CN107748147B - 一种白色发光的上转换纳米颗粒及基于其的同时实现多组分肿瘤标志物检测的试纸条 - Google Patents

一种白色发光的上转换纳米颗粒及基于其的同时实现多组分肿瘤标志物检测的试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种白色发光的上转换纳米颗粒及基于其的同时实现多组分肿瘤标志物检测的试纸条，该纳米颗粒具有三层核壳结构，在近红外光激发下发白光；将其标记待检测的多种肿瘤标志物的抗体后，固定在试纸条的标记复合物结合区，可实现对多种肿瘤标志物的同时检测。本发明实现了单一上转换纳米颗粒对多种肿瘤标志物的灵敏检测，其操作简单、特异性好，定性定量实时检测灵敏度高。

Description

一种白色发光的上转换纳米颗粒及基于其的同时实现多组分 肿瘤标志物检测的试纸条
技术领域
本发明属于生物医学诊断技术领域，具体涉及一种多组分肿瘤标志物的上转换试纸检测方法。
背景技术
恶性肿瘤即人们常说的癌症，是机体部分基因表达不受控制，细胞恶性增值破坏正常的机体生命活动，其生长速度快，会造成人体的消瘦、发热及严重的脏器受损，最终危机生命。目前，癌症已成为危及人们生命的第一杀手。因此，对于癌症的前期检测及临床的及时监测已成为现代生物医学的重大课题。随着纳米科技的成熟，纳米技术与癌症标记物的结合平台用于肿瘤标志物的检测已成为热点。胶体金试纸条是最早广泛应用的免疫层析试纸，它结构简单、快速、不需要任何仪器设备，可肉眼辨别结果。但是相比于上转换试纸而言，胶体金试纸条灵敏度差、难以实现定量测量，且稳定性稍差。稀土掺杂上转换发光纳米材料(UCNPs)是一类可以吸收近红外光，而发射短波长近紫外可见光的纳米材料，具有荧光背景弱、无生物干扰、组织穿透能力强、灵敏度高等一系列优点。因此，把UCNPs与免疫层析试纸结合，可以带来突破性的改变，UCNPs反斯托克位移的独特上转换发光现象可以使其在标记生物活性分子时，排除生物样品的自发光干扰现象，提高信噪比，增强灵敏度和稳定性，对癌症标志物实现高灵敏度的定量检测。
上转换试纸检测方法可用于血清学检查，帮助医生进行辅助诊断，这对疗效诊断和随访具有重要价值，且试纸检测方法在操作、反应速度、价格方面都存在明显优势。所检测的肿瘤标志物可以是酶、激素、糖蛋白、胚胎抗原或肿瘤代谢物。目前常见的有：
1、甲胎蛋白
甲胎蛋白(AFP)可为肝癌的早期诊断提供重要依据。内胚层瘤、恶性畸胎瘤、胃癌等伴肝癌转移者体内AFP增高。
2、癌胚抗原
癌胚抗原(CEA)在胃肠道肿瘤、肺癌、乳腺癌、泌尿系肿瘤等可出现增高。癌症病人的胸、腹水、分泌物、消化液中CEA含量增高，且癌症越晚期CEA越高，阳性率越高。
但是现有的上转换试纸条在同时检测多种肿瘤标志物时，不同的T线需要采用不同的上转换纳米颗粒，制作工艺复杂，且严重影响检测效率。
发明内容
为克服上述现有技术所存在的不足之处，本发明提供了一种白色发光的上转换纳米颗粒及基于其的同时实现多组分肿瘤标志物检测的试纸条，旨在利用一种上转换纳米材料同时检测多种肿瘤标志物，提高检测效率。
为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：
本发明首先公开了一种白色发光的上转换纳米颗粒，其特点在于：所述的上转换纳米颗粒用在试纸条上，同时实现多组分肿瘤标志物的检测；所述的上转换纳米颗粒具有三层核壳结构，以掺杂有Yb、Tm和Er的NaGdF4纳米颗粒为内核，在所述内核外包裹有Eu掺杂的NaGdF4第一壳层，且在所述第一壳层外包裹有NaYF4第二壳层，构成Yb、Tm、Er和Eu共掺杂的NaGdF4:Yb/Tm/Er@NaGdF4:Eu@NaYF4核壳结构；所述的上转换纳米颗粒在近红外光激发下发出蓝、绿、红三基色光，总体显示白光发光。
上述的上转换纳米颗粒采用晶种法制备，具体步骤如下：
a、合成掺杂有Yb、Tm和Er的NaGdF4纳米颗粒作为内核
称取油酸(OA)10mL、十八烯(ODE)10mL、Gd(OAc)3 0.0841g、Yb(OAc)3 0.0858g、0.1mol/LTm水溶液25μL、0.2mol/L Er水溶液2μL、NaF固体0.4200g，加入到三口烧瓶A中，磁力搅拌升温至110℃～120℃，保持10min，然后抽真空除去水和氧气；除尽后通N2，升温至300℃，反应1.5h；
b、在所述内核外包裹Eu掺杂的NaGdF4第一壳层
称取油酸(OA)4mL、十八烯(ODE)4mL、Gd(OAc)3 0.0568g、Eu(OAc)3 0.0098g，加入到三口烧瓶B中，磁力搅拌升温至110℃～120℃，保持10min，然后抽真空除去水和氧气；除尽后通N2，升温至220℃，并在步骤a反应结束后，用针管以1mL/min的速度将其注入到所述三口烧瓶A中，300℃反应0.5-1h；
c、在所述第一壳层外包裹NaYF4第二壳层
称取油酸(OA)4mL、十八烯(ODE)4mL、Y(OAc)3 0.0532g，加入到三口烧瓶C中，磁力搅拌升温至110℃～120℃，保持10min，然后抽真空除去水和氧气；除尽后通N2，并在步骤b反应结束后，用针管以1mL/min的速度将其注入到所述三口烧瓶A中，300℃反应0.5-1h；反应完成后降至室温，将三口烧瓶A中反应液于离心管中，离心分离出所得纳米颗粒；
d、剥离步骤c所得纳米颗粒表面的油酸
取步骤c所得纳米颗粒，向其中加pH＝1的乙醇和浓盐酸的混合液，超声分散均匀后，再边震荡边超声30min，然后离心后去掉上清液，再向所得纳米颗粒中加入pH＝4的乙醇和浓盐酸的混合液，超声分散均匀后，再边震荡边超声40-60min，然后再次离心分离，所得纳米颗粒经水洗后，即为水溶性的白色发光的上转换纳米颗粒；
将所述的上转换纳米颗粒分散在pH＝6.5～7.4的0.01M PBS缓冲溶液中储存备用。
以所述的白色发光的上转换纳米颗粒同时实现多组分肿瘤标志物检测的方法，其特点在于：利用所述上转换纳米颗粒所具有的蓝、绿、红三个波段的发光，使一个波段、任意两个波段的组合、及三个波段各对应一种肿瘤标志物的检测，共可实现7种肿瘤标志物的同时检测；以所述的上转换纳米颗粒作为免疫层析试纸条的示踪标志物，利用上转换纳米颗粒的白色发光，或者利用荧光染料与上转换纳米颗粒之间的荧光共振能量转移(FRET)作用，使上转换纳米颗粒相应一个或两个波段的光猝灭，致使上转换纳米颗粒表现出剩下的发光颜色。根据试纸条检测区上纳米颗粒的颜色变化，以判断待检测试样所存在的肿瘤标志物，实现待检测试样中所含肿瘤标志物种类的定性检测。
本发明还公开了一种同时实现多组分肿瘤标志物检测的试纸条，包括加样区、标记复合物结合区、检测区、质控区及手持区，其特点在于：在所述标记复合物结合区固定有上述的白色发光的上转换纳米颗粒，所述白光颗粒上标记有待检测的多种肿瘤标志物的抗体；在所述检测区的不同区域设有与待检测的肿瘤标志物抗体的种类数量相同的若干条检测T线，各检测T线上分别包被有一种待检测的肿瘤标志物的抗体，且各肿瘤标志物的抗体以不同颜色的荧光染料进行修饰；在所述质控区设有质控C线，在所述质控C线上包被有羊抗鼠IgG抗体。
使用时，将待检测试样滴加在所述加样区，若所述待检测试样中存在与标记复合物结合区上转换纳米颗粒上所修饰的多种肿瘤标志物的抗体相对应的抗原，则该抗原与上转换纳米颗粒上标记的相应抗体结合，一同进入检测区并部分固定在检测区相应的T线上，其余部分随待检测试样流入质检区；检测完成后，通过980nm激光激发，观察T线和C线的颜色变化，以判断待检测试样所存在的肿瘤标志物，实现待检测试样中所含肿瘤标志物种类的定性检测。
具体来说，检测时，将待检测试样滴加在所述加样区，若所述待检测试样中存在与标记复合物结合区上转换纳米颗粒上所修饰的多种肿瘤标志物的抗体相对应的抗原，则该抗原与上转换纳米颗粒上标记的相应抗体结合，形成新的结合物并进入检测区，与检测区T线上面相对应的肿瘤标志物抗体结合，被固定在检测区相应的T线上；在980nm激光激发下，各T线上面的荧光染料与上转换纳米颗粒会通过荧光共振能量转移(FRET)作用，将上转换纳米颗粒相应波段的光猝灭，致使上转换纳米颗粒表现出剩下的发光颜色，各T线也显示不同颜色发光；
同时，检测时，将待检测试样滴加在所述加样区，标记复合物结合区上固定的上转换纳米颗粒随检测试样一起向前流动，部分被固定在检测区T线上面，其余部分随待检测试样流入质检区，上转换纳米颗粒上标记的待检测的肿瘤标志物的抗体与质检区C线上面包被的IgG抗体结合，并被固定在质检区C线上；C线上包被的IgG抗体未被染料标记，980nm激光激发下，C线上的颗粒表现出所有波段发光，即白光。
进一步的，在加样区滴加已知浓度的系列标准抗原溶液，进行检测；检测完成后，通过980nm激光激发，获得检测区相应T线与质检区C线的荧光强度，并建立T线和C线荧光强度比值与抗原浓度的标准曲线，以实现待检测试样中所含肿瘤标志物浓度的定量检测。
上述试纸条的制作方法为：
(1)样品垫的处理
以纤维素膜作为样品垫材料，将样品垫在样品垫处理液中浸泡不超过30min后，37℃烘干，完成样品垫的处理；
(2)结合垫的处理
以玻璃纤维素膜作为结合垫材料，首先将结合垫在结合垫处理液中浸泡不超过30min后，37℃烘干，然后再将结合垫放入标记有待检测的多种肿瘤标志物的抗体的白色发光的上转换纳米颗粒的溶液中浸泡不超过30min后，37℃烘干，完成结合垫的处理；
(3)硝酸纤维素膜的处理
将硝酸纤维素膜分为两部分；将待检测的各肿瘤标志物的抗体在第一部分的不同区域以1μL/cm的参数划线，形成若干条包被有一种肿瘤标志物的抗体的检测T线，各肿瘤标志物的抗体以不同颜色的荧光染料进行修饰；将羊抗鼠IgG抗体在第二部分以2μL/cm的参数划线，形成质控C线；烘干，即完成硝酸纤维素膜的处理；
(4)试纸条的组装
从黏性塑料底板的前端向后端依次粘合处理后的样品垫形成加样区、粘合处理后的结合垫形成标记复合物结合区、粘合处理后的硝酸纤维素膜形成检测区和质控区、粘合吸水纸形成手持区，其中检测区位于标记复合物结合区和质控区之间。
其中：步骤(1)所述的样品垫处理液为含有质量浓度0.05～10％BAS和0.1％～2％Tween-20的0.01M、pH＝7.0～8.0的PBS缓冲溶液；步骤(2)所述的结合垫处理液为含有质量浓度0.05～10％BAS、0.1％～3％Tween-20和1％～10％蔗糖的0.01M、pH＝7.0～8.0的PBS缓冲溶液。
步骤(2)所述的标记有待检测的多种肿瘤标志物的抗体的白色发光的上转换纳米颗粒的溶液的获取方法为：将上转换纳米颗粒分散在pH＝6.5～7.4的0.01M PBS缓冲溶液中，然后按照上转换纳米颗粒的质量与待检测的各肿瘤标志物的抗体的质量之比皆为100～300:1，再向PBS缓冲溶液中加入待检测的多种肿瘤标志物的抗体，常温下摇床反应2～4h，然后4℃离心分离，获得标记有待检测的多种肿瘤标志物的抗体的白色发光的上转换纳米颗粒，再分散于含有质量浓度0.5～5％BAS的0.01M、pH＝7.0～8.0的PBS缓冲溶液中，4℃保存，即完成步骤(2)所述的标记有待检测的多种肿瘤标志物的抗体的白色发光的上转换纳米颗粒的溶液的配制。
在肿瘤标志物的抗体上修饰荧光染料的方法为：将抗体稀释在0.1M、pH＝8.0-9.0的碳酸盐缓冲溶液中，然后按照抗体与染料的质量比为10～100:1，加入荧光染料溶液，摇床反应2-4h；所得反应液用0.01M、pH＝7.0-8.0的PBS缓冲溶液进行透析过夜，以除去未结合的染料，即在肿瘤标志物的抗体上修饰上了荧光染料，4℃保存。
优选的，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸的长度为8～17mm，组装时各部分的接触区域相互叠压1～3mm；所述黏性塑料底板的长度为60mm。
本发明的有益效果体现在：
1、本发明以一种上转换纳米颗粒实现了多组分肿瘤标志物的快速检测筛选，准确性及特异性高。
2、本发明的试纸条以UCNPs为生物标记物标记抗体，能在近红外光激发下直接观测结果，由于UCNPs独特的光学特性，消除了背景干扰，灵敏度大大提高；且试纸中的UCNPs对检测者和环境无害，安全性好。
3、本发明的试纸条纸所检测样品无需太多前处理，借助上转换发光传感器可直接实现定量测量，操作简单快捷，可现场操作。
附图说明
图1为实施例1所得上转换纳米颗粒的荧光发射光谱图；
图2为上转换检测试纸条的结构示意图；
图3为免疫反应为阴性的反应示意图；
图4为免疫反应为阳性的反应示意图。
具体实施方式
以下通过实施例和附图对本发明的技术方案进行细致说明。
实施例1、CEA、AFP肿瘤标志物的检测
本实施例以CEA和AFP作为待检测的肿瘤标志物为例，具体如下。
1、UCNPs-抗体的制备
1.1、采用晶种法制备具有三层核壳结构的白色发光的上转换纳米颗粒，其是以掺杂有Yb、Tm和Er的NaGdF4纳米颗粒为内核，在内核外包裹有Eu掺杂的NaGdF4第一壳层，且在第一壳层外包裹有NaYF4第二壳层，构成Yb、Tm、Er和Eu共掺杂的NaGdF4:Yb/Tm/Er@NaGdF4:Eu@NaYF4核壳结构；具体制备步骤如下：
a、合成掺杂有Yb、Tm和Er的NaGdF4纳米颗粒作为内核
称取油酸(OA)10mL、十八烯(ODE)10mL、Gd(OAc)3 0.0841g、Yb(OAc)3 0.0858g、0.1mol/L Tm水溶液25μL、0.2mol/L Er水溶液2μL、NaF固体0.4200g，加入到三口烧瓶A中，磁力搅拌升温至110℃～120℃，保持10min，然后抽真空除去水和氧气；除尽后通N2，升温至300℃，反应1.5h；
b、在内核外包裹Eu掺杂的NaGdF4第一壳层
称取油酸(OA)4mL、十八烯(ODE)4mL、Gd(OAc)3 0.0568g、Eu(OAc)3 0.0098g，加入到三口烧瓶B中，磁力搅拌升温至110℃～120℃，保持10min，然后抽真空除去水和氧气；除尽后通N2，升温至220℃，并在步骤a反应结束后，用针管以1mL/min的速度将其注入到三口烧瓶A中，300℃反应1h；
c、在第一壳层外包裹NaYF4第二壳层
称取油酸(OA)4mL、十八烯(ODE)4mL、Y(OAc)3 0.0532g，加入到三口烧瓶C中，磁力搅拌升温至110℃～120℃，保持10min，然后抽真空除去水和氧气；除尽后通N2，并在步骤b反应结束后，用针管以1mL/min的速度将其注入到所述三口烧瓶A中，300℃反应1h；反应完成后降至室温，将三口烧瓶A中反应液于离心管中，离心分离出所得纳米颗粒；
d、剥离步骤c所得纳米颗粒表面的油酸
取步骤c所得纳米颗粒，向其中加pH＝1的乙醇和浓盐酸的混合液(7.5mL乙醇、62.5μL浓盐酸)，超声分散均匀后，再边震荡边超声30min，然后离心后去掉上清液，再向所得纳米颗粒中加入pH＝4的乙醇和浓盐酸的混合液(7.5mL乙醇、7.5mL浓盐酸)，超声分散均匀后，再边震荡边超声40min，然后再次离心分离，所得纳米颗粒经水洗后，即为水溶性的白色发光的上转换纳米颗粒；按照5mg/mL的浓度，将上转换纳米颗粒分散在pH＝6.5的0.01MPBS缓冲溶液中储存备用。图1为本实施例所得上转换纳米颗粒的荧光发射光谱图。
1.2、通过静电吸附等作用在上转换纳米颗粒表面标记上肿瘤标志物的抗体
取步骤1.1所得分散在pH＝6.5的0.01M PBS缓冲溶液中的上转换纳米颗粒1mL，向其中加入10μL 2mg/ml的CEA单克隆抗体和8μL 2.5mg/mL的AFP单克隆抗体，常温下摇床反应2h，然后4℃离心分离，获得标记有待检测的多种肿瘤标志物的抗体的白色发光的上转换纳米颗粒，再分散于含有质量浓度2％BAS的0.01M、pH＝7.0的PBS缓冲溶液中，4℃保存，获得标记有待检测的多种肿瘤标志物的抗体的白色发光的上转换纳米颗粒的溶液的配制。
1.3、肿瘤标志物的抗体上修饰荧光染料
取50μL 1.9mg/mL CEA抗体用0.1M、pH＝9.0的碳酸盐缓冲溶液稀释至500μL，加入3μL1mg/mL荧光染料溶液异硫氰基罗丹明B(RBITC)，摇床反应4h；所得反应液用0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲溶液进行透析过夜，以除去未结合的RBITC，即在CEA单克隆抗体修饰上了荧光染料RBITC，4℃保存。
取30μL 3.3mg/mLAFP抗体用0.1M、pH＝9.0的碳酸盐缓冲溶液稀释至500μL，加入3μL1mg/mL荧光染料溶液4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑(NBD-Cl)荧光，摇床反应4h；所得反应液用0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲溶液进行透析过夜，以除去未结合的NBD-Cl，即在AFP抗体修饰上了荧光染料NBD-Cl，4℃保存。
2、试纸条的制备
如图2所示，本实施例同时实现多组分肿瘤标志物检测的试纸条，包括加样区、标记复合物结合区、检测区、质控区及手持区。在标记复合物结合区固定有上述白色发光的上转换纳米颗粒，在上转换纳米颗粒上标记有待检测的两种肿瘤标志物的抗体；在检测区的不同区域设有两条检测T线，T1包被有CEA抗体，T2包被有AFP抗体，且两种肿瘤标志物的抗体以不同颜色的荧光染料进行修饰；在质控区设有质控C线，在质控C线上包被有羊抗鼠IgG抗体。
具体的，试纸条按如下方法制作：
(1)样品垫的处理
以纤维素膜作为样品垫材料，将样品垫在样品垫处理液中浸泡5min后，37℃烘干，完成样品垫的处理；样品垫处理液为含有质量浓度0.5％BAS和1％Tween-20的0.01M、pH＝8.0的PBS缓冲溶液；
(2)结合垫的处理
以玻璃纤维素膜作为结合垫材料，首先将结合垫在结合垫处理液中浸泡5min后，37℃烘干，然后再将结合垫放入步骤1.2所得标记有待检测的多种肿瘤标志物的抗体的白色发光的上转换纳米颗粒的溶液中浸泡5min后，37℃烘干，完成结合垫的处理；结合垫处理液为含有质量浓度1％BAS、2％Tween-20和5％蔗糖的0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲溶液。
(3)硝酸纤维素膜的处理
将硝酸纤维素膜分为两部分：
将待检测的两种肿瘤标志物的抗体CEA抗体和AFP抗体在第一部分的不同区域以1μL/cm的参数划线，分别形成包被有相应肿瘤标志物的抗体的检测T1线和检测T2线，其中，CEA抗体上修饰有异硫氰基罗丹明B(RBITC)荧光染料、AFP抗体上修饰有4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑(NBD-Cl)荧光染料；
将羊抗鼠IgG抗体在第二部分以2μL/cm的参数划线，形成质控C线；烘干，即完成硝酸纤维素膜的处理；
(4)试纸条的组装
从黏性塑料底板的前端向后端依次粘合处理后的样品垫形成加样区、粘合处理后的结合垫形成标记复合物结合区、粘合处理后的硝酸纤维素膜形成检测区和质控区、粘合吸水纸形成手持区，其中检测区位于标记复合物结合区和质控区之间。
3、上转换试纸条的检测过程
检测时，将待检测试样滴加在加样区，若待检测试样中存在肿瘤标志物AFP和CEA，会与标记复合物结合区表面标记有待检测的肿瘤标志物AFP、CEA抗体的UCNPs反应，肿瘤标志物AFP和CEA与UCNPs上标记的AFP、CEA抗体结合，进入检测区，固定在UCNPs上的肿瘤标志物AFP和CEA分别与检测区T1线上固定的修饰RBITC的CEA、T2线上固定的修饰NBD-Cl的AFP抗体反应，并部分固定在检测区T线上面，其余部分随待检测试样流入质检区，固定在UCNPs上的肿瘤标志物AFP和CEA与质控区检测线C线上面固定的羊抗鼠IgG抗体结合，固定在检测线C线上。
检测完成后，通过980nm激光激发，观察检测区和质检区的颜色变化。此时，980nm激发光照射下，T1线上面的RBITC与上转换纳米颗粒之间存在荧光共振能量转移(FRET)，致使上转换纳米颗粒绿光发射峰减弱甚至消失，T1线固定的上转换纳米颗粒表现出紫色发光。T2线上面的NBD-Cl与上转换纳米颗粒之间存在荧光共振能量转移(FRET)，致使上转换纳米颗粒蓝光区发射峰减弱甚至消失，T2线固定的上转换纳米颗粒表现出黄色发光。质控区检测线C线上面固定的上转换纳米颗粒，发射峰未发生变化，980nm激发光照射下上转换纳米颗粒显示白光。图3为免疫反应为阴性的反应示意图，图4为免疫反应为阳性的反应示意图。
此外，通过配置不同浓度梯度的CEA抗原(10-200ng/ml)、AFP抗原(100-1000ng/ml)，在样品垫上面含有滴加不同浓度的CEA抗原、AFP抗原的样品标准液，每个浓度制作三张相同的试纸条，静置五分钟后，用上转换发光传感器对试纸进行扫描，通过反应前后的荧光强度对比，T线与C线荧光强度的对比，建立标准曲线，还可以实现定量测量。
以上所述仅为本发明的示例性实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种同时实现多组分肿瘤标志物检测的试纸条，包括加样区、标记复合物结合区、检测区、质控区及手持区，其特征在于：在所述标记复合物结合区固定有白色发光的上转换纳米颗粒，在所述上转换纳米颗粒上标记有待检测的多种肿瘤标志物的抗体；在所述检测区的不同区域设有与待检测的肿瘤标志物抗体的种类数量相同的若干条检测T线，各检测T线上分别包被有一种待检测的肿瘤标志物的抗体，且各肿瘤标志物的抗体以不同颜色的荧光染料进行修饰；在所述质控区设有质控C线，在所述质控C线上包被有羊抗鼠IgG抗体；
使用时，将待检测试样滴加在所述加样区，若所述待检测试样中存在与标记复合物结合区上转换纳米颗粒上所修饰的多种肿瘤标志物的抗体相对应的抗原，则该抗原与上转换纳米颗粒上标记的相应抗体结合，一同进入检测区并部分固定在检测区相应的T线上，其余部分随待检测试样流入质控区；检测完成后，通过980nm激光激发，观察T线和C线的颜色变化，以判断待检测试样中所存在的肿瘤标志物，实现待检测试样中所含肿瘤标志物种类的定性检测；
所述白色发光的上转换纳米颗粒具有三层核壳结构，以掺杂有Yb、Tm和Er的NaGdF4纳米颗粒为内核，在所述内核外包裹有Eu掺杂的NaGdF4第一壳层，且在所述第一壳层外包裹有NaYF4第二壳层，构成Yb、Tm、Er和Eu共掺杂的NaGdF4:Yb/Tm/Er@NaGdF4:Eu@NaYF4核壳结构；所述的上转换纳米颗粒在近红外光激发下发出蓝、绿、红三基色光，总体显示白光发光；利用所述上转换纳米颗粒所具有的蓝、绿、红三个波段的发光，使一个波段、任意两个波段的组合、及三个波段各对应一种肿瘤标志物的检测，共可实现7种肿瘤标志物的同时检测。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：在加样区滴加已知浓度的系列标准抗原溶液，进行检测；检测完成后，通过980nm激光激发，获得检测区相应T线与质控区C线的荧光强度，并建立T线和C线荧光强度比值与抗原浓度的标准曲线，以实现待检测试样中所含肿瘤标志物浓度的定量检测。
3.一种权利要求1或2所述试纸条的制作方法，其特征在于：
(1)样品垫的处理
以纤维素膜作为样品垫材料，将样品垫在样品垫处理液中浸泡不超过30min后，37℃烘干，完成样品垫的处理；
(2)结合垫的处理
以玻璃纤维素膜作为结合垫材料，首先将结合垫在结合垫处理液中浸泡不超过30min后，37℃烘干，然后再将结合垫放入标记有待检测的多种肿瘤标志物的抗体的白色发光的上转换纳米颗粒的溶液中浸泡不超过30min后，37℃烘干，完成结合垫的处理；
(3)硝酸纤维素膜的处理
将硝酸纤维素膜分为两部分；将待检测的各肿瘤标志物的抗体在第一部分的不同区域以1μL/cm的参数划线，形成若干条包被有一种肿瘤标志物的抗体的检测T线，各肿瘤标志物的抗体以不同颜色的荧光染料进行修饰；将羊抗鼠IgG抗体在第二部分以2μL/cm的参数划线，形成质控C线；烘干，即完成硝酸纤维素膜的处理；
(4)试纸条的组装
从黏性塑料底板的前端向后端依次粘合处理后的样品垫形成加样区、粘合处理后的结合垫形成标记复合物结合区、粘合处理后的硝酸纤维素膜形成检测区和质控区、粘合吸水纸形成手持区，其中检测区位于标记复合物结合区和质控区之间。
4.根据权利要求3所述的制作方法，其特征在于：
步骤(1)所述的样品垫处理液为含有质量浓度0.05～10％BAS和0.1％～2％Tween-20的0.01M、pH＝7.0～8.0的PBS缓冲溶液；
步骤(2)所述的结合垫处理液为含有质量浓度0.05～10％BAS、0.1％～3％Tween-20和1％～10％蔗糖的0.01M、pH＝7.0～8.0的PBS缓冲溶液。
5.根据权利要求3所述的制作方法，其特征在于：步骤(2)所述的标记有待检测的多种肿瘤标志物的抗体的白色发光的上转换纳米颗粒的溶液的获取方法为：将上转换纳米颗粒分散在pH＝6.5～8.0的0.01M PBS缓冲溶液中，然后按照上转换纳米颗粒的质量与待检测的各肿瘤标志物的抗体的质量之比皆为100～300:1，再向PBS缓冲溶液中加入待检测的多种肿瘤标志物的抗体，常温下摇床反应2～4h，然后4℃离心分离，获得标记有待检测的多种肿瘤标志物的抗体的白色发光的上转换纳米颗粒，再分散于含有质量浓度0.5～5％BAS的0.01M、pH＝7.0～8.0的PBS缓冲溶液中，4℃保存，即完成步骤(2)所述的标记有待检测的多种肿瘤标志物的抗体的白色发光的上转换纳米颗粒的溶液的配制。
6.根据权利要求3所述的制作方法，其特征在于，在肿瘤标志物的抗体上修饰荧光染料的方法为：将抗体稀释在0.1M、pH＝8.0-9.0的碳酸盐缓冲溶液中，然后按照抗体与染料的质量比为10～100:1，加入荧光染料溶液，摇床反应2-4h；所得反应液用0.01M、pH＝7.0-8.0的PBS缓冲溶液进行透析过夜，以除去未结合的染料，即在肿瘤标志物的抗体上修饰上了荧光染料，4℃保存。
7.根据权利要求3所述的制作方法，其特征在于：所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸的长度为8～17mm，组装时各部分的接触区域相互叠压1～3mm；所述黏性塑料底板的长度为60mm。
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