는, pExo가 FGF2, G-CSF, 프락탈카인(Fractalkine), PDGF-AA/BB, GRO, IL-1RA, IL-8, VEGF, RANTES, IL-15, IL-4, IL-6, IP-10, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, TNFa를 비롯한 사이토카인의 상이한 수준을 함유한다는 것을 나타내었다. 이들 사이토카인 및 성장 인자는 세포 증식, 조직 및 기관 재생에 연관되고, 면역-조절 활성을 갖는다고 공지되어 있다.
Figure pct00031
Figure pct00032
16. 실시예 16: 태반 엑소좀(pExo)의 시험관내 기능성 활성
태반 엑소좀은 인간 신장 상피 세포의 증식을 촉진한다(도 19). 10종의 상이한 pExo 제제를 사용하여 증식 검정에서 인간 신장 상피 세포의 증식에 대한 이의 효과를 시험하였다. 이 검정에서, 5×10e4개의 세포를 웰당 24-웰 플레이트에 시딩하고, 각각의 pExo 처리를 3개의 농도로 시험하였다. 4일 후, 각각의 웰로부터의 세포를 수거하고, 계수하였다. 배수 증식을 투입 세포 수에 대해서 계산한다. 이 데이터는, 모든 10종의 pExo 제제가 기초 배지에 비해서 pExo의 증식을 자극하였다는 것을 나타내었다. 모두는 20%의 완전 배지(대조군 배지)와 동등하고, 일부는 완전 배지보다 훨씬 더 높았다. 이 데이터는, pExo가 인간 신장 상피 세포의 성장을 촉진시키는 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.
태반 엑소좀은 인간 기관지 기관 상피 세포(PBTEC)의 증식을 촉진시킨다(도 20). 하기 실시예에서 pExo를 96-웰 플레이트에서 1ug/㎖ 내지 25ug/㎖의 4가지 농도로 사용하여 인간 1차 기관지 폐 상피 세포의 증식(3000개 세포/웰)에 대한 효과를 조사하였다. 처리 3일 후, 세포 증식을 WST-1 증식 키트(시그마사(Sigma))를 사용하여 측정하였다. 데이터는, pExo가 용량 의존적인 방식으로 PBTEC를 촉진시킨다는 것을 나타낸다.
태반 엑소좀은 인간 피부 섬유모세포(HDF)의 증식을 촉진시킨다(도 21). 하기 실시예에서 pExo를 96-웰 플레이트에서 1ug/㎖ 내지 25ug/㎖의 4가지 농도로 사용하여 인간 1차 기관지 폐 상피 세포의 증식(3000개 세포/웰)에 대한 효과를 조사하였다. 처리 3일 후, 세포 증식을 WST-1 증식 키트(시그마사(Sigma))를 사용하여 측정하였다. 데이터는, pExo가 용량 의존적인 방식으로 인간 피부 섬유모세포를 촉진시킨다는 것을 나타낸다.
17. 실시예 17: 태반 엑소좀(pExo)의 생체내 분포
생체내 pExo의 생체 분포를 결정하기 위해서, pExo를 형광 염료(Exo-Glow, 에스비아이사(SBI Inc))로 표지하고, 표지된 pExo 300ug을 꼬리 정맥을 통해 마우스에 주입하였다. 그런 다음 동물을 희생시키지 않고 전신 라이브 영상화 시스템으로 염료의 분포를 관찰하였다. 유리 염료를 대조군으로 사용하였다. 데이터는, pExo의 신호가 마우스에서 6일까지 유리 염료보다 훨씬 더 높고, pExo가 마우스의 상체와 하체 모두에 존재한다는 것을 나타내었다.
상이한 기관 및 조직에서 pExo의 분포를 결정하기 위해서, 마우스에게 유리 Exo-Glow 염료 또는 표지된 pExo(300ug)를 주입하였다. 주입 48시간 후, 마우스를 희생시키고 생체외에서 기관을 분석하였다. 데이터는, pExo가 폐, 간, 비장, 위, GI관 및 대퇴골(골수)에 존재함을 나타낸다. 상이한 기관에서 염료 분포의 생체외 분석을 생체외 영상화에 의해 분석하였다.
18. 실시예 18: 조직 및 기관 복구에서의 pExo의 생체내 활성
뇌졸중 모델: pExo가 생체내에서 생물학적 활성을 가질 수 있는지 결정하기 위해서, 2마리의 단일 태반 공여자로부터 2개의 pExo 제제를 하기에 도시된 연구 설계와 같이 MCAO 뇌졸중 모델에 사용하였다. 각각의 동물에게 뇌졸중 유도 후 1일, 6일 및 11일에 100ug의 pExo 3개를 제공하였다. PBS(비히클)를 대조군으로 사용한다. 래트를 매주 제35일까지 신경학적 중증도 점수, 보행 테스트, 앞다리 배치 및 신체 점수로 평가하였다.
동물의 신경학적 기능은, pExo로 치료된 뇌졸중이 있는 래트가 제7일에서부터 제35일까지 신경점수가 유의하게 개선되었음을 나타낸다. 보디 스윙, 앞다리 배치, 보행 검사를 포함한 다른 기능 시험은 모두 pExo 치료에 의해 상당한 개선을 나타낸다.
뒷다리 허혈 모델(HLI): 조직 및 기관 복구를 위한 pExo의 기능을 당뇨병 마우스가 뒷다리 허혈을 갖도록 수술로 유도된 제2 마우스 HLI 모델에서 시험하였다. 마우스에게 수술 후 1, 6 및 11일에 100ug을 주사하고(i.v.), 수술 후 제2주 및 제4주에 뒷다리의 혈류를 측정하였다. 결과는, 두 pExo 처리 모두 이들 동물의 앞다리의 혈류를 개선하였음을 나타낸다.
항노화 연구: 노화에 대한 pExo의 효과를 52주령 수컷 C57BL/6J 마우스에서 결정하였다. 종점은 T 림프구, 혈장 인슐린 및 내당능, 가속 로타로드 검사, 임상 화학 및 혈액학의 측정이었다. 연구 결과는 곧 발표될 예정이며, 생체내에서, pExo의 항노화 효과를 계속해서 입증될 것으로 예상된다.
로타로드 검정을 4개의 EzRod 시험 챔버를 사용하여 수행하였다. 가속 로타로드 패러다임을 위해, 마우스에서 최대 지속 기간 3분 및 30초 ITI로 4회의 시험을 수행하였다. 각각의 마우스를 EZRod 기계에 놓고, 모든 시험에 대해 낙하 대기 시간을 기록하였다. 마우스가 떨어지거나 3분이 경과하면, 다음 시험을 시작하기 전에 마우스를 EzRod 시험 챔버 바닥에 30초 동안 방치하였다.
내당능 분석을 위해서, 마우스를 4시간 동안 금식시켰다. 약 1㎜의 꼬리를 제거한 후 꼬리 끝에서 혈당을 측정하였다. 혈액의 첫 번째 방울을 시간 0에 대한 혈당계(One-Touch Ultra)를 통해 확인하였다. 혈액을 또한 시간 0에 꼬리 조각에서 수집하고, 인슐린 측정을 위해 혈장으로 가공하였다. 시간 0 절차 직후에, 글루코스(멸균수 중의 20% 용액)를 경구 위관 영양법(oral gavage)(10㎖/㎏에서 2g/㎏)을 통해 투여하고, 후속 글루코스 측정 및 인슐린을 위한 혈액을 글루코스 투여 후 15, 30, 60 및 120분에 수집하였다.
GVHD 모델: 단일 또는 다중 용량의 pExo를 3천만 개의 인간 PBMC를 정맥내 제공받은 마우스에게 IV로 투여하였다. GVHD에 대한 효과를 생존 및 체중 분석으로 측정하고, 세포 생착을 분석하였다.
상기에서 관찰된 항노화 효과 및 T 세포 억제에 기초하여, PD-L1 및 Visfatin 키트를 사용하여 pExo 샘플을 시험하고 데이터를 pg 또는 ng/㎎으로 정규화하였다. 결과는, pExo가 상당한 수준의 PD-L1 및 Visfatin(eNAMPT)을 함유하고 있음을 나타낸다.
Figure pct00033
19. 실시예 19: pExo를 사용한 폐 손상의 치료
폐 손상 치료에서 pExo의 역할을 추가로 평가하기 위해서, 본 발명자들은 인간 1차 세포(폐 기관지/기관 상피 세포)의 증식에 대한 pExo의 활성을 평가하고, 세포 증식 검정에서 DMEM 배양 pExo와 PBS 배양 pExo를 비교하였다. 세포를 96웰 플레이트에 3000개 세포/웰(n=3)로 시딩하고, 밤새 배양 후 PBS로 세척하고, 2일 동안 pExo의 존재 하에서 처리하거나 또는 pExo 없이 처리한 후 WST 검정하고, 데이터를 기초 배지(BM)에 정규화하였다. 결과는, DMEM(6명의 상이한 공여자)과 PBS(3명의 상이한 공여자)로부터 배양된 pExo가 폐 기관지 기관 상피 세포(PBTEC)의 증식을 증가시키는 것을 나타내었다. 본 연구는, pExo가 폐 감염 환자(예를 들어, COVID-19 환자)의 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS) 및/또는 인공호흡기 유도된 손상과 같은 폐 손상 질환에 사용될 수 있음을 입증한다.
pExo가 인간 1차 세포에서 용량 의존적 방식으로 증식을 증가시키는지를 평가하기 위해서, 세포를 96웰 플레이트에 3000개 세포/웰(n=3)로 시딩한 다음, 밤새 배양한 후 PBS로 세척하였다. 세포를 2일 동안 증가하는 농도의 pExo(1 내지 25㎍/㎖)로 처리한 후, WST 검정하고, 데이터를 기초 배지에 정규화하였다. 결과는 pExo가 PBTEC에서 용량 의존적 방식으로 증식을 증가시킨다는 것을 입증하는데, 이는 치료를 자극하는 역할 및 폐 손상 치료제로서의 유용성을 추가로 뒷받침한다.
본 발명자들은 다음으로 MSD 검정으로 선택된 사이토카인 및 케모카인 조성을 평가하고, DMEM, PBS 및 식염수(0.89% NaCl)의 3가지 다른 배양 조건으로부터의 pExo를 비교하였다. 간략하면, PBS 또는 식염수에 재현탁되기 전에 확립된 순차적 원심분리를 통해 pExo를 단리하고, 제조사의 지침에 따라 MSD 검정에 첨가하였다. 데이터를 개별 pExo 농도에 따라 pg/㎎ pExo로 정규화하였고, 데이터는 하기 표에 나타낸 바와 같이 시험된 샘플의 평균이다.
Figure pct00034
결과는 pExo가 조사된 사이토카인과 시험된 케모카인을 각각 함유함을 나타낸다. 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor: HGF)는 이러한 시험된 분자 중에서 가장 높은 수준을 가지며, DMEM 배양 pExo는 다른 배양 방법에 비해 시험된 대부분의 이러한 케모카인 및 사이토카인이 더 풍부하다. 본 연구는 pExo가 많은 세포 유형에 대한 재생 활성으로서 높은 수준의 HGF를 함유하고, DMEM 배양으로부터 유래된 pExo가 케모카인 및 사이토카인이 보다 더 풍부하다는 것을 입증한다.
20. 실시예 20: Covid-19 유도된 또는 인공호흡기 유도된 폐 손상의 치료
인공호흡기-연관된 폐 손상(ventilator-associated lung injury: VALI)은 기계 호흡 중에 발생하는 급성 폐 손상으로 인공호흡기-유도된 폐 손상(ventilator-induced lung injury: VILI)이라고도 지칭된다. 기계 호흡 동안, 폐로의 가스 흐름은 저항이 가장 적은 경로를 따를 것이다. 허탈(collapsing)되거나 분비물로 채워진 폐 영역은 과소 팽창되는 반면, 상대적으로 정상적인 영역은 과팽창될 것이다. 이러한 영역은 과도하게 팽창되어 손상될 것이다. 또 다른 가능한 인공호흡기-연관 폐 손상은 생체손상(biotrauma)으로 알려져 있다. 생체손상은 염증 반응의 임의의 매개체 또는 균혈증으로 인한 손상을 앓고 있는 폐와 관련된다. 결국, 산소 독성이 산화 스트레스를 포함한 여러 기전을 통해 인공호흡기-연관 폐 손상에 기여한다. VALI는 급성 폐 손상 또는 급성 호흡 곤란 증후군(ALI/ARDS)에 대해서 기계 호흡을 제공받는 사람에게 가장 흔하다. 기계 호흡하는 사람의 24%는 ALI 또는 ARDS가 아닌 다른 이유로 VALI가 발생할 것이다(https://en.wikipedia.org/wiki/Ventilator-associated_lung_injury).
전임상 데이터는 중간엽 줄기세포가 VILI 이후 조직 복구를 촉진함으로써 VILI를 치료하는 데 사용될 수 있음을 뒷받침한다. MSC는 부상 관련 전염증성 반응을 감소시켜 박테리아 감염에 대한 숙주 반응을 향상시킬 수 있다. MSC는 가용성 분비 생성물 및 미세소포 또는 엑소좀 둘 다에서 기인하는 주변분비(paracrine) 의존성뿐만 아니라 직접적인 세포-세포 상호작용을 포함한 다중 기전을 통해 영향을 미치는 것으로 나타났다(문헌[Horie and Laffrey. (2016) Recent insights: mesenchymal stromal/stem cell therapy for acute respiratory distress syndrome. F1000Research. (doi:10.12688/f1000research.8217.1)]).
본 발명자들은 다음 결과에 기초하여 Covid-19 유도 폐 손상 또는 VILI의 치료를 위해 태반 엑소좀(pExo)을 사용할 것을 제안한다:
1. pExo는 시험관내에서 인간 폐 기관지 상피 세포의 세포 증식을 촉진한다.
2. pExo는 HGF, PDGF-BB, FGF2를 포함한 사이토카인 조성을 함유한다. 혈관신생 촉진(pro-angiogenesis) 및 재생 촉진(pro-regeneration)인 VEGF.
3. pExo는 조직 복구를 위한 상피 세포인 HUVEC의 이동을 유인할 수 있는 케모카인을 함유한다.
4. pExo는 세포에 대한 산화 독성 손상을 감소시킨다.
5. pExo는 전임상 동물 모델에서 폐에 국지화된다.
6. pExo는 생체내에서 마우스 혈관신생을 개선한다.
결론
본 명세서에 존재하는 결과는 인간 태반 유래 엑소좀(pExo)이 상이한 인간 기관 및 조직으로부터 유래된 세포의 증식을 자극하는 데 중요한 생물학적 활성을 함유하고 있음을 나타낸다. 생체내 데이터는, pExo가 설치류 모델에서 폐, 간, 신장, 비장, 골수, GI관 및 위를 포함한 상이한 기관에 분포하고 인간에게 투여되는 경우 유사한 결과를 가질 가능성이 있음을 뒷받침한다. 인간에서 pExo의 투여는 pExo의 생물학적 분자를 이러한 기관으로 이동시키고, 이것은 설치류 모델에서와 같이 이러한 기관에서 지속될 것이다. 조직 및 기관 손상(뇌졸중 및 HLI)의 두 동물 모델에서 pExo는 대조군과 비교하여 동물의 회복에 상당한 이점을 나타내었다. 이러한 증거는 pExo가 하기 질환 또는 적응증을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 인간의 치료제에 유익할 것임을 뒷받침한다.
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
등가물:
본 개시내용은 본 명세서에 기재된 구체적인 실시형태에 제한되지 않는다. 실제로, 기재된 것에 더하여, 본 명세서에 제공된 주제의 다양한 변형은 상기 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되도록 의도된다.
다양한 간행물, 특허 및 출원이 본 명세서에 인용되며, 이의 개시내용은 전문이 참조에 의해 포함된다.

Claims (60)

  1. 대상체에서 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 엑소좀의 집단 또는 엑소좀의 집단을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 엑소좀의 집단은 CD1c, CD20, CD24, CD25, CD29, CD2, CD3, CD8, CD9, CD11c, CD14, CD19, CD31, CD40, CD41b, CD42a, CD44, CD45, CD49e, CD4, CD56, CD62P, CD63, CD69, CD81, CD86, CD105, CD133-1, CD142, CD146, CD209, CD326, HLA-ABC, HLA-DRDPDQ, MCSP, ROR1, SSEA-4 또는 이들의 조합물에 대해서 양성인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀의 집단은 CD1c, CD20, CD24, CD25, CD29, CD2, CD3, CD8, CD9, CD11c, CD14, CD19, CD31, CD40, CD41b, CD42a, CD44, CD45, CD49e, CD4, CD56, CD62P, CD63, CD69, CD81, CD86, CD105, CD133-1, CD142, CD146, CD209, CD326, HLA-ABC, HLA-DRDPDQ, MCSP, ROR1 및 SSEA-4에 대해서 양성인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀의 집단은 CD9, CD29, CD42a, CD62P, CD63, CD81, CD133-1, CD146, HLA-DRP 또는 이들의 조합물에 대해서 양성인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 엑소좀의 집단은 CD9, CD29, CD42a, CD62P, CD63, CD81, CD133-1, CD146 및 HLA-DRP에 대해서 양성인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀의 집단은 CD1c, CD20, CD24, CD25, CD29, CD2, CD3, CD8, CD9, CD11c, CD14, CD19, CD31, CD40, CD41b, CD42a, CD44, CD45, CD49e, CD4, CD56, CD62P, CD63, CD69, CD81, CD86, CD105, CD133-1, CD142, CD146, CD209, CD326, HLA-ABC, HLA-DRDPDQ, MCSP, ROR1 및 SSEA-4로 이루어진 군으로부터 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 또는 그 초과의 마커에 대해서 양성인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 엑소좀의 집단은 CD9, CD29, CD42a, CD62P, CD63, CD81, CD133-1, CD146 및 HLA-DRP로 이루어진 군으로부터 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 또는 그 초과의 마커에 대해서 양성인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀의 집단은 CD3-, CD11b-, CD14-, CD19-, CD33-, CD192-, HLA-A-, HLA-B-, HLA-C-, HLA-DR-, CD11c- 또는 CD34-인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀의 집단은 CD3-, CD11b-, CD14-, CD19-, CD33-, CD192-, HLA-A-, HLA-B-, HLA-C-, HLA-DR-, CD11c- 및 CD34-인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀의 집단은 비-암호 RNA 분자를 포함하는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 비-암호 RNA 분자는 마이크로RNA인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 마이크로RNA는 표 7의 마이크로RNA 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 마이크로RNA는 hsa-mir-26b, hsa-miR-26b-5p, hsa-mir-26a-2, hsa-mir-26a-1, hsa-miR-26a-5p, hsa-mir-30d, hsa-miR-30d-5p, hsa-mir-100, hsa-miR-100-5p, hsa-mir-21, hsa-miR-21-5p, hsa-mir-22, hsa-miR-22-3p, hsa-mir-99b, hsa-miR-99b-5p, hsa-mir-181a-2, hsa-mir-181a-1, hsa-miR-181a-5p 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀의 집단은 표 3 또는 표 11의 사이토카인 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인을 포함하는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀의 집단은 표 4의 사이토카인 수용체 및 이들의 조합물을 포함하는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀의 집단은 표 6의 단백질 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 포함하는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀의 집단은 세포질 아코니테이트 하이드라타제(Cytoplasmic aconitate hydratase), 세포 표면 당단백질 MUC18, 단백질 아르기닌 N-메틸트랜스퍼라제 1, 구아닌 뉴클레오타이드-결합 단백질 G(들) 소단위 알파, 쿨린(Cullin)-5, 칼슘-결합 단백질 39, 글루코시다제 2 소단위 베타, 클로라이드 세포내 채널 단백질 5, 세마포린-3B, 60S 리보솜 단백질 L22, 스플라이소솜(Spliceosome) RNA 헬리카제 DDX39B, 전사 활성화인자 단백질(Transcriptional activator protein) Pur-알파, 세포 예정사 단백질(Programmed cell death protein) 10, BRO1 도메인-함유 단백질 BROX, 카이뉴레닌--옥소글루타레이트 트랜스아미나제 3, 라미닌(Laminin) 소단위 알파-5, ATP-결합 카세트 서브-패밀리 E 구성원 1, 신탁신-결합 단백질 3, 프로테아솜 소단위 베타 타입-7 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 포함하는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀의 집단은 태반-유래 엑소좀 집단인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 태반-유래 엑소좀 집단은 전체 태반 배양물의 배지로부터 유래되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 태반-유래 엑소좀 집단은 태반엽(placental lobe) 또는 태반의 부분을 포함하는 배양물의 배지로부터 유래되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 태반-유래 엑소좀 집단은 태반 줄기세포, 바람직하게는 태반-유래 부착 세포(PDAC)를 포함하는 배양물의 배지로부터 유래되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 조직 배양 배지, 식염수 용액 및 완충 식염수 용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀의 집단은 간충직 줄기세포, 제대혈 또는 태반 관류액으로부터 유래된 엑소좀의 집단보다 적어도 2배 더 높은 수준으로 적어도 1종의 마커 분자를 포함하는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀의 집단은 간충직 줄기세포, 제대혈 또는 태반 관류액으로부터 유래된 엑소좀의 집단보다 적어도 2배 더 낮은 수준으로 적어도 1종의 마커 분자를 포함하는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태는 폐 질환, 장애 또는 병태인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 폐 질환, 장애 또는 병태는 급성 폐 손상, 급성 및 만성 질환, 천식, 만성 페쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease: COPD), 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 폐암 후 폐 수술의 회복, 폐 색전증, 급성 호흡 곤란 증후군, 폐렴, 바이러스 감염, 코로나바이러스 감염, Covid-19 및 인공호흡기 유도된 폐 손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태는 간 질환, 장애 또는 병태인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 간 질환, 장애 또는 병태는 급성 간 손상, 급성 및 만성 질환, 간 경변증, 간 섬유증, 간 염증, 대사 장애, 약물에 의해 유발된 간 손상, 독, 알코올, 바이러스(예를 들어, 간염) 또는 다른 감염 질환 및 담즙정체성 간 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  28. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태는 뇌/척수 질환, 장애 또는 병태인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 뇌/척수 질환, 장애 또는 병태는 급성 뇌/척수 손상, 급성 및 만성 질환, 뇌졸중, 일과성 허혈성 발작, 파킨슨 및 다른 운동 장애, 치매, 알츠하이머병 뇌전증/발작, 척수병증, 다발성 경화증, 중추 신경계의 감염, 척수 외상, 척수 염증, 근위축성 측삭 경화증, 척수성 근위축으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  30. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태는 신장 질환, 장애 또는 병태인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 신장 질환, 장애 또는 병태는 급성 신장 손상, 급성 및 만성 질환, 외상, 약물(예를 들어, 화학치료제)에 의해서 유도된 신장 손상 또는 신장 부상, 신장 낭종, 신장 결석 및 신장 감염, 신장 이식 후 신장 기능의 회복, 당뇨병성 신장 질환 및 다낭성 신장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  32. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태는 위장 질환, 장애 또는 병태인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 위장 질환, 장애 또는 병태는 급성 위장 손상, 자가면역 질환, 급성 및 만성 질환, 크론병, 과민성 대장 증후군, 항문주위 농양, 대장염, 대장 용종 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  34. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태는 골수 질환, 장애 또는 병태인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  35. 제32항에 있어서, 상기 골수 질환, 장애 또는 병태는 급성 및 만성 질환, 빈혈, 백혈구 감소증, 혈소판감소증 재생불량성 빈혈, 골수증식성 장애 및 줄기세포 이식으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  36. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태는 눈 질환, 장애 또는 병태인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 눈 질환, 장애 또는 병태는 급성 눈 손상, 만성 및 급성 눈 질환, 안구 건조 증후군 및 당뇨망막병증 및 황반변성으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  38. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태는 비장 질환, 장애 또는 병태인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 비장 질환, 장애 또는 병태는 급성 비장 손상, 만성 및 급성 비장 질환, 비장 기능이 비대하거나 조절되지 않는 것과 연관된 질환 및 루푸스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  40. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태는 피부 질환, 장애 또는 병태인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 피부 질환, 장애 또는 병태는 급성 피부 손상, 만성 및 급성 피부 질환, 당뇨병성 족부 궤양, 화학적 화상으로 인한 상처, 불 화상, 예를 들어, 상처로 인해 유발되는 피부 또는 조직 손상, 질환 또는 수술 절차, 탈모, 모낭 질환, 장애 또는 병태, 주름 및 감소된 탄력으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  42. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태는 허혈성 질환, 장애 또는 병태인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 허혈성 질환, 장애 또는 병태는 급성 허혈성 손상, 만성 및 급성 허혈성 질환, 허혈성 심장 질환, 허혈성 혈관 질환, 허혈성 대장염, 장간막 허혈, 뇌 허혈(예를 들어, 뇌졸중), 급성 또는 만성 하지 허혈, 피부 허혈, 허혈성 신장 및 혈관신생의 촉진을 필요로 하는 조직 또는 기관에서의 혈관신생의 촉진으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  44. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태는 심장/심혈관 질환, 장애 또는 병태인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 심장/심혈관 질환, 장애 또는 병태는 급성 심장/심혈관 손상, 고혈압, 죽상경화증, 심근경색(myocardial infarction: MI) 및 만성 심부전으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  46. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태는 노화 연관 질환, 장애 또는 병태인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  47. 제42항에 있어서, 상기 노화 연관 질환, 장애 또는 병태는 노화 관련 허약, 노화 관련 당뇨병성 족부 궤양, 알츠하이머병; 노화 관련 황반변성, 노화 관련 난청, 노화 관련 기억력 저하, 노화 관련 인지력 감퇴, 노화 관련 치매, 노화 관련 핵성 백내장, 노화 연관된 기능 상실 및 노화의 다른 효과로 이루어진 군으로부터 선택되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  48. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태는 전신 질환, 장애 또는 병태인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 전신 질환, 장애 또는 병태는 급성 및 만성 질환, 이식편대숙주병 및 감염(예를 들어, 귀 감염)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 정맥내 투여를 위해서 제형화되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  51. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 국지 주사를 위해서 제형화되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  52. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 국소 투여를 위해서 제형화되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  53. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 흡입을 위해서 제형화되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  54. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 경구 투여를 위해서 제형화되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  55. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 피하 투여를 위해서 제형화되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  56. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 협측 또는 설하 투여를 위해서 제형화되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  57. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 귀에 대한 투여를 위해서 제형화되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  58. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 비내 투여를 위해서 제형화되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  59. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 안구 투여를 위해서 제형화되는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
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