CN104142398A - 检测罗丹明b的胶体金检测卡、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测罗丹明B的胶体金检测卡的制备方法以及使用该检测卡检测罗丹明B的检测方法，属于食品安全检测领域。该检测卡能够简便、快速、特异且灵敏地检测食品样本中的罗丹明B。

Description

检测罗丹明B的胶体金检测卡、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及食品安全的快速检测技术领域，具体地，本发明涉及一种快速检测罗丹明B的胶体金检测卡的制备方法、由此制得的胶体金检测卡及应用。

背景技术

罗丹明B（Rhodamine B）又称玫瑰红B或碱性玫瑰精，俗称花粉红，是一种具有鲜桃红色的人工合成染料。罗丹明B在溶液中有强烈的荧光，用作实验室中细胞荧光染色剂、有色玻璃、特色烟花爆竹等行业。

罗丹明B具有脂溶性，曾被用作食品染色和添加剂，主要是辣椒面和辣椒油的染色剂。虽然国家禁止食品中添加罗丹明B，但自2011年起，发生了多起罗丹明B食品安全事件。使用了被污染的调味品制作食品时会造成残留，经试验证明罗丹明B具有潜在的致癌和致突变性。

因此，有必要对食品中的罗丹明B进行检测。目前采用较多的方法为高效液相色谱法，该方法具有很好的灵敏度和特异性，但操作繁琐、耗时长，不适于对大批量样品的检测，且需要昂贵的仪器设备，检测成本高，因此需要提供一种能够快速、简便且灵敏地检测食品中罗丹明B的方法。

发明内容

本发明提供了一种快速检测罗丹明B的胶体金检测卡的制备方法，其制备工艺简单，成本低，且制得的胶体金检测卡能够满足现场快速检测的需要，检测快速，携带方便，操作简单，无需特殊设备和仪器。另外，本发明还提供了利用本发明的胶体金检测卡检测罗丹明B的方法。

一方面，本发明提供了一种检测罗丹明B的胶体金检测卡的制备方法，其包括制备金标垫8，所述金标垫8的制备包括：用含金标抗罗丹明B单克隆抗体的金标蛋白工作液喷涂金标垫，其中所述金标蛋白工作液包含体积比为0.5%～2%的SDS-L（例如体积比1%～2%的SDS-L，例如体积比1%的SDS-L）和0.02M磷酸盐缓冲液。

在一个实施方式中，所述金标蛋白工作液还包含0.1‰g/ml PVA、0.1‰g/ml BSA、0.3‰g/ml PEG20000和5%g/ml蔗糖。

在一个实施方式中，所述金标抗罗丹明B单克隆抗体的制备包括：

A.使用0.01%g/ml氯金酸水溶液和1%g/ml柠檬酸钠水溶液制备胶体金溶液，其中0.01%g/ml氯金酸水溶液：1%g/ml柠檬酸钠=（10～1000）mL：（0.2～20）mL；

B.用所制备的胶体金溶液标记罗丹明B单克隆抗体，其中所使用的胶体金溶液：0.75mg/mL罗丹明B单克隆抗体：1%g/ml PEG20000：10%g/mlBSA=（10～1000）mL：（150～15000）μg：（1～100）mL：（1～100）mL。

具体地，按照0.8cm*30cm金标垫对应金标抗罗丹明B单克隆抗体工作液（浓缩金标抗罗丹明B单克隆抗体按1：2～1：5的体积比用金标蛋白工作液稀释）0.7mL的用量，用1mL移液枪将金标抗罗丹明B单克隆抗体工作液均匀喷涂于金标垫上，置于35℃真空干燥后备用。

在一个实施方式中，胶体金溶液制备中0.01%g/ml氯金酸水溶液：1%g/ml柠檬酸钠=100mL：2mL，用所制备的胶体金溶液标记罗丹明B单克隆抗体中所使用的胶体金溶液：0.75mg/mL罗丹明B单克隆抗体：1%g/mlPEG20000：10%g/ml BSA=100mL：1.5mg：10mL：10mL。

在一个实施方式中，所述方法还包括制备硝酸纤维素膜7，所述硝酸纤维素膜7的制备包括在硝酸纤维素膜上喷涂罗丹明B抗原溶液和羊抗鼠IgG溶液，形成两条平行线作为检测线10和质控线11，其中罗丹明B抗原溶液为含罗丹明B抗原的pH为7.2的0.02M的磷酸盐缓冲液，且10.7mg/mL罗丹明B抗原的体积：0.02M的磷酸盐缓冲液的体积为1：30至1：42，例如1：35，羊抗鼠IgG溶液为含羊抗鼠IgG的pH为7.2的0.02M磷酸盐缓冲液，且7.5mg/mL羊抗鼠IgG的体积：0.02M的磷酸盐缓冲液的体积为1：3至1：5，例如1：4。

在一个实施方式中，所述方法还包括制备样品垫9，所述样品垫9的制备包括用pH7.4的0.05M Tris缓冲液处理样品垫。

在一个实施方式中，所述方法还包括制备

吸水纸6；

将吸水纸6、硝酸纤维素膜7、金标垫8、样品垫9粘贴在底板5上，形成金标试纸条2；

将金标试纸条2装入检测卡壳体1内，使样品垫9的位置正对检测卡壳体1的加样孔3，硝酸纤维素膜7的位置正对检测卡壳体1的观测孔4。

另一方面，本发明提供了由本发明的方法制备的罗丹明B的胶体金检测卡。

再一方面，本发明提供了用本发明的罗丹明B胶体金检测卡检测样品中的罗丹明B的方法，所述方法包括对样品进行前处理。

在一个实施方式中，所述样品的前处理包括：

称取1g样品，于50mL离心管中，加入5～10mL乙腈，涡旋振荡使样品完全分散，再加入5mL正己烷，涡旋振荡使样品完全混匀，室温下振荡15～30min，离心后取1～2mL上清，氮气吹干，然后加入1～2mL样品稀释液；涡旋振荡直至残余物质充分溶解。

在本发明的检测方法中，判定结果如下：

阴性：当质控区显示一条红色条带，检测区同时也显示出一条红色条带，快速检测卡以显示红色线为“︳︳”，判为阴性；

阳性：当质控区显示一条红色条带，而检测区不显色，快速检测卡以显示红色线为“︳”，判为阳性。

无效：当质控区不显示红色条带，则无论检测区显示出红色条带与否，该检测卡无效。

在一个实施方式中，用于检测的样品为豆瓣酱、辣椒酱、辣椒面、辣椒油、火锅底料。

本发明的检测卡具有以下优点：

1）特异性强，敏感性高。该胶体金检测卡以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，二者通过物理吸附相结合。胶体金标记对单克隆抗体的特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，检测卡具有较强的特异性和较高的敏感性，检出罗丹明B最低限量可达到5ppb。

2）简便、快速、时效性强。使用胶体金检测卡，无需任何其他试剂和仪器，可现场操作，检测时间仅需5～8min，能够满足现场快速检测的需要，且携带方便，操作简单。

3）结果显示形象、直观、准确。检测卡以显示棕红色线“︳”和“︳︳”作为检测结果阳性和阴性标记，即在包被膜上显示一条棕红色“︳”时，表示在被检样品中含有罗丹明B，显示两条棕红色线“︳︳”时，表示在被检样品中不含罗丹明B。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。

4）节省费用，适用范围广，便于推广。使用本发明的检测卡，比用仪器分析和ELISA试剂盒的费用大幅下降，其本发明的检测卡的制备工艺简单，成本低，且在常温下即可保存。另外，本发明的检测卡的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括实验室检验、海关检验、各级检验检疫部门、加工企业和消费者，其改变了对罗丹明B的检测必须由专业机构的专业人员才能进行检测的局限性，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。

附图说明

图1为本发明检测罗丹明B的胶体金检测卡示意图；

图2为本发明检测罗丹明B的胶体金检测卡中所述金标试纸条5的结构示意图;

图3为图2的左视图。

具体实施方式

关键试剂及设备来源

罗丹明B完全抗原（10.7mg/mL）与罗丹明B抗鼠单克隆抗体（7.5mg/mL）购于上海麦仓生物技术有限公司；羊抗鼠IgG购于上海弘炬生物技术有限公司；金标点样仪与切条机购于上海金标生物科技有限公司。

实施例1检测罗丹明B的胶体金检测卡的制备

以下以100个检测罗丹明B的胶体金检测卡为例，描述了其制备方法。

（1）硝酸纤维素膜7的制备

具体地，将罗丹明B抗原（罗丹明B完全抗原）和羊抗鼠IgG分别按1：35和1：4的体积比例用pH为7.2的0.02M磷酸盐缓冲液稀释，然后用金标点样仪（具体地，将罗丹明B抗原溶液置于泵3标记T，将羊抗鼠溶液放置于泵1标记C，然后选择手动每次泵入50μL，排出50μL，排空管道内的空气；选择运行，打开模拟模式，然后运行给膜定位；确定膜的位置后开始连续划线，每次划线完成后用黑笔标记划线不规则处、断点等，每次划线保持膜的位置固定）将其分别喷涂成两条平行线于硝酸纤维素膜（长20～25mm，宽300mm，厚约0.3mm，最终制得的检测卡中每条宽3mm,）上，其中，罗丹明B抗原作为检测线，羊抗鼠IgG作为质控线，两条线居于硝酸纤维素膜中间位置且相距约5mm，然后置于35℃真空干燥后备用。

（2）样品垫9的制备

具体地，按照2.4cm*30cm样品垫对应pH7.4的0.05M Tris缓冲液5mL的用量，使用1mL移液枪将pH为7.4的0.05M Tris缓冲液均匀喷涂于样品垫（玻璃纤维膜，长17mm，宽300mm，厚约0.5mm，最终制得的检测卡中每条宽3mm）上，置于25℃温育后备用。或者，可以在处理量大时，将样品垫处理液放入专用不锈钢方盒中，将样品垫一张一张慢慢浸入处理液中，至液面高于样品垫3mm以上；样品垫之间不得存有气泡；样品垫层数不得多于20张，然后置于25℃温育后备用。

（3）胶体金溶液的制备

具体地，用新制纯化水配制0.01%g/ml的氯金酸溶液，置于锥形瓶中，并放入洁净的搅拌子，用磁力搅拌电热套加热至沸腾，在150r/min磁力搅拌下，迅速加入1%g/ml的柠檬酸钠溶液，保持温度和转速不变，至溶液变为亮红色时，继续加热搅拌15min后，停止加热，并把锥形瓶从磁力搅拌电热套上移开，室温冷却，4℃冰箱保存备用。其中，氯金酸：柠檬酸钠=100mL：2mL。

（4）用制备好的胶体金溶液标记抗罗丹明B单克隆抗体

具体地，取上述制备的胶体金溶液于离心管中，用0.1M碳酸钾溶液调节pH至7.4。搅拌的同时缓慢加入罗丹明B单克隆抗体溶液（购买的单克隆抗体用纯化水稀释10倍后加入，胶体金溶液中抗体终浓度为15μg/mL），全部加入并混匀后，室温放置30min。然后缓慢加入1%g/ml的PEG20000溶液，混匀后室温放置15min。然后缓慢加入10%g/ml BSA溶液以饱和游离的胶体金，然后于4℃、10000rpm离心30min。离心后取出离心管，小心弃去上清，将沉淀用1/10体积（离心前胶体金溶液的1/10）金标蛋白存储液（含0.1‰g/ml PVA、0.1‰g/ml BSA、0.3‰g/ml PEG20000和5%g/ml蔗糖的水溶液）溶解后，4℃冰箱保存备用。其中，胶体金溶液：罗丹明B单克隆抗体：PEG20000：BSA=100mL：1.5mg：10mL：10mL。

（5）金标垫8的制备

具体地，按照0.8cm*30cm金标垫对应金标抗罗丹明B单克隆抗体工作液（将上述制备的浓缩金标抗罗丹明B单克隆抗体按1：4的体积比用金标蛋白工作液稀释，金标蛋白工作液为0.1‰g/ml PVA、0.1‰g/ml BSA、0.3‰g/ml PEG20000、5%g/ml蔗糖以及体积比为1%的SDS-L，pH为7.4的0.02M磷酸盐缓冲液）0.7mL的用量，用1mL移液枪将金标抗罗丹明B单克隆抗体工作液均匀喷涂于金标垫（聚酯膜，长7～9mm，宽300mm，厚约0.5mm，最终制得的检测卡中每条宽3mm）上，置于35℃真空干燥后备用。

（6）金标试纸条2的组装

具体地，将底板5（PVC胶板，上海良信科技有限公司，长60mm，宽300mm，厚约0.5mm，最终制得的检测卡中每条宽3mm）自上而下划分好4个位置，先将干燥好的硝酸纤维素膜7粘贴在相应位置，再分别将吸水纸6（吸水纸，长约17mm，宽300mm，厚约0.5mm，最终制得的检测卡中每条宽3mm）和干燥好的金标垫8紧邻硝酸纤维素膜7粘贴在底板5上，并稍微压住硝酸纤维素膜7，最后将样品垫9紧邻金标垫8贴在底板5上，并压住金标垫8。用切条机将所组装的金标试纸条2切割成3mm宽度（切割后的金标试纸条2长60mm，宽3mm，厚约1.5mm）

将组装好的标试纸条2装入检测卡壳体1（长70mm，宽20mm，厚5mm）中，此时，样品垫9的位置正对检测卡的加样孔3，硝酸纤维素膜7的位置正对检测卡的观测孔4，与干燥剂一起装入铝箔袋中，密封包装。

具体见图1和图2。所制备的罗丹明B的胶体金检测卡，其包括检测卡壳体1和金标试纸条2，检测卡壳体1上开有加样孔3和观测孔4；金标试纸条2封装于检测卡壳体1中，金标试纸条2包括底板5，底板5上依次设置有吸水纸6、硝酸纤维素膜7、金标垫8和样品垫9，吸水纸6和金标垫8分别设置在硝酸纤维素膜7两端，在硝酸纤维素膜7的两端结合处，吸水纸6和金标垫8的一小段（1～2mm）重叠压在硝酸纤维素膜7上，样品垫9设置在金标垫8的另一端，样品垫9的一小段（1～2mm）重叠压在金标垫8上；金标垫8上喷涂有金标抗罗丹明B单克隆抗体，硝酸纤维素膜7上依次喷涂有材质为罗丹明B抗原的检测线10和材质为羊抗鼠IgG的质控线11。

实施例2罗丹明B检测卡的使用

（1）样本前处理：

待检测样本：豆瓣酱、辣椒酱、辣椒面、辣椒油、火锅底料等。

称取1g样品，于50mL离心管中，加入5mL乙腈，涡旋振荡使样品完全分散，再加入5mL正己烷，涡旋振荡使样品完全混匀，室温下振荡15min，室温4000rpm离心5min后取1mL上清，氮气吹干，然后加入样品稀释液（pH为7.4的0.01M磷酸盐缓冲液；涡旋振荡使残余物质复溶，取样液进行检测。

（2）使用检测卡

对样品进行检测时，将检测卡平放，取80μL样液滴入加样孔3，在5～8分钟内观察结果。

（3）检测结果分析

羊抗鼠IgG和罗丹明B抗原分别喷涂在硝酸纤维素膜的质控线11（C）和检测线10（T），含罗丹明B的待测样品经样品垫9根据层析原理向另一端移动，并先后经过质控线11和检测线10，固化在金标垫8上的金标记抗罗丹明B单克隆抗体与样品中的罗丹明B起特异性反应，并竞争抑制其与检测线上的罗丹明B结合。因此，当罗丹明B在样本中浓度高于某一量时，胶体金标记的罗丹明B抗体与罗丹明B全部结合，从而在检测区内因为竞争反应不会与罗丹明B抗原结合而不会出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗体抗原竞争反应，将会在检测区与质控区内出现红色条带。

阴性：当质控区显示一条红色条带，检测区同时也显示出一条红色条带，快速检测卡以显示红色线为“︳︳”，判为阴性，如图1（a）所示。

阳性：当质控区显示一条红色条带，而检测区不显色，快速检测卡以显示红色线为“︳”，判为阳性，如图1（b）所示。

无效：当质控区不显示红色条带，则无论检测区显示出红色条带与否，该检测卡无效，如图1（c）所示。

经检测，所述豆瓣酱、辣椒酱、辣椒面、辣椒油、火锅底料的检测结果如下。

	豆瓣酱	辣椒酱	辣椒面	辣椒油	火锅底料
						空白样	-	-	-	-	-
添加5ng/mL	+	+	+	+	+
						添加10ng/mL	+	+	+	+	+

（4）金标蛋白工作液中SDS-L对检测结果的影响

按1：4分别用不含SDS-L和含体积比为0.5%、1%及2%的SDS-L的金标蛋白工作液稀释浓缩金标抗罗丹明B单克隆抗体，喷涂于金标垫后制成检测卡，然后用于检测待测样品，检测结果如下表所示：

Claims (10)

1.一种检测罗丹明B的胶体金检测卡的制备方法，其包括制备金标垫（8），所述金标垫（8）的制备包括：用含金标抗罗丹明B单克隆抗体的金标蛋白工作液喷涂金标垫，其中所述金标蛋白工作液包含体积比为0.5%～2%的SDS-L和pH7.4的0.02M磷酸盐缓冲液。

2.根据权利要求1所述的方法，所述金标蛋白工作液包含体积比为1%～2%的SDS-L和pH7.4的0.02M磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1或2所述的方法，所述金标蛋白工作液还包含0.1‰g/ml PVA、0.1‰g/ml BSA、0.3‰g/ml PEG20000和5%g/ml蔗糖。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，所述金标抗罗丹明B单克隆抗体的制备包括：

A.使用0.01%g/ml氯金酸水溶液和1%g/ml柠檬酸钠水溶液制备胶体金溶液，其中0.01%g/ml氯金酸水溶液：1%g/ml柠檬酸钠=（10～1000）mL：（0.2～20）mL；

B.用所制备的胶体金溶液标记罗丹明B单克隆抗体，其中所使用的胶体金溶液：0.75mg/mL罗丹明B单克隆抗体：1%g/ml PEG20000：10%g/mlBSA=（10～1000）mL：（150～15000）μg：（1～100）mL：（1～100）mL。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，

胶体金溶液制备中，0.01%g/ml氯金酸水溶液：1%g/ml柠檬酸钠=100mL：2mL；用所制备的胶体金溶液标记罗丹明B单克隆抗体中，所使用的胶体金溶液：0.75mg/mL罗丹明B单克隆抗体：1%g/ml PEG20000：10%g/mlBSA=100mL：1.5mg：10mL：10mL。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其还包括制备硝酸纤维素膜（7），所述硝酸纤维素膜（7）的制备包括在硝酸纤维素膜上喷涂罗丹明B抗原溶液和羊抗鼠IgG溶液，形成两条平行线作为检测线（10）和质控线（11），其中罗丹明B抗原溶液为含罗丹明B抗原的pH为7.2的0.02M磷酸盐缓冲液，且10.7mg/mL罗丹明B抗原的体积：0.02M的磷酸盐缓冲液的体积为1：30至1：42，羊抗鼠IgG溶液为含羊抗鼠IgG的pH为7.2的0.02M的磷酸盐缓冲液，且7.5mg/mL羊抗鼠IgG的体积：0.02M的磷酸盐缓冲液的体积为1：3至1：5。

7.如权利要求6所述的方法，其中10.7mg/mL罗丹明B抗原的体积：0.02M的磷酸盐缓冲液的体积为1：35，7.5mg/mL羊抗鼠IgG的体积：0.02M的磷酸盐缓冲液的体积为1：4。

8.如前述任一项权利要求所述的方法，其还包括制备样品垫（9），所述样品垫（9）的制备包括用pH7.4的0.05M Tris缓冲液处理样品垫。

9.如前述任一项权利要求所述的方法，其还包括

制备吸水纸（6）；

将吸水纸（6）、硝酸纤维素膜（7）、金标垫（8）、样品垫（9）粘贴在底板（5）上，形成金标试纸条（2）；和

将金标试纸条（2）装入检测卡壳体（1）内，使样品垫（9）的位置正对检测卡壳体（1）的加样孔（3），硝酸纤维素膜（7）的位置正对检测卡壳体（1）的观测孔（4）。

10.由权利要求1-9中任一项所述的方法制备的罗丹明B的胶体金检测卡。