CN108619506A - 抗Hib-RSV-脑膜炎球菌-肺炎球菌联合疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗Hib‑RSV‑脑膜炎球菌‑肺炎球菌联合疫苗，所述联合疫苗包括：Hib‑肺炎球菌免疫中间体，脑膜炎球菌免疫中间体和呼吸道合胞病毒免疫中间体，所述Hib‑肺炎球菌免疫中间体以肺炎球菌表达的高保守性并具有免疫原性的蛋白为载体蛋白，缀合Hib荚膜多糖；所述脑膜炎球菌免疫中间体包括ΔfHbp，所述重组ΔfHbp包含fHbp可变体V1的VA、VB结构域以及fHbp可变体V3的VC、VD、VE结构域；所述呼吸道合胞病毒免疫中间体的抗原为可引起机体免疫反应的RSV膜表面融合蛋白F和/或附着蛋白G，其中表达蛋白抗原的核酸序列重组在核酸载体上，重组蛋白的核酸序列以减毒胞内细菌为细菌载体；上述组分的免疫中间体分别制备为冻干粉剂，临用复融混合。

Description

抗Hib-RSV-脑膜炎球菌-肺炎球菌联合疫苗

技术领域

本发明涉及一种抗Hib-RSV-脑膜炎球菌-肺炎球菌联合疫苗，属于生物制药领域。

背景技术

1、肺炎链球菌及其流行病学

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)简称肺炎球菌(Pneumococcus)，寄居于正常人的 鼻咽腔中，是细菌性大叶性肺炎、脑膜炎、中耳炎、肺炎、支气管炎的主要病原菌。肺炎 球菌导致的疾病一直是全球严重的公共卫生问题，在全世界范围内有较高的发病率和病死 率，尤其是对2岁以下的儿童和老人。目前已上市的肺炎球菌荚膜糖疫苗和荚膜糖蛋白质 结合疫苗，其设计都基于肺炎球菌荚膜糖，涵盖了导致肺炎球菌性疾病的最常见血清型。 但肺炎球菌荚膜糖为胸腺非依赖性抗原(Thymus independent antigen，TI-Ag)，抗体反应主要 依赖于其重复单位组成的线性表位，在无T淋巴细胞辅助的情况下直接与B淋巴细胞表面 的IgM受体交联，所诱导的抗体主要为IgM和IgG2，缺少较好的补体活化能力，抗体水平 不能维持足够长的时间，且不能诱导免疫记忆，无法在2岁以下幼儿中产生免疫保护。荚 膜糖复杂的结构导致每一个血清型的免疫原性不同，无法产生有效的免疫应答。肺炎球菌 结合疫苗包括血清型别多，各型别用于结合的特异性结构不同，导致其每个型别的结合方 法相异。对荚膜糖的修饰及与载体蛋白的结合要在保证荚膜糖特异基团不丢失、抗原性和 免疫原性不受影响的前提下进行，同时为了避免糖链的过度交联和结合物除菌过滤的要求， 对荚膜糖及结合物分子的大小应当有一定控制。7价疫苗于2000年2月在美国获准使用。 由于肺炎球菌型别多，在结合疫苗的制作过程需要结合蛋白成分，因蛋白成分可以引起局 部反应，所以生产包含12个型别以上的结合疫苗就很困难。结合疫苗在初次免疫后活的抗 体浓度仅能维持几个月，随后就会下降到免疫前水平；并且结合疫苗的整个工艺过程中需 要加入多种化学试剂参与反应，并且荚膜糖蛋白结合疫苗的血清型覆盖率低和非疫苗血清 型肺炎球菌感染性疾病的增加使得更多研究者开始关注其他方向的肺炎球菌疫苗开发。

二、流感嗜血杆菌及其流行病学

流感嗜血杆菌中b型流感嗜血杆菌(Hib)侵袭力最强的一个血清型，是引起小儿严重 感染的重要致病菌，其感染对象主要是5岁以下儿童，尤其是2岁以下的婴幼儿。Hib通过易感者呼吸道传播，定植于鼻咽部，可表现为无症状携带，持续数月，少部分人群则发生Hib侵袭性疾病。Hib感染最常见的疾病为脑膜炎与肺炎，另外还包括骨髓炎、脓毒性关节炎，会厌炎及败血症等。Hib最重要的致病因子是其荚膜多糖PRP，能在Hib感染和克隆过 程中提供生存优势，抵抗补体介导的吞噬作用，抑制血清杀菌活性，逃脱鼻粘膜免疫，促 进细菌在人群中的传播。

Hib结合疫苗根据PRP长度、载体蛋白不同常见的有四种，其免疫原性各有特点：(1) 以白喉类毒素蛋白为载体的结合疫苗(PRP-diphthena toxoid，PRP-D)：与Hib多糖疫苗免疫 原性相似，具有一定的年龄特点，成人初次接种后就可产生较高水平的抗体，而>15月的儿 童虽可以产生较高水平抗体，但加强接种后无长期保持作用。(2)以B组脑膜炎双球菌胞 膜蛋白为载体的结合疫苗(PRP-OMP):PRP-OMP对所有年龄组人群均有较好的免疫原性。第 1剂接种后，大多数人均能产生高水平的抗体。再次接种后的抗体效价亦大于PRP-D，Hb-OC，PRP-T，但PRP-OMP的抗体维持的时间短，且抗体峰值水平较Hb-OC，PRP-T低。 (3)以减毒的白喉类毒素CRM197为载体的结合疫苗(Hb-OC，PRP-CRM197)：2月龄婴 儿第1剂接种产生的抗体水平较低，但4和6月龄分别再次注射后可诱导出高水平的抗体，1年后抗体仍可维持一定的水平。(4)以破伤风类毒素为载体的结合疫苗(PRP-T)：与Hb-OC 类似，在较大儿童及成人，第1剂接种即可显示较好的免疫原性。小婴儿对第1剂接种免 疫反应较弱，第2剂及第3剂再次接种后即能产生较高水平的抗体，且抗体水平维持时间 较长。目前，国内及国际上主要使用的是PRP-CRM197，PRP-T两种，PRP-T适用于大多 数年龄段人群的Hib疫苗接种。

三、呼吸道合胞病毒及其流行病学

呼吸道传染病至今仍然是世界上导致死亡的主要原因之一，而流感病毒(Influenza virus，FLU)和呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)则是重要的呼吸道病 原体。目前，流感已有安全有效的不同类型疫苗，为流感的防控提供了保证。而RSV由于 自身免疫特性，尚无有效的疫苗可用。RSV是引起婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原，也 是造成老年人和免疫缺陷成人住院和因肺炎死亡的重要原因。据统计，6个月以内的婴幼儿 因RSV感染导致住院率达70％，2周岁以内的儿童感染率甚至高达99％。RSV因其致病范 围广，病情高发，且会引起严重的并发症等，给人类健康和生命安全造成了严重威胁。世 界卫生组织已将RSV疫苗定为优先发展的疫苗之一。

RSV隶属于副粘病毒科肺病毒属，是单股负链RNA病毒。RSV基因组全长约15Kb， 编码10种主要蛋白，包括三个跨膜蛋白(G、F和SH)、两个基质蛋白(M和M2)、三个 核衣壳蛋白(N、P和L)及两个非结构蛋白(NS1和NS2)构成，其中融合蛋白F(Fusion protein，F)和附着蛋白G(Attchment protein，G)是RSV激发机体产生保护性抗体最重要 的病毒蛋白。G蛋白高度差异，根据G蛋白抗原性差异RSV可分为A和B两个亚型；RSV 的F蛋白高度保守，介导病毒包膜和宿主细胞膜的融合，使得病毒成功入侵宿主细胞并且 还可引起相邻细胞质膜间的融合促进体外合胞体的形成。针对RSV F和G糖蛋白的中和抗 体能有效防止RSV再感染，因此RSV F和G蛋白已被公认为RSV的毒力致病分子和保护 性抗原。

对于RSV而言，20世纪60年代，FμLginiti VA等研制的***灭活疫苗(FI-RSV)由于诱发Th2型免疫过激导致2名儿童死亡，以失败告终。目前RSV疫苗的研究主要集中 在载体疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、VLP疫苗，但至今无获批的RSV疫 苗可用。RSV疫苗的研究一直是国际社会关注的焦点，从已有的研制中的RSV疫苗可见， 注射免疫不能产生有效的粘膜和细胞免疫反应且免疫保护效果受限、DNA疫苗存在潜在安 全性以及全长F、G蛋白疫苗存在潜在Th1/Th2失平衡等瓶颈问题亟待解决。阻碍RSV疫 苗研制的主要障碍有以下几点：一是大多数动物模型包括黑猩猩等均为半敏感感染/复制模 型，因此难以完全再现RSV的致病性；二是作为疫苗主要目标人群的新生儿免疫***发育 不成熟，同时体内存在的母传抗体能介导免疫干扰；三是RSV存在两种不同抗原亚型，而 且自然感染难以产生有效的免疫保护作用；四是***灭活疫苗(FI-RSV)不仅不能防 止婴幼儿感染，在之后的自然感染中，接种疫苗的儿童病情加重(即疾病增强作用)、甚至 死亡。

近年来的研究表明，以载体为基础构建的RSV疫苗有望用于新生儿。载体疫苗主要包 括病毒载体疫苗和细菌载体疫苗。RSV病毒载体疫苗主要包括：痘苗病毒(vacciniavirus) 载体疫苗、腺病毒(adenovirus，Ad)载体及副黏病毒(paramyxovirus)载体疫苗等，近年 来，腺病毒载体疫苗和副黏病毒载体疫苗受到广泛关注。

四、脑膜炎奈瑟氏菌(Nm)及其流行病学

流行性脑脊髓膜炎(epidemic cerebrospinal meningitis)是由脑膜炎奈瑟氏菌，通过呼吸道 传播引起的急性化脓性脑膜炎，在世界各地均有不同程度的流行。脑膜炎奈瑟菌也称为脑 膜炎球菌，是一类革兰染色阴性双球菌，通常定植在人的鼻咽部。人类是其唯一宿主，因 而Nm表现出对人类鼻咽部高度的适应性，10％-40％的健康人群都是Nm的无临床症状携 带者，在脑膜炎爆发性流行时期，无症状携带者比例更可高达70％。少数情况下，Nm可 经血侵入脑脊髓膜，引起化脓性炎症，出现脑膜刺激症和化脓性脑膜炎的脑脊液变化。疫 苗预防是防治脑膜炎球菌病的重要手段，因为即使采用抗生素干涉，这种疾病仍有高发病 率和死亡率。

具有致病性的Nm菌株一般都具有荚膜结构，健康人群正常携带的菌株往往会缺失荚 膜，成为不能分群的菌株。根据Nm荚膜多糖的化学组成可将其分成A、B、C、D、H、I、 K、L、X、Y、Z、29E和w135 13个血清群(Serogroup)，而根据其外膜蛋白(OMP)、PorB(2 或3类OMp)和PorA(1类OMP)的抗原性差异，又可分成不同的血清型和血清亚型。全球 每年约发生120万的Nm感染病例，多数病例是由A、B、C、W135、Y群菌株引起。而在 发达国家中由B群Nm引起的流行性脑脊髓膜炎病例更是高达总病例的80％。在我国的流 行主要以A群为主，近年来由于疫苗的广泛接种，A群引起的感染得到有效控制，而由B 群引起的病例也相对增多。单一血清群、血清型和血清亚型的流脑菌苗在整体上很难预防 流行性脑脊髓膜炎的发生。随着对Nm表面抗原结构更加深入的研究，流脑菌苗正朝着多 元化方向发展。

流脑多糖-蛋白缀合菌苗已有研制，Chiron和Wyem使用脱毒白喉类毒素(CRM197)作 为蛋白载体，Baxter用破伤风类毒素作为载体，开发了A/C群脑膜炎球菌缀合疫苗，于1999 年11月引入了英国。此后Sanofi-Pasteur开发了A/C/Y/W135群多糖共价结合白喉类毒素 (MCV4)的四价缀合疫苗，我国已有几种A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖与载体蛋白TT的缀合疫苗批准上市。由于脑膜炎球菌多糖及缀合疫苗应用，有效的预防了A、C、Y和W135 群脑膜炎球菌的感染。与A、C、W135、Y群菌株荚膜多糖不同，B群Nm菌株的荚膜多 糖免疫原性较低，并且MenB荚膜多糖的结构与正在发育的神经组织及少数成熟组织中的 神经细胞黏附分子同源，免疫接种易产生自身免疫。因此，B群Nm的荚膜多糖不能用作 疫苗的抗原成份。B群疫苗的研究目前主要集中在非荚膜抗原，如蛋白、脂多糖 (1ipopolysaccharide，LOS)等。筛选非荚膜表面抗原的主要挑战是其安全性、抗原保守性及 能引发广泛有效的杀菌力反应。能作为候选疫苗的具有免疫原性的蛋白质需具备以下特点： 在大多数菌株中都表达且结构保守；可诱生杀菌抗体或保护性抗体。目前在蛋白质疫苗的 研究方面取得了一定进展，诺华公司应用反向疫苗学研制的4CMenB疫苗已通过Ⅲ期临床 实验。在研热点候选抗原有PorA，NhhA、GNA2132、NadA和fHBP等，其中fHBP是最 有前途的候选蛋白质之一。

fHBP为因子H结合蛋白(Factor H-binding Protein，fHBP)，又称为脂蛋白2086，几乎 表达于所有脑膜炎奈瑟菌表面，由255个氨基酸残基组成，分子量29000。因子H是补体替代途径的关键调节子，它在因子I介导的C3b裂解为灭活片段iC3b过程中发挥辅助因子作用。也促进替代途径c3转化酶C3bBb的衰变。fHBP和因子H结合可下调替代途径，从 而有利于脑膜炎奈瑟菌生存。fHBP对于脑膜炎球菌在人类的血液、血清和抗菌性多肽存在 的情况下的生存是极为重要的。其氨基酸序列较保守，变种内91.6％-100％氨基酸相同。 重组fHBP抗体可引起针对同一类变种的补体介导的杀菌作用和诱导感染乳鼠模型的被动 保护。由完整fHBP获得的抗体不仅滴度高，且对顺序变异不敏感，即使有少量氨基酸改变， 只要决定空间构象的关键氨基酸不变，抗体杀菌活性变化不大。所有这些特点使fHBP成为 脑膜炎奈瑟菌最有效的抗原之一和最有希望的候选通用疫苗。根据整个蛋白的抗原交叉反应性和序列相似性，脑膜炎球菌fHbp可以被分为3个抗原变体组。通常，针对变体V1的 fHbp(也被称为亚家族B)制备的抗体对来自变体V1表达fHbp的菌株具有杀菌活性，但 不针对变体V2和V3(也称为亚族A)中表达fHbp的菌株，反之亦然。在每个变体组中也 存在fHbp的亚变体。最近，fHbp的分子结构已显示为“模块化”，fHbp变体含有五个可变 结构域的不同组合(VA～VE)，每个可变区段衍生自亚族A和亚族B。因此，通过基因工 程手段自由组合五个结构域可以得到覆盖A、B两个亚族三种变体的抗原的重组ΔfHbp蛋 白，成为广谱的疫苗抗原及蛋白载体。

目前市场上缺乏对于口鼻部上呼吸道感染的多种细菌的联合免疫用药，而上呼吸道感 染容易引发一系列的并发疾病，且各类疾病之间联系紧密、容易相互影响，尤其是对于易 感人群来说，联合病症对于身体健康有严重的影响，甚至会危及生命。因此需要对呼吸系 统类疾病进行联合免疫，从而更加有效地避免同类型疾病的发生。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种抗Hib-RSV-脑膜炎球菌-肺炎 球菌联合疫苗。

为实现上述发明目的，本发明采用的抗Hib-RSV-脑膜炎球菌-肺炎球菌联合疫苗的技术 方案如下：

所述联合疫苗包括：

Hib-肺炎球菌免疫中间体，所述Hib-肺炎球菌免疫中间体以肺炎球菌表达的高保守性 并具有免疫原性的蛋白为载体蛋白，缀合Hib荚膜多糖；

脑膜炎球菌免疫中间体，所述脑膜炎球菌免疫中间体包括ΔfHbp，所述重组ΔfHbp包 含fHbp可变体V1的VA、VB结构域以及fHbp可变体V3的VC、VD、VE结构域；

呼吸道合胞病毒免疫中间体，所述呼吸道合胞病毒免疫中间体的抗原为可引起机体免 疫反应的RSV膜表面融合蛋白F和/或附着蛋白G，其中表达蛋白抗原的核酸序列重组在核 酸载体上，重组蛋白的核酸序列以减毒胞内细菌为细菌载体；

上述组分的免疫中间体分别制备为冻干粉剂，临用复融混合。

优选的，所述Hib-肺炎球菌免疫中间体还包括与载体蛋白缀合的肺炎球菌荚膜多糖。 虽然改性后的肺炎球菌载体蛋白具有免疫原性，但为了保证肺炎球菌稳定且良好的免疫原 性，在Hib荚膜多糖与载体蛋白缀合的同时，使纯化并活化的肺炎球菌荚膜多糖与肺炎球 菌载体蛋白缀合，形成新的免疫中间体，保证Hib-肺炎球菌免疫中间体的免疫活性。

优选的，肺炎球菌荚膜多糖选自以下血清型中的一种及以上：1、2、3、4、5、6B、 7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和/ 或33F。

优选的，肺炎球菌载体蛋白包括：肺炎球菌溶血蛋白及其改性衍生物、肺炎球菌表面 蛋白及其改性衍生物、肺炎球具表面黏附蛋白及其改性衍生物或肺炎球菌三组氨酸蛋白家 族融合蛋白。

更优选的，肺炎球菌载体蛋白具体为：改性肺炎球菌溶血蛋白△A146Ply、肺炎球菌溶 血蛋白衍生物dPly、肺炎球菌表面蛋白A、肺炎球菌表面黏附蛋白A或肺炎球菌三组氨酸 蛋白PhtA、PhtB、PhtD、PhtE、PhtDE。

作为一种优选的实施方式，优选改性后无毒的溶血蛋白△A146Ply与7价、13价或23 价肺炎球菌荚膜多糖缀合。

优选的，RSV蛋白为F蛋白，根据表达蛋白的核酸序列设计特异性引物，引物序列如序列表SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。

优选的，重组的RSV蛋白抗原为pcDNA3.1-F。

优选的，减毒胞内细菌载体选自：L3261、SL7207或ty21a。

优选的，转染至细菌载体内的RSV抗原为SL7207/pcDNA3.1-F。

优选的，所述重组ΔfHbp的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：9所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQ ID NO：10所示。

重组的ΔfHbp蛋白对低表达甚至不表达fHbp的MenB菌株失去保护能力，能够有效地免疫所有表达fHbp(V1、V3和V2变体)的MenB菌株的侵染，因此该蛋白的免疫无法 实现理论上的全覆盖，但由于本发明中的联合疫苗需要以混合形式存在，各抗原之间不可 避免的产生竞争和相互抑制的关系，作为免疫中间体的载体也不宜过大，通过实验证实， ΔfHbp蛋白可以达到预设的免疫效果，因此不选择修饰耦连其他蛋白的全覆盖蛋白作为载 体蛋白。

与现有技术相比，本发明的肺炎球菌疫苗的蛋白-荚膜糖结合体可在不同的血清型间起 到诱导交叉免疫保护作用；并且蛋白本身的作为毒力因子可诱导更强的免疫保护作用，对 荚膜糖在免疫上起补充作用，从而增强了疫苗的免疫保护作用，同时肺炎球菌的自身蛋白 可以避免与其他疫苗如白喉疫苗、破伤风疫苗在体内产生免疫冲突，使得本结合疫苗的实 现成为了可能。本结合疫苗提高了接种者的肺炎球菌感染的免疫记忆应答；肺炎球菌蛋白 的加入使得肺炎球菌的免疫需要依赖胸腺免疫，因此使得肺炎球菌的免疫实现了全年龄段 及全部血清型的长效、全覆盖式免疫；肺炎球菌荚膜糖与肺炎球菌蛋白偶联之后提高了体 内免疫应答的速度及扩展了其免疫的深度和广度，二者之间的协同作用虽然没有单独每种 疫苗的效果好，但减少了接种次数，提高了接种效率，减轻了被接种者的身体负担；

本发明的呼吸道合胞病毒中间体以载体为基础构建的RSV活载体疫苗可在机体细胞 形成的蛋白质构象与其天然构象完全相同，减毒沙门氏菌既可携带原核表达质粒也可携带 真核表达质粒，不会导致抗原表位的丧失或变化，形成的免疫力更利于抵抗随后的自然感 染；免疫效力高、成本低及安全性好；避免了RSV存在的体外繁殖滴度低和稳定性差的问 题，重组减毒沙门氏菌疫苗生产工艺简单，疫苗易于储存和运输，因此疫苗的成本相对较 低，有利于疫苗的大规模制备；重组减毒菌疫苗可经口服免疫、鼻内免疫和直肠免疫等多 种途径免疫，抗原被直接递呈到APC细胞，有效激发细胞免疫和体液免疫，且经黏膜途径免疫不会产生疾病增强作用，且能突破母传抗体的干扰；

脑膜炎球菌免疫中间体针对B群脑膜炎球菌荚膜多糖成份不适合用作疫苗，利用反向 遗传学的技术，表达B群脑膜炎球菌人H因子结合蛋白重组蛋白与奈瑟氏菌粘附素A蛋白 的融合产物ΔfHbp-NadA。该融合蛋白的ΔfHbp含有fHbp A亚族和fHbp B亚族(V1～V3三种变体)的保守结构域，能够覆盖所有表达fHbp蛋白的Nm B群菌株，并且，ΔfHbp包 含fHbp完整的VA～VE五个结构域，其结构、功能和抗原位点保持了完整性；同时，该融 合蛋白的NadA在50％的Nm B群菌株中表达，且这些菌株基本为高致病菌。因此即使不 表达fHbp但表达NadA的菌株也能被ΔfHbp-NadA蛋白覆盖，以此重组蛋白为抗原制成的 蛋白疫苗能广谱保护几乎所有Nm B群致病菌的感染；

三种免疫中间体临用混合作为联合疫苗，可进行广谱保护，减少接种次数和接种后反 应，对于接种者具有积极意义。

附图说明

图1是本发明实施例提供的F蛋白PCR扩增产物电泳图；

图2是本发明实施例提供的阳性质粒构建***位点图；

图3是本发明实施例提供的小鼠体内感染的F蛋白PCR扩增产物电泳图；

图4为fHbp V1～V3可变体结构域及重组ΔfHbp结构域；

图5为ΔfHbp扩增电泳图谱与pET-ΔfHbp鉴定电泳图谱；

图6为IPTG诱导重组菌表达ΔfHbp蛋白；

图7为Western-Blot鉴定ΔfHbp重组蛋白；

图8为SDS-PAGE鉴定纯化后的ΔfHbp重组蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的抗Hib-RSV-脑膜炎球菌-肺炎球菌联合疫苗作进一步 详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对 本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验 材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

1.制备Hib-肺炎球菌免疫中间体

1.1制备肺炎球菌荚膜糖

a.取现有的7价肺炎球菌的常见致病血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F的肺炎 球菌培养；

b.分别提纯以上各种血清型肺炎球菌中抗原性强的荚膜多糖4、9V、14、19F及23F，寡糖18C及多糖6B；

c.肺炎球菌灭活后离心收集上清液，经超滤浓缩，根据各肺炎球菌血清型特性分别加 入适量(体积分数为70％的)预冷乙醇，离心收集，得粗制荚膜糖；将粗制荚膜糖溶于乙 酸钠溶液中，然后按1：2比例以冷酚混匀，离心去除蛋白，反复酚提5-6次，收集上清， 用蒸馏水透析，透析后液体加2mol/L氯化钙溶液，加入乙醇搅拌，离心去除核酸，收集上 清，补加乙醇搅拌(终浓度80％)，离心收集沉淀，用乙醇、丙酮洗涤沉淀，脱水干燥后得 精制荚膜糖，置-20℃保存备用。

1.2肺炎球菌表达的高保守性并具有免疫原性的蛋白△A146Ply

根据GenBank公布的Ply基因(序列登录号：X52474)，改性肺炎球菌溶血蛋白△A146Ply 的设计引物序列如下表1：

表1

SEQ ID NO	引物	序列(5’-3’)
			1	F-△A146Ply-N	GGAATTCCATATGGCAAATAAAGCAGTA AAT
2	R-△A146Ply-N	CGAGCTCGTCATTTTCTACCTTATCCTCT
			3	F-△A146Ply-C	CGGCGGCCGCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG
4	R-△A146Ply-C	CCCTCGAGTTACTAGTCATTTTCTACCTTATCCTCT

其中划线部分为相应的限制性内切酶酶切位点。

根据常规实验方法将△A146Ply基因PCR扩增后，1％凝胶电泳，回收目标DNA片段，将目标DNA片段连接入pET-28a质粒中，在大肠杆菌感受态细胞BL21内转化抽提重组 DNA质粒，IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，确定表达量及表达形式后进 行Ni-NTA树脂纯化；采用0.2％***溶液去除内毒素，即溶血活性，得到去除内毒素 后的△A146Ply蛋白。△A146Ply蛋白为Ply蛋白第146位丙氨酸缺失的改性蛋白，蛋白纯 度达到80％以上，检测证明具有免疫原性且残留的内毒素含量低于0.1EU/μg。

采用氨基还原法将肺炎球菌表面蛋白与荚膜糖进行偶联，具体为将上述步骤获得的 △A146Ply蛋白与多种荚膜糖以1：2～4质量比混合，以制备10mL疫苗原液为例，加入荚膜多糖4、9V、14、19F及23F各40μg，寡糖18C 2μg及多糖6B 80μg，△A146Ply蛋白160μg。 经过凝胶层析柱纯化后测定荚膜糖含量。

1.3制备b型流感嗜血杆菌荚膜多糖

a.采用CY培养基对Hib菌株1842在37℃下进行发酵，发酵液经甲醛灭活，离心取上清后，利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)进行沉淀。然后用0.5～1M的NaCl对复合 物沉淀进行解离，添加冰乙醇至终浓度25％(v/v)，沉淀核酸，然后加冰乙醇至终浓度75％ (v/v)，沉淀得到粗多糖。

b.上述粗多糖用醋酸钠溶液溶解，冷酚抽提5-6次，最后超滤浓缩去除苯酚残留，经 75％(v/v)乙醇沉淀得到精糖，置-20℃保存备用。

1.4Hib荚膜多糖、肺炎球菌荚膜多糖与肺炎球菌蛋白结合

将肺炎球菌荚膜多糖、HIb荚膜多糖活化后与肺炎球菌蛋白△A146Ply结合，形成Hib- 肺炎球菌免疫中间体。

1.5Hib-肺炎球菌免疫中间体的免疫学评价

小鼠活体实验中，每只小鼠肌肉注射，每针剂量0.5mL，间隔一个月，共免疫3针；肺炎球菌-百白破联合疫苗给药剂量0.5mL，间隔一月，共免疫3针。接种完成后用ELISA法 检测小鼠血清中抗肺炎球菌荚膜糖PS IgG抗体水平，采用ELISA法检测抗破伤风抗体 GMT。评估结果如下表2：

表2

2、制备呼吸道合胞病毒免疫中间体

2.1呼吸道合胞病毒(RSV)的质粒构建、表达和纯化

选择RSV F蛋白的CDS区基因(GeneID：1489825)进行扩增，F蛋白的CDS区基因 如序列表SEQ ID NO：5所示，根据F基因的特异性设计上下游引物，上游引物序列如序 列表SEQ ID NO：6所示，下游引物如序列表SEQ ID NO：7所示，结合引物后的待扩增片 段如序列表SEQ ID NO：8所示。

F蛋白CDS区序列具体如下：

ATGGAGCTGCTGATCCACAGGTTAAGTGCAATCTTCCTAACTCTTGCTATTAATGCATTGTACCTCACCTCAAGTCAGAACATAACTGAGGAGTTTTACCAATCGACATGTAGTGCAGTTAGCAGAGGTTATTTTAGTGCTTTAAGAACAGGTTGGTATACCAGTGTCATAACAATAGAATTAAGTAATATAAAAGAAACCAAATGCAATGGAACTGACACTAAAGTAAAACTTATAAAACAAGAATTAGATAAGTATAAGAATGCAGTGACAGAATTACAGCTACTTATGCAAAACACACCAGCTGCCAACAACCGGGCCAGAAGAGAAGCACCACAGTATATGAACTATACAATCAATACCACTAAAAACCTAAATGTATCAATAAGCAAGAAGAGGAAACGAAGATTTCTGGGCTTCTTGTTAGGTGTAGGATCTGCAATAGCAAGTGGTATAGCTGTATCCAAAGTTCTACACCTTGAAGGAGAAGTGAACAAGATCAAAAATGCTTTGTTATCTACAAACAAAGCTGTAGTCAGTCTATCAAATGGGGTCAGTGTTTTAACCAGCAAAGTGTTAGATCTCAAGAATTACATAAATAACCAATTATTACCCATAGTAAATCAACAGAGCTGTCGCATCTCCAACATTGAAACAGTTATAGAATTCCAGCAGAAGAACAGCAGATTGTTGGAAATCAACAGAGAATTCAGTGTCAATGCAGGTGTAACAACACCTTTAAGCACTTACATGTTAACAAACAGTGAGTTACTATCATTGATCAATGATATGCCTATAACAAATGATCAGAAAAAATTAATGTCAAGCAATGTTCAGATAGTAAGGCAACAAAGTTATTCTATCATGTCTATAATAAAGGAAGAAGTCCTTGCATATGTTGTACAGCTACCTATCTATGGTGTAATAGATACACCTTGCTGGAAATTACACACATCACCTCTATGCACCACCAACATCAAAGAAGGATCAAATATTTGTTTAACAAGGACTGATAGAGGATGGTATTGTGATAATGCAGGATCAGTATCCTTCTTTCCACAGGCTGACACTTGTAAAGTACAGTCCAATCGAGTATTTTGTGACACTATGAACAGTTTGACATTACCAAGTGAAGTCAGCCTTTGTAACACTGACATATTCAATTCCAAGTATGACTGCAAAATTATGACATCAAAAACAGACATAAGCAGCTCAGTAATTACTTCTCTTGGAGCTATAGTGTCATGCTATGGTAAAACTAAATGCACTGCATCCAACAAAAATCGTGGGATTATAAAGACATTTTCTAATGGTTGTGACTATGTGTCAAACAAAGGAGTAGATACTGTGTCAGTGGGCAACACTTTATACTATGTAAACAAGCTGGAAGGCAAGAACCTTTATGTAAAAGGGGAACCTATAATAAATTACTATGACCCTCTAGTGTTTCCTTCTGATGAGTTTGATGCATCAATATCTCAAGTCAATGAAAAAATCAATCAAAGTTTAGCTTTTATTCGTAGATCTGATGAATTACTACATAATGTAAATACTGGCAAATCTACTACAAATATTATGATAACTACAATTATTATAGTAATCATTGTAGTATTGTTATCATTAATAGCTATTGGTTTGCTGTTGTATTGCAAAGCCAAAAACACACCAGTTACACTAAGCAAAGACCAACTAAGTGGAATCAATAATATTGCATTCAGCAAATAG

取复苏并进行继代培养的Vero细胞，清洗后接入稀释的病毒，37℃吸附1h，每间隔15min 摇动一次，使病毒充分感染细胞；倒掉接毒细胞瓶的病毒稀释液和未接毒细胞瓶的培养液， 分别添加6～8mL含2％血清的DMEM维持液，37℃CO₂孵箱中培养，第二天起每天观察 细胞病变情况。当细胞出现75％病变时收毒(约需要7d)，即将培养液于-80℃/37℃反复冻 融3次后，10000r/min离心10min，无菌操作取上清，分装，于-80℃冰箱长期保存。

采用DEPC(焦炭酸二乙酯)对提取RNA需要的离心管、枪头及PCR管进行去RNA 酶处理，并采用RNA/DNA试剂盒提取RSV RNA。本实施例中采用的提取试剂盒为TaKaRa 小量病毒RNA/DNA提取试剂盒，按说明书操作即可。提取出的RNA需立即使用或置于 -80℃冰箱保存备用。

逆转录体系采用25μL体系，加入RNA 12μL，通用引物Oligo(d)T18 1μL轻轻混匀，70℃孵育5min，冰浴2min。向离心管中加入AMV 1μL，AMV Buffer 5μL，dNTP 5μL，RNaseInhibitor 1μL轻轻混匀，42℃孵育60min。70℃10min灭活转录酶。得到的产物cDNA需 立即使用或于-20℃长期保存备用。

根据RSV F蛋白CDS片段设计特异性引物，引物序列由5’端至3’端依次为保护碱基- 酶切位点-连接引物，上游酶切位点为Hind III酶切位点，下游酶切位点为Xho I酶切位点， 引物序列具体如下：

F:：5'-ccc-AAGCTT-CAGAAAACCGTGACCTATCAAG-3'

R：5'-cc-CTCGAG-ACATGAAGTTTTGCCTCACTAGTA-3'

PCR体系采用25μL体系，加入10×rTaq buffer 2.5μL，dNTP 2μL，rTaq 0.25μL，上游 引物1μL，下游引物1μL，水17.25μL，RT-PCR产物cDNA 1μL；扩增F全长片段的反应 条件：94℃5min，94℃50s，55℃退火50s，72℃延伸1.5min，25个循环，72℃延伸10min， 4℃结束；扩增G全长片段的反应条件：94℃5min，94℃45s，58℃退火45s，72℃延伸1min， 25个循环，72℃延伸7min，4℃结束。

采用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳检测，检测后确认F基因片段大小约为 2150bp的PCR扩增片段。扩增产物电泳图如图1所示，图中条带1位F基因，条带M1为 标准DNA marker，条带清晰，符合预期理论值。

采用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。-20℃保存。

根据上述引物，采用表达载体pcDNA3.1构建pcDNA3.1-F，将F蛋白基因片段克隆入pcDNA3.1的CMV启动子下游，构建成真核表达质粒pcDNA3.1-F。构建成功的部分连接 片段如图2所示。

扩增F蛋白基因序列，限制性内切酶酶切PCR产物和pcDNA3.1，双酶切产物后连接，完成质粒构建。

引物连接后的待扩增片段具体如下：

CTTAGTTATTCAAAAACTACATCTTAGCAGAAAACCGTGACCTATCAAGCAAGAACGAAATTAAACCTGGGGCAAATAACCATGGAGCTGCTGATCCACAGGTTAAGTGCAATCTTCCTAACTCTTGCTATTAATGCATTGTACCTCACCTCAAGTCAGAACATAACTGAGGAGTTTTACCAATCGACATGTAGTGCAGTTAGCAGAGGTTATTTTAGTGCTTTAAGAACAGGTTGGTATACCAGTGTCATAACAATAGAATTAAGTAATATAAAAGAAACCAAATGCAATGGAACTGACACTAAAGTAAAACTTATAAAACAAGAATTAGATAAGTATAAGAATGCAGTGACAGAATTACAGCTACTTATGCAAAACACACCAGCTGCCAACAACCGGGCCAGAAGAGAAGCACCACAGTATATGAACTATACAATCAATACCACTAAAAACCTAAATGTATCAATAAGCAAGAAGAGGAAACGAAGATTTCTGGGCTTCTTGTTAGGTGTAGGATCTGCAATAGCAAGTGGTATAGCTGTATCCAAAGTTCTACACCTTGAAGGAGAAGTGAACAAGATCAAAAATGCTTTGTTATCTACAAACAAAGCTGTAGTCAGTCTATCAAATGGGGTCAGTGTTTTAACCAGCAAAGTGTTAGATCTCAAGAATTACATAAATAACCAATTATTACCCATAGTAAATCAACAGAGCTGTCGCATCTCCAACATTGAAACAGTTATAGAATTCCAGCAGAAGAACAGCAGATTGTTGGAAATCAACAGAGAATTCAGTGTCAATGCAGGTGTAACAACACCTTTAAGCACTTACATGTTAACAAACAGTGAGTTACTATCATTGATCAATGATATGCCTATAACAAATGATCAGAAAAAATTAATGTCAAGCAATGTTCAGATAGTAAGGCAACAAAGTTATTCTATCATGTCTATAATAAAGGAAGAAGTCCTTGCATATGTTGTACAGCTACCTATCTATGGTGTAATAGATACACCTTGCTGGAAATTACACACATCACCTCTATGCACCACCAACATCAAAGAAGGATCAAATATTTGTTTAACAAGGACTGATAGAGGATGGTATTGTGATAATGCAGGATCAGTATCCTTCTTTCCACAGGCTGACACTTGTAAAGTACAGTCCAATCGAGTATTTTGTGACACTATGAACAGTTTGACATTACCAAGTGAAGTCAGCCTTTGTAACACTGACATATTCAATTCCAAGTATGACTGCAAAATTATGACATCAAAAACAGACATAAGCAGCTCAGTAATTACTTCTCTTGGAGCTATAGTGTCATGCTATGGTAAAACTAAATGCACTGCATCCAACAAAAATCGTGGGATTATAAAGACATTTTCTAATGGTTGTGACTATGTGTCAAACAAAGGAGTAGATACTGTGTCAGTGGGCAACACTTTATACTATGTAAACAAGCTGGAAGGCAAGAACCTTTATGTAAAAGGGGAACCTATAATAAATTACTATGACCCTCTAGTGTTTCCTTCTGATGAGTTTGATGCATCAATATCTCAAGTCAATGAAAAAATCAATCAAAGTTTAGCTTTTATTCGTAGATCTGATGAATTACTACATAATGTAAATACTGGCAAATCTACTACAAATATTATGATAACTACAATTATTATAGTAATCATTGTAGTATTGTTATCATTAATAGCTATTGGTTTGCTGTTGTATTGCAAAGCCAAAAACACACCAGTTACACTAAGCAAAGACCAACTAAGTGGAATCAATAATATTGCATTCAGCAAATAGACAAAAAACCACCTGATCATGTTTCAACAACAGTCTGCTGATCACCAATCCCAAATCAACCCATAACAAACACTTCAACATCACAGTACAGGCTGAATCATTTCTTCACATCATGCTACCCACACAACTAAGCTAGATCCTTAACTCATAGTTACATAAAAACCTCAAGTATCACAATCAAACACTAAATCAACACATCATTCACAAAATTAACAGCTGGGGCAAATATGTCGCGAAGAAATCCTTGTAAATTTGAGATTAGAGGTCATTGCTTGAATGGTAGAAGATGTCACTACAGTCATAATTACTTTGAATGGCCTCCTCATGCCTTACTAGTGAGGCAAAACTTCATGTTAAACAAGATACTCAAGTCAATGGACAAAAGCATAGACACTTTGTCTGAAATAAGTGGAGCTGCTGAACTGGACAGAACAGAAGAATATGCTCTTGGTATAGTTGGAGTGCTAGAGAGTTACATAGGATCTATAAACAACATAACA

片段中下划线位置为F蛋白的启动子和终止子。

PCR质粒PCR产物F片段长约2150bp，与预期PCR产物一致。阳性质粒序列测定结 果与原F基因序列完全一致。双酶切载体和目的片段位置也与预期一致。证明阳性质粒构 建成功。

2.2重组真核表达质粒导入减毒沙门氏菌

在LB平板上划线培养鼠伤寒沙门氏菌SL7207；挑取单个菌落接种3ml LB液体培养基， 37℃过夜振荡培养；每5ml LB液体培养基接种100μL过夜培养物，37℃，225prm振荡培养，至OD_600nm＝0.6；培养物冰浴30min，4000rpm离心10min；倒去所有营养液，用等体 积、冰浴的WB溶液重悬细菌，4000prm，离心10min(WB＝10％甘油，90％双蒸水，过滤)； 重复上一步2次：倾去大部分WB，使剩余体积为50μL(每10ml原始培养物制备感受态细 胞50μL，即0.5％)，混匀即为感受态细胞。

每40μL感受态细胞中加入5μL质粒pcDNA3.1-F、pcDNA3.1以及荧光质粒pEGFP， 混匀；吸取40μL加入冰预冷的电极杯中，进行电转化。参数设置为2.5Kv，200Ω，25μF， t≈4.5-5.0ms。另取不加质粒的感受态细胞电转化作对照：电击后，立即向电极杯中加入1mlLB，混匀，37℃振荡培养1h；取200μL铺带有Amp^R抗性的LB平板，37℃过夜培养。

挑取转化出的菌落在带有Amp^R的LB液体培养基中培养至OD_600nm＝1.0；提取质粒后电 泳鉴定，证明与已知质粒大小相同。

2.3携带RSV重组蛋白的沙门氏菌免疫学评价

2.3.1感染腹腔原代巨噬细胞预试验

取小鼠腹腔原代巨噬细胞，摘除眼球放血后，断颈处死小鼠，用75％的乙醇浸泡小鼠； 将小鼠固定，无菌打开小鼠腹部的皮肤，暴露腹膜；将10ml 37℃水浴的无血清培养基RPMI1640沿耻骨前沿、腹中线一侧注射入小鼠的腹腔，不要拔出针头，然后用手指轻轻按摩腹部；无菌收集腹水，并分离巨噬细胞。

将分离的巨噬细胞进行细胞计数，铺板24孔细胞板，5×10⁵～1×10⁶个cell/孔，在含有 RPMI培养基的细胞瓶中37℃吸附2h；用无抗生素的不完全培养基RPMI1640洗涤细胞2次，以除去未吸附的细胞；5000rpm离心收集菌体，用0.01mol/L PBS(pH7.4)重悬；将减 毒沙门氏菌计数后与细胞数按1:1、5:1、10:1、20:1、50:1、100:1、500:1和1000:1不同的 比例加入到24孔细胞板中每个比例重复3孔，37℃孵育30min；用0.01mol/L PBS(pH7.4) 洗涤细胞3次，再用含有100mg/L的硫酸庆大霉素的RPMI1640培养液培养细胞2h，以杀 死胞外菌；再向细胞培养物中加入10mg/L的四环素，37℃孵育2h，以阻断胞内菌的繁殖； 再换用含有10mg/L的硫酸庆大霉素的RPMI1640(含有10％FCS)继续培养48-96h，每隔 12h观察有无污染出现，以确定感染量。

将重组减毒沙门氏菌与巨噬细胞按MOI＝20作用，感染后48～72h用荧光显微镜观察细 胞中有无绿色荧光表达。在感染后48h和72h都能够看见大约有34/的细胞中有绿色荧光表 达，而对照中没有发现荧光。

2.3.2重组减毒沙门氏菌体内感染试验

本实施例采用小鼠进行体内感染试验，口服给药。

取6-8周龄雌性小鼠，分成4组，SL7207/pcDNA3.1-F一组，对照SL7207/pcDNA3.l一组，FI-RSV疫苗作为疫苗阳性对照一组，PBS组作为阴性对照。免疫前30min先用7.5％ 的NaHCO₃灌胃中和胃酸，100μL/只，然后口服免疫重组菌(10⁸cfu/只，200μL)。

分别在口服免疫后0h、24h、48h和72h，提取肠道粘膜的总RNA，每次2只。剪取小 肠粘膜约100mg，剪碎后加入1.0mol TRIzol试剂，用组织捣碎机匀浆，在15～30℃温育5min；加入200μL的氯仿，盖紧管盖，剧烈震荡15s；15～30℃温育2-3mni；2-8℃12000g离心15min；转移水相到一新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，15i-30℃作用10min，2-8℃12000g离心10min；弃去上清液，加入75％乙醇l.0ml，振摇，2-8℃7500g离心5min；弃去上清，干燥 沉淀物(室温约5min)；加入20μL DEPC水溶解，-20℃保存。

提取总RNA后，进行反转录cDNA合成及PCR扩增，扩增目的基因F的是否转录表 达。扩增时用β-actin作为内参。

β-actin特异性引物：Pβl序列为5’-GTGGGCCGCTcTAGGCACCAA-3’；Pβ2序列为5’-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3’；

F蛋白基因：94℃预变性3min，35个cycle，72℃延伸10min，产物置冰箱待测。

β-actin：取反转录产物2.0μL，加入PCR混合液48.0μL，包括Pβ1、Pβ2各40pmol，94℃ 预变性5min，35个cycle，72℃延伸5min，产物置冰箱待测。

PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检验，检验结果如图3所示。图中条带1为F蛋白基因，条带2为β-actin基因。检验结果显示条带位置正确清晰，说明目的基因F正确转录。2.3.3间接免疫荧光试验(IFA)检测F蛋白在体内的表达

分别在口服免疫后24h、48h和72h采集小鼠的腹腔巨噬细胞，计数后，铺板96孔细胞 板，5×10⁵～1×10⁶个cell/孔；在37℃、5％的二氧化碳温箱中温育2h后用PBS洗涤一次，然后弃去PBS；加入150μL 4℃预冷丙酮到96孔细胞板中，4℃孵育30min；弃去丙酮，室 温干燥；F蛋白的真核表达质粒免疫的小鼠血清1:80稀释，每个组重复两个孔；加入50μL 稀释的血清，37℃温育30min；移去稀释血清，200μL PBS洗涤6次；加入50μL 1:100稀 释的荧光标记羊抗鼠IgG，37℃温育30min；移去液体，在纸巾上使细胞板干燥，用PBS 洗涤4次；于荧光显微镜下观察。

高压电转化至aroA突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207株构建成重组沙门氏菌SL7207/pcDNA3.1-F，制备小鼠腹腔巨噬细胞，感染SL7207/pcDNA3.1-F，经荧光显微镜可以检测到有荧光蛋白表达。将SL7207/pcDNA3.1-F口服免疫小鼠，2d后提取肠道粘膜总RNA，可以检测到目的基因的转录和表达；同时制备免疫小鼠的腹腔巨噬细胞，用FITC 标记的羊抗鼠IgG进行间接免疫荧光试验可以检测到特异性的黄绿色荧光。结果表明该减 毒沙门氏菌不仅可将目的基因呈递给小鼠体细胞，而且，转运的目的基因可以获得转录和 表达。

口服给药一周后，经小鼠眼眶取血，分离血清用PBS将各组小鼠血清从1：10000开始 倍比稀释至1：5120000，间接ELISA检测抗体效价，即IgG滴度(几何平均值)。检测结 果见表3。

表3小鼠IgG抗体滴度表

	平行1	平行2	平行3	平行4
					SL7207/pcDNA3.1-F	10523	14962	13328	17385
SL7207/pcDNA3.1	0	0	0	0
					FI-RSV	29618	28619	21309	24661
PBS阴性对照	0	0	0	0

由上述实验可以看出，本发明中采用的呼吸道合胞病毒重组蛋白以细菌为载体，进入 小鼠体内后，小鼠存活率正常，粪便检验正常；小鼠的正常免疫应答被激发，并且经过黏 膜取样检验，在样品中检出一定量的IgA抗体，说明以本发明中得到的重组载体菌可以作 为抗原对呼吸道合胞病毒进行免疫反应，并可进一步实验验证其有效性。

3、制备脑膜炎球菌免疫中间体

3.1ΔfHbp重组蛋白的克隆和原核表达

fHbp是一种膜表面脂蛋白，许多脑膜炎球菌的菌株都带有其基因，也发现不携带该基 因的菌株。根据整个蛋白的抗原交叉反应性和序列相似性，脑膜炎球菌fHbp可以被分为3 个抗原变体组V1～V3。通常，针对变体V1的fHbp(也被称为亚家族B)制备的抗体对来自变体V1表达fHbp的菌株具有杀菌活性，但不针对变体V2和V3(也称为亚族A)中表 达fHbp的菌株，反之亦然。fHbp的蛋白分子含有五个可变结构域的不同组合(V_A～V_E)， 每个可变区段衍生自亚族A和亚族B。我们根据其结构域特点，设计了ΔfHbp的结构(如 图4示)，其包含V1的A、B结构域(B结构域上含有V1的抗原表位)，以及V3的C、D、 E结构域(C、D、E结构域含有V2和V3的抗原表位，且其174-216位氨基酸高度保守， 只有个别氨基酸的差异)，理论上，重组的ΔfHbp能覆盖所有野生型fHbp 3个变体的抗原 位点，具有广谱抗菌的潜力。

根据GeneBank登录的fHbp V1和fHbp V3全长CDS序列，我们设计如下2对引物： 引物在P1和P4位置分别引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。

P1：GGATTCATGAACCGAACTGCCTTCTGCTGCC

P2：GCCGGGCAGTTGGTTGAAGGCGGTA

P3：ACGGCATTCGGTTCAGACGATGCCA

P4：AAGCTTTTACTGCTTGGCGGCAAGACCGATA

分别以表达fHbp V1和V3的两株MenB群菌为模板(购自美国ATCC)，进行PCR扩 增。其中P1，P2可扩增fHbp V1的A、B结构域基因片段，P3和P4可扩增V3的C、D、 E结构域基因片段。再以这两段基因片段为模板，P1，P4为引物，进行搭桥PCR，可扩增 得到重组的ΔfHbp全长片段。用BamH I和HindⅢ双酶切目的基因(PCR产物)和原核 表达载体pET32a(+)，凝胶回收盒回收Δfhbp基因片段和线性pET32a载体。胶回收后， 用DNA连接酶，16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5a菌株，单克隆扩增，小提质粒后，BamH I和HindⅢ双酶切鉴定的约800bp条带，在卡那霉素抗性下筛选阳性克隆，获得重组质粒 pET-ΔfHbp，PCR扩增电泳图谱与鉴定正确电泳图谱如图5示。将鉴定正确的重组质粒以 15％甘油菌形式-70℃保存，并测序鉴定正确，其ΔfHbp的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO： 9示，其核苷酸编码序列如序列表SEQID NO：10(826bp)所示。

SEQ ID NO：10(826bp)：

ATGAACCGAACTGCCTTCTGCTGCCTTTTCCTGACCACCGCCCTGATTCTGACCGCCTGCAGCAGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAAGCGGCGGTGTCGCCGCCGACATCGGCACGGGGCTTGCCGATGCACTAACTACGCCGCTCGACCATAAAGACAAAGGTTTGAAATCTCTGACATTGGAAGACTCCATTCCCCAAAACGGAACACTAACCCTGTCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTTCAAAGCCGGCGACAAAGACAACAGCCTCAACACGGGCAAACTGAAGAACGACAAAATCAGCCGCTTCGACTTCGTGCAAAAAATCGAAGTGGACGGACAAACCATCACGCTGGCAAGCGGCGAATTTCAAATATACAAACAGGACCACTCCGCCGTCGTTGCCCTACAGATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGATAAACCAACGCTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGAGAACATACCGCCTTCAACCAACTGCCCGGCACGGCATTCGGTTCAGACGATGCCAGTGGAAAACTGACCTACACCATAGATTTCGCCGCCAAGCAGGGACACGGCAAAATCGAACATTTGAAATCGCCAGAACTCAATGTTGACCTGGCCGCCTCCGATATCAAGCCGGATAAAAAACGCCATGCCGTCATCAGCGGTTCCGTCCTTTACAACCAAGCCGAGAAAGGCAGTTACTCTCTAGGCATCTTTGGCGGGCAAGCCCAGGAAGTTGCCGGCAGCGCAGAAGTGGAAACCGCAAACGGCATACGCCATATCGGTCTTGCCGCCAAGCAGTAA

其氨基酸序列为SEQ ID NO：9：

MNRTAFCCLFLTTALILTACSSGGGGSGSGGVAADIGTGLADALTTPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGTAFGSDDASGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAASDIKPDKKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ

将重组质粒pET-ΔfHbp转化E.coli BL21(DE3)，37℃过夜培养(含50μg/ml卡纳青霉素)，得到ΔfHbp/BL21(DE3)表达菌，挑取单克隆，37℃振荡培养至菌密度达OD600 约0.5～1.0，加入终浓度0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃振荡诱导培 养2-6小时，经SDS-PAGE鉴定，结果如图6显示，ΔfHbp/BL21(DE3)诱导后有明显的 表达条带，分子量分别为30kD。经Western-Blot鉴定为ΔfHbp重组蛋白，如图7所示：1， 2泳道为ΔfHbp/BL21(DE3)诱导表达物，1，2用fHbp单抗检测，1有30kD的预期条带， 结果符合预期。最后两个重组蛋白经质谱鉴定，确定为ΔfHbp重组蛋白。

3.2ΔfHbp重组蛋白的小规模纯化及其免疫效果评价

将ΔfHbp/BL21(DE3)接种LB(含50μg/ml卡纳霉素)液体培养基，37℃、200rpm 培养12小时，以1％接种比例扩大培养，37℃、200rpm培养3-6小时后，OD600至16～ 20，IPTG(0.5mM)诱导4小时。离心机离心收集菌体。超声破菌，之前的SDS-PAGE显 示，重组蛋白表达以包涵体的形式(图3)。先后用TE+300mM Nacl，TE+1％Triton-100洗 涤包涵体后，8000rpm离心20min获得包涵体，洗涤后，溶解于3mol/L urea，20mmol/L Tris-Cl，1mmol/L EDTA，pH4.0溶液中，经CM柱离子交换层析纯化，可得到与目标蛋白 大小相符的两个目的蛋白。最后待重组蛋白稀释复性至24h后，超滤器低温快速浓缩至原 体积的1.2倍，过阴离子交换柱Q SepharoseF.F，收集目的蛋白峰，检测方法同图7，凝 胶检测蛋白含量达到95.3％以上，纯化效果如图8所示，WB检测确为目的蛋白。用PBS (pH7.4)透析除盐后，BCA法测蛋白浓度含量约0.5mg/mL。

小鼠免疫：分别用纯化后的ΔfHbp重组蛋白皮下免疫6周龄SPF级NIH小鼠10只，免疫剂量为每次纯化后的ΔfHbp重组蛋白50ug/只(溶解于0.2ml生理盐水中)，免疫程序为0，2，4周，免疫结束后2周采血，离心收集血清；另设10只小鼠对照，相同方法注射 生理盐水。收集好的血清ELISA法测血清抗体的滴度，具体方法如下：采用纯化后的ΔfHbp 重组蛋白，分别以适宜剂量包被酶标板，37℃孵育过夜，洗板后加入系列稀释的待测小鼠 血清，37℃孵育后洗板，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗显色，酶标仪测定，读 取492nm(630nm为参比波长)吸光度值(A值)。阴性对照组血清A均值+3倍的标准偏 差为Cutoff值，待测血清A值大于Cutoff值判为阳性，以A值大于Cutoff值的最大稀释度 计算各型别小鼠的几何平均滴度，即为小鼠血清IgG抗体效价(表4)。两种重组蛋白免疫 小鼠后均产生了高低度的血清抗体。

表4.各组抗原三次免疫小鼠后血清抗体的滴度测定(几何平均值)

免疫抗原	血清IgG抗体滴度(GMT)
		ΔfHbp	1:25489
阴性对照(生理盐水)	0

重组蛋白免疫效果的评价，采取两种方法，一为全菌体包被测定全细胞ELISA，另一 为流行株的杀菌力实验。全菌体包被选择MenB群菌株MC58(高表达fHbp V1可变体)、8047(高表达fHbp V2可变体)、M1239高表达fHbp V3可变体)，961-5945(中量表达fHbp 蛋白)和67/00(低量表达fHbp蛋白)，将这些菌株扩大培养增殖后，刮取细菌菌苔，以生 理盐水溶解，甲醛杀菌后，稀释为2×10⁸个/ml，以此浓度包被96孔酶标板，100ul/孔，4℃ 包被过夜，洗板后，进行检测，结果见表5。同样，培养MenB群菌株MC58(高表达fHbp V1可变体)、8047(高表达fHbp V2可变体)、M1239高表达fHbp V3可变体)，961-5945 (中量表达fHbp蛋白)和67/00(低量表达fHbp蛋白)后用相应血清抗体进行杀菌检测， 测定并计算杀菌抗体滴度(与补体阴性对照孔相比，50％以上杀菌率的血清最高稀释度为 血清抗体杀菌滴度)，结果见表6。

表5各MenB菌株全细胞ELISA

菌株	ΔfHbp血清	生理盐水血清
			MC58	979956	<200
8047	534678	<200
			M1239	997854	<200
961-5945	328940	<200
			67/00	25679	<200

表6各MenB菌株杀菌力实验:BC50titer(1：)

菌株	ΔfHbp血清	生理盐水血清
			MC58	1756	1
8047	1023	2
			M1239	1872	-2
961-5945	154	-1
			67/00	6	1

备注：杀菌力实验以大于1：8为具有保护性。

由表4和表5的结果综合分析可得，ΔfHbp蛋白疫苗能够有效免疫所有表达fHbp(V1、 V3和V2变体)的MenB菌株的侵染，但对低表达甚至不表达fHbp的MenB菌株失去保护能力，但由于联合疫苗抗原种类较多，不宜选用过大的载体进行后续实验，因此选择免疫能力较强的ΔfHbp作为免疫中间体的蛋白载体，而不因为追求全面保护对载体蛋白再进行偶连。

3.4多价Nm多糖-ΔfHbp蛋白缀合疫苗的制备和免疫效果评价

3.4.1.A群、C群、Y群和W135群Nm菌荚膜多糖的制备

A群脑膜炎球菌采用29201菌株，C群脑膜炎球菌采用29205菌株，Y群脑膜炎球菌采用29028菌株，W135群脑膜炎球菌采用29037菌株，脑膜炎球菌经发酵培养后，采用沙 培离心机、碟片式离心机或其他大容量离心机分离培养液，收集离心上清；将离心上清以100KD膜包超滤浓缩，采用25-80％的乙醇进行分级沉淀，收集沉淀并用无水乙醇及丙酮分别洗涤，得到粗制多糖；灭菌注射用水溶解多糖并经脱氧胆酸钠处理后，采用GE填料Captoadhere和Capto DEAE或其他厂家相同功能性质的离子交换填料，以串联层析或分步层析的方法进行粗糖精制，收集流穿峰，采用GE Sephadex G25Coarse对流穿峰进行脱盐，乙醇沉淀或冻干回收多糖，置于-20℃保存备用。

3.4.2.A/C/Y/W135群多糖-ΔfHbp蛋白缀合疫苗的制备

本发明采用CDAP活化多糖后衍化结合的工艺制备多价荚膜多糖-ΔfHbp蛋白缀合疫 苗。具体方法为：将A/C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖溶解至5-15mg/ml，调节pH值至10.8左右，在多糖溶液中加入1/10(g/g)的CDAP，室温、维持pH值10.8的碱性环境下活化 多糖8min。按1：1(与活化多糖的体积比)的比例加入0.5mol/L的已二酰肼，室温反应 50-70min。50KD膜包超滤去除溴化氰及已二酰肼，得到多糖衍生物。将多糖衍生物与载体 蛋白ΔfHbp以1：1(g/g)的比例混合并搅拌，按碳二亚胺：多糖＝1：10的比例加入碳二 亚胺，室温、酸性环境(pH5.6)下反应60min。经100KD超滤膜包超滤去除杂质，并浓缩。 最后采用GESepharose 4FF进行凝胶层析纯化，收集V0附近的洗脱液。用0.22μm滤膜除 菌过滤，得到A/C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖-ΔfHbp蛋白缀合免疫中间体原液。

将此原液采用磷酸铝佐剂搅拌吸附，以0.15mol/L氯化钠稀释配制，至多价多糖蛋白结 合物以多糖含量计终浓度分别为20μg/ml，铝含量终浓度为0.45-0.6mg/ml，搅拌均匀，以预 填充注射器分装，0.5ml/支，制成A/C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖-ΔfHbp蛋白缀合疫苗制 剂，2-8℃保存。也可在疫苗原液中加入80mg/ml蔗糖作为赋形剂，每支多糖含量20μg/ml 冻干后制成蛋白疫苗制剂，2-8℃保存。

3.4.3.A/C/Y/W135群多糖-ΔfHbp蛋白缀合疫苗效果评价

小鼠免疫：分别用A/C/Y/W135群多糖-ΔfHbp蛋白缀合疫苗蛋白原液、冻干制剂和佐 剂吸附制剂皮下免疫6周龄SPF级NIH小鼠10只，免疫剂量为每次0.2ml/只，免疫程序为0，2，4周，免疫结束后2周采血，离心收集血清；另设10只小鼠对照，相同方法注射生 理盐水。收集好的血清ELISA法测血清抗体的滴度，具体方法如下：采用纯化后的ΔfHbp 重组蛋白，分别以适宜剂量包被酶标板，37℃孵育过夜，洗板后加入系列稀释的待测小鼠 血清，37℃孵育后洗板，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗显色，酶标仪测定，读 取492nm(630nm为参比波长)吸光度值(A值)。阴性对照组血清A均值+3倍的标准偏 差为Cutoff值，待测血清A值大于Cutoff值判为阳性，以A值大于Cutoff值的最大稀释度 计算各型别小鼠的几何平均滴度，即为小鼠血清IgG抗体效价(表7)。缀合疫苗原液和两 种剂型免疫小鼠后均产生了高低度的血清抗体。

表7.各组抗原三次免疫小鼠后血清抗体的滴度测定(几何平均值)

免疫物	血清IgG抗体滴度(GMT)
		疫苗原液	1:22449
疫苗冻干制剂	1:25376
		疫苗佐剂吸附制剂	1:24936
阴性对照(生理盐水)	0

缀合疫苗各剂型免疫效果的评价，同样采取两种方法，全菌体包被测定全细胞ELISA 和流行株的杀菌力实验。全菌体包被选择A群脑膜炎球菌29201菌株，B群脑膜炎球菌MC58 和67/00菌株，C群脑膜炎球菌29205菌株，Y群脑膜炎球菌29028菌株，W135群脑膜炎球菌29037菌株，将这些菌株扩大培养增殖后，刮取细菌菌苔，以生理盐水溶解，甲醛杀 菌后，稀释为2×10⁸个/ml，以此浓度包被96孔酶标板，100ul/孔，4℃包被过夜，洗板后， 用相应疫苗血清抗体进行ELISA检测，结果见表8。

表8各群脑膜炎球菌菌株全细胞ELISA

菌株	疫苗原液	疫苗冻干制剂	疫苗佐剂吸附制剂	生理盐水
					A群29201	1059456	1174856	1298936	<200
C群29205	996543	1025467	1145793	<200
					Y群29028	998359	1104574	1221453	<200
W群29037	1032579	1124694	1308945	<200
					B群MC58	1125690	1231245	1324760	<200
B群67/00	678947	797320	895680	<200

同样，A群脑膜炎球菌29201菌株，B群脑膜炎球菌MC58和67/00菌株，C群脑膜炎 球菌29205菌株，Y群脑膜炎球菌29028菌株，W135群脑膜炎球菌29037菌株后用相应疫 苗血清抗体进行杀菌检测，测定并计算杀菌抗体滴度(与补体阴性对照孔相比，50％以上 杀菌率的血清最高稀释度为血清抗体杀菌滴度)，结果见表9。

表9各群脑膜炎球菌菌株杀菌力实验:BC50titer(1：)

备注：杀菌力实验以大于1：8为具有保护性。

由以上结果综合分析可得，以重组ΔfHbp为蛋白载体的新型多价脑膜炎球菌缀合疫苗 具有广谱的免疫效果，其免疫小鼠血清能与A、B、C、Y和W135五个群的模式菌株产生交联反应，同时能够覆盖B群中表达fHbp(3种变体)以及不表达fHbp但表达NadA的高 致病菌，并在杀菌检测中表现出广谱且极强的杀菌效果，从而保护人们(尤其是婴幼儿及 年老体弱者)免受绝大部分Nm致病菌侵害导致的脊髓脑膜炎危害。

4、呼吸道合胞病毒-RSV-流脑-肺炎联合疫苗的效果评价

将呼吸道合胞病毒重组载体菌SL7207/pcDNA3.1-F复苏后，与A/C/Y/W135群脑膜炎 球菌多糖-ΔfHbp蛋白缀合免疫中间体冻干粉、Hib-肺炎球菌免疫中间体临用混合，进行小 鼠免疫。

选择免疫6周龄SPF级NIH小鼠10只，免疫剂量为每次0.2ml/只，免疫程序为0，2， 4周，免疫结束后2周采血，离心收集血清；另设10只小鼠对照，相同方法注射生理盐水。 收集好的血清ELISA法测血清抗体的滴度，检测结果如表10所示。

表10

免疫	GMT	生理盐水
			Hib	1265	0
RSV	801	0
			A群29201	1354	0
C群29205	1246	0
			Y群29028	1221	0
W群29037	1129	0
			B群MC58	1362	0
B群67/00	561	0
			肺炎球菌4型血清多糖	3901	0
肺炎球菌6B型血清多糖	4167	0
			肺炎球菌9V型血清多糖	5279	0
肺炎球菌14型血清多糖	3298	0
			肺炎球菌18型血清多糖	4116	0
肺炎球菌19型血清多糖	4879	0
			肺炎球菌23F型血清多糖	5238	0

由表10可知,联合免疫后的抗体滴度实验与单独免疫无极显著差异(与上述单独免疫 相比，P<0.005，统计学阳性对照数据见上述制备方法中各中间体数据。)，可有效进行Hib、 RSV和流脑的多重免疫保护，但免疫效果相对降低，可考虑多次免疫已保证有效免疫。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说 明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出 的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 武汉博沃生物科技有限公司

<120> 抗Hib-RSV-脑膜炎球菌-肺炎球菌联合疫苗

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggaattccat atggcaaata aagcagtaaa t 31

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgagctcgtc attttctacc ttatcctct 29

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggcggccgc atggcaaata aagcagtaaa tg 32

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccctcgagtt actagtcatt ttctacctta tcctct 36

<210> 5

<211> 1725

<212> DNA

<213> respiratory syncytial virus

<400> 5

atggagctgc tgatccacag gttaagtgca atcttcctaa ctcttgctat taatgcattg 60

tacctcacct caagtcagaa cataactgag gagttttacc aatcgacatg tagtgcagtt 120

agcagaggtt attttagtgc tttaagaaca ggttggtata ccagtgtcat aacaatagaa 180

ttaagtaata taaaagaaac caaatgcaat ggaactgaca ctaaagtaaa acttataaaa 240

caagaattag ataagtataa gaatgcagtg acagaattac agctacttat gcaaaacaca 300

ccagctgcca acaaccgggc cagaagagaa gcaccacagt atatgaacta tacaatcaat 360

accactaaaa acctaaatgt atcaataagc aagaagagga aacgaagatt tctgggcttc 420

ttgttaggtg taggatctgc aatagcaagt ggtatagctg tatccaaagt tctacacctt 480

gaaggagaag tgaacaagat caaaaatgct ttgttatcta caaacaaagc tgtagtcagt 540

ctatcaaatg gggtcagtgt tttaaccagc aaagtgttag atctcaagaa ttacataaat 600

aaccaattat tacccatagt aaatcaacag agctgtcgca tctccaacat tgaaacagtt 660

atagaattcc agcagaagaa cagcagattg ttggaaatca acagagaatt cagtgtcaat 720

gcaggtgtaa caacaccttt aagcacttac atgttaacaa acagtgagtt actatcattg 780

atcaatgata tgcctataac aaatgatcag aaaaaattaa tgtcaagcaa tgttcagata 840

gtaaggcaac aaagttattc tatcatgtct ataataaagg aagaagtcct tgcatatgtt 900

gtacagctac ctatctatgg tgtaatagat acaccttgct ggaaattaca cacatcacct 960

ctatgcacca ccaacatcaa agaaggatca aatatttgtt taacaaggac tgatagagga 1020

tggtattgtg ataatgcagg atcagtatcc ttctttccac aggctgacac ttgtaaagta 1080

cagtccaatc gagtattttg tgacactatg aacagtttga cattaccaag tgaagtcagc 1140

ctttgtaaca ctgacatatt caattccaag tatgactgca aaattatgac atcaaaaaca 1200

gacataagca gctcagtaat tacttctctt ggagctatag tgtcatgcta tggtaaaact 1260

aaatgcactg catccaacaa aaatcgtggg attataaaga cattttctaa tggttgtgac 1320

tatgtgtcaa acaaaggagt agatactgtg tcagtgggca acactttata ctatgtaaac 1380

aagctggaag gcaagaacct ttatgtaaaa ggggaaccta taataaatta ctatgaccct 1440

ctagtgtttc cttctgatga gtttgatgca tcaatatctc aagtcaatga aaaaatcaat 1500

caaagtttag cttttattcg tagatctgat gaattactac ataatgtaaa tactggcaaa 1560

tctactacaa atattatgat aactacaatt attatagtaa tcattgtagt attgttatca 1620

ttaatagcta ttggtttgct gttgtattgc aaagccaaaa acacaccagt tacactaagc 1680

aaagaccaac taagtggaat caataatatt gcattcagca aatag 1725

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccaagcttc agaaaaccgt gacctatcaa g 31

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccctcgagac atgaagtttt gcctcactag ta 32

<210> 8

<211> 2306

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttagttatt caaaaactac atcttagcag aaaaccgtga cctatcaagc aagaacgaaa 60

ttaaacctgg ggcaaataac catggagctg ctgatccaca ggttaagtgc aatcttccta 120

actcttgcta ttaatgcatt gtacctcacc tcaagtcaga acataactga ggagttttac 180

caatcgacat gtagtgcagt tagcagaggt tattttagtg ctttaagaac aggttggtat 240

accagtgtca taacaataga attaagtaat ataaaagaaa ccaaatgcaa tggaactgac 300

actaaagtaa aacttataaa acaagaatta gataagtata agaatgcagt gacagaatta 360

cagctactta tgcaaaacac accagctgcc aacaaccggg ccagaagaga agcaccacag 420

tatatgaact atacaatcaa taccactaaa aacctaaatg tatcaataag caagaagagg 480

aaacgaagat ttctgggctt cttgttaggt gtaggatctg caatagcaag tggtatagct 540

gtatccaaag ttctacacct tgaaggagaa gtgaacaaga tcaaaaatgc tttgttatct 600

acaaacaaag ctgtagtcag tctatcaaat ggggtcagtg ttttaaccag caaagtgtta 660

gatctcaaga attacataaa taaccaatta ttacccatag taaatcaaca gagctgtcgc 720

atctccaaca ttgaaacagt tatagaattc cagcagaaga acagcagatt gttggaaatc 780

aacagagaat tcagtgtcaa tgcaggtgta acaacacctt taagcactta catgttaaca 840

aacagtgagt tactatcatt gatcaatgat atgcctataa caaatgatca gaaaaaatta 900

atgtcaagca atgttcagat agtaaggcaa caaagttatt ctatcatgtc tataataaag 960

gaagaagtcc ttgcatatgt tgtacagcta cctatctatg gtgtaataga tacaccttgc 1020

tggaaattac acacatcacc tctatgcacc accaacatca aagaaggatc aaatatttgt 1080

ttaacaagga ctgatagagg atggtattgt gataatgcag gatcagtatc cttctttcca 1140

caggctgaca cttgtaaagt acagtccaat cgagtatttt gtgacactat gaacagtttg 1200

acattaccaa gtgaagtcag cctttgtaac actgacatat tcaattccaa gtatgactgc 1260

aaaattatga catcaaaaac agacataagc agctcagtaa ttacttctct tggagctata 1320

gtgtcatgct atggtaaaac taaatgcact gcatccaaca aaaatcgtgg gattataaag 1380

acattttcta atggttgtga ctatgtgtca aacaaaggag tagatactgt gtcagtgggc 1440

aacactttat actatgtaaa caagctggaa ggcaagaacc tttatgtaaa aggggaacct 1500

ataataaatt actatgaccc tctagtgttt ccttctgatg agtttgatgc atcaatatct 1560

caagtcaatg aaaaaatcaa tcaaagttta gcttttattc gtagatctga tgaattacta 1620

cataatgtaa atactggcaa atctactaca aatattatga taactacaat tattatagta 1680

atcattgtag tattgttatc attaatagct attggtttgc tgttgtattg caaagccaaa 1740

aacacaccag ttacactaag caaagaccaa ctaagtggaa tcaataatat tgcattcagc 1800

aaatagacaa aaaaccacct gatcatgttt caacaacagt ctgctgatca ccaatcccaa 1860

atcaacccat aacaaacact tcaacatcac agtacaggct gaatcatttc ttcacatcat 1920

gctacccaca caactaagct agatccttaa ctcatagtta cataaaaacc tcaagtatca 1980

caatcaaaca ctaaatcaac acatcattca caaaattaac agctggggca aatatgtcgc 2040

gaagaaatcc ttgtaaattt gagattagag gtcattgctt gaatggtaga agatgtcact 2100

acagtcataa ttactttgaa tggcctcctc atgccttact agtgaggcaa aacttcatgt 2160

taaacaagat actcaagtca atggacaaaa gcatagacac tttgtctgaa ataagtggag 2220

ctgctgaact ggacagaaca gaagaatatg ctcttggtat agttggagtg ctagagagtt 2280

acataggatc tataaacaac ataaca 2306

<210> 9

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Ala Ala Thr Ala Pro Cys Cys Leu Pro Leu Thr Thr Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Val

20 25 30

Ala Ala Ala Ile Gly Thr Gly Leu Ala Ala Ala Leu Thr Thr Pro Leu

35 40 45

Ala His Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ser Leu Thr Leu Gly Ala Ser Ile

50 55 60

Pro Gly Ala Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Thr

65 70 75 80

Pro Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ser Leu Ala Thr Gly Leu Leu Leu

85 90 95

Ala Ala Leu Ile Ser Ala Pro Ala Pro Val Gly Leu Ile Gly Val Ala

100 105 110

Gly Gly Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Gly Pro Gly Ile Thr Leu Gly

115 120 125

Ala His Ser Ala Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Ile Ala Ala Pro

130 135 140

Ala Leu Ile Ala Ser Leu Ile Ala Gly Ala Ser Pro Leu Val Ser Gly

145 150 155 160

Leu Gly Gly Gly His Thr Ala Pro Ala Gly Leu Pro Gly Thr Ala Pro

165 170 175

Gly Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Thr Thr Thr Ile Ala Pro Ala

180 185 190

Ala Leu Gly Gly His Gly Leu Ile Gly His Leu Leu Ser Pro Gly Leu

195 200 205

Ala Val Ala Leu Ala Ala Ser Ala Ile Leu Pro Ala Leu Leu Ala His

210 215 220

Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Thr Ala Gly Ala Gly Leu Gly Ser

225 230 235 240

Thr Ser Leu Gly Ile Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Val Ala Gly Ser

245 250 255

Ala Gly Val Gly Thr Ala Ala Gly Ile Ala His Ile Gly Leu Ala Ala

260 265 270

Leu Gly

<210> 10

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgaaccgaa ctgccttctg ctgccttttc ctgaccaccg ccctgattct gaccgcctgc 60

agcagcggag gcggcggaag cggaagcggc ggtgtcgccg ccgacatcgg cacggggctt 120

gccgatgcac taactacgcc gctcgaccat aaagacaaag gtttgaaatc tctgacattg 180

gaagactcca ttccccaaaa cggaacacta accctgtcgg cacaaggtgc ggaaaaaact 240

ttcaaagccg gcgacaaaga caacagcctc aacacgggca aactgaagaa cgacaaaatc 300

agccgcttcg acttcgtgca aaaaatcgaa gtggacggac aaaccatcac gctggcaagc 360

ggcgaatttc aaatatacaa acaggaccac tccgccgtcg ttgccctaca gattgaaaaa 420

atcaacaacc ccgacaaaat cgacagcctg ataaaccaac gctccttcct tgtcagcggt 480

ttgggcggag aacataccgc cttcaaccaa ctgcccggca cggcattcgg ttcagacgat 540

gccagtggaa aactgaccta caccatagat ttcgccgcca agcagggaca cggcaaaatc 600

gaacatttga aatcgccaga actcaatgtt gacctggccg cctccgatat caagccggat 660

aaaaaacgcc atgccgtcat cagcggttcc gtcctttaca accaagccga gaaaggcagt 720

tactctctag gcatctttgg cgggcaagcc caggaagttg ccggcagcgc agaagtggaa 780

accgcaaacg gcatacgcca tatcggtctt gccgccaagc agtaa 825

Claims (10)

1.一种抗Hib-RSV-脑膜炎球菌-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗包括：

a)Hib-肺炎球菌免疫中间体，所述Hib-肺炎球菌免疫中间体以肺炎球菌表达的高保守性并具有免疫原性的蛋白为载体蛋白，缀合Hib荚膜多糖；

b)脑膜炎球菌免疫中间体，所述脑膜炎球菌免疫中间体包括ΔfHbp，所述重组ΔfHbp包含fHbp可变体V1的VA、VB结构域以及fHbp可变体V3的VC、VD、VE结构域；

c)呼吸道合胞病毒免疫中间体，所述呼吸道合胞病毒免疫中间体的抗原为可引起机体免疫反应的RSV膜表面融合蛋白F和/或附着蛋白G，其中表达蛋白抗原的核酸序列重组在核酸载体上，重组蛋白的核酸序列以减毒胞内细菌为细菌载体；

上述组分的免疫中间体分别制备为冻干粉剂，临用复融混合。

2.根据权利要求1所述的抗Hib-RSV-脑膜炎球菌-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：所述Hib-肺炎球菌免疫中间体还包括与载体蛋白缀合的肺炎球菌荚膜多糖。

3.根据权利要求1所述的抗Hib-RSV-脑膜炎球菌-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：肺炎球菌荚膜多糖选自以下血清型中的一种及以上：1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F和/或33F。

4.根据权利要求1所述的抗Hib-RSV-脑膜炎球菌-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于，肺炎球菌载体蛋白包括：肺炎球菌溶血蛋白及其改性衍生物、肺炎球菌表面蛋白及其改性衍生物、肺炎球具表面黏附蛋白及其改性衍生物或肺炎球菌三组氨酸蛋白家族融合蛋白。

5.根据权利要求1所述的抗Hib-RSV-脑膜炎球菌-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于，肺炎球菌载体蛋白具体为：改性肺炎球菌溶血蛋白△A146Ply、肺炎球菌溶血蛋白衍生物dPly、肺炎球菌表面蛋白A、肺炎球菌表面黏附蛋白A或肺炎球菌三组氨酸蛋白PhtA、PhtB、PhtD、PhtE、PhtDE。

6.根据权利要求1所述的抗Hib-RSV-脑膜炎球菌-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：RSV蛋白为F蛋白，根据表达蛋白的核酸序列设计特异性引物，引物序列如序列表SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。

7.根据权利要求1所述的抗Hib-RSV-脑膜炎球菌-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：重组的RSV蛋白抗原为pcDNA3.1-F。

8.根据权利要求1所述的抗Hib-RSV-脑膜炎球菌-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：减毒胞内细菌载体选自：L3261、SL7207或ty21a。

9.根据权利要求1所述的抗Hib-RSV-脑膜炎球菌-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：转染至细菌载体内的RSV抗原为SL7207/pcDNA3.1-F。

10.根据权利要求1所述的抗Hib-RSV-脑膜炎球菌-肺炎球菌联合疫苗，其特征在于：所述重组ΔfHbp的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：9所示，其核苷酸编码序列如序列表SEQID NO：10所示。