CN108627506A - 一种食品中罗丹明b胶体金刚碳检测试纸条的制备方法 - Google Patents

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张兴梅
张科
韩琰旭
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Abstract

本发明涉及一种食品中罗丹明B胶体金刚碳检测试纸条的制备方法，该方法用黑色标记物胶体金刚碳代替胶体金显色，有明显的优势，检测线为微红色为阳性，变黑则为阴性。这样既保持了免疫法的快速，操作简单等有点，又提高了灵敏度和特异性。

Description

一种食品中罗丹明B胶体金刚碳检测试纸条的制备方法
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，尤其涉及一种食品中罗丹明B胶体金刚碳检测试纸条的制备方法。
背景技术
罗丹明B(Rhodamine B)又称玫瑰红B,或碱性玫瑰精，俗称花粉红，分子式：C28H31ClN2O3，分子量:479.01；是一种具有鲜桃红色的人工合成的染料。经老鼠试验发现，罗丹明B会引致皮下组织生肉瘤，被怀疑是致癌物质。罗丹明B在溶液中有强烈的荧光,用作实验室中细胞荧光染色剂、有色玻璃、特色烟花爆竹等行业。由于其廉价，着色效果好，曾经用作食品添加剂，但后来实验证明罗丹明B会致癌，现在已不允许用作食品染色。但是有些不法分子在利益的驱使下仍会使用罗丹明B作为食品的着色剂，这就要对其进行日常监管；所以我们对不法分子将罗丹明B用于食品加工生产的行为要坚决抵制，有关部门坚决查处。
对罗丹明B的检测目前分为两种：定量检测和快速检测。定量检测主要有色谱法，光谱法，分光光度法，这种方法准确、定量分析，但是不适合现场快速检测；快速检测常用的方法有胶体金层析方法和ELSIA方法，快速检测在打击犯罪和快速查处执法方面很有效果。
胶体金层析方法最为快速，操作最为简单，但是由于免疫胶体金方法的原理所致，检测线包埋的罗丹明B-BSA抗原为红色细线，所以当红色的免疫胶体金与罗丹明B-BSA结合呈现的红色时，二者有视觉上的重叠，很难区分阴阳性，或者只能通过深浅判断，严重影响灵敏度；另一方面红色基质对检测线的判断也是有一定的影响，从而影响特异性。
发明内容
针对现阶段的罗丹明B胶体金检测试纸条存在的问题，本发明提供了一种食品中罗丹明B胶体金刚碳检测试纸条的制备方法，该方法解决了传统试纸条上面T线红色与胶体金红色重叠的问题，同时对其它试纸条的生产具有一定的参考价值，而且能够清晰判断、快速、准确的判断，操作简单。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种食品中罗丹明B胶体金刚碳检测试纸条的制备方法，它包括以下步骤：
S1：胶体碳金钢化：选择粒径在10-100nm之间胶体碳溶液，接着在3个大气压的压力下煮沸胶体碳溶液30-40min，然后于40-60KHZ下超声30-40min，得到均匀分散成的胶体金刚碳溶液，最后将其稀释成标准浓度的胶体金刚碳溶液；
S2：取粒径为40nm的胶体金钢碳溶液100mL，调至pH＝7.2，分别标记抗体得到碳标抗体溶液；
S3：先将碳标抗体溶液于常温、转速为1200-1500rpm条件下离心20-30min，弃去由凝聚的碳颗粒形成的沉淀，取黑色上清溶液于4℃在转速为8000r/min条件下离心30min，离心后溶液分为三层：透明上清液、管底可流动的黑色沉淀及管底壁上黑色致密的毯子碳颗粒层，将可流动的黑色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量0.8倍，加入0.1％的叠氮钠4℃保存备用；
S4：将样品垫和碳标抗体结合垫通过处理液进行水化和封闭处理：样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封闭处理，浸泡30min后于温度37℃下烘干2小时，结合垫处理液为：含有终质量浓度为0.3％吐温-20、2％海藻糖、10％蔗糖及pH值为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液；
S5：将步骤S2碳标抗体溶液喷涂在碳标抗体结合垫上：喷涂机将碳标抗体在结合垫上均匀喷涂，喷样量在30μL/cm2，37℃真空干燥；
S6：检测点抗原和控制点二抗的包被：分别将包被抗原均稀释到0.8mg/mL，二抗稀释到0.2mg/mL，点样在NC膜上分别为检测点和质控点，于温度37℃下干燥；
S7：试纸条的组装：将2.4cm×0.8cmNC膜、1.8cm×0.8cm吸水纸、0.6cm×0.8cm胶体碳结合垫、1.5cm×0.8cm样品垫依次粘贴在PVC胶板上，即成胶体金刚碳试纸条大板。
根据上述的食品中罗丹明B胶体金刚碳检测试纸条的制备方法，步骤S2中标记抗体的方法如下：取100mL胶体碳溶液，在磁力搅拌器下混合条件下，加入最佳用量(6μg/mL)的单克隆抗体，加入终质量浓度为1％的海藻糖，接着加入终质量浓度为0.5％的BSA，得到碳标抗体100mL，4℃保存过夜后冷冻超速离心纯化。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明方法用黑色标记物胶体金刚碳代替胶体金显色，有明显的优势，检测线为微红色为阳性，变黑则为阴性。这样既保持了免疫法的快速，操作简单等有点，又提高了灵敏度和特异性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明提供了本发明提供了一种食品中罗丹明B胶体金刚碳检测试纸条的制备方法，它包括以下步骤：
S1：胶体碳金钢化：选择粒径在10-100nm之间胶体碳溶液，接着在3个大气压的压力下煮沸胶体碳溶液30-40min，然后于40-60KHZ下超声30-40min，得到均匀分散成的胶体金刚碳溶液，最后将其稀释成标准浓度的胶体金刚碳溶液；
S2：取粒径为40nm的胶体金钢碳溶液100mL，调至pH＝7.2，分别标记抗体得到碳标抗体溶液；标记抗体的方法如下：取100mL胶体碳溶液，在磁力搅拌器下混合条件下，加入最佳用量(6μg/mL)的单克隆抗体，加入终质量浓度为1％的海藻糖，接着加入终质量浓度为0.5％的BSA，得到碳标抗体100mL，4℃保存过夜后冷冻超速离心纯化；
S3：先将碳标抗体溶液于常温、转速为1200-1500rpm条件下离心20-30min，弃去由凝聚的碳颗粒形成的沉淀，取黑色上清溶液于4℃在转速为8000r/min条件下离心30min，离心后溶液分为三层：透明上清液、管底可流动的黑色沉淀及管底壁上黑色致密的毯子碳颗粒层，将可流动的黑色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量0.8倍，加入0.1％的叠氮钠4℃保存备用；
S4：将样品垫和碳标抗体结合垫通过处理液进行水化和封闭处理：样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封闭处理，浸泡30min后于温度37℃下烘干2小时，结合垫处理液为：含有终质量浓度为0.3％吐温-20、2％海藻糖、10％蔗糖及pH值为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液；
S5：将步骤S2碳标抗体溶液喷涂在碳标抗体结合垫上：喷涂机将碳标抗体在结合垫上均匀喷涂，喷样量在30μL/cm2，37℃真空干燥；
S6：检测点抗原和控制点二抗的包被：分别将包被抗原均稀释到0.8mg/mL，二抗稀释到0.2mg/mL，点样在NC膜上分别为检测点和质控点，于温度37℃下干燥；
S7：试纸条的组装：将2.4cm×0.8cmNC膜、1.8cm×0.8cm吸水纸、0.6cm×0.8cm胶体碳结合垫、1.5cm×0.8cm样品垫依次粘贴在PVC胶板上，即成胶体金刚碳试纸条大板。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种食品中罗丹明B胶体金刚碳检测试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1：胶体碳金钢化：选择粒径在10-100nm之间胶体碳溶液，接着在3个大气压的压力下煮沸胶体碳溶液30-40min，然后于40-60KHZ下超声30-40min，得到均匀分散成的胶体金刚碳溶液，最后将其稀释成标准浓度的胶体金刚碳溶液；
S2：取粒径为40nm的胶体金钢碳溶液100mL，调至pH＝7.2，分别标记抗体得到碳标抗体溶液；
S3：先将碳标抗体溶液于常温、转速为1200-1500rpm条件下离心20-30min，弃去由凝聚的碳颗粒形成的沉淀，取黑色上清溶液于4℃在转速为8000r/min条件下离心30min，离心后溶液分为三层：透明上清液、管底可流动的黑色沉淀及管底壁上黑色致密的毯子碳颗粒层，将可流动的黑色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量0.8倍，加入0.1％的叠氮钠4℃保存备用；
S4：将样品垫和碳标抗体结合垫通过处理液进行水化和封闭处理：样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封闭处理，浸泡30min后于温度37℃下烘干2小时，结合垫处理液为：含有终质量浓度为0.3％吐温-20、2％海藻糖、10％蔗糖及pH值为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液；
S5：将步骤S2碳标抗体溶液喷涂在碳标抗体结合垫上：喷涂机将碳标抗体在结合垫上均匀喷涂，喷样量在30μL/cm2，37℃真空干燥；
S6：检测点抗原和控制点二抗的包被：分别将包被抗原均稀释到0.8mg/mL，二抗稀释到0.2mg/mL，点样在NC膜上分别为检测点和质控点，于温度37℃下干燥；
S7：试纸条的组装：将2.4cm×0.8cmNC膜、1.8cm×0.8cm吸水纸、0.6cm×0.8cm胶体碳结合垫、1.5cm×0.8cm样品垫依次粘贴在PVC胶板上，即成胶体金刚碳试纸条大板。
2.根据权利要求1所述的食品中罗丹明B胶体金刚碳检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤S2中标记抗体的方法如下：取100mL胶体碳溶液，在磁力搅拌器下混合条件下，加入最佳用量(6μg/mL)的单克隆抗体，加入终质量浓度为1％的海藻糖，接着加入终质量浓度为0.5％的BSA，得到碳标抗体100mL，4℃保存过夜后冷冻超速离心纯化。
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