CN108623685A - 抗ox40抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及特异性结合OX40的新型抗体和抗体片段以及含有所述抗体或抗体片段的组合物。此外，本发明涉及编码所述抗体或其抗体片段的核酸及包含其的宿主细胞，以及相关用途。此外，本发明涉及这些抗体和抗体片段的治疗和诊断用途。

Description

抗OX40抗体及其用途

本发明涉及特异性结合OX40的新型抗体和抗体片段以及含有所述抗体或抗体片段的组合物。此外，本发明涉及编码所述抗体或其抗体片段的核酸及包含其的宿主细胞，以及相关用途。此外，本发明涉及这些抗体和抗体片段的治疗和诊断用途。

背景技术

OX40(也称为CD134、TNFRSF4和ACT35)最初被描述为大鼠CD4 T细胞上的T细胞激活标志物(Paterson DJ,Jefferies WA,Green JR,Brandon MR,Corthesy P,Puklavec M,Williams AF.Antigens of activated rat T lymphocytes including a molecule of50,000Mr detected only on CD4 positive T blasts.Mol Immunol.1987；24:1281–1290)并且随后显示为在TCR招募中被上调(Mallett S,Fossum S,BarclayAN.Characterization of the MRC OX40 antigen of activated CD4positive Tlymphocytes--a molecule related to nerve growth factor receptor.EMBO J.1990；9:1063–1068)。OX40在CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、NKT细胞和嗜中性粒细胞上被鉴定(D.J.Paterson,W.A.Jefferies,J.R.Green et al.,“Antigens of activated Rat Tlymphocytes including a molecule of 50,000M(r)detected only on CD4 positive Tblasts,”Molecular Immunology,vol.24,no.12,pp.1281–1290,1987)。OX40信号传导能够促进对T细胞的共刺激信号，导致增强的细胞增殖、存活、效应子功能和迁移(Gramaglia I,Weinberg AD,Lemon M,Croft M.Ox-40 ligand:a potent costimulatory molecule forsustaining primary CD4 T cell responses.J Immunol.1998；161:6510–6517；Gramaglia I,Jember A,Pippig SD,Weinberg AD,Killeen N,Croft M.The OX40costimulatory receptor determines the development of CD4 memory by regulatingprimary clonal expansion.J Immunol.2000；165:3043–3050)。

OX40的配体，OX40L主要表达在抗原呈递细胞(APC)上并且其表达可以通过CD40和肥大细胞信号传导、toll样受体(TLR)以及炎性细胞因子被诱导。除了APC之外，非造血细胞例如平滑肌和血管内皮细胞也可以表达OX40L。在过量表达OX40L的转基因小鼠中，有增加的T-细胞激活，并且当被免疫时，这些小鼠产生增强的T细胞应答(Murata K,Nose M,Ndhlovu LC,Sato T,Sugamura K,Ishii N.Constitutive OX40/OX40 ligandinteraction induces autoimmune-like diseases.J Immunol.2002；169:4628–4636和Sato T,Ishii N,Murata K,Kikuchi K,Nakagawa S,Ndhlovu LC,SugamuraK.Consequences of OX40-OX40 ligand interactions in langerhans cell function:enhanced contact hypersensitivity responses in OX40L-transgenic mice.Eur JImmunol.2002；32:3326–3335)。这一数据表明OX40L表达是T细胞中OX40信号传导的限制性因子。

在携带肿瘤的小鼠中，小鼠OX40的体内连接(通过可溶性小鼠OX40L-免疫球蛋白融合蛋白或小鼠OX40L模拟物，如抗小鼠CD134特异性抗体)增强抗肿瘤免疫，导致各种小鼠恶性肿瘤细胞系的小鼠模型例如淋巴瘤、黑素瘤、肉瘤、结肠癌、乳腺癌和神经胶质瘤中的无肿瘤存活(Sugamura et al.Nature Rev Imm2004；4:420-431)。

有人建议通过使用OX40结合剂结合OX40而增强哺乳动物对抗原的免疫应答(WO99/42585；Weinberg,2000)。尽管该文献概括提及OX40结合剂，但是重点是使用OX40L或其部分；抗OX40抗体作为OX40L的等同物而公开。事实上，当Weinberg小组将该研究用于非人灵长类动物的研究时，他们再次有意选择了结合OX40L结合位点并大体模拟OX40L的抗体。

Al-Shamkhani等人(Eur J Chem1996；26:1695-1699)使用了称为OX86的抗OX40抗体，其不阻断OX40L结合，以探索OX40在激活的小鼠T细胞上的差异表达；Hirschhorn-Cymerman等人(J Exp Med2009；206:1103-1116)在小鼠模型中使用了OX86和环磷酰胺作为潜在化学免疫治疗。但是OX86预期不结合人OX40，当选择在人中有效的抗体时，人们根据Weinberg的研究会选择结合在OX40L结合位点的抗体。

在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中，人OX40的体内连接(通过抗人OX40特异性抗体，其与人OX40上的OX40L结合结构域相互作用；US2009/0214560A1)增强抗肿瘤免疫，其导致各种人恶性肿瘤细胞系例如淋巴瘤、***癌、结肠癌及乳腺癌的肿瘤生长抑制。

在人类中，人OX40连接介导的抗肿瘤免疫应答的精确机制尚未证实，但是据认为是经过OX40跨膜信号传导途径介导的，该途径受与OX40L的相互作用刺激。这种相互作用由三聚体OX40L与OX40的结合而介导。在目前抗癌治疗中，推荐使用三聚化OX40配体作为比抗OX40抗体更有效的药物(Morris et al.Mol Immunol2007；44:3112-3121)。

此外，在免疫原性差的肿瘤中，单一的抗OX40治疗不能提供足够的抗肿瘤免疫原性，因此还希望开发OX40与其他策略的组合。人们发现调控OX40信号传导与在肿瘤细胞中失调的其他信号传导途径(例如血管发生途径，PD-1途径)的组合可以进一步增强治疗功效。

但是，仍然需要开发新的抗OX40抗体，其与现有技术中已知的抗OX40抗体相比，能够避免阻断OX40与OX40L的结合，从而更好地用来治疗或延缓各种癌症、免疫相关疾病和T细胞功能障碍性疾病。

发明概述

申请人令人惊奇地发现，为了活化T细胞、诱导T细胞介导的抗肿瘤活性，使用结合人OX40的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段能够更好地结合人OX40，同时不阻断人OX40与OX40配体(OX40L)的结合，产生增强的免疫应答。

优选地，本发明的抗OX40抗体或其片段能够活化T细胞，例如增强T效应细胞的免疫刺激/效应功能和/或使这些细胞增殖和/或下调T调节细胞的免疫抑制功能。更优选地，所述抗体能够引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。因此，本发明的OX40抗体能够用来治疗或延缓各种癌症、免疫相关疾病和T细胞功能障碍性疾病。

本发明因此提供了结合人OX40或食蟹猴OX40的抗体或其片段(优选地抗原结合片段)，其中所述抗体或其片段不阻断人或食蟹猴OX40与其配体OX40L的结合。在优选的实施方案中，所述抗体或其片段不仅不阻断人或食蟹猴OX40与其配体OX40L的结合，而且增加OX40的基于OX40L的T细胞活化。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段结合人OX40或食蟹猴OX40。在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段不结合鼠OX40，例如大鼠OX40或小鼠OX40。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体具有激动剂活性。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段结合人OX40或食蟹猴OX40的Kd小于大约100nM，优选地，小于或等于大约10nM，更优选地小于或等于大约8nM，更优选地小于或等于大约7nM、6nM、5nM、4nM、3nM或2nM，最优选地，所述Kd小于或等于大约1nM或0.8nM。在一些实施方案中，抗体结合亲和力是使用生物光干涉测定法(例如Fortebio亲和测量)或MSD测定法测定的。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段对人OX40或食蟹猴OX40的结合是使用流式细胞术(例如FACS)测定法测定的。在一些实施方案中，对人OX40或食蟹猴OX40的结合具有小于或等于大约10nM、9nM、8nM或7nM的EC50。在一些实施方案中，对人OX40或食蟹猴OX40的结合具有小于或等于大约6nM或大约5nM或大约4nM或大约3nM的EC50。在一些实施方案中，在用流式细胞术测定法进行的测定中，本发明的抗体或其片段结合细胞上表达的OX40，与不表达OX40的相应对照细胞相比，MFI值大于1000倍差异，优选地大于1100倍差异、1200倍差异、1300倍差异、1400倍差异、1500倍差异、1600倍差异、1700倍差异、1800倍差异、1900倍差异、2000倍差异。

另一方面，本发明提供能够活化T细胞(例如CD4+T细胞)的具有激动剂活性的抗OX40抗体或其片段。

在一些实施方案中，抗OX40抗体的激动剂活性由T细胞活化后释放的细胞因子的水平来评估。因此，本发明提供了与用IgG对照抗体处理的CD4+T细胞的细胞因子生成相比，提高CD4+T细胞的细胞因子生成的抗OX40抗体或其片段。在一些实施方案中，该细胞因子是炎性细胞因子，例如γ-干扰素(例如IFNg)或白细胞介素(例如IL-2)。

优选地，与相应的对照IgG相比，本发明的抗OX40抗体或其片段能够将CD4+T细胞分泌的IL-2水平增加高达大约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍或更高。在一些实施方案中，与相应的对照IgG相比，本发明的抗OX40抗体或其片段能够将CD4+T细胞分泌的IFNg水平增加高达大约1倍、2倍或3倍或更高。在一些实施方案中，通过ELISA测定T细胞的细胞因子分泌水平。

在一些实施方案中，抗OX40抗体的激动剂活性由OX40信号传导(例如监测NFkB下游信号传导)来评估。因此，本发明提供了与用IgG对照抗体相比，提高NFκB介导的转录活性水平的抗OX40抗体或其片段。优选地，与相应的对照IgG相比，本发明的抗OX40抗体或其片段能够将NFκB介导的转录活性水平提高大约1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或更多。

在一些优选的实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段能够诱发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段的功能需要抗体交联。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段的功能是下述一项或多项：提高CD4+效应T细胞增殖和/或细胞因子生成，提高CD4+记忆T细胞增殖和/或细胞因子生成，和/或通过ADCC来消减细胞。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段相比已知的抗OX40抗体具有更好的抗肿瘤活性，例如相比于IgG对照或已知的抗OX40抗体，本发明的抗OX40抗体或其片段能够降低受试者中的肿瘤体积，优选地同时不影响受试者的体重。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)，其中所述HCVR包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含与选自SEQ ID NO:30、1、2和3的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含与选自SEQID NO:31、4、5、6和7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，且HCDR3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(LCVR)，其中所述LCVR包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含与SEQID NO:9所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，LCDR3包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中所述HCVR包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3并且所述LCVR包含(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包含与选自SEQ ID NO:30、1、2和3的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含与选自SEQ ID NO:31、4、5、6和7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，且HCDR3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成；其中LCDR1包含与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，LCDR3包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)，其中所述HCVR包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含选自SEQ ID NO:30、1、2和3的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含选自SEQ IDNO:31、4、5、6和7的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(LCVR)，其中所述LCVR包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQID NO:9所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中所述HCVR包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3并且所述LCVR包含(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包含选自SEQ ID NO:30、1、2和3的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含选自SEQ ID NO:31、4、5、6和7的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；LCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中所述HCVR包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3并且所述LCVR包含(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或由其组成，且HCDR3包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或由其组成；其中LCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或由其组成，LCDR3包含SEQID NO:11所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中所述HCVR包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3并且所述LCVR包含(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或由其组成，且HCDR3包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或由其组成；其中LCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或由其组成，LCDR3包含SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中所述HCVR包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3并且所述LCVR包含(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR3包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或由其组成；且LCDR3包含SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中所述HCVR包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3并且所述LCVR包含(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR2包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR3包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或由其组成；且LCDR3包含SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中所述HCVR包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3并且所述LCVR包含(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR2包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR3包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或由其组成；且LCDR3包含SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链可变区HCVR，其包含与选自SEQ ID NO:16、17、18和19的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区LCVR，其包含与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中重链可变区HCVR包含与选自SEQ ID NO:16、17、18和19的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区LCVR包含与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链可变区HCVR，其包含选自SEQ ID NO:16、17、18和19的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区LCVR，其包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中重链可变区HCVR包含选自SEQ ID NO:16、17、18和19的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区LCVR包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中重链可变区HCVR包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区LCVR包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中重链可变区HCVR包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区LCVR包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中重链可变区HCVR包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区LCVR包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中重链可变区HCVR包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区LCVR包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链，其中重链包含与选自SEQ ID NO:32、33、35、36、37、38、39或40的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链包含与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中重链包含与选自SEQ ID NO:32、33、35、36、37、38、39或40的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成；轻链包含与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链，其中重链包含选自SEQ ID NO:32、33、35、36、37、38、39或40的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中重链包含选自SEQ ID NO:32、33、35、36、37、38、39或40的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明抗OX40抗体或其片段的重链和/或轻链还包含信号肽序列，例如METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:46)。

在一些实施方案中，本发明的抗体还涵盖抗OX40抗体的氨基酸序列的变体，以及与上文所述的任何抗体结合相同表位的抗体。

在某些实施方案中，提供结合OX40或其片段的抗体或抗体片段(优选的抗原结合片段)，其中所述抗体结合OX40的片段内的表位。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体是IgG1形式的抗体或IgG2形式的抗体或IgG4形式的抗体。在一些实施方案中，抗OX40抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗OX40抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗OX40抗体是人抗体。在一些实施方案中，至少部分的抗OX40抗体的框架序列是人共有框架序列。在一个实施方案中，本发明的抗OX40抗体还涵盖其抗体片段，优选地选自以下的抗体片段：Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)₂片段。

在一方面，本发明提供了编码以上任何抗OX40抗体或其片段的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。

在一个实施方案中，本发明提供制备抗OX40抗体或其片段(优选的抗原结合片段)的方法，其中所述方法包含在适于表达编码所述抗体或其片段(优选的抗原结合片段)的核酸的条件下培养所述宿主细胞，以及任选地分离所述抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。在某个实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞回收抗OX40抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。

在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何抗OX40抗体或其片段(优选地其抗原结合片段)的组合物，优选地组合物为药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用载体。在一些实施方案中，所述药物组合物用于治疗癌症，优选地肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌、结肠癌等。

在一些实施方案中，本发明提供了免疫缀合物，其包含本文中提供的任何抗OX40抗体和细胞毒性剂。在一些实施方案中，所述免疫缀合物用于治疗癌症，优选地肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌、结肠癌等。

在一方面中，本发明涉及在受试者中活化T细胞或诱导T细胞介导的抗肿瘤活性或增强机体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗OX40抗体或其片段。本发明还涉及本文所述的任何抗OX40抗体或其片段制备用于在受试者中活化T细胞或诱导T细胞介导的抗肿瘤活性或增强机体的免疫应答的组合物或药物的用途。

在另一方面中，本发明涉及治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗OX40抗体或其片段。在一个实施方案中，癌症是肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌、结肠癌等。在另一方面，本发明还涉及本文所述的任何抗OX40抗体或其片段制备用于在受试者中治疗癌症的药物的用途。在一个实施方案中，癌症是肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌、结肠癌等。

在一些实施方案中，本文所述的方法还包括向所述受试者联合施用有效量的第二药物或活性剂，其中本文所述的抗OX40抗体或其片段是第一药物。在一些实施方案中，第二药物或活性剂选自化疗剂。在一些实施方案中，第二药物或活性剂选自PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体)或者抗血管发生剂(例如贝伐珠单抗)。

在一些实施方案中，受试者或个体是哺乳动物，优选地人。

在一方面中，本发明涉及检测样品中OX40的方法，所述方法包括(a)将样品与本文所述的任何抗OX40抗体或其片段接触；和(b)检测抗OX40抗体或其片段和OX40间的复合物的形成。在一个实施方案中，抗OX40抗体是被可检测地标记的。

在一些实施方案中，本发明涉及试剂盒或制品，其包含本文所述的任何抗OX40抗体或其片段。在一些实施方案中，所述试剂盒或制品包含本文所述的抗OX40抗体或其片段与任选的可药用载体。在一些实施方案中，该试剂盒或制品进一步包含关于施用药物来治疗癌症的说明书。

本发明还涵盖本文所述的任何实施方案的任意组合。本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的发明的任何和所有抗OX40抗体或其片段、方法和用途。

附图说明

图1显示了通过流式细胞术测定的在CHO细胞中产生的本发明的抗体(IgG2形式的ADI-20057，在CHO细胞中表达)随着浓度增加对OX40L与CHO细胞上表达的OX40的结合的阻断。

图2显示了用PHA加上在CHO细胞中产生的IgG1和IgG2形式的本发明的抗体活化的PBMC中T细胞活化时的IL-2分泌。

图3显示了通过抗-CD3和抗-CD28刺激加上在CHO细胞中产生的IgG1或IgG2形式的本发明的抗体，用人OX40和NFkB启动子-luc稳定转染的Jurkat中的荧光素酶报告基因检测,其中Jurkat与Raji细胞混合。

图4显示了通过抗-CD3和抗-CD28刺激加上在CHO细胞中产生的IgG1形式的本发明的抗体，用人OX40和NFkB启动子-luc稳定转染的Jurkat中的荧光素酶报告基因检测,其中Jurkat与Raji细胞混合。

图5显示了用SEE(1ng/ml)和在CHO细胞中产生的IgG1或IgG2形式的本发明的OX40抗体的DC共培养测定法。

图6显示了通过抗-CD3和抗-CD28和重组OX40L刺激加上在CHO细胞中产生的本发明的IgG1或IgG2形式的抗体或对照(IgG4、Pogalizumab，OX40L)，混合Raji细胞后，在稳定转染了人OX40和NFkB启动子-luc的Jurkat细胞中的荧光素酶报告基因检测。

图7显示了在HEK293细胞中产生的IgG1形式的本发明的抗体在基于荧光素酶报道基因中对表达人OX40的CHO细胞的ADCC活性。

图8显示了在HEK293细胞中产生的IgG2形式的本发明的抗体在基于荧光素酶报道基因中对表达人OX40的CHO细胞的ADCC活性。

图9显示了在NOG小鼠中给药在CHO细胞中产生的IgG1形式的本发明的OX40抗体ADI-20057-g1的Hu-PBMC LoVo肿瘤小鼠模型中个体小鼠的肿瘤生长曲线(其中每一条曲线代表一只小鼠的数据)。

图10显示了在NOG小鼠中给药在CHO细胞中产生的IgG2形式的本发明的OX40抗体ADI-20057-g2的Hu-PBMC LoVo肿瘤小鼠模型中个体小鼠的肿瘤生长曲线(其中每一条曲线代表一只小鼠的数据)。

图11显示了在NOG小鼠中给药在CHO细胞中产生的IgG1和IgG2形式的本发明的OX40抗体ADI-20057-g1和ADI-20057-g2的Hu-PBMC LoVo肿瘤小鼠模型。显示了在肿瘤植入后第28天的最终肿瘤体积测量。

图12显示了在NOG小鼠中给药在CHO细胞中产生的IgG1和IgG2形式的本发明的OX40抗体ADI-20057-g1和ADI-20057-g2的Hu-PBMC LoVo肿瘤小鼠模型。显示了给药后小鼠体重变化。

发明详述

定义

在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。

为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括现有技术已知以及本文中所描述的那些。

本文所用的术语“抗OX40抗体”、“抗OX40”、“OX40抗体”或“结合OX40的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲合力结合人或食蟹猴OX40蛋白或其片段以致所述抗体可以用作靶向人或食蟹猴OX40中的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗OX40抗体与非人或食蟹猴OX40蛋白结合的程度低于所述抗体与人或食蟹猴OX40结合的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％或以上，如例如通过放射性免疫测定(RIA)或生物光干涉测定法或MSD测定法测量的。在一些实施方案中，抗OX40的抗体结合人或食蟹猴的OX40的解离常数(Kd)≤100nM，≤10nM或≤1nM(例如10^-7M以下，例如10^-7M至10^-10M，例如10^-8M至10^-9M)。

如本文所用，“单克隆抗体”或“mAb”指来源于例如真核生物的、原核生物的或噬菌体克隆的单一拷贝或克隆的抗体，而不指其产生的方法。单克隆抗体或其抗原结合片段可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术例如CDR嫁接、或此类或其它本领域已知的技术的组合来产生。

“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1，CH2，和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。“天然序列Fc区”包含与在自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区；及其天然存在变体。

“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

与参照抗体“结合相同表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％以上的所述参照抗体与其抗原的结合，反之，参照抗体在竞争测定中阻断50％以上的该抗体与其抗原的结合。

本领域已知五个主要类别的抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些抗体中的数个可以进一步被划分为亚类(同种型)，例如，IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄，IgA₁和IgA₂。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ。

“IgG形式的抗体”是指抗体的重链恒定区所属于的IgG形式。所有同一型的抗体的重链恒定区都是相同的，不同型的抗体之间的重链恒定区不同。例如，IgG1形式的抗体是指其重链恒定区Ig结构域为IgG1的Ig结构域。

术语“功能障碍”在免疫功能障碍的背景中指降低的对抗原性刺激的免疫响应性的状态。如本文中使用的，术语“功能障碍”还包括对抗原识别的不感受或不响应，特别地，将抗原识别转化成下游T细胞效应器功能，诸如增殖，细胞因子生成(例如γ干扰素)和/或靶细胞杀伤的能力受损。

本文所用的表述“不阻断人OX40与OX40配体/OX40L的结合”意思是本发明的抗体不影响人OX40与OX40L的结合。在一些实施方案中，与存在阴性对照(例如IgG抗体)时OX40与OX40L的结合程度相比，存在本发明抗OX40抗体时OX40与OX40L的结合程度不减少。在一些实施方案中，与存在阴性对照(例如IgG抗体)时OX40与OX40L的结合程度相比，存在本发明抗OX40抗体时OX40与OX40L的结合程度最多减少10％。在一些实施方案中，OX40与OX40L的结合程度通过荧光素酶报告基因测定。在一些实施方案中，OX40与OX40L的结合程度通过流式细胞术测定。

“活化T细胞”意指诱导，引起或刺激效应或记忆T细胞具有更新，持续或放大的生物学功能。增强T细胞功能的例子包括：相对于干预前的此类水平，升高的来自CD8⁺效应T细胞的γ-干扰素(例如IFNg)或白细胞介素(例如IL-2)分泌，升高的来自CD4⁺记忆和/或效应T细胞的γ-干扰素(例如IFNg)或白细胞介素(例如IL-2)分泌，升高的CD4⁺效应和/或记忆T细胞增殖，升高的CD8⁺效应T细胞增殖，升高的抗原响应性(例如清除)。在一个实施方案中，增强的水平是至少50％,或者60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、2倍、3倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。测量此增强的方式是本领域普通技术人员已知的。

“肿瘤免疫”指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。如此，作为治疗概念，肿瘤免疫在此类逃避减弱时得到“治疗”，并且肿瘤被免疫***识别并攻击。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合，肿瘤收缩和肿瘤清除。

“免疫原性”指特定物质引发免疫应答的能力。肿瘤是免疫原性的，并且增强肿瘤免疫原性有助于通过免疫应答清除肿瘤细胞。

如本文中使用的，“抗体的激动剂活性”指抗体能活化它所结合的抗原的生物学活性。

“抗血管发生剂”指阻断或在某种程度上干扰血管发育的化合物。抗血管发生剂可以是例如结合涉及促进血管发生的生长因子或生长因子受体的小分子或抗体。在一个实施方案中，抗血管发生剂是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，诸如贝伐单抗(AVASTIN)。

术语“PD-1轴结合拮抗剂”是指如下的分子，其抑制PD-1轴结合配偶与一种或多种它的结合配偶相互作用，从而去除源自PD-1信号传导轴上的信号传导的T细胞功能障碍-一项结果是恢复或增强T细胞功能(例如增殖，细胞因子生成，靶细胞杀伤)。如本文中使用的，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体)，PD-L1结合拮抗剂(例如抗PD-L1抗体)和PD-L2结合拮抗剂(例如抗PD-L2抗体)。

术语“PD-1结合拮抗剂”指如下的分子，其降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-1与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-L1，PD-L2)相互作用的信号转导。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1结合一种或多种它的结合配偶的分子。在一个特定方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1结合PD-L1和/或PD-L2。例如，PD-1结合拮抗剂包括降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-1与PD-L1和/或PD-L2相互作用的信号转导的抗PD-1抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂降低由或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导的负面共刺激信号(经由PD-1介导信号传导)，从而使得功能障碍性T细胞不太功能障碍性(例如增强对抗原识别的效应器应答)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体。在一个具体实施方案中，PD-1结合拮抗剂是WO2015/095423中公开的MDX-1106(nivolumab)、MK-3475(pembrolizumab)、CT-011(pidilizumab)或AMP-224。

术语“PD-L1结合拮抗剂”指如下的分子，其降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-L1与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1，B7-1)相互作用的信号转导。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1结合它的结合配偶的分子。在一个特定方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1结合PD-1和/或B7-1。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂包括降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-L1与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1，B7-1)相互作用的信号转导的抗PD-L1抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂降低由或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导的负面共刺激信号(经由PD-L1介导信号传导)，从而使得功能障碍性T细胞不太功能障碍性(例如增强对抗原识别的效应器应答)。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一个具体方面，抗PD-L1抗体是WO2015/095423中公开的YW243.55.S70、MDX-1105、MPDL3280A或MEDI4736。

术语“PD-L2结合拮抗剂”指如下的分子，其降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-L2与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1)相互作用的信号转导。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2结合一种或多种它的结合配偶的分子。在一个特定方面，PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2结合PD-1。在一些实施方案中，PD-L2拮抗剂包括降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-L2与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1)相互作用的信号转导的抗PD-L2抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂降低由或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导的负面共刺激信号(经由PD-L2介导信号传导)，从而使得功能障碍性T细胞不太功能障碍性(例如增强对抗原识别的效应器应答)。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是免疫粘附素。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如NK细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型免疫球蛋白使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或美国专利No.6,737,056(Presta)中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括PBMC和NK细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的。本文实施例中提供了用于评估ADCC活性的一种例示性测定法。

如本文中使用的，术语“OX40”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人、食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然OX40，除非另有说明。该术语涵盖“全长”，未加工的OX40以及因细胞中的加工所致的任何形式的OX40。该术语还涵盖OX40的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。

“OX40活化”指OX40受体的活化。通常，OX40活化导致信号转导。

术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂例子参见WO2015/153513中所公开的那些。

“化疗剂”包括在治疗癌症中有用的化学化合物。化疗剂的例子参见WO2015/153513中所公开的那些，包括厄洛替尼(erlotinib)(Genentech/OSIPharm.)，硼替佐米(bortezomib)(Millennium Pharm.)，双硫仑(disulfiram)，烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)；氮丙啶类(aziridines)等；及任何上述各项的药学可接受盐，酸或衍生物。

化疗剂还包括(i)起调节或抑制激素对肿瘤作用的作用的抗激素剂，诸如抗***类和选择性***受体调控物类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括柠檬酸他莫昔芬)；(ii)抑制在肾上腺中调节***生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑，氨鲁米特(aminoglutethimide)；(iii)抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)；(iv)蛋白质激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α，Ralf和H-Ras；(vii)核酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如 和rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂，诸如 rmRH；和(ix)及任何上述药剂的药学可接受盐，酸和衍生物。

化疗剂还包括抗体，诸如阿仑珠单抗(alemtuzumab)(Campath)，贝伐珠单抗(bevacizumab)(Genentech)等等，和抗体药物缀合物，吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)(Wyeth)。具有作为与本发明化合物组合的药剂的治疗潜力的别的人源化单克隆抗体例子如阿泊珠单抗(apolizumab)，优特克单抗(ustekinumab)，维西珠单抗(visilizumab)，和抗白介素-12(ABT-874/J695，WyethResearch and Abbott Laboratories)，其为经遗传修饰以识别白介素-12p40蛋白的重组专有人序列全长IgG1λ抗体。

化疗剂还包括“EGFR抑制剂”，其指结合EGFR或以其它方式直接与EGFR相互作用并阻止或降低其信号传导活性的化合物，其另外还称作“EGFR拮抗剂”。此类药剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的例子包括MAb 579(ATCC CRL HB8506)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利No.5,891,996中所述；和结合EGFR的人抗体，诸如ABX-EGF或帕尼单抗(Panitumumab)(参见WO98/50433，Abgenix/Amgen)；人EGFR抗体，HuMax-EGFR(GenMab)。抗EGFR抗体可与细胞毒剂缀合，由此产生免疫缀合物(参见例如EP 659,439A2，Merck Patent GmbH)。EGFR拮抗剂包括小分子，诸如美国专利No.5,616,582，5,457,105，5,475,001，5,654,307，5,679,683，6,084,095，6,265,410，6,455,534，6,521,620，6,596,726，6,713,484，5,770,599，6,140,332，5,866,572，6,399,602，6,344,459，6,602,863，6,391,874，6,344,455，5,760,041，6,002,008，和5,747,498，以及PCT公开文本WO98/14451，WO98/50038，WO99/09016，和WO99/24037中描述的化合物。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774，厄洛替尼(erlotinib)等。

化疗剂还包括“酪氨酸激酶抑制剂”，包括前一段中提到的EGFR靶向药物；小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂，诸如可从Takeda获得的TAK165；雷帕霉素(西罗莫司，)等；或任何下列专利公开文本中描述的：美国专利No.5,804,396；WO1999/09016(American Cyanamid)；WO1998/43960(American Cyanamid)；WO1997/38983(Warner Lambert)；WO1999/06378(Warner Lambert)；WO1999/06396(WarnerLambert)；WO1996/30347(Pfizer,Inc)；WO1996/33978(Zeneca)；WO1996/3397(Zeneca)和WO1996/33980(Zeneca)。

化疗剂还包括***(dexamethasone)，氢化可的松(hydrocortisone)、干扰素，贝伐珠单抗(bevacuzimab)，贝沙罗汀(bexarotene)等，及其药学可接受盐。

化疗剂还包括具有止痛，退热和消炎效果的非类固醇消炎药。NSAID包括酶环氧合酶的非选择性抑制剂。NSAID的具体例子包括阿司匹林(aspirin)。NSAID可被指示用于诸如类风湿性关节炎，骨关节炎，炎性关节病，强直性脊柱炎，银屑病关节炎，莱特尔氏综合征，急性痛风，痛经，骨转移疼痛，头痛和偏头痛，手术后疼痛，由于炎症和组织损伤引起的轻至中度疼痛，发热，肠梗阻，和肾绞痛等疾患的症状缓解。

关于上述各种化疗剂的详细列举和介绍可以参见PCT国际申请WO2015/153513中公开的那些，其以全文引入本文作为参考。

术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子，单核因子；白介素(IL)，诸如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)和γ-干扰素。如本文中使用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体，及其药剂学可接受的衍生物和盐。

术语“双抗体(diabodies)”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段在相同的多肽链(VH-VL)中包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用因为太短而不能在相同链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更充分地描述于例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：6444-6448(1993)中。三抗体和四抗体同样描述于Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)中。

“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变域)联合，而且可以使用多种测定法来评估，例如本文所公开的那些。

“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在某些实施方案中，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)，天然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液。

术语“有效量”指本发明的抗体或片段这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在治疗的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；它的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。

适用于本发明的“抗体及其抗原结合片段”包括但不限于多克隆、单克隆、单价、双特异性、异缀合物、多特异性、重组、异源、异源杂合、嵌合、人源化(特别是嫁接有CDR的)、去免疫的、或人的抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段、由Fab表达库产生的片段、Fd、Fv、二硫化物连接的Fv(dsFv)、单链抗体(例如scFv)、双抗体或四抗体(Holliger P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(14),6444-6448)、纳米抗体(nanobody)(也称为单域抗体)、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗Id抗体)和上述任一种的表位结合片段。

“Fab”片段包括重链可变结构域和轻链可变结构域，并且还包括轻链的恒定结构域以及重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段因在重链CH1结构域的羧基末端增加了一些残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不同。Fab’-SH是本文中对其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab’)₂抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号***，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见，例如，Kindt等Kuby Immunology，6^thed.，W.H.Freeman and Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构域来分离结合所述抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)。

“框架”或“F R”是指除高变区(HVR)(例如互补决定区)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常出现在重链可变结构域(VH)(或轻链可变结构域(VL))的以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

除非另有说明，抗体各个结构域中的残基的编号根据EU编号***，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。

术语“全长抗体”、“完整的抗体”和“完整抗体”在本文被可交换地用于指结构与天然抗体结构基本相似或具有包含如本文所定义的Fc区的重链的抗体。

“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域以紧密的，非共价缔合的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接从而使轻链和重链可以以类似于双链Fv种类的“二聚体”结构缔合。在这种构型中，每个可变结构域的三个HVRs相互作用从而限定在VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。总而言之，六个HVRs将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个HVRs的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和性低于完整结合位点。关于scFv的综述参见例如Pluckthun于The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，卷113，Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag，New York，1994)，pp.269-315中。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换地使用且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。

“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于这样抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人共有框架”是指这样的框架，即在选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列中，其代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。一般而言，该序列的亚型是如Kabat等(Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，1-3卷)中公开的亚型。在一个实施方案中，对于VL，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型III。

“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。

术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌，和肺的鳞癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)，胰腺癌，成胶质细胞瘤，***，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，尿道癌，肝瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，***癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，***癌，***癌，黑素瘤，浅表扩散性黑素瘤，恶性雀斑样痣黑素瘤，肢端黑素瘤，结节性黑素瘤，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，毛细胞性白血病，慢性成髓细胞性白血病，和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)，水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖，脑瘤和脑癌，以及头颈癌，及相关转移。在某些实施方案中，适合于通过本发明的抗体来治疗的癌症包括肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌或结肠癌，包括那些癌症的转移性形式。

术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。

术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”，“癌性”，“细胞增殖性病症”，“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。

“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。

“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。

“分离的”抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。

“分离的”核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色***置的染色***置处。

“分离的编码抗OX40抗体或其抗原结合片段的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码抗体重和轻链(或其抗原结合片段)，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。

相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的相同氨基酸残基的百分比。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。

当在本申请中提到序列同一性的百分比时，若未另外特别指出，这些百分比相对于较长序列的全长计算。相对于较长序列的全长计算适用于核酸序列和多肽序列两者。

术语“药物组合物”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

术语“药用载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂或媒介物。

用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。

术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。

“受试者/患者样品”指从癌症患者或癌症受试者得到的细胞或流体的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、细针吸出物、支气管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手术标本、循环中的肿瘤细胞、血清、血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如***固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。

术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症，用法，剂量，施用，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。

本发明的抗体

一方面，本发明提供了分离的结合人OX40的抗体或其片段(优选地抗原结合片段)，其中所述抗体或其片段能够结合人OX40，同时不阻断人OX40与OX40配体(OX40L)的结合。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段能够活化T细胞，例如增强T效应细胞的免疫刺激/效应功能和/或使这些细胞增殖。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段能够引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段能够用来治疗或延缓各种癌症、免疫相关疾病和T细胞功能障碍性疾病。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段结合人OX40或食蟹猴OX40。在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段不结合鼠OX40，例如大鼠OX40或小鼠OX40。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体具有激动剂活性。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段结合人OX40或食蟹猴OX40的Kd小于大约100nM，优选地，小于或等于大约10nM，更优选地小于或等于大约8nM，更优选地小于或等于大约7nM、6nM、5nM、4nM、3nM或2nM，最优选地，所述Kd小于或等于大约1nM或0.8nM。在一些实施方案中，抗体结合亲和力是使用生物光干涉测定法(例如Fortebio亲和测量)或MSD测定法测定的。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段对人OX40或食蟹猴OX40的结合是使用流式细胞术(例如FACS)测定法测定的。在一些实施方案中，对人OX40或食蟹猴OX40的结合具有小于或等于大约10nM、9nM、8nM或7nM的EC50。在一些实施方案中，对人OX40或食蟹猴OX40的结合具有小于或等于大约6nM或大约5nM或大约4nM或大约3nM的EC50。在一些实施方案中，在用流式细胞术测定法进行的测定中，本发明的抗体或其片段结合细胞上表达的OX40，与不表达OX40的相应对照细胞相比，MFI值大于1000倍差异，优选地大于1100倍差异、1200倍差异、1300倍差异、1400倍差异、1500倍差异、1600倍差异、1700倍差异、1800倍差异、1900倍差异、2000倍差异。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段具有功能性Fc区。在一些实施方案中，功能性Fc区的效应子功能是ADCC。在一些实施方案中，该Fc区是人IgG1。

另一方面，本发明提供能够活化T细胞(例如CD4+T细胞)的具有激动剂活性的抗OX40抗体或其片段。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段能够活化T细胞。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体能够不仅不阻断人OX40与其配体OX40L的结合，而且增加OX40的基于OX40L的T细胞活化。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段增强CD4+效应T细胞功能，例如通过提高CD4+效应T细胞增殖和/或提高CD4+效应T细胞的γ-干扰素生成(例如与本发明的抗OX40抗体或其片段处理之前的增殖和/或细胞因子生成相比，或者与对照抗体(例如IgG抗体)处理的CD4+效应T细胞的增殖和/或细胞因子生成相比)。在一些实施方案中，该细胞因子是γ-干扰素，例如IFNg或白细胞介素，例如IL-2。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段提高肿瘤内(浸润性)CD4+效应T细胞的数目(例如CD4+效应T细胞的总数，或例如CD45+细胞中CD4+细胞的百分比)，例如与本发明的抗OX40抗体或其片段处理之前(或与对照抗体(例如IgG抗体)处理之后)肿瘤内(浸润性)CD4+T细胞的数目相比。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段提高表达γ-干扰素的肿瘤内(浸润性)CD4+效应T细胞的数目(例如表达γ-干扰素的CD4+细胞的总数，或例如总CD4+细胞中表达γ-干扰素的CD4+细胞的百分比)，例如与本发明的抗OX40抗体或其片段处理之前(或与对照抗体(例如IgG抗体)处理之后)表达γ-干扰素的肿瘤内(浸润性)CD4+T细胞的数目相比。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段提高肿瘤内(浸润性)CD8+效应T细胞的数目(例如CD8+效应T细胞的总数，或例如CD45+细胞中CD8+的百分比)，例如与本发明的抗OX40抗体或其片段处理之前(或与对照抗体(例如IgG抗体)处理之后)肿瘤内(浸润性)CD8+T效应细胞的数目相比。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段提高表达γ-干扰素的肿瘤内(浸润性)CD8+效应T细胞的数目(例如总CD8+细胞中表达γ-干扰素的CD8+细胞的百分比)，例如与本发明的抗OX40抗体或其片段处理之前(或与对照抗体，例如IgG抗体处理之后)表达γ-干扰素的肿瘤内(浸润性)CD8+T细胞的数目相比。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段增强记忆T细胞功能，例如通过提高记忆T细胞增殖和/或提高记忆细胞的细胞因子生成。在一些实施方案中，该细胞因子是γ-干扰素或白细胞介素。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段提高表达OX40的靶细胞中的OX40信号转导。在一些实施方案中，OX40信号转导是通过监测NFkB下游信号传导而检测的。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段的激动剂活性由T细胞活化后释放的细胞因子的水平来评估。因此，本发明提供了与用IgG对照处理的CD4+T细胞的细胞因子生成相比，提高CD4+T细胞的细胞因子生成的抗OX40抗体或其片段。在一些实施方案中，该细胞因子是炎性细胞因子，例如γ-干扰素(例如IFNg)或白细胞介素(例如IL-2)。

优选地，与相应的对照IgG相比，本发明的抗OX40抗体或其片段能够将CD4+T细胞分泌的IL-2水平增加高达大约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍或更高。在一些实施方案中，与相应的对照IgG相比，本发明的抗OX40抗体或其片段能够将CD4+T细胞分泌的IFNg水平增加高达大约1倍、2倍或3倍或更高。在一些实施方案中，通过ELISA测定T细胞的细胞因子分泌水平。

在一些实施方案中，抗OX40抗体的激动剂活性由OX40信号传导(例如监测NFkB下游信号传导)来评估。因此，本发明提供了与用IgG对照抗体相比，提高NFκB介导的转录活性水平的抗OX40抗体或其片段。优选地，与相应的对照IgG相比，本发明的抗OX40抗体或其片段能够将NFκB介导的转录活性水平提高大约1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或更多。

在一些优选的实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段能够诱发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段结合人效应细胞，例如结合人效应细胞表达的FcγR(例如活化性FcγR)。在一些实施方案中，该人效应细胞实施(能够实施)ADCC效应子功能。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段的功能需要抗体交联。在一些实施方案中，功能是刺激CD4+效应T细胞增殖。在一些实施方案中，抗体交联是通过提供粘附至固体表面(例如细胞培养板)的抗人OX40激动性抗体而测定的。在一些实施方案中，抗体交联是通过在该抗体的IgG Fc部分中引入突变(例如氨基酸序列突变)并测试突变体抗体的功能而测定的。在一些实施方案中，抗体交联是通过FcgRIIb来实现的。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)，其中所述HCVR包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含与选自SEQ ID NO:30、1、2和3的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含与选自SEQID NO:31、4、5、6和7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，且HCDR3包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，抗OX40抗体或其片段的HCVR的CDR(例如与参考序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的CDR)的氨基酸序列相对于对应的参考序列包含一个或多个置换(例如保守性置换)、***或缺失，但是包含所述CDR的抗OX40抗体或其片段仍然具有结合OX40的能力，且不阻断OX40与其配体OX40L的结合。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(LCVR)，其中所述LCVR包含互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含与SEQID NO:9所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，LCDR3包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，抗OX40抗体或其片段的LCVR的CDR(例如与参考序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的CDR)的氨基酸序列相对于对应的参考序列包含一个或多个置换(例如保守性置换)、***或缺失，但是包含所述CDR的抗OX40抗体或其片段仍然具有结合OX40的能力，且不阻断OX40与其配体OX40L的结合。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)，其中重链可变区HCVR包含与选自SEQ ID NO:16、17、18和19的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗OX40抗体的重链可变区HCVR包含与选自SEQ IDNO:16、17、18和19的氨基酸序列相比具有一个或多个置换(例如保守性置换)、***或缺失的氨基酸序列，但是包含所述HCVR的抗OX40抗体或其片段仍然具有结合OX40的能力，且不阻断OX40与其配体OX40L的结合。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(LCVR)，其中轻链可变区LCVR包含与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗OX40抗体的轻链可变区LCVR包含与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列相比具有一个或多个置换(例如保守性置换)、***或缺失的氨基酸序列，但是包含所述LCVR的抗OX40抗体或其片段仍然具有结合OX40的能力，且不阻断OX40与其配体OX40L的结合。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链，其中重链包含与选自SEQ ID NO:32、33、35、36、37、38、39或40的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗OX40抗体的重链包含与选自SEQ ID NO:32、33、35、36、37、38、39或40的氨基酸序列相比具有一个或多个置换(例如保守性置换)、***或缺失的氨基酸序列，但是包含所述重链的抗OX40抗体或其片段仍然具有结合OX40的能力，且不阻断OX40与其配体OX40L的结合。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链包含与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗OX40抗体的轻链包含与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列相比具有一个或多个置换(例如保守性置换)、***或缺失的氨基酸序列，但是包含所述轻链的抗OX40抗体或其片段仍然具有结合OX40的能力，且不阻断OX40与其配体OX40L的结合。在优选的实施方案中，置换、***或缺失发生在CDR外的区域(例如在FR中)。任选地，本发明的抗OX40抗体包括对轻链可变区、重链可变区、轻链或重链的翻译后修饰。

在一些实施方案中，置换为保守性置换。保守置换是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸置换，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸置换，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸置换，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸置换。示例性的置换如下表A所示：

表A

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体经改变以增加或降低抗体经糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点而方便地实现。在一些应用中，除去不想要的糖基化位点的修饰可以是有用的，或例如除去岩藻糖模块以提高抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等(2002)JBC277:26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖苷化修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。

在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，以便增强例如抗体治疗癌症或细胞增殖性疾病的有效性。Fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。

在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代MAb”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基置换。

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。

在一些实施方案中，本发明涵盖抗OX40抗体的片段。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH，F(ab’)₂、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有单一抗原结合位点，和残留的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)₂片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体是人源化抗体。用于使抗体人源化的不同方法是技术人员已知的，如由Almagro&Fransson综述的，其内容通过提述完整并入本文(Almagro JC和Fransson J(2008)Frontiers inBioscience13:1619-1633)。Almagro&Fransson区分理性办法和经验办法。理性办法的特征在于生成少数工程化抗体变体并评估其结合或任何其它感兴趣的特性。如果设计的变体不产生预期的结果，那么启动新一轮的设计和结合评估。理性办法包括CDR嫁接、表面重建(Resurfacing)、超人源化(Superhumanization)和人字符串内容优化(Human StringContent Optimization)。相比之下，经验办法基于生成大的人源化变体库并使用富集技术或高通量筛选选出最佳克隆。因而，经验办法依赖于能够对大量抗体变体进行搜索的可靠的选择和/或筛选***。体外展示技术，如噬菌体展示和核糖体展示满足这些要求并且是技术人员公知的。经验办法包括FR库、导向选择(Guided selection)、框架改组(Framework-shuffling)和Humaneering。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体是人抗体。可使用本领域中已知的各种技术来制备人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol5：368-74(2001)以及Lonberg，Curr.Opin.Immunol 20：450-459(2008)。

可通过在组合文库中筛选具有所需活性的抗体来分离本发明抗体。举例来说，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示文库并且在这些文库中筛选具有所需结合特征的抗体的方法。这些方法于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O′Brien等人编，人Press，Totowa，NJ，2001)中评述，并且进一步于例如McCafferty等人，Nature348：552-554；Clackso等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology248：161-175(Lo编，Human Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；以及Lee等人，J.Immunol.Methods284(1-2)：119-132(2004)中描述。

在一些实施方案中，本发明还涵盖与治疗性模块，如细胞毒性剂或免疫抑制剂缀合的抗OX40单克隆抗体(“免疫缀合物”)。细胞毒性剂包括任何对细胞有害的药剂。适合于形成免疫缀合物的细胞毒性剂(例如化疗剂)的例子是本领域中已知的，参见例如WO05/103081。例如，细胞毒性剂包括但不限于：放射性同位素(例如，At²¹¹，I¹³¹，I¹²⁵，Y⁹⁰，Re¹⁸⁶，Re¹⁸⁸，Sm¹⁵³，Bi²¹²，P³²，pb²¹²和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如核酸水解酶；抗生素；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；和已知的各种抗肿瘤或抗癌剂。

例示性的细胞毒性剂可选自抗微管剂，铂配位复合物，烷化剂，抗生剂，拓扑异构酶II抑制剂，抗代谢物，拓扑异构酶I抑制剂，激素和激素类似物，信号转导途径抑制剂，非受体酪氨酸激酶血管发生抑制剂，免疫治疗剂，促凋亡剂，LDH-A的抑制剂，脂肪酸生物合成的抑制剂，细胞周期信号传导抑制剂，HDAC抑制剂，蛋白酶体抑制剂，和癌代谢的抑制剂。

在一个实施方案中，细胞毒性剂选自抗微管剂，铂配位复合物，烷化剂，抗生素，拓扑异构酶II抑制剂，抗代谢物，拓扑异构酶I抑制剂，激素和激素类似物，信号转导途径抑制剂，非受体酪氨酸激酶血管发生抑制剂，免疫治疗剂，促凋亡剂，LDH-A的抑制剂，脂肪酸生物合成的抑制剂，细胞周期信号传导抑制剂，HDAC抑制剂，蛋白酶体抑制剂，和癌代谢的抑制剂。在一个实施方案中，细胞毒性剂是紫杉烷(taxane)。在一个实施方案中，紫杉烷是帕利他赛(paclitaxel)或多西他赛(docetaxel)。在一个实施方案中，细胞毒性剂是铂剂。在一个实施方案中，细胞毒性剂是EGFR的拮抗剂。在一个实施方案中，EGFR的拮抗剂是N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(例如厄洛替尼(erlotinib))。在一个实施方案中，细胞毒性剂是RAF抑制剂。在一个实施方案中，RAF抑制剂是BRAF和/或CRAF抑制剂。在一个实施方案中，RAF抑制剂是维罗非尼(vemurafenib)。在一个实施方案中，细胞毒性剂是PI3K抑制剂。

在一些实施方案中，本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性或多特异性的。多特异性单抗可以对一种靶多肽的不同表位是特异性的或可以含有对超过一种靶多肽特异性的抗原结合域。参见例如，Tutt等(1991)J.Immunol.147:60-69。抗OX40单抗可以与另一种功能性分子(例如另一种肽或蛋白质)连接或共表达。例如抗体或其片段可以功能性与一或多种其它分子，如另一种抗体或抗体片段连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价联合或以其它方式)以产生具有第二或更多结合特异性的双特异性或多特异性抗体。

本发明的核酸以及包含其的宿主细胞

在一方面，本发明提供了编码以上任何抗OX40抗体或其片段的核酸。所述核酸可以编码包含抗体的轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列，或包含抗体的轻链和/或重链的氨基酸序列。示例性的编码抗体重链可变区的核酸序列包括与选自SEQ ID NO:12,13,14或15的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸序列，或者包括选自SEQ ID NO:12,13,14或15所示的核酸序列。示例性的编码抗体轻链可变区的核酸序列包括与SEQ ID NO:20所示的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸序列，或者包括SEQ ID NO:20所示的核酸序列。

在一个实施方案中，提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。

在一个实施方案中，提供包含所述载体的宿主细胞。用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见，例如，美国专利号5,648,237，5,789,199和5,840,523，还见Charlton，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编辑，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以从可溶级分中的细菌细胞糊状物分离，并且可以进一步纯化。

在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。例如，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是关于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经进行“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)，和Li等，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293HEK或293细胞，如例如Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977)中所描述的)等。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：216(1980))；以及骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如Yazaki和Wu，Methods in MolecularBiology，卷248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。

在一个实施方案中，提供了制备抗OX40抗体的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。为了重组产生抗OX40抗体，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体)的核酸，并将其***一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。

测定法

可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗OX40抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹，等来进行。可使用本领域已知方法来测定OX40结合，本文中公开了例示性方法。在一些实施方案中，使用生物光干涉测定法(例如Fortebio亲和测量)或MSD测定法。

另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与本文中公开的任何抗OX40抗体竞争对OX40的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与本文中公开的任何抗OX40抗体所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,Methods in Molecular Biologyvol.66(Humana Press,Totowa,NJ)。

本发明还提供了用于鉴定具有生物学活性的抗OX40抗体的测定法。生物学活性可以包括例如结合OX40(例如结合人和/或食蟹猴OX40)，提高OX40介导的信号转导(例如提高NFkB介导的转录)，通过ADCC消减表达人OX40的细胞，增强T效应细胞功能(例如CD4+效应T细胞)(例如通过提高效应T细胞增殖和/或提高效应T细胞的细胞因子生成(例如γ干扰素或白细胞介素))，增强记忆T细胞功能(例如CD4+记忆T细胞)(例如通过提高记忆T细胞增殖和/或提高记忆T细胞的细胞因子生成(例如γ干扰素或白细胞介素))，结合人效应细胞。还提供在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。

在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。

可以使用本领域已知的方法来测定T细胞活化。例如，通过T细胞活化后释放的细胞因子，例如γ干扰素或白细胞介素的水平来测定。还可以使用本领域公知的方法来测定OX40信号传导，从而测定T细胞的活化。在一个实施方案中，生成表达人OX40和报告基因(包含融合至报告基因(例如β萤光素酶)的NFkB启动子)的转基因细胞。对细胞添加抗OX40抗体导致NFkB转录升高，这使用针对报告基因的测定法(例如荧光素酶报告基因测定法)来检测。

供任何上述体外测定法使用的细胞包括天然表达OX40或经改造而表达OX40的细胞或细胞系。此类细胞包括天然表达OX40的活化后的T细胞，Treg细胞和活化后的记忆T细胞。此类细胞还包括表达OX40的细胞系和并非正常情况下表达OX40但已经用编码OX40的核酸转染的细胞系。

可以理解的是，能够使用本发明的免疫缀合物替换或补充抗OX40抗体来进行任何上述测定法。

可以理解的是，能够使用抗OX40抗体和别的治疗剂来进行任何上述测定法。

药物组合物和药物制剂

本发明还包括包含抗OX40抗体的组合物(包括药物组合物或药物制剂)和包含编码抗OX40抗体的多核苷酸的组合物。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种结合OX40的抗体或其片段或一种或多种编码一种或多种结合OX40的抗体或其片段的多核苷酸。这些组合物还可以包含合适的药用载体，如本领域中已知的药用赋形剂，包括缓冲剂。

适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些具有石油、动物、植物或合成起源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”,第五版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,PharmaceuticalPress,London,Chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准载体，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。

可以通过将具有所需纯度的本发明的抗OX40抗体与一种或多种任选的药用载体(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备包含本文所述的抗OX40抗体的药物制剂，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。

示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它抗癌活性成分，例如化疗剂、PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体)或者抗血管发生剂(例如贝伐珠单抗)。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

关于包含本发明抗体的药物制剂，还可以参见WO2015/153513中公开的那些。

抗体的治疗方法和用途

在一方面中，本发明涉及在受试者中活化T细胞或诱导T细胞介导的抗肿瘤活性或增强机体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗OX40抗体或其片段。

在另一方面中，本发明涉及治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗OX40抗体或其片段。在一个实施方案中，癌症是肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌、结肠癌等。

在另一方面，本发明涉及在受试者中引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗OX40抗体或其片段。

在另一方面，本发明涉及在受试者中治疗或延缓各种癌症、免疫相关疾病和T细胞功能障碍性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗OX40抗体或其片段。

一些实施方案中，本文所述的方法还包括向所述受试者联合施用有效量的第二药物或活性剂，其中本文所述的抗OX40抗体或其片段是第一药物。在一些实施方案中，第二药物或活性剂选自化疗剂。在一些实施方案中，第二药物或活性剂选自PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体)或者抗血管发生剂(例如贝伐珠单抗)。

在一些实施方案中，受试者或个体是哺乳动物，优选地人。

在其他方面，本发明提供抗OX40抗体或其片段在生产或制备药物中的用途，所述药物用于治疗上文提及的相关疾病或病症。

在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。

在一些实施方案中，癌症的例子进一步包括但不限于B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，小淋巴细胞性(SL)NHL，中级/滤泡性NHL，中级弥漫性NHL，高级成免疫细胞性NHL，高级成淋巴细胞性NHL，高级小无核裂细胞性NHL，贮积病(bulkydisease)NHL，套细胞淋巴瘤，AIDS相关淋巴瘤，和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，毛细胞性白血病，慢性成髓细胞性白血病，和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)，水肿(诸如与脑瘤有关的)，B细胞增殖性病症，和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。更具体例子包括但不限于复发性或顽固性NHL，前线(front line)低级NHL，阶段III/IVNHL，化疗耐受性NHL，前体B成淋巴细胞性白血病和/或淋巴瘤，小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞性白血病和/或前淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞前淋巴细胞性淋巴瘤，免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞性(lymphoplasmacytic)淋巴瘤，淋巴浆细胞性淋巴瘤，边缘区B细胞淋巴瘤，脾边缘区淋巴瘤，节外边缘区(extranodal marginalzone)-MALT淋巴瘤，节边缘区(nodal marginal zone)淋巴瘤，毛细胞性白血病，浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤，低级/滤泡淋巴瘤，中级/滤泡NHL，套细胞淋巴瘤，滤泡中心淋巴瘤(滤泡的)，中级弥漫性NHL，弥漫性大B细胞淋巴瘤，攻击性(agressive)NHL(包括攻击性前线NHL和攻击性复发性NHL)，自体干细胞移植后复发性或顽固性NHL，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤，高级成免疫细胞NHL，高级成淋巴细胞NHL，高级小无核裂细胞NHL，贮积病(bulky disease)NHL，伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤，前体(外周)大粒状淋巴细胞白血病，蕈样肉芽肿病和/或塞扎里(Sezary)综合征，皮肤淋巴瘤，间变性大细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤。

在一些实施方案中，癌症的例子进一步包括但不限于B细胞增殖性病症，其进一步包括但不限于淋巴瘤(例如B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL))和淋巴细胞性白血病。此类淋巴瘤和淋巴细胞性白血病包括例如a)滤泡性淋巴瘤，b)小无核裂细胞淋巴瘤(Small Non-Cleaved Cell Lymphoma)/伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤(包括地方性伯基特氏淋巴瘤，散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特氏淋巴瘤)，c)边缘区淋巴瘤(包括结外边缘区B细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT)，结边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)，d)套细胞淋巴瘤(MCL)，e)大细胞淋巴瘤(包括B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)，弥漫性混合细胞淋巴瘤，免疫母细胞性淋巴瘤，原发性纵隔B细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤)，f)毛细胞白血病，g)淋巴细胞性淋巴瘤，瓦尔登斯特伦(waldenstrom)氏巨球蛋白血症，h)急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，B细胞幼淋巴细胞白血病，i)浆细胞赘生物，浆细胞骨髓瘤，多发性骨髓瘤，浆细胞瘤，和/或j)霍奇金氏病。

在任何方法的一些实施方案中，该癌症是B细胞增殖性病症。在一些实施方案中，该B细胞增殖性病症是淋巴瘤，非霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)，攻击性NHL，复发性攻击性NHL，复发性无痛性NHL，顽固性NHL，顽固性无痛性NHL，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，小淋巴细胞淋巴瘤，白血病，毛细胞白血病(HCL)，急性淋巴细胞性白血病(ALL)，或套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，该B细胞增殖性病症是NHL，诸如无痛性NHL和/或攻击性NHL。在一些实施方案中，该B细胞增殖性病症是无痛性滤泡性淋巴瘤或弥漫性大B细胞淋巴瘤。

在本发明的任何方法的一些实施方案中，本发明的具有激动剂活性的抗OX40抗体或其片段的施用与肿瘤抗原的施用组合。在一些实施方案中，该肿瘤抗原包含蛋白质。在一些实施方案中，该肿瘤抗原包含核酸。在一些实施方案中，该肿瘤抗原是肿瘤细胞。

在本发明的任何方法的一些实施方案中，该癌症展示人效应细胞(例如受到人效应细胞浸润)。用于检测人效应细胞的是方法本领域公知的，包括例如通过IHC。在一些实施方案中，该癌症展示高水平的人效应细胞。在一些实施方案中，人效应细胞是NK细胞，巨噬细胞，单核细胞中的一项或多项。在一些实施方案中，该癌症是本文中描述的任何癌症。在一些实施方案中，该癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)，成胶质细胞瘤，成神经细胞瘤，黑素瘤，乳腺癌(例如三重阴性乳腺癌)，胃癌，结直肠癌(CRC)，或肝细胞癌。

在本发明的任何方法的一些实施方案中，该癌症展示表达FcR的细胞(例如受到表达FcR的细胞浸润)。用于检测FcR的方法是本领域公知的，包括例如通过IHC。在一些实施方案中，该癌症展示高水平的表达FcR的细胞。在一些实施方案中，FcR是FcγR。在一些实施方案中，FcR是活化性FcγR。在一些实施方案中，该癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)，成胶质细胞瘤，成神经细胞瘤，黑素瘤，乳腺癌(例如三重阴性乳腺癌)，胃癌，结直肠癌(CRC)，或肝细胞癌。

在某些实施方案中，本文所述的方法和用途还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。可以单独或与疗法中的其它治疗剂组合使用本发明的抗体。例如，可以与至少一种另外的治疗剂共施用本发明的抗体。

此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或药剂之前，同时，和/或之后发生本发明的抗体的施用。在一个实施方案中，抗OX40抗体的施用和别的治疗剂的施用彼此在约一个月内，或约一，两或三周内，或约1，2，3，4，5，或6天内发生。也可以与放射疗法组合使用本发明的抗体。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与化疗或化疗剂联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与放疗或放疗剂联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与靶向疗法或靶向治疗剂联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与免疫疗法或免疫治疗剂，例如单克隆抗体联合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与PARP抑制剂(例如Olaparanib，Rucaparib，Niraparib，Cediranib，BMN673，Veliparib)，Trabectedin，nab-paclitaxel(清蛋白结合的帕利他赛，ABRAXANE)，Trebananib，Pazopanib，Cediranib，Palbociclib，everolimus，氟尿嘧啶(例如FOLFOX，FOLFIRI)，IFL，regorafenib，Reolysin，Alimta，Zykadia，Sutent，Torisel(temsirolimus)，Inlyta(axitinib，Pfizer)，Afinitor(everolimus，Novartis)，Nexavar(sorafenib，Onyx/Bayer)，Votrient，Pazopanib，axitinib，IMA-901，AGS-003，cabozantinib，Vinflunine，Hsp90抑制剂(例如apatorsin)，Ad-GM-CSF(CT-0070)，Temazolomide，IL-2，IFNa，vinblastine，Thalomid，dacarbazine，cyclophosphamide，lenalidomide，azacytidine，lenalidomide，bortezomid(VELCADE)，amrubicine，carfilzomib，pralatrexate，和/或enzastaurin联合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与PD-1轴结合拮抗剂联合施用。PD-1轴结合拮抗剂包括但不限于PD-1结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。"PD-1"的备选名称包括CD279和SLEB2。"PD-L1"的备选名称包括B7-H1，B7-4，CD274，和B7-H。"PD-L2"的备选名称包括B7-DC，Btdc，和CD273。在一些实施方案中，PD-1，PD-L1，和PD-L2是人PD-1，PD-L1和PD-L2。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1结合其配体结合配偶的分子。在一个具体方面，PD-1配体结合配偶是PD-L1和/或PD-L2。在另一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1结合其结合配偶的分子。在一个具体方面，PD-L1结合配偶是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2结合其结合配偶的分子。在一个具体方面，PD-L2结合配偶是PD-1。拮抗剂可以是抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，或寡肽。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如人抗体，人源化抗体，或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自下组：MDX-1106(nivolumab，OPDIVO)，Merck3475(MK-3475，pembrolizumab，KEYTRUDA)和CT-011(Pidilizumab)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如包含融合至恒定区(例如免疫球蛋白序列的Fc区)的，PD-L1或PD-L2的胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，抗PD-Ll结合拮抗剂选自下组：YW243.55.S70，MPDL3280A，MEDI4736和MDX-1105。MDX-1105，也称作BMS-936559，是WO2007/005874中记载的抗PD-L1抗体。抗体YW243.55.S70(重和轻链可变区序列分别显示于SEQ ID No.20和21)是WO 2010/077634 A1中记载的抗PD-L1。MDX-1106，也称作MDX-1106-04，ONO-4538，BMS-936558或nivolumab，是WO2006/121168中记载的抗PD-1抗体。Merck 3475，也称作MK-3475，SCH-900475或pembrolizumab，是WO2009/114335中记载的抗PD-1抗体。CT-011，也称作hBAT，hBAT-1或pidilizumab，是WO2009/101611中记载的抗PD-1抗体。AMP-224，也称作B7-DCIg，是WO2010/027827和WO2011/066342中记载的PD-L2-Fc融合可溶性受体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是MDX-1106。"MDX-1106"的备选名称包括MDX-1106-04，ONO-4538，BMS-936558或nivolumab。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是nivolumab(CAS注册号：946414-94-4)。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与针对活化性共刺激分子的激动剂联合施用。在一些实施方案中，活化性共刺激分子可包括CD40，CD226，CD28，GITR，CD137，CD27，HVEM，或CD127。在一些实施方案中，针对活化性共刺激分子的激动剂是结合CD40，CD226，CD28，OX40，GITR，CD137，CD27，HVEM，或CD127的激动性抗体。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与针对抑制性共刺激分子的拮抗剂联合施用。在一些实施方案中，抑制性共刺激分子可包括CTLA-4(也称作CD152)，PD-1，TIM-3，BTLA，VISTA，LAG-3，B7-H3，B7-H4，IDO，TIGIT，MICA/B，或精氨酸酶。在一些实施方案中，针对抑制性共刺激分子的拮抗剂是结合CTLA-4，PD-1，TIM-3，BTLA，VISTA，LAG-3(例如LAG-3-IgG融合蛋白(IMP321))，B7-H3，B7-H4，IDO，TIGIT，MICA/B，或精氨酸酶的拮抗性抗体。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与包含过继转移表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(例如细胞毒性T细胞或CTL)的治疗联合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与血管发生抑制剂联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与针对VEGF，例如VEGF-A的抗体联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与贝伐珠单抗(也称作Genentech)联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与针对血管生成素2(也称作Ang2)的抗体联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与MEDI3617联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与针对VEGFR2的抗体联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与ramucirumab联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与VEGF受体融合蛋白联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与aflibercept联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与ziv-aflibercept(也称作VEGF陷阱或)联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与针对VEGF和Ang2的双特异性抗体联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与RG7221(也称作vanucizumab)联合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与血管发生抑制剂联合和与PD-1轴结合拮抗剂(例如PD-1结合拮抗剂诸如抗PD-1抗体，PD-L1结合拮抗剂诸如抗PD-L1抗体，和PD-L2结合拮抗剂诸如抗PD-L2抗体)联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与贝伐珠单抗和PD-1轴结合拮抗剂(例如PD-1结合拮抗剂诸如抗PD-1抗体，PD-L1结合拮抗剂诸如抗PD-L1抗体，和PD-L2结合拮抗剂诸如抗PD-L2抗体)联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与贝伐珠单抗和MDX-1106(nivolumab，OPDIVO)联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与贝伐珠单抗和Merck 3475(MK-3475，pembrolizumab，KEYTRUDA)联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与贝伐珠单抗和CT-011(Pidilizumab)联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与贝伐珠单抗和YW243.55.S70联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与贝伐珠单抗和MPDL3280A联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与贝伐珠单抗和MEDI4736联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与贝伐珠单抗和MDX-1105联合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与抗肿瘤剂联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与Bruton氏酪氨酸激酶(BTK)的抑制剂联合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与奥奴珠单抗和PD-1轴结合拮抗剂(例如PD-1结合拮抗剂诸如抗PD-1抗体，PD-L1结合拮抗剂诸如抗PD-L1抗体，和PD-L2结合拮抗剂诸如抗PD-L2抗体)联合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与癌症疫苗联合施用。在一些实施方案中，该癌症疫苗是肽癌症疫苗，其在一些实施方案中是个性化肽疫苗。在一些实施方案中，该肽癌症疫苗是多价长肽，多重肽，肽混合物，杂合肽，或经肽脉冲的树突细胞疫苗(参见例如Yamada et al.，Cancer Sci,104:14-21,2013)。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与佐剂联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与包含TLR激动剂，例如Poly-ICLC(也称作)，LPS，MPL，或CpG ODN的治疗联合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与肿瘤坏死因子(TNF)α联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与白细胞介素(例如IL-1、IL-10、IL-4、IL-13、IL-17等)联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与靶向CXCL10的治疗联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与靶向CCL5的治疗联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与LFA-1或ICAM1激动剂联合施用。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与选择蛋白激动剂联合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与B-Raf的抑制剂联合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与B-Raf的抑制剂(例如维罗非尼或dabrafenib)和MEK(例如MEK1和/或MEK2)的抑制剂(例如cobimetinib或trametinib)联合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与c-Met的抑制剂联合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与选择性降解***受体的药剂联合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与放射疗法联合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体或其片段可以与溶瘤病毒联合施用。

更多的可以与本发明的抗OX40抗体或其片段组合的疗法或药物或活性成分参见WO2015/153513中公开的那些。

上文记录的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或佐剂之前，同时，和/或之后发生本发明抗体的施用。也可以与放射疗法组合使用本发明抗体。

本发明的抗体(以及任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果局部治疗需要，病灶内给药。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的合适剂量(当单独或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和进程、所述抗体是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体的应答，和主治医师的判断力。所述抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。

用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文中提供的任何抗OX40抗体或其抗原结合片段可以用于检测OX40在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。

在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的抗OX40抗体。在另一个方面中，提供检测OX40在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，方法包含检测OX40蛋白在生物样品中的存在。在某些实施方案中，OX40是人OX40。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗OX40抗体在允许抗OX40抗体与OX40结合的条件下接触，并检测在抗OX40抗体和OX40之间是否形成复合物。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗OX40抗体被用于选择适合利用抗OX40抗体的治疗的受试者，例如其中OX40是用于选择患者的生物标记物。

在一个实施方案中，可以使用本发明的抗体诊断癌症或肿瘤。

在某些实施方案中，提供标记的抗OX40抗体。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。示例性标记包括但不限于，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，荧光素酶(luceriferase)，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HR)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶解酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，以及利用过氧化氢氧化染料前体的酶如HR，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。

在一个方面，本发明提供诊断方法，例如用于鉴定有可能响应抗OX40抗体治疗的癌症患者。

在一些实施方案中，提供用于鉴定有可能响应抗OX40抗体治疗的患者的方法或用于诊断癌症的方法，该方法包括(i)测定来自该患者的癌症样品中表达FcR的细胞的存在或缺失或量(例如每个给定样品尺寸中的数目)，(ii)若该样品包含表达FcR的细胞(例如高数目的表达FcR的细胞)，则将该患者鉴定为有可能响应，或将患者诊断为具有包含FcR(例如高FcR)的癌症。用于检测表达FcR的细胞的方法是本领域公知的，包括例如IHC。在一些实施方案中，FcR是FcγR。在一些实施方案中，FcR是活化性FcγR。在一些实施方案中，该癌症是本文中描述的任何癌症。在一些实施方案中，该癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)，成胶质细胞瘤，成神经细胞瘤，黑素瘤，乳腺癌(例如三重阴性乳腺癌)，胃癌，结直肠癌(CRC)，或肝细胞癌。在一些实施方案中，该方法是体外方法。

在一些实施方案中，提供用于鉴定有可能响应抗OX40抗体治疗的患者的方法或用于诊断癌症的方法，该方法包括(i)测定来自该患者的癌症样品中人效应细胞(例如浸润性效应细胞)的存在或缺失或量(例如每个给定样品尺寸中的数目)，并(ii)若该样品包含效应细胞(例如高数目的效应细胞)，则将该患者鉴定为有可能响应或将患者诊断为具有包含人效应细胞的癌症。用于检测浸润性人效应细胞的方法是本领域公知的，包括例如IHC。在一些实施方案中，人效应细胞是NK细胞，巨噬细胞，单核细胞中的一项或多项。在一些实施方案中，该效应细胞表达活化性FcγR。在一些实施方案中，该方法是体外方法。在一些实施方案中，该癌症是本文中描述的任何癌症。在一些实施方案中，该癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)，成胶质细胞瘤，成神经细胞瘤，黑素瘤，乳腺癌(例如三重阴性乳腺癌)，胃癌，结直肠癌(CRC)，或肝细胞癌。

在一些实施方案中，提供对癌症患者推荐治疗的方法，其包括上述用于鉴定有可能响应抗OX40抗体治疗的患者的方法或用于诊断癌症的方法的步骤，以及(iii)当样品具有表达FcR的细胞或具有人效应细胞，推荐抗OX40抗体(例如本发明的抗OX40抗体或其片段)的治疗。

在一些实施方案中，提供治疗癌症患者的方法，其包括上述用于鉴定有可能响应抗OX40抗体治疗的患者的方法或用于诊断癌症的方法的步骤，以及(iii)当样品具有表达FcR的细胞或具有人效应细胞，用抗OX40抗体(例如本发明的抗OX40抗体或其片段)治疗该患者。

在本文中提供的任何发明的一些实施方案中，样品是在用抗OX40抗体治疗之前获得的。在一些实施方案中，样品是在用癌症药物治疗之前获得的。在一些实施方案中，样品是在癌症已经转移之后获得的。在一些实施方案中，样品是***固定、石蜡包膜(FFPE)的。在一些实施方案中，样品是活检(例如芯活检)，手术标本(例如来自手术切除的标本)，或细针吸出物。

本发明示例性抗OX40抗体的序列

本发明的这些以及其它方面和实施方案在附图(附图简述紧随其后)和以下的发明详述中得到描述并且示例于以下实施例中。上文以及整个本申请中所论述的任何或所有特征可以在本发明的各种实施方案中组合。以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以说明而非限定的方式来描述，并且本领域技术人员可以进行多种修改。

实施例

实施例1.抗OX40抗体以及对照抗体的生产和纯化

通过问询Adimab抗体平台通过Adimab鉴定了抗OX40抗体。文库和它们在筛选过程中的使用参见，例如Xu等人,2013；WO2009036379；WO 2010105256；W02012009568。

在酵母或CHO-S细胞或293HEK细胞中表达并且纯化本发明的如下抗OX40抗体：

抗体名称
	ADI-20057
ADI-23504
	ADI-23507
ADI-23509

在293HEK细胞中表达并且纯化实施例中使用的下述对照抗体：

如本文所用，pogalizumab是在293HEK细胞中瞬时表达的人IgG1 OX40抗体，其利用来自建议的INN：列表114(参见http://www.who.int/medicines/publications/druginformation/innlists/PL114.pdf)的重链和轻链序列。如本文所用，Hu106-222是在293HEK细胞中瞬时表达的人源化IgG1 OX40抗体，其利用来自美国专利US9006399的重链和轻链序列。如本文所用，11D4是在293HEK细胞中瞬时表达的人源化IgG1 OX40抗体，其利用来自美国专利US8236930的重链和轻链序列。如本文所用，tavolixizumab是在293HEK细胞中瞬时表达的人源化IgG1 OX40抗体，其利用来自建议的INN：列表115(参见http://www.who.int/medicines/publications/druginformation/innlists/PL115.pdf)的重链和轻链序列。

对于酵母材料的处理：

使酵母克隆生长至饱和，然后在30℃下振荡诱导48小时。诱导后，将酵母细胞沉淀并收获上清液用于纯化。使用蛋白A柱纯化IgG并用乙酸(PH 2.0)洗脱。通过木瓜蛋白酶消化产生Fab片段并通过KappaSelect(GE Healtheare LifeSciences)纯化。

对于CHO-S细胞的处理：

根据制造商的说明书使用试剂盒(Invitrogen)产生表达CHO-S细胞系。对于mAb表达，将重链和轻链的DNA序列***到pCHO1.0质粒中，其中重链在轻链的上游。将全长人OX40 CDS序列(购自Sino Biological)***到pCHO1.0载体中用于产生稳定的过表达细胞系。

对于293HEK细胞的处理

对于293HEK细胞中蛋白的瞬时表达，使用载体pV120，其中抗体的重链和轻链克隆到单独的载体中。使用标准步骤用PEI进行到293HEK细胞的转染；在培养7天后收集上清液，并在AKTA***(GE)上纯化。

实施例2：抗OX40抗体的结合动力学和亲和力测定

采用MSD-SET和生物光干涉测量(ForteBio)测定法测定本发明抗体结合人OX40的动力学和平衡解离常数(KD)。

1.ForteBio KD测定(生物光干涉法)

ForteBio亲和力测定按照现有的方法(Estep,P等人，High throughput solutionBased measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):p.270-8)进行。简言之，传感器在分析缓冲液中线下平衡30分钟，然后线上检测60秒建立基线，在线加载如上所述获得的经纯化的抗体至AHQ传感器(ForteBio)上进行ForteBio亲和测量。再将具有加载的抗体的传感器暴露于100nM的OX40抗原中作用5分钟，之后将传感器转移至分析缓冲液解离5分钟用于解离速率测量。使用1:1结合模型进行动力学的分析。

在如上测定法所述进行的实验中，ADI-20057、ADI-23504、ADI-23507和ADI-23509(在酵母中表达的IgG1形式的抗OX40抗体的Fab)在两位数纳摩尔至个位数纳摩尔范围内以单价K_D结合人OX40_Fc(结合了抗体Fc部分的人OX40，购自R&D Systems)。当抗体在传感器尖端上时，ADI-20057、ADI-23504、ADI-23507和ADI-23509(以IgG1形式且在酵母中表达的抗OX40抗体)在个位数的纳摩尔至亚纳摩尔的范围以双价结合的K_D值结合人OX40_Fc(购自R&D Systems)；ADI-20057、ADI-23504、ADI-23507和ADI-23509(以IgG1形式且在酵母中表达)以个位数的纳摩尔水平结合食蟹猴的OX40_Fc(购自Acro Biosystems)。当抗体在传感器尖端上时，ADI-20057、ADI-23504、ADI-23507和ADI-23509(以IgG1形式且在酵母中表达的抗OX40抗体)不结合小鼠OX40_Fc(购自Acro Biosystems)(表7)。

表7：通过生物光干涉测量IgG1形式的本发明抗体的结合

2.MSD-SET动力学检测

平衡亲和力的检测参见Estep,P.等人,MAbs,2013.5(2):p.270-8。在PBS+0.1％不含IgG的BSA(PBSF)中进行溶液平衡滴定(SET)，其中抗原(biotin-OX-40单体(生物素化的OX-40，购自Acro Biosystems)保持恒定在10-100pM，并与以5-100nM起始以3至5倍连续稀释的Fab或mAb孵育(实验条件是样品依赖性的)。将在PBS中以20nM稀释的抗体在4℃或在室温下过夜包被在标准结合MSD-ECL板(Multi-array 96-孔平板，货号#:L15XA-3，https://www.mesoscale.com/en/products/l15xa-3/)上，持续30分钟。将板用BSA封闭30分钟，同时以700rpm振荡。然后将板用洗涤缓冲液(PBSF+0.05％Tween 20)洗涤3次。施加SET样品并在700rpm振荡、在板上孵育150s，然后洗涤一次。通过用PBSF中250ng/mL磺基标签标记的链霉亲和素在板上孵育3分钟检测板上捕获的抗原。将板用洗涤缓冲液洗涤三次，然后使用具有表面活性剂的1x Read Buffer T(货号#:R92TC-1 https://www.mesoscale.com/en/products/r92tc-1/)在MSD Sector Imager 2400仪器上读数。将游离抗原的百分比作为滴定抗体的函数在Prism中作图，并拟合二次方程式以提取K_D。为了提高处理量，液体处理机器人被用于整个MSD-SET实验，包括SET样品制备。

在如以上测定法所述进行的实验中，IgG1形式且在酵母中表达的ADI-23504和ADI-23507的Fab形式以可检测的亚纳摩尔单价K_D值结合人OX40(表8)。

表8：IgG1形式的本发明抗体的MSD结合

实施例3：本发明抗OX40抗体与人OX40的结合

可以在基于流式细胞术的测定法中测量本发明的抗体与人OX40的结合。

1.与CHO细胞上的人OX40的结合

通过转染带有克隆到MCS的人OX40cDNA(Sino Biological,HG10481-G)的pCHO1.0载体(Invitrogen)产生过表达人OX40的CHO细胞(CHO-hOX40细胞)。将CHO-hOX40细胞(0.2×10⁶个细胞)与100nM的实验抗体在PBS 0.1％BSA中在冰上孵育30分钟。然后将细胞洗涤至少两次，并与二抗(PE标记的，SouthernBiotech，终浓度为5μg/ml)在PBS 0.1％BSA中在冰上(避光)孵育30分钟。将细胞洗涤至少两次并通过流式细胞术进行分析。在Canto II***(BD Biosciences)上进行流式细胞术，并相应地计算MFI。

在如以上测定法所述进行的实验中，ADI-20057、ADI-23504、ADI-23507和ADI-23509(IgG1形式，在酵母中表达)结合CHO细胞上过表达的OX40，与染色的野生型CHO细胞相比，MFI值>1000倍差异(表9)。

表9：流式细胞术测定的酵母中产生的IgG1形式本发明的抗体与表达人OX40的CHO细胞的结合

在如以上测试法所述进行的实验中，在293HEK细胞中表达的IgG1形式的ADI-20057结合CHO细胞上过表达的OX40，EC50值为2.873nM(表10)。

表10：流式细胞术测定的293HEK细胞产生的IgG1形式的本发明抗体与表达人OX40的CHO细胞的结合

*IgG1包含SEQ ID NO:41所示的重链和SEQ ID NO:43所示的轻链，对于以下内容中的IgG1对照同样如此。

在如以上测定法所述进行的实验中，在293HEK细胞中表达的IgG2形式的ADI-20057结合在CHO细胞上过表达的OX40，EC50值为5.187nM(表11)。

表11：流式细胞术测定的293HEK细胞产生的本发明IgG2形式的抗体与表达人OX40的CHO细胞的结合

*IgG2包含SEQ ID NO:44所示的重链和SEQ ID NO:45所示的轻链，对于以下内容中的IgG2对照同样如此。

2.与293HEK细胞上的人OX40的结合

可以在流式细胞术测定法中测量本发明的抗体与人OX40的结合。将过表达人OX40的293HEK细胞(0.2×10⁶个，与上文所述针对CHO细胞类似的方法制备)与100nM的实验抗体在PBS 0.1％BSA中在冰上孵育30分钟。然后将细胞洗涤至少两次，并与二抗(PE标记的，SouthernBiotech，终浓度为5μg/ml)在PBS 0.1％BSA中在冰上(避光)孵育30分钟。将细胞洗涤至少两次并通过流式细胞术进行分析。在Accuri C6***(BD Biosciences)上进行流式细胞术，并相应地计算MFI。

在如上测定法所述进行的实验中，ADI-20057(IgG1形式，在酵母中表达)与阴性对照IgG1对照的弱或不结合相比，在200nM、40nM、8nM和1.6nM的浓度强结合OX40(表12)。

表12：通过流式细胞术的酵母细胞中产生的本发明IgG1形式的抗体结合表达人OX40的293HEK细胞

3.与活化的原代CD4+T细胞上的人OX40的结合

可以在流式细胞术测定法中测量本发明的抗体与原代T细胞上的人OX40的结合。

用抗-CD3/CD28 DynaBeads(Invitrogen)活化来自健康供体的原代CD4+T细胞48小时，并将0.2×10⁶个细胞与100nM的实验抗体在PBS 0.1％BSA中在冰上孵育30分钟。然后将细胞洗涤至少两次，并与二抗(PE标记的，SouthernBiotech，终浓度为5μg/ml)在PBS0.1％BSA中在冰上(避光)孵育30分钟。将细胞洗涤至少两次并通过流式细胞术进行分析。在Accuri C6***(BD Biosciences)上进行流式细胞术，并相应地计算MFI。

在如上测定法所述进行的实验中，ADI-20057(IgG1形式，在酵母中表达)与阴性对照IgG1对照相比以高的MFI信号结合OX40(表13)。

表13：流式细胞术测定的酵母细胞中产生的IgG1形式的本发明抗体与活化的CD4+T细胞的结合(MFI)

实施例4.本发明抗体对人OX40L与OX40相互作用的阻断

可以通过流式细胞术测量本发明的抗体阻断人OX40与OX40L结合的能力。

方法1：将如前文实施例3所述制备的表达人OX40的CHO细胞0.2×10⁶个与实验抗体(100nM)在PBS 0.1％BSA中在冰上孵育30分钟。然后将细胞洗涤3次，并与连接NHS-荧光素(Promega)的OX40L-hFc(自AcroBiosystems获得)(～10μg/ml)在PBS 0.1％BSA中在冰上(避光)孵育30分钟。将细胞洗涤3次。在Accuri C6***(BD Biosciences)上进行流式细胞术，并且在C6软件上计算MFI。

在如上测定法所述进行的实验中，ADI-20057(在酵母中表达的IgG1形式)不阻断人OX40L-FITC结合至表达人OX40的CHO细胞(如实施例3所述制备)，因为MFI值与对照IgG1对照的MFI值类似(表14)。

表14：流式细胞术测定的在酵母细胞中产生的IgG1形式的本发明的抗体对OX40L与CHO细胞上表达的OX40的结合的阻断

方法2：还使用与鼠Fc融合的OX40L(OX40L-mFc自AcroBiosystems获得)，随后使用抗鼠FC-FITC二抗(Biolegend)，使用染色方法，如方法1所述。在Accuri C6***(BDBiosciences)上进行流式细胞术，并且在C6软件上计算MFI。

在如上测定法所述进行的实验中，与对照pogalizumab和OX40L相比，ADI-20057-g2(IgG2形式的抗体，且在CHO细胞中表达)同样不阻断人OX40L(与小鼠Fc融合的(60μg/ml))与CHO细胞上的OX40的结合(图1)。从图中可以看出，ADI-20057-g2抗体与对照IgG4对于OX40与OX40L的结合的作用类似。其中对照IgG4包含SEQ ID NO:42所示的重链和SEQ IDNO:43所示的轻链，后同。

实施例5.本发明的抗OX40抗体的激动剂活性

1.板结合抗体T细胞活化测定法

根据Untouched CD4+T细胞分离试剂盒(Invitrogen)中制造商的说明书进行T细胞分离。装有1.5ml试管架的磁体用于去除不需要的磁珠(QIAGEN)。

可以通过测量T细胞活化后由T细胞释放的炎性细胞因子评估本发明的抗OX40抗体的激动剂活性。用次优抗-CD3(0.25μg/ml)抗体(Biolegend)和抗-OX40(6μg/ml)测试抗体包被96孔平底板(Corning),在37摄氏度持续2小时或4摄氏度过夜。洗涤后，将100,000个CD4+原代T细胞加入到溶液中含有2μg/ml抗-CD28抗体(Biolegend)的总共200μl培养基的每孔中。5天后，通过ELISA(Ready-SET-Go！；eBioscience)测试IL-2分泌水平。

在如上测定法所述进行的实验中，在酵母细胞中产生的IgG1形式的ADI-20057，比IgG4对照增加IL-2和IFNg分泌，来自两种不同健康供体的T细胞中的IL-2水平高达100倍增加，IFNg水平高达3倍不同(表15)。

表15：用次优抗CD3活化加上在酵母细胞中产生的IgG1形式的本发明抗体ADI-20057的T细胞活化的IL-2和IFNg分泌

2.可溶性抗体T细胞活化测定法

测试1：

可以通过测量T细胞活化后由T细胞释放的炎性细胞因子评估本发明的抗OX40抗体的激动剂活性。用PHA(10μg/ml,Sigma)和200nM候选抗-OX40抗体刺激100,000个CD4+T细胞5天，通过ELISA(Ready-SET-Go！；eBioscience)测试IL-2分泌。

在如上测定法所述进行的实验中，在酵母细胞中产生的IgG1形式的ADI-20057，比IgG4对照增加IL-2的分泌，来自六种不同健康供体T细胞中的IL-2水平增加高达4倍(表16)。

表16：PHA活化加上在酵母细胞中产生的本发明的IgG1形式的抗体的T细胞活化时的IL-2分泌

测试2：

可以通过测量T细胞活化后由T细胞释放的炎性细胞因子来评估本发明的抗-OX40抗体的激动剂活性。用抗-CD3抗体(Biolegend)(浓度1μg/ml)、抗-CD28抗体(Biolegend)(2μg/ml)和10μg/ml、20μg/ml或40μg/ml抗-OX40抗体刺激100,000个CD4+T细胞5天，通过ELISA(Ready-SET-Go！；eBioscience)测试IL-2分泌。

在如上测试法所述进行的实验中，10ug/ml、20ug/ml和40ug/ml浓度的HEK293细胞表达的IgG1形式的抗OX40抗体ADI-20057，比IgG1对照增加IL-2的分泌(表17)，以及所有浓度的HEK293细胞表达的IgG2形式的抗-OX40抗体ADI20057也一样(表18)。

表17：用溶液中的抗-CD3、抗-CD28抗体加上HEK293细胞产生的IgG1形式的本发明的抗体ADI-20057活化T细胞时的IL-2分泌

表18：用溶液中的抗-CD3、抗-CD28抗体加上HEK293细胞产生的IgG2形式的本发明的抗体ADI-20057活化T细胞时的IL-2分泌

测试3：

可以通过测量T细胞活化后由T细胞释放的炎性细胞因子来评价本发明的抗-OX40抗体的激动剂活性。在通过ELISA(Ready-SET-Go！；eBioscience)测试IL-2分泌之前，用PHA(5μg/ml；Sigma)和5μg/ml、10μg/ml或20μg/ml抗-OX40抗体刺激100,000个PBMC 5天。

在如上测试法所述进行的实验中，在CHO细胞中表达的ADI-20057-g1(IgG1形式)、ADI-20057-g2(IgG2形式)、在5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml时比IgG1对照和IgG2对照增加了IL-2分泌，高于对照抗体11D4、Hu106-222和pogalizumab基准(图2)。

3.荧光素酶报告基因T细胞活化测定法

可以通过在荧光素酶报告基因测定法中测量NFkB介导的转录活化的促进来评估本发明的抗-OX40抗体的激动剂活性。用PHA5(5μg/ml；Sigma)或抗-CD3(2μg/ml；Biolegend)加上抗-CD28(2μg/ml；Biolegend)和溶液中的抗-OX40抗体(100nM)活化过表达人OX40(购自Sino)和NFkB-荧光素酶构建体(NFkB启动子-luc,Promega)的Jurkat细胞(美国ATCC)，持续18小时，然后在细胞裂解和添加底物和生物发光测量之后在检测装置(Molecular Devices)上测试，其指示相对荧光素酶表达诱导。

在如上测定法所述进行的实验中，在酵母细胞中产生的IgG1形式的ADI-20057增加荧光素酶表达大于IgG4对照，在使用PHA(Sigma)或抗-CD3(Biolegend)活化中信号分别高达大约3.79倍的增加和大约4.27倍的增加(表19)。

表19：用人OX40和NFkB启动子-luc稳定转染的Jurkat中的萤光素酶报告基因检测，其通过PHA或抗-CD3加上抗-CD28刺激加上酵母细胞中产生的本发明的IgG1形式的抗体的刺激

在如上测定法所述进行的实验中，进一步添加Raji细胞(ATCC)以提供共刺激信号和FcgRIIb用于IgG交联，ADI-20057-g1是人IgG1 OX40抗体，ADI-20057-g2是人IgG2 OX40抗体，二者都在CHO细胞中表达，它们通过OX40活化增加的荧光素酶表达大于IgG对照(IgG1对照和IgG2对照)，EC50值分别为0.09635nM和0.5674nM(图3)。

在基本上如该测定法所述进行的实验中，CHO细胞中产生的人IgG1 OX40抗体，ADI-23504-g1，是CHO细胞中产生的人IgG1 OX40抗体ADI-20057-g1的亲和力成熟的形式，与IgG1对照相比表现出更好的激动剂活性，其EC50值分别为1.265nM和0.8231nM(图4)。

4.混合的淋巴细胞反应(MLR)/DC T细胞共培养测定法

可以通过在混合淋巴细胞反应期间或DC-T细胞共培养测定法测量IL-2的释放评估本发明的抗体对OX40信号的激动剂活性。将2×10⁶个PBMC铺板在6孔组织培养板的每个孔中或T25组织培养瓶中。将细胞孵育2-3小时，以允许单核细胞的附着。通过在含有1％AB血清、10mM HEPES、50μMβ-Me、IL-4(1000U/ml)和GM-CSF(1000U/ml)，或上述成分各25-50ng/ml的X-VIVO 15培养基中培养来自PBMC的单核细胞(1×10⁶个细胞/ml)产生未成熟骨髓moDC。2天后，加入补充有IL-4和GM-CSF的新鲜培养基。在第5天，将细胞冷冻或通过加入含有rTNFa(1000U/ml)、IL-1b(5ng/ml)、IL-6(10ng/ml)和1μM PGE₂的刺激混合物、以3×10⁵个细胞/ml的细胞密度持续2天诱导成熟。根据在Untouched CD4+T细胞分离试剂盒(Invitrogen)中制造商的说明书进行T细胞分离。装有1.5ml试管架的磁体用于去除不需要的磁珠(QIAGEN)。

将100,000-200,000个分离的T细胞(来自供体)与10,000-20,000个同种异体moDC(如上)以总体积200μl在96-圆底组织培养板中混合，在37℃下持续4-5天。加入SEE(1ng/ml)以增加T细胞活化。在MLR的开始加入测试抗体，并在整个培养期间孵育。根据制造商的说明书(eBioscience)进行IL-2的检测。在Multiskan FC***(Thermo)上测定OD测量值。

在如上测定法所述进行的实验中，CHO细胞中表达的IgG1形式的人抗体ADI-20057-g1和CHO细胞中表达的人IgG2抗体ADI-20057-g2，在～1.48ug/ml、～4.4μg/ml、～13.3μg/ml和～40μg/ml浓度下使用时，增加IL-2分泌，高于pogalizumab、11D4、Hu106-222和tavolixizumab。Pogalizumab在所有浓度下具有差的激动剂活性(图5，其中IgG对照为IgG1对照)。

实施例6基于荧光素酶报告基因检测本发明抗体对OX40L介导的OX40的T细胞活化

可以通过测量抗体阻断OX40L介导的OX40对T细胞活化的性能来评估本发明的抗-OX40抗体的阻断活性，T细胞的活化性能利用NFkB介导的转录活性评估(参见实施例5)。使用抗-CD3(2μg/ml；Biolegend)、抗-CD28(2μg/ml；Biolegend)和重组OX40L(60μg/ml；AcroBiosystems)，再加上增加浓度的抗-OX40抗体(本发明的IgG1形式的CHO细胞中表达的ADI-20057-G1，本发明的IgG2形式的CHO细胞中表达的ADI-20057-G2)和IgG4对照、Pogalizumab，OX40L(自AcroBiosystems获得)，在溶液中持续18小时，活化过表达人OX40和NFkB-荧光素酶构建体(NFkB启动子-luc，美国Promega)的Jurkat细胞(美国ATCC)，然后在细胞裂解和加入底物后进行检测和吸光度测量。

Pogalizumab在大于约0.08nM或更高的浓度下容易阻断基于OX40L的T细胞活化，而在CHO细胞中产生的IgG1形式的人OX40抗体ADI-20057-g1和在CHO中产生的IgG2形式的人OX40抗体ADI-20057-g2不仅不阻断OX40与OX40L的结合，而且可以增加基于OX40L的T细胞活化因而能够增强OX40的基于OX40L的T细胞活化(相比阴性对照IgG4)(图6)。

实施例7.本发明抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性

基于荧光素酶报告基因抗体依赖性细胞介导的细胞毒性测定法

可以使用荧光素酶报告基因测定法(Promega)来测量OX40抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。将靶细胞(表达人OX40的CHO细胞(如上所述制备))以1.2×10⁶个细胞/ml接种在含有10％Ultra-Low IgG FBS(Sigma)的25μl RPMI培养基(Gibco)中。制备1μg/ml抗体的1：3连续稀释液，加入25μl/孔。接种25μl的6×10⁶细胞/ml ADCC效应细胞(Promega)，并在37℃下用5％CO₂孵育6小时。加入75μl萤光素酶测定法试剂(Promega)，并将混合物至室温持续20分钟。将板以300g/min离心2分钟。小心转移120μl的细胞上清至Optiplates。在光度计中读板。拟合曲线并使用GraphPad Prism 6.0确定抗体反应的EC50。

在如以上测定法所述进行的实验中，在HEK293细胞中表达的IgG1形式的ADI-20057增加荧光素酶表达，从而支持ADCC活性(图7)。在HEK293细胞中表达的IgG2同种型的ADI-20057不引起ADCC活性(图8)。

实施例8.本发明抗体的抗肿瘤活性

可以在人源化小鼠模型(NOG hu-PBMC LoVo肿瘤模型)中研究本发明的OX40抗体的抗肿瘤功效。

根据ATCC说明书(F-12K)培养LoVo人结肠癌细胞(ATCC#CCL-229)。将悬浮在0.2mlPBS(其中含有66万个人PBMC)中的200万个LoVo细胞植入雌性NOG(北京维通利华实验动物技术有限公司)的右胁腹中。

在整个研究期间每周测量两次肿瘤和体重，当肿瘤达到端点时或当小鼠具有>20％体重减轻时使小鼠安乐死。在植入后3天，将小鼠随机分为6-7组，每组用数字卡尺估计平均肿瘤体积，并且通过下式计算肿瘤体积(mm³)：每组的(宽度)2×长度/2约为50mm³。

在植入后第3、7、11和14(或15)天，用PBS、10mg/kg相关IgG同种型对照(equitech-Bio)或抗-OX40抗体(在CHO细胞中表达的IgG1形式的人OX40抗体ADI-20057-g1或在CHO细胞中表达的IgG2形式的人OX40抗体ADI-20057-g2)腹膜内(IP)给药小鼠。

在如上测定法所述进行的实验中，在CHO细胞中表达的IgG1形式的人OX40抗体ADI-20057-g1中与IgG对照(equitech-Bio)(图9)相比、和与pogalizumab和11D4(图11)相比，降低肿瘤体积生长。在如上测定法所述进行的实验中，在CHO细胞中表达的IgG2形式的人OX40抗体ADI-20057-g2与IgG对照(equitech-Bio)(图10)、pogalizumab和11D4(图11)相比，显著降低肿瘤体积生长。ADI-20057-g1和ADI-20057-g2与IgG对照、pogalizumab和11D4(图12)相比，不显著影响小鼠体重。

SEQUENCE LISTING

<110> 信达生物制药（苏州）有限公司

曾竣玮

H.巴鲁赫

刘晓林

<120> 抗OX40抗体及其用途

<130> PF 170116CNI

<140> CN 201710185399.9

<141> 2017-03-25

<160> 46

<170> PatentIn version 3.2

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Tyr Thr Phe Leu Glu Tyr Tyr Met His

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

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Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Val Ile Asn Pro Ser Glu Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Val Ile Asn Pro Ser Gly Gly Asp Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Val Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

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Gln Gln Ser Ala Asn Tyr Pro Tyr Thr

1 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggcggtgt actactgcgc aagagaccac 300

gccagcagca gctggtacac tacccattta gacctatggg ggagaggtac cttggtcacc 360

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgcaagg catctggata caccttcacg aattactata tgcactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggagtt atcaacccta gtgagggtag cacaaggtac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggcggtgt actactgcgc aagagaccac 300

gccagcagca gctggtacac tacccattta gacctatggg ggagaggtac cttggtcacc 360

gtctcctca 369

<210> 14

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggagtg atcaacccta gtggtggtga tacaagctac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggcggtgt actactgcgc cagagaccac 300

gccagcagca gctggtacac tacccattta gacctatggg ggagaggtac cttggtcacc 360

gtctcctca 369

<210> 15

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgcaagg catctggata caccttcctg gagtactata tgcactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggagtt atcaacccta gtggtggtag cacaatttac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggcggtgt actactgcgc aagagaccac 300

gccagcagca gctggtacac tacccattta gacctatggg ggagaggtac cttggtcacc 360

gtctcctca 369

<210> 16

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu

100 105 110

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 17

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Ser Glu Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu

100 105 110

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 18

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Ser Gly Gly Asp Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu

100 105 110

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu

100 105 110

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagatattg caacatatta ctgtcagcag tccgccaatt acccttacac ttttggcgga 300

gggaccaagg ttgagatcaa a 321

<210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 21

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 22

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

20 25

<210> 23

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 23

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10

<210> 24

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 24

Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 25

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 26

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

20

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 27

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 28

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 28

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 29

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(5)

<223> X1选自T或L,X2选自S、N或E

<400> 30

Tyr Thr Phe X1 X2 Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 31

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> X1选自I或V，X2选自G或E，X3选自S或D，X4选自S、R或I

<400> 31

X1 Ile Asn Pro Ser X2 Gly X3 Thr X4 Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 32

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 32

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu

100 105 110

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 33

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu

100 105 110

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val

195 200 205

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys

210 215 220

Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 34

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 35

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 35

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Ser Glu Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu

100 105 110

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 36

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 36

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Ser Glu Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu

100 105 110

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val

195 200 205

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys

210 215 220

Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 37

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 37

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Ser Gly Gly Asp Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu

100 105 110

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 38

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 38

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Ser Gly Gly Asp Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu

100 105 110

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val

195 200 205

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys

210 215 220

Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 39

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 39

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu

100 105 110

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 40

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Ala Ser Ser Ser Trp Tyr Thr Thr His Leu Asp Leu

100 105 110

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val

195 200 205

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys

210 215 220

Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 41

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 41

Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Arg Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asn Tyr Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn

85 90 95

Ala Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Pro Gly Trp Tyr Ala Ala Asp Val Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser

225 230 235 240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly Lys

465

<210> 42

<211> 465

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 42

Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Arg Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asn Tyr Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn

85 90 95

Ala Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Pro Gly Trp Tyr Ala Ala Asp Val Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp

210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr

225 230 235 240

Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro

245 250 255

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

260 265 270

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp

275 280 285

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

290 295 300

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val

305 310 315 320

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

325 330 335

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

340 345 350

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

355 360 365

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

370 375 380

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

385 390 395 400

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

405 410 415

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

420 425 430

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

435 440 445

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

450 455 460

Lys

465

<210> 43

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 43

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

Ala Asp Leu Pro Ala Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

130 135 140

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

145 150 155 160

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

165 170 175

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

195 200 205

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

210 215 220

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 44

<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 44

Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Leu Gln Leu Gln Lys Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asn Tyr Ala Met Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn

85 90 95

Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Pro Gly Trp Tyr Ala Ala Asp Val Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp

210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys

225 230 235 240

Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser

245 250 255

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

260 265 270

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

275 280 285

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

290 295 300

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val

305 310 315 320

Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

325 330 335

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

340 345 350

Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

355 360 365

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

370 375 380

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

385 390 395 400

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp

405 410 415

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

420 425 430

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

435 440 445

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 45

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 45

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Ile Met Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr

20 25 30

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Ile

65 70 75 80

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

Ala Asp Leu Pro Ala Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

130 135 140

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

145 150 155 160

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

165 170 175

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

195 200 205

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

210 215 220

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 46

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 46

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

Claims (21)

1.抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中所述HCVR包含互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3并且所述LCVR包含(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包含与选自SEQ ID NO:30、1、2和3的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含与选自SEQ ID NO:31、4、5、6和7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，且HCDR3包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成；其中LCDR1包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，LCDR2包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成，LCDR3包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。

2.权利要求1的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区HCVR，所述HCVR包含与选自SEQ ID NO:16、17、18和19的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。

3.权利要求1或2的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区LCVR，所述LCVR包含与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。

4.权利要求1的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链，其中重链包含与选自SEQID NO:32、33、35、36、37、38、39或40的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。

5.权利要求1或4的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，其中轻链包含与SEQID NO:34所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由其组成。

6.权利要求1至5中任一项的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是IgG1形式的抗体或IgG2形式或IgG4形式的抗体或抗原结合片段。

7.权利要求1至6中任一项的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体。

8.权利要求1至7中任一项的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源化的抗体或人抗体。

9.权利要求1至8中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是选自以下的抗体片段：Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)₂片段。

10.抗OX40抗体或其抗原结合片段，其与权利要求1-9中的任何抗体或其抗原结合片段结合相同的表位。

11.分离的核酸，其编码权利要求1至10中任一项的抗OX40抗体或其抗原结合片段。

12.包含权利要求11的核酸的载体，优选地所述载体是表达载体。

13.包含权利要求12的载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。

14.制备抗OX40抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达编码权利要求1至10中任一项的抗OX40抗体或其抗原结合片段的核酸的条件下培养权利要求13的宿主细胞，任选地分离所述抗体或其抗原结合片段，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗OX40抗体或其抗原结合片段。

15.药物组合物，其包含权利要求1至10中任一项的抗OX40抗体或其抗原结合片段，以及任选地药用载体。

16.免疫缀合物，其包含权利要求1至10中任一项的抗OX40抗体或其抗原结合片段和细胞毒性剂。

17.在受试者中活化T细胞或诱导T细胞介导的抗肿瘤活性或增强机体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至10中任一项的抗OX40抗体或其抗原结合片段、或权利要求15的药物组合物、或权利要求16的免疫缀合物。

18.治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至10中任一项的抗OX40抗体或其抗原结合片段、或权利要求15的药物组合物、或权利要求16的免疫缀合物。

19.权利要求18的方法，其中所述癌症是肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌，或结肠癌。

20.权利要求17至19中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者联合施用有效量的第二药物或活性剂，其中权利要求1至10中任一项的抗OX40抗体或其抗原结合片段、或权利要求15的药物组合物、或权利要求16的免疫缀合物是第一药物，优选地第二药物或活性剂选自化疗剂；更优选地，第二药物或活性剂选自PD-1轴结合拮抗剂或者抗血管发生剂；最优选地，第二药物或活性剂选自抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体或贝伐珠单抗。

21.检测样品中OX40的方法，所述方法包括

(a)将样品与权利要求1至10中任一项的任何抗OX40抗体或其抗原结合片段接触；和

(b)检测抗OX40抗体或其抗原结合片段和OX40间的复合物的形成；任选地，抗OX40抗体是被可检测地标记的。